docsprawozdanie za rok ii - zakład mikrobiologii stosowanej
download 
Reklamacja Transkrypt
sprawozdanie za rok ii - zakład mikrobiologii stosowanej
Program LIDER – IV konkurs RAPORT ROCZNY ZA ROK …2... z realizacji Projektu w ramach Programu „LIDER” ZA OKRES OD 01. 01. 2015 R. DO 31. 12. 2015 R. Podać numer roku sprawozdawczego 1.DANE O PROJEKCIE Tytuł projektu Nowy algorytm identyfikacji zakażeń Mycobacterium kansasii Nr umowy LIDER/044/457/L4/12/NCBR/2013 Data rozpoczę cia realizacji Projektu (zgodnie z umową ) czenia realizacji Projektu 01. 04. 2014 r. Data zakoń Sł owa kluczowe Mycobacterium kansasii ; typowanie genetyczne; molekularna diagnostyka bakteriologiczna; algorytm identyfikacji; epidemiologia Klasyfikacja wg OECD Nauki medyczne i nauki o zdrowiu – Biotechnologia medyczna (zgodnie z umową ) 31. 03. 2017 r. 2. DANE KONTAKTOWE KIEROWNIKA PROJEKTU I JEDNOSTKI Imię i nazwisko Kierownika Projektu Dr n. med. Tomasz JAGIELSKI (1) 22 55 41 312 Telefon email [email protected] Nazwa Jednostki Uniwersytet Warszawski Adres 00927 Warszawa; Krakowskie Przedmieście 26/28 Dane osoby odpowiedzialnej ze strony Jednostki za kontakty z NCBR /podać imię i nazwisko osoby, stanowisko sł uż bowe i nazwa komórki organizacyjnej/ (1) 22 55 41 312 Telefon email Dr n. med. Tomasz JAGIELSKI Fax (1) 22 55 41 402 [email protected] Strona 1 z 15 Program LIDER – IV konkurs 3. ZADANIA BADAWCZE – ZAAWANSOWANIE PRAC /od począ tku realizacji projektu/ N r z a d a n i a * Status zadania (nie rozpoczę te/trwa/ zakoń czone) Planowana realizacja zadania wg harmonogramu umowy * Nazwa zadania* 1 2 3 Przygotowanie materiał u badawczego; wybór szczepów M. kansasii i ich rewitalizacja na pożywkach hodowlanych; zebranie i opracowanie wywiadu epidemiologicznego, w tym zebranie wywiadu o chorych, od których izolowano szczepy; analiza dokumentacji medycznej i laboratoryjnej; izolacja DNA chromosomowego ze szczepów M. kansasii ; typowanie genetyczne szczepów M. kansasii (analiza sekwencyjna – czę ść I.) Identyfikacja gatunkowa; weryfikacja przynależnoś ci szczepów do gatunku M. kansasii (testy biochemiczne, HPLC, analiza PCRRFLP); typowanie genetyczne szczepów M. kansasii (analiza sekwencyjna – czę ść II); analiza profilów lekooporności (metoda mikrorozcieńczeń ) Typowanie genetyczne szczepów M. kansasii (m. in. analiza PFGE, AFLP, MST, PCRRFLP, analiza sekwencyjna – czę ść III); opracowanie nowej metody genotypowania (analiza bioinformatyczna); analizy komparatystyczne i filogenetyczne; określenie pokrewień stw genetycznych między szczepami M. kansasii ; wykreślenie struktury genetycznej badanej populacji M. kansasii ZAKOŃ CZONE ZAKOŃ CZONE TRWA Termin rozpoczę cia realizacji zadania Termin zakoń czenia realizacji zadania 20140401 20140930 148 800 20160930 200 400 20141001 493 200 20150401 Strona 2 z 15 20140401 20150331 20150401 Data rozpoczęcia realizacji zadania 20141001 Planowany koszt zadania (w zł ) Program LIDER – IV konkurs 4 5 Analiza profilów lekoopornoś ci (metoda pasków Etest); poszukiwanie genów zwią zanych z wirulencją M. kansasii (analiza bioinformatyczna) i identyfikacja takich genów wśród szczepów M. kansasii (PCR sequencing) Integracja i opracowanie danych; analiza statystyczna; propozycja algorytmu identyfikacji szczepów M. kansasii o szczególnym znaczeniu epidemiologiczny i klinicznym jako zasady nowego testu diagnostycznego TRWA 20151201 20161130 20161201 NIE ROZPOCZĘ TE 20170331 236 400 20150901 121 200 NIE DOTYCZY Razem 1 200 000,00 zł Razem Wypeł nić dla wszystkich zadań od począ tku realizacji Projektu. * Wypeł nić zgodnie z harmonogramem stanowią cym zał ą cznik nr 2 do umowy. ** Koszt poniesiony – suma kosztów kwalifikowanych w poprzednich latach budż etowych oraz wydatków poniesionych w bież ą cym okresie sprawozdawczym. Strona 3 z 15 Program LIDER – IV konkurs 4. ZESTAWIENIE KOSZTÓW – STOPIEŃ WYKORZYSTANIA BUDŻETU W bież ą cym roku sprawozdawczym Od po Koszty Planowane * (wg kosztorysu) (w zł ) Koszty Poniesione ** (w zł ) Koszty Planowane * (w zł ) 439 800 90 000 470 200 200 000 139 016,55 115 726,29 240 484,48 99 045,47 439 800 90 000 470 200 200 000 1 200 000 594 272,79 1 200 000 1. Wynagrodzenia z pochodnymi 2. Aparatura 3. Inne koszty bezpoś rednie 4. Koszty ogólne Cał kowity koszt realizacji Projektu = suma poz. 1 4 zgodnie z kosztorysem stanowią cym zał ą cznik nr 3 do umowy Suma wydatków poniesionych w bież ą cym okresie sprawozdawczym *** Suma kosztów kwalifikowanych w poprzednich latach budż etowych oraz wydatków poniesionych w bież ą cym okresie sprawozdawczym * ** Strona 4 z 15 Program LIDER – IV konkurs 5. OPIS PRAC REALIZOWANYCH W BIEŻĄCYM OKRESIE SPRAWOZDAWCZYM Zadanie*: nr 2 Nazwa zadania: Identyfikacja gatunkowa; weryfikacja przynależ noś ci szczepów do gatunku M. kansasii (testy biochemiczne, HPLC, analiza PCRRFLP); typowanie genetyczne szczepów M. kansasii (analiza sekwencyjna – czę ś ć II); analiza profilów lekooporności (metoda mikrorozcień czeń ) Wykonawcy zadania (imię i nazwisko, pełniona funkcja osób w zespole badawczym biorą cych udział w realizacji zadania) : 1. Dr Tomasz Jagielski – a). Analiza sekwencyjna fragmentu 16S rDNA w szczepach Mycobacterium kansasii ; b). Nadzór merytoryczny nad wszystkimi etapami eksperymentalnymi projektu uruchomionymi i realizowanymi w ramach zadania nr 2; c). Organizacja i prowadzenie spotkań roboczych czł onków zespoł u badawczego; d). Współ autorstwo publikacji i doniesień zjazdowych 2. Mgr Zofia Bakuła – a). Analiza sekwencyjna regionu ITS w szczepach Mycobacterium kansasii ; b). Współautorstwo publikacji i doniesień zjazdowych Mgr Izabela Szulc – a). Typowanie genetyczne szczepów Mycobacterium kansasii w oparciu o sekwencje repetytywne MKANMIRU118 i MKANMIRU23; b). Współ autorstwo doniesień zjazdowych Mgr Małgorzata Proboszcz – a). Oznaczanie wraż liwoś ci szczepów Mycobacterium kansasii na wybrane leki p/prą tkowe; b). Współ autorstwo doniesień zjazdowych Dr Aleksandra Safianowska – a). Konsultacja przy oznaczaniu lekowraż liwoś ci szczepów Mycobacterium kansasii ; b). Współautorstwo publikacji i doniesień zjazdowych 3. 4. 5. Opis realizowanych prac** : W ramach zadania nr 2, zgodnie z Harmonogramem projektu, rozpoczę tego dn. 1. 10. 2014 r. i zakoń czonego dn. 31. 03. 2015 r. przeprowadzono typowanie genetyczne szczepów M. kansasii , w oparciu o dwa markery, tj. fragment genu 16S rRNA oraz niekodują cy region ITS (ang. internal transcribed spacer ) w obrę bie operonu rRNA. Na podstawie wytypowanych wcześniej (patrz Raport roczny za rok I ) sekwencji repetytywnych w genomie M. kansasii (MKANMIRU118 i MKANMIRU23) przeprowadzono typowanie genetyczne wybranej kolekcji szczepów M. kansasii . Ponadto, w ramach zadania nr 2, zgodnie z Harmonogramem projektu, rozpoczę to oznaczanie profilów lekowraż liwości szczepów M. kansasii , wg metody mikrorozcieńczeń . Zadanie*: nr 3 Nazwa zadania: Typowanie genetyczne szczepów M. kansasii (m. in. analiza PFGE, AFLP, MST, PCRRFLP, analiza sekwencyjna – czę ść III); opracowanie nowej metody genotypowania (analiza bioinformatyczna); analizy komparatystyczne i filogenetyczne; określenie pokrewień stw genetycznych mię dzy szczepami M. kansasii ; wykreś lenie struktury genetycznej badanej populacji M. kansasii Wykonawcy zadania (imię i nazwisko, pełniona funkcja osób w zespole badawczym biorą cych udział w realizacji zadania) : 1. Dr Tomasz Jagielski – a). Analiza sekwencyjna fragmentu genu tuf w wybranych szczepach Mycobacterium kansasii ; b). Optymalizacja typowania genetycznego prą tków Mycobacterium kansasii metodąPFGE; c). Nadzór merytoryczny nad wszystkimi etapami eksperymentalnymi projektu uruchomionymi i realizowanymi w ramach zadania nr 3; d). Organizacja i prowadzenie spotkańroboczych czł onków zespoł u badawczego; d). Współautorstwo publikacji i doniesień zjazdowych 2. Mgr Zofia Bakuł a – a). Typowanie testem GenoType Mycobacterium CM/AS szczepów klinicznych Mycobacterium kansasii izolowanych od polskich chorych; b). Współautorstwo publikacji i doniesień zjazdowych Mgr Izabela Szulc – a). Typowanie genetyczne szczepów Mycobacterium kansasii w oparciu o nowo zaprojektowane sekwencje starterowe MKANMIRU118 i MKANMIRU23; b). analizy bioinformatyczne sekwencji typu „shotgun”; c). Współ autorstwo doniesień zjazdowych Mgr Katarzyna Roeske – a). Typowanie testem GenoType Mycobacterium CM/AS szczepów klinicznych Mycobacterium kansasii otrzymanych z zagranicznych kolekcji kultur; b). Wykrywanie plazmid pMK12478 w szczepach Mycobacterium kansasii Mgr Małgorzata Proboszcz – a). Oznaczanie wraż liwoś ci szczepów Mycobacterium kansasii na wybrane leki p/prą tkowe; b). Współ autorstwo doniesień zjazdowych Dr Aleksandra Safianowska – a). Konsultacja przy oznaczaniu lekowraż liwoś ci szczepów Mycobacterium kansasii ; b). Współautorstwo publikacji i doniesień zjazdowych 3. 4. 5. 6. Strona 5 z 15 Program LIDER – IV konkurs Opis realizowanych prac** : W ramach zadania nr 3, zgodnie z Harmonogramem projektu, rozpoczę tego dn. 1. 04. 2015 r. i realizowanego do chwili obecnej, wykonano uzupełniają ce i koń cowe typowanie genetyczne szczepów M. kansasii przy uż yciu komercyjnego zestawu GenoType Mycobacterium CM/AS (Hain Lifescience). Kontynuowano też próby róż nicowania w obrę bie typów genetycznych M. kansasii za pomocąlokalizowania sekwencji repetytywnych MKANMIRU118 i MKANMIRU23. Ponadto, przeprowadzono analizę sekwencyjną fragmentu genu tuf dla wybranych szczepów M. kansasii i na podstawie otrzymanych wyników zaprojektowano nową metodę (PCRRFLP) identyfikacji typów genetycznych w obrę bie gatunku. Podjęto teżbadania w zakresie pozyskania sekwencji typu „shotgun” wybranych szczepów M. kansasii z uż yciem metody sekwencjonowania nowej generacji (platforma Illumina). Uzyskano sekwencje dla 18 szczepów M. kansasii , reprezentujących róż ne typy genetyczne i na podstawie tych sekwencji wykonano analizęzmiennoś ci genów konserwowanych w celu wykrycia potencjalnych markerów zróż nicowania w obrę bie typów genetycznych M. kansasii . Poszukując determinantów zmienności w szczepach klinicznych M. kansasii , przeprowadzono teżanalizęobecnoś ci plazmidu pMK12478. W trakcie realizacji zadania nr 3, ukoń czono takż e oznaczenie profilów lekowrażliwoś ci szczepów M. kansasii , wg metody mikrorozcień czeń. W koń cu, w ramach omawianego zadania rozpoczę to typowanie genetyczne szczepów M. kansasii metodą PFGE (przy użyciu nowo zakupionego zestawu do PFGE Mapper XA Chiller System, 240V (BioRad)). Zadanie*: nr 4 Nazwa zadania: Analiza profilów lekooporności (metoda pasków Etest); poszukiwanie genów zwią zanych z wirulencją M. kansasii (analiza bioinformatyczna) i identyfikacja takich genów wś ród szczepów M. kansasii (PCR sequencing) Wykonawcy zadania (imię i nazwisko, pełniona funkcja osób w zespole badawczym biorą cych udział w realizacji zadania) : 1. Dr Tomasz Jagielski – a). Nadzór merytoryczny nad wszystkimi etapami eksperymentalnymi projektu uruchomionymi i realizowanymi w ramach zadania nr 4; b). Organizacja i prowadzenie spotkańroboczych czł onków zespoł u badawczego; c). Współ autorstwo publikacji i doniesień zjazdowych 2. Mgr Zofia Bakuła – a). Określanie wartoś ci MIC wybranych leków p/prą tkowych dla szczepów Mycobacterium kansasii metodą Etest; b). Współautorstwo publikacji i doniesień zjazdowych Dr Aleksandra Safianowska – a). Konsultacja przy oznaczaniu lekowraż liwoś ci szczepów Mycobacterium kansasii ; b). Współautorstwo publikacji i doniesień zjazdowych 3. Opis realizowanych prac** : W ramach zadania nr 4, rozpoczętego dn. 01. 09. 2015 r., tj. z 3miesię cznym wyprzedzeniem w stosunku do Harmonogramu projektu (1. 12. 2015 r.) i realizowanego do chwili obecnej, wykonano pierwsze oznaczenia profilów lekowraż liwości szczepów M. kansasii , wg metody gradientowodyfuzyjnej (paski Etest). W ostatnich dniach sprawozdawanego okresu uruchomiono też analizy bioinformatycznej w celu wykrycia genów zwią zanych z wirulencją prą tków M. kansasii . Podsumowując, zadanie nr 2 został o zakoń czone zgodnie z Harmonogramem projektu. Podobnie, zgodnie z Harmonogramem projektu, przebiega realizacja prac badawczych uję tych w zadaniach nr 3 i 4. Przy tym, zadanie nr 4 rozpoczę to 3 miesiące wcześniej niż pierwotnie zakł adał to Harmonogram projektu. Poza tym, niewielkim odstę pstwem od przyję tego na począ tku planu realizacji projektu jest zamknię cie identyfikacji gatunkowej przy uż yciu komercyjnego zestawu GenoType Mycobacterium CM/AS (Hain Lifescience), a takż e oznaczeń profilów lekowraż liwoś ci M. kansasii , wg metody mikrorozcień czeń, w ramach zadania nr 3 (a nie – zadnia nr 2, jak na to wskazuje Harmonogram projektu). Na chwilę obecną nie ma zagrożenia dla terminowego ukoń czenia projektu (tj. do dn. 31. 03. 2017 r.). Tabelę należy wypełnić tylko dla zadań wykonywanych w bieżącym okresie sprawozdawczym. *Nr i nazwa zadania zgodne z harmonogramem stanowiącym załącznik nr 2 do umowy. ** Opis rezultatów osiągniętych w okresie sprawozdawczym lub działań wykonanych w tym okresie – w przypadku zadań, które nie zostały jeszcze zakończone. 6. SPRAWOZDANIE MERYTORYCZNE – PODSUMOWANIE OSIĄGNIĘTYCH WYNIKÓW Strona 6 z 15 Program LIDER – IV konkurs (nie więcej niż 10 str. A4) 6.1 Sumaryczny opis rezultatów osią gnię tych w Projekcie (w podziale na zadania) – od począ tku realizacji Projektu ZADANIE NR 2 Nazwa zadania: Identyfikacja gatunkowa; weryfikacja przynależ noś ci szczepów do gatunku M. kansasii (testy biochemiczne, HPLC, analiza PCRRFLP); typowanie genetyczne szczepów M. kansasii (analiza sekwencyjna – czę ś ć II); analiza profilów lekooporności (metoda mikrorozcieńczeń) Status zadania: zakończone / w trakcie realizacji (wybrać wł aś ciwe) Opis rezultatów: 1. TYPOWANIE GENETYCZNE SZCZEPÓW M. KANSASII (ANALIZA SEKWENCYJNA – CZĘŚĆ II) W poprzednim okresie sprawozdawczym (1. 04. – 31. 12. 2014 r.) przeprowadzono analizę sekwencyjną fragmentu genu hsp65 (644 pz), fragmentu genu rpoB (342 pz) oraz niekodują cego regionu ITS (ang. internal transcribed spacer ), w obrę bie operonu rRNA (436 pz) dla wybranych 15 szczepów M. kansasii reprezentują cych róż ne typy genetyczne i pochodzą cych z kolekcji Radboud University Nijmegen Medical Centre (patrz Raport roczny za rok I – Sprawozdanie merytoryczne – Zadanie nr 2 pkt 2 Tabela IV ). W okresie podlegają cym niniejszemu sprawozdaniu analiząsekwencyjnąw/w genetycznych loci postanowiono obją ćpozostał e szczepy M. kansasii , pochodzące od pojedynczych pacjentów (104). Wyniki analizy regionu ITS dla takich szczepów przedstawiono w Tab. I. Tabela I. Wyniki analizy sekwencyjnej regionu ITS dla 104 szczepów M. kansasii izolowanych od pojedynczych pacjentów. Liczba szczepów Podobieństwo [%] * sekwencji 97 100% ** 1 95% 3 3 <50% brak produktu Oceniane względem sekwencji regionu ITS szczepu ATCC 12478 (szczep referencyjny M. kansasii genotyp I); ** Szczep reprezentujący genotyp II; wszystkie pozostałe szczepy (103) zostały wcześniej oznaczone jako genotyp I. * Wszystkie szczepy M. kansasii genotypu I, dla których otrzymano produkt PCR (97/104; 93,3%), miał y identyczną sekwencję ITS. Wyją tek stanowił y 3 szczepy, dla których analiza sekwencyjna regionu ITS wykluczył a przynależ noś ćdo gatunku M. kansasii (wynik ten wskazuje na kontaminację próbek). Nie zidentyfikowano wystę powania typów poś rednich M. kansasii (moż liwoś ć taką daje wł aś nie analiza sekwencyjna regionu ITS [1]). Dla 15 szczepów M. kansasii genotypu I wykonano analizęsekwencyjnąfragmentu genu rpoB i fragmentu genu 16S rRNA. Podobnie jak w wypadku regionu ITS, nie zaobserwowano ż adnej zmiennoś ci sekwencyjnej w obu badanych loci. Na tej podstawie uznano, że nie będą one miały zastosowania jako markery zróż nicowania genetycznego w obrę bie typów M. kansasii i zaniechano dalszej analizy (dla pozostałych 89 szczepów). Wysokie (99%) podobień stwo sekwencji fragmentu genu 16S rRNA między poszczególnymi genotypami M. kansasii , wykluczył o uż ycie tego regionu równieżjako markera do identyfikacji do poziomu genotypów. Róż nice w sekwencjach regionu ITS mię dzy róż nymi genotypami M. kansasii starano się wykorzystać dla zaproponowania nowej metody wykrywania genotypów, podobnej do PCRRFLP dla genów hsp65 i rpoB . W tym celu, korzystają c z oprogramowania insilico.ehu.es ( http://insilico.ehu.es/restriction/compare_seq/ ; [2]) poszukiwano w sekwencjach ITS miejsc restrykcyjnych charakterystycznych dla poszczególnych typów genetycznych. Bez powodzenia. Strategia ta okazał a sięskuteczna dopiero w wypadku fragmentu genu tuf (patrz Zadanie nr 3 pkt 1). 2. ANALIZA PROFILÓW LEKOOPORNOŚCI (METODA MIKROROZCIEŃCZEŃ) Oznaczenia lekowrażliwości przeprowadzono dla 66 (37,9%) spoś ród 174 szczepów M. kansasii wytypowanych do badań, gdyż tylko taką liczbę (66) szczepów udało się rewitalizować . Szczepy te pochodził y od 47 (45,2%) pacjentów obję tych badaniem (por. Raport roczny za rok I – Sprawozdanie merytoryczne – Zadanie nr 1 pkt 1 ). Wyniki oznaczeńlekowraż liwoś ci, wg metody mikrorozcień czeń , omówiono razem z wynikami lekowraż liwoś ci, wg metody gradientowodyfuzyjnej (paski Etest) (patrz Zadanie nr 4 pkt 1). Strona 7 z 15 Program LIDER – IV konkurs ZADANIE NR 3 Nazwa zadania: Typowanie genetyczne szczepów M. kansasii (m. in. analiza PFGE, AFLP, MST, PCRRFLP, analiza sekwencyjna – częś ćIII); opracowanie nowej metody genotypowania (analiza bioinformatyczna); analizy komparatystyczne i filogenetyczne; okreś lenie pokrewieństw genetycznych między szczepami M. kansasii ; wykreś lenie struktury genetycznej badanej populacji M. kansasii Status zadania: zakoń czone / w trakcie realizacji (wybrać wł aś ciwe) Opis rezultatów: 1. TYPOWANIE GENETYCZNE SZCZEPÓW M. KANSASII (ANALIZA SEKWENCYJNA – CZĘŚĆ III) Poszukując nowych markerów zróżnicowania genetycznego M. kansasii , wytypowano, w toku analiz bioinformatycznych i przeglą du piś miennictwa gen tuf , kodują cy czynnik elongacji translacji EFTu. Badania innych autorów wskazywał y na przydatnoś ćanalizy sekwencyjnej tego genu w identyfikacji róż nych gatunków prą tków [3]. Do amplifikacji fragmentu genu tuf (740 pz) wykorzystano startery T1/T2 i protokółPCR wcześ niej opisane [3]. W pierwszej kolejnoś ci, analizie sekwencyjnej poddano 15 szczepów M. kansasii prezentujących róż ne typy genetyczne (por. Zadanie nr 2 pkt 1). Analizy bioinformatyczne wykazał y istotnązmiennoś ćsekwencji fragmentu genu tuf mię dzy róż nymi typami genetycznymi, przy jednoczesnej pełnej homologii w obrębie tych samych typów genetycznych. Liczba róż nic mię dzy sekwencjami genu tuf dla róż nych typów genetycznych wahała sięod 14 (typ II versus typ IV) do 46 (typ III versus typ VI) zmian nukleotydowych, przekł adają c się , odpowiednio, na 98% i 93% podobień stwa sekwencji. Odległości genetyczne mię dzy poszczególnymi typami genetycznymi M. kansasii (IVI), na podstawie analizy sekwencyjnej fragmentu genu tuf zilustrowano na drzewie filogenetycznym (Ryc. 1). Ryc. 1. Dendrogram ilustrujący odległoś ci genetyczne mię dzy badanymi szczepami M. kansasii należ ą cymi do różnych typów genetycznych (IVI), wyprowadzony na podstawie sekwencji fragmentu genu tuf . Na podstawie wyników analizy sekwencyjnej fragmentu genu tuf , zaprojektowano nowąmetodętypowania genetycznego M. kansasii . W metodzie tej, produkt amplifikacji (PCR) poddaje się analizie restrykcyjnej przy uż yciu pojedynczego enzymu MvaI. Enzym ten został wybrany spośród kilkuset innych, w toku symulowanych in silico restrykcji fragmentu genu tuf od róż nych typów genetycznych M. kansasii . Użycie enzymu MvaI dawał o najbardziej dyskryminatywne (charakterystyczne i ł atwo identyfikowane dla poszczególnych typów genetycznych M. kansasii ) wzory restrykcyjne (Tab. II). Tabela II. Profile restrykcyjne dla genotypów IVI M. kansasii , na podstawie PCRRFLP dla fragmentu genu tuf (MvaI). Ty p Długość fragmentów restrykcyjnych (MvaI) [pz] generowanych w analizie in silico oczekiwanych w ż elu agarozowym I II 321, 87, 84, 70, 69, 59, 51 321, 121, 87, 84, 69, 58 320, 90, 70, 60, 50 320, 120, 90, 70, 60 III 321, 171, 71, 69, 58, 51 320, 170, 70, 60, 50 IV 492, 72, 63, 58, 51, 6 490, 70, 60, 50 V VI 390, 171, 71, 57, 51 408, 120, 84, 72, 59 390, 170, 70, 60, 50 410, 120, 80, 70, 60 Strona 8 z 15 Program LIDER – IV konkurs ZaprojektowanąreakcjęPCRRFLP przeprowadzono dla pojedynczych szczepów M. kansasii reprezentują cych poszczególne genotypy (IVI) (Ryc. 2), a dalej także dla 80 szczepów klinicznych, wyizolowanych od pojedynczych pacjentów. Wyniki genotypowania był y całkowicie zbież ne z wynikami typowania metodą PCRRFLP dla genów hsp65 i rpoB oraz metodą analizy sekwencyjnej regionu ITS uzyskanymi wcześniej (Tabela III). Ryc. 2. Wyniki restrykcji enzymem MvaI sekwencji fragmentu genu tuf otrzymanych w wyniku amplifikacji (PCR) ze szczepów M. kansasii typu: I (ATCC12478), II (B11073207), III (1010001468), IV (1010001458), V (1010001454), VI (NLA001001166); wzorzec wielkości – GeneRuler LowRange DNA Ladder. Tabela III. Porównanie metod dotychczas stosowanych w genotypowaniu M. kansasii i nowo zaprojektowanej metody PCRRFLP dla genu tuf . Oznaczenie szczepu Liczba * szczepów Typ genetyczny ustalony metodą : sekwencjonowani PCRRFLP e hsp6 5 rpo B tu f ITS ATCC12478; ATCC25221; NLA001000927; NLA001000449; NLA00100521; 1010001495; POL19; POL1180 85 I I I I B11063838; B11073207 NLA0010011128; 1010001469; POL10 5 II II II II 1010001468 1 III III III III 1010001458 1 IV IV IV IV 1010001454; 1010001493 2 V V V V NLA001001166 1 VI VI VI VI Ogółem 95 szczepów; w puli tej – 15 szczepów udostępnionych przez Radboud University Nijmegen Medical Centre i 80 szczepów wyizolowanych od pacjentów z Polski . * 2. TYPOWANIE GENETYCZNE SZCZEPÓW M. KANSASII (ANALIZA SEKWENCYJNA – CZĘŚĆ III) – NEXT GENERATION SEQUENCING (NGS) W ramach zadania nr 3 rozpoczę to badania w zakresie pozyskania sekwencji typu „shotgun” dla wybranych szczepów M. kansasii przy uż yciu metody sekwencjonowania nowej generacji (platforma Illumina). Uzyskano sekwencje 18 szczepów M. kansasii , reprezentujących różne typy genetyczne (IVI). W oparciu o zebrane dane sekwencyjne wykonano analizęzmiennoś ci genów konserwowanych ( AroC, ArgH, cya, dnaN, thrA, sucA, rpoB, purH, purE, pta, murC, hisD, hemD ). Przeprowadzono analizę drzew filogenetycznych z wykorzystaniem algorytmu Neighbor Joining. Wytypowano szczególnie interesują ce geny (np. ArgH ) do dalszych analiz, mogą ce spełniać funkcję markerów zróżnicowania genetycznego w obrę bie poszczególnych genotypów M. kansasii . 3. TYPOWANIE GENETYCZNE SZCZEPÓW M. KANSASII (ANALIZA SEKWENCYJNA – CZĘŚĆ III) – DETEKCJA PLAZMIDU pMK12478 Strona 9 z 15 Program LIDER – IV konkurs W zwią zku z doniesieniami o zwią zku obecnoś ci plazmidu pMK12478 w szczepach M. kansasii z ich wirulencją [4,5], korzystając z wcześ niej opracowanego protokoł u [5], zbadano wystę powanie tego plazmidu we wszystkich szczepach obję tych badaniem (174), a takż e 15 szczepów pochodzących z kolekcji Radboud University Nijmegen Medical Centre. Wyniki pokazano w Tabeli IV. Spośród 174 badanych szczepów, plazmid pMK12478 wykryto w 34 (19,5%) szczepach, wyizolowanych od 25 (24%) pacjentów. Tabela IV. Obecnoś ć plazmidu pMK12478 w szczepach M. kansasii. Nr szczepu Genoty p ATCC12478 I pMK1247 8 + NLA00100521 I ATCC25221 I NLA001000927 I NLA001000449 Genoty p 1010001469 II pMK1247 8 + 1010001468 III + 1010001458 IV 1010001454 V I 1010001493 V + 1010001495 I NLA001001166 VI B11073207 II + POL1,810,206,31,403,46,512,603,130,145,155,1602,1645,170,1723 I + I II Oznaczenie szczepu B11063838 II POL27,119,2730,329,445,4750,539,64129,13144,14654,1569,16 3,1669,171,174 NLA001001112 8 II + POL10 4. TYPOWANIE GENETYCZNE SZCZEPÓW M. KANSASII – ANALIZA W OPARCIU O SEKWENCJE REPETYTYWNE MKANMIRU Na podstawie opracowanych uprzednio warunków amplifikacji krótkich tandemowych sekwencji powtórzonych zidentyfikowanych w genomie M. kansasii (MKANMIRU118, MKANMIRU23), zbadano ich obecnoś ćwś ród wybranych 12 szczepów M. kansasii (w tej liczbie – 7 szczepów genotypu I oraz 5 szczepów genotypu II). Wyniki typowania w oparciu o sekwencje MKANMIRU118,23 dla 7 szczepów M. kansasii genotypu I przedstawiono w Tab. V. Tabela V. Wyniki amplifikacji sekwencji MKANMIRU118 i MKANMIRU23 dla 7 szczepów M. kansasii (genotyp I). MKA NMI RU Wielkość produktu dla szczepu wzorc. [pz] Jednostka powtórzon a [pz] Liczba powtórze ń Sekwencj a flankując a [pz] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1216 987 1127 771 997 760 822 921 1126 56 68 62 77 57 56 55 57 54 11,9 6,7 6,7 4,5 5,9 6,3 5,8 5,1 5 10 11 12 893 871 934 54 55 57 13 650 14 15 AT CC 124 78 092 7 77 44 044 9 772 8 62 00 101 000 149 5 550 531 712 425 661 418 573 630 856 1272 987 1189 771 1100 760 822 921 ca . 850 1328 987 1189 771 1000 760 877 921 ca. 850 1328 987 1189 771 1000 760 767 921 ca. 850 1328 987 1189 771 1000 760 767 921 ca. 850 434 492 632 400 871 brak 400 871 brak 400 871 brak 52 5 390 400 871 ca . 550 1328 987 1189 771 1000 760 767 921 ca. 850 400 871 brak 1328 987 1189 771 brak 760 767 921 ca. 850 8,5 6,9 5,3 1328 987 1189 771 1000 760 767 921 ca. 850 400 871 brak 680 680 500 560 680 680 ca. 450 613 87 4,6 213 613 613 613 613 613 613 613 524 56 5,8 199 524 524 524 524 524 524 524 16 597 54 4,6 350 400 1200 1200 1200 1200 1200 1200 17 697 62 5 387 689 689 689 689 689 689 689 18 390 53 5,3 109 390 390 390 390 390 390 390 23 634 40 5,1 430 634 634 634 634 634 634 634 400 871 brak Ogólnie, wykazano niewielki potencjałróż nicują cy sekwencji MKANMIRU1, 5, 7, 12, 13 i 16 pomię dzy szczepami M. kansasii należ ącymi do I typu genetycznego i podobnie nieznacznązdolnoś ćdyskryminatywnąsekwencji MKANMIRU2, 7, 11, 13 i 16 wobec szczepów M. kansasii reprezentujących II typ genetyczny. Obecnie trwają poszukiwania kolejnych sekwencji repetytywnych, o wię kszej sile różnicującej w obrę bie poszczególnych genotypów M. kansasii . Strona 10 z 15 Program LIDER – IV konkurs 5. TYPOWANIE GENETYCZNE SZCZEPÓW M. KANSASII – ANALIZA PFGE Waż nym etapem badawczym podjętym w ramach zadania nr 3 był o wł ą czenie analizy PFGE (elektroforeza pulsacyjna w zmiennym polu elektrycznym; ang. pulsedfield gel electrophoresis ) dla oceny zróż nicowania wewną trzgatunkowego (na poziomie genotypów i szczepów) M. kansasii . Jak dowiedziono wcześ niej, metoda ta pozwala róż nicować szczepy M. kansasii w obrębie poszczególnych typów genetycznych [6,7]. Dotychczas udał o sięopracowaći wdroż yćprotokółanalizy PFGE, a takż e zoptymalizować większość warunków eksperymentalnych (m.in. otrzymanie hodowli szczepów M. kansasii o wł aś ciwej gę stoś ci optycznej, izolacja DNA w bloczkach agarozowych). Obecnie, procedura PFGE testowana jest dla róż nych grup szczepów M. kansasii . Istotnym elementem bę dzie zapewnienie powtarzalnoś ci wyników analizy. 6. TYPOWANIE GENETYCZNE SZCZEPÓW M. KANSASII – ANALIZA AFLP Z uwagi na znaczą co wyż szy, wobec pierwotnej oferty handlowej, koszt aparatury do PFGE i podroż enie odczynników, postanowiono wycofać z zadań badawczych analizę AFLP, której koszty odczynnikowe są takż e wysokie (optymalizacja i wdrożenie tej metody zwykle są czasochłonne, przez co koszty materiał owe mogł yby istotnie nadwyrę ż yć budż et projektu). ZADANIE NR 4 Nazwa zadania: Analiza profilów lekooporności (metoda pasków Etest); poszukiwanie genów zwią zanych z wirulencją M. kansasii (analiza bioinformatyczna) i identyfikacja takich genów wś ród szczepów M. kansasii (PCR sequencing) Status zadania: zakoń czone / w trakcie realizacji (wybrać wł aś ciwe) Opis rezultatów: 1. ANALIZA PROFILÓW LEKOOPORNOŚ CI (METODA PASKÓW ETEST) Kolejnym zadaniem badawczym projektu realizowanym w sprawozdawanym okresie był o oznaczenie profilów wraż liwoś ci szczepów M. kansasii na leki stosowane w terapii zakaż eńprą tkowych, w tym zakaż eńwywoł anych prą tkami M. kansasii . Ustalenie profilów lekowrażliwości M. kansasii prowadzono dwiema metodami – metodąrozcień czeniową(tzw. metodą proporcji), a takż e metodągradientowodyfuzyjną , przy uż yciu komercyjnie dostępnych, tzw. pasków Etest (Biomérieux). Plan doś wiadczalny projektu zakładałuż ycie nastę pują cych leków: ryfampicyny (RMP), izoniazydu (INH), etambutolu (EMB), streptomycyny (SM) – tzw. leki I. rzutu, a także etionamidu (ETH), amikacyny (AMK), klarytromycyny (CLR), ryfabutyny (RFB), ciprofloksacyny (CFX), klofazyminy (CFZ) i cykloseryny (CS) – tzw. leki II. rzutu. Z uwagi na wysokie koszty i ograniczoną dostę pność niektórych leków, a teżchcą c zapewnićmaksymalnąpowtarzalnoś ćwyników oznaczeńi ujednolicenie metodyki oznaczeń zdecydowano się wykonać je przede wszystkim przy uż yciu komercyjnie dostę pnych pasków Etest (Biomérieux). (Zaletą pasków Etest jest także możliwośćustalenia wartości minimalnego stę ż enia hamują cego (MIC, ang. minimal inhibitory concentration ) leku w trakcie jednego pasaż u, bez koniecznoś ci nastawiania szeregu stę ż eń , jak w metodzie rozcień czeń ). Uż ycie metody rozcień czeniowej (proporcji) ograniczono jedynie do zbadania wraż liwoś ci na dwa gł ówne leki p/prą tkowe, tj. RMP i INH. Ponadto, ze względu na utrudnionądostę pnośćRFB, CFX, CFZ i CS postanowiono pominą ć je w oznaczeniach, a w ich miejsce włą czyć moksyfloksacynę (MFX) i preparat złoż ony, tj. trimetoprim/sulfametoksazol (TMP/SMX). Ogółem, do badania lekowrażliwości M. kansasii , wł ą czono 66 szczepów (z ogólnej puli 174 szczepów), bo tyle zachował o ż ywotnoś ć po procesie rewitalizacji (por. Raport roczny za rok I – Sprawozdanie merytoryczne – Zadanie nr 1 pkt 1 ). Badanie lekowrażliwości metodąrozcień czeń (proporcji) wykonywano wg wytycznych Clinical and Laboratory Stadards Institute (CLSI) [8], zaś stosując metodę pasków Etest, postę powano ś ciś le wg zaleceń producenta. Jako szczepów kontrolnych używano szczepu M. tuberculosis H37Rv (metoda rozcień czeń ) i szczepu M. kansasii ATCC12478 (metoda Etest). W sprawozdawanym okresie wykonano oznaczenia wraż liwoś ci 66 szczepów M. kansasii na INH i RMP metodą rozcieńczeń oraz oznaczenia wrażliwości 42 szczepów M. kansasii na 5 leków (RMP, SM, CLM, MOX, TMP/SMX) metodą pasków Etest. Wyniki zestawiono w Tabeli VI. Tabela VI. Wrażliwość szczepów M. kansasii na wybrane leki p/prą tkowe w metodzie rozcień czeń i pasków Etest. Lek Wartoś ć * krytyczna [mg/L] Liczba szczepów opornych (%) Liczba szczepów wraż liwych (%) Ś rednia wartoś ć MIC MIC 50 MIC 90 0,008 1,5 0,064 0,023 4 0,094 <0,002 <0,002 Etest RMP SM CLM 1 10 16 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 42 (100%) 42 (100%) 42 (100%) MOX 2 0 (0%) 42 (100%) 0,011 ± 0,009 2,095 ± 1,5 0,075 ± 0,08 <0,002 ± 0,00015 Strona 11 z 15 Program LIDER – IV konkurs TMP/SMX 2/38 INH RMP 1 40 43 (100%) 0 (0%) >32/608 >32/60 8 >32/60 8 Metoda rozcień czeń (proporcji) 66 (100%) 0 (0%) 0 (0%) 66 (100%) nie dotyczy nie dotyczy Stężenia krytyczne leków w metodzie pasków Etest określone zostały wg wytycznych CLSI lub danych literaturowych [810]; stężenia krytyczne leków w metodzie proporcji były zgodne z wytycznymi CLSI [8]. * Wszystkie szczepy M. kansasii (66) były wraż liwe na RMP i oporne na INH w metodzie rozcień czeń (proporcji). W metodzie Etest, wszystkie badane szczepy (43) były wraż liwe na cztery leki (RMP, SM, CLM, MOX), przy jednoczesnej opornoś ci na TMP/SMX. Postę p przy realizacji projektu przedstawiono graficznie na Ryc. 3. RYC. 3. SCHEMAT ILUSTRUJĄ CY KLUCZOWE ETAPY PROJEKTU – POSTĘ P PRAC Strona 12 z 15 Program LIDER – IV konkurs PIŚ MIENNICTWO: Strona 13 z 15 Program LIDER – IV konkurs Iwamoto T., Saito H. Comparative study of two typing methods hsp65 PRA and ITS sequencing revealed a possible evolutionary link between Mycobacterium kansasii type I and II isolates. FEMS Microbiol. Lett. 254, 129133 (2005) 2. San Millán RM, et al. Online exercise for the design and simulation of PCR and PCRRFLP experiments. BMC Res. Notes 6, 513 (2003) 3. Mignard S, Flandrois JP. Identification of Mycobacterium using the EFTu encoding ( tuf ) gene and the tmRNA encoding ( ssrA ) gene. J. Med. Microbiol. 56, 10331041 (2007) 4. Wang J, et al. Insights on the emergence of Mycobacterium tuberculosis from the analysis of Mycobacterium kansasii . Genome Biol. Evol. 7, 856870 (2015) 5. Ummels R, et al. Identification of a novel conjugative plasmid in mycobacteria that requires both type IV and type VII secretion. MBio. 5, 0174401714 (2014) 6. Wallace RJ, et al. DNA large restriction fragment pattern of sporadic and epidemic nosocomial strains of Mycobacterium chelonae and Mycobacterium abscessus . J. Clin. Microbiol. 31, 26972701 (1993) 7. Kwenda G, et al. Molecular characterization of clinical and environmental isolates of Mycobacterium kansasii isolates from South African gold mines. J. Water Health. 3, 190202 (2015) 8. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Susceptibility testing of Mycobacteria, Nocardiae, and other aerobic Actinomycetes: Approved Standard – Second Edition. M242A (2011) 9. Gitti Z, et al. Clinical significance and antibiotic susceptibilities of nontuberculous mycobacteria from patients in Crete, Greece. Future Microbiol. 6, 10991109 (2011) 10. Nie W, et al. Species identification and clarithromycin susceptibility testing of 278 clinical nontuberculosis mycobacteria isolates. Biomed Res. Int. 2015, 506598 (2015) 1. 6.2 Spis publikacji powstał ych w ramach Projektu (tytuł , autorzy, wydawnictwo – nazwa, tom , rok) Prace oryginalne : 1. 2. Bakuł a, Z., Modrzejewska, M., Safianowska, A., van Ingen, J., Proboszcz, M., Bielecki, J., Jagielski, T. Proposal of a new method for subtyping of Mycobacterium kansasii based upon PCRrestriction enzyme analysis of the tuf gene. Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 2015. doi: 10.1016/j.diagmicrobio.2015.12.009. /Impact Factor = 2,457/. 2014 Bakuł a, Z., Safianowska, A., NowackaMazurek, M., Bielecki, J., Jagielski, T. Subtyping of Mycobacterium kansasii by PCRRestriction Enzyme Analysis of the hsp65 gene. Biomed Res. Int., 2013, 2013:178725. /Impact Factor = 1,579/. 2014 Prace poglądowe : Jagielski, T., Minias, A., van Ingen, J., Rastogi, N., Brzostek, A., Ż aczek, A., Dziadek, J. Molecular epidemiology of Mycobacterium tuberculosis and other mycobacteria: methodological and clinical aspects. Clin. Microbiol. Rev., 2016, 29(2), 239290. /Impact Factor = 17,406/. – Manuskrypt publikacji przyjęty do pisma dn. 29. 12. 2015 r. 2014 1. 6.3 Inne formy upowszechniania wyników badań (np. udział w konferencjach, sympozjach, wdroż enia), rok Udział w konferencjach : 1. 2. 3. Bakuł a, Z., Modrzejewska, M., Safianowska, A., Bielecki, J., Jagielski, T. Proposal of a new method for subtyping of Mycobacterium kansasii based upon PCRrestriction enzyme analysis of the tuf gene. Materiał y XVI. Konferencji pt.: «Molecular biology in diagnostics of infectious diseases and biotechnology – in memory of Professor Wł adysł aw J.H. KunickiGoldfinger», Warszawa, S.G.G.W., 2015, str. 35. Żaczek, A., Parniewski, P., Brzostek, A., SzulcKieł bik, I., Struś , K., Pociask, A., Jagielski, T., Dziadek, J. MIRUVNTR typing in epidemiological study of Mycobacterium kansasii . VII.P.18. Materiał y VI. Konferencji Weigl’a, Uniwersytet Gdański, Gdań sk, 2015, str. 157. Bakuł a, Z., Safianowska, A., Proboszcz, M., NowackaMazurek, M., Bielecki, J., Jagielski, T. Comparison of three PCRbased methods with highpressure liquid chromatography (HPLC) analysis for the identification of Mycobacterium kansasii clinical isolates. Proceedings of the 25th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Copenhagen, 2015, P1204. 6.4 Informacja o patentach, zgł oszeniach patentowych, licencjach, czy wdroż eniach bę dą cych wynikiem projektu, rok Brak 6.5 Informacja o dział aniach promocyjnych zgodnie z umową na wykonanie projektu (dotyczy: informowania opinii publicznej o tym, ż e realizacja Projektu został a sfinansowana przez Centrum – podać datę i miejsce zamieszczenia informacji, sposób informowania) Strona 14 z 15 Program LIDER – IV konkurs Informacja na stronie Zakładu Mikrobiologii Stosowanej, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski: http://zms.biol.uw.edu.pl/projektybadawcze/ Witryna internetowa dedykowana projektowi: http://zms.biol.uw.edu.pl/LIDER/ 7. ZGODNOŚĆ POSTĘPÓW W REALIZACJI PROJEKTU Z OPISEM PROJEKTU, HARMONOGRAMEM I KOSZTORYSEM PRAC, STANOWIĄCYMI ZAŁĄCZNIKI DO UMOWY ☒ TAK ☐ NIE Czy postę p i zakres prac są zgodne z umową ? Jeś li zaznaczono NIE , tzn. w cią gu okresu sprawozdawczego nastą pił y odstę pstwa od ustaleń rzeczowych/czasowych/finansowych zawartych w umowie, należ y poniż ej wskazać , jakie są to odstę pstwa (i jakich zadań dotyczą ), podać ich przyczyny, wymienić podję te lub planowane dział ania naprawcze, okreś lić wpł yw na dalsze prowadzenie projektu i osią gnię cie planowanych rezultatów. Zadanie nr … Nazwa zadania …. Odstępstwo: …. Przyczyna: …. Działania naprawcze:…….. Wpływ na rezultaty Projektu:……. Zadanie nr …….. …………. 8. CZY DALSZE PROWADZENIE PRAC PROWADZI DO OSIĄGNIĘCIA ZAKŁADANYCH WYNIKÓW? ☒ Tak ☐ Nie 9. PODPISY I PIECZĘCIE Data i podpis Kierownika Projektu Podpis i pieczę ć sł uż bowa osoby odpowiedzialnej ze strony Jednostki za czę ś ć finansową raportu Pieczę ć Jednostki 10. POTWIERDZENIE ZŁOŻENIA RAPORTU wypełnia NCBR Data zł oż enia raportu Imię i nazwisko pracownika NCBR Podpis Strona 15 z 15
