Oznaczanie aktywności proteolitycznej trypsyny Zajęcia 3

Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie.
Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.
Oznaczanie aktywności proteolitycznej trypsyny
Zajęcia 3-godzinne – część A, zajęcia 4-godzinne – część A i B
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z metodą oznaczania aktywności endopeptydaz na przykładzie trypsyny. Na zajęciach 3-godzinnych studenci oznaczają aktywność trypsyny wobec kazeiny,
na ćwiczeniach 4-godzinnych porównują aktywność tego enzymu wobec dwóch białek substratowych różniących się zarówno zawartością kluczowych dla oznaczenia aminokwasów, jak i dostępnością hydrolizowanych przez enzym wiązań.
Wprowadzenie
Peptydazy (hydrolazy peptydowe EC 3.4.) to enzymy, które rozrywają, przy udziale cząsteczki
wody, wiązania peptydowe łączące aminokwasy w peptydach i białkach. Reakcja hydrolizy wiązania
peptydowego prowadzi do odtworzenia grupy α-karboksylowej jednego, i grupy α-aminowej drugiego aminokwasu. W zależności od położenia hydrolizowanego wiązania wyróżnia się endopeptydazy
(proteinazy), które rozszczepiają wiązania peptydowe położone w pewnej odległości od końca łańcucha oraz egzopeptydazy hydrolizujące wiązania peptydowe położone skrajnie. Egzopeptydazy działające przy C-końcu peptydu nazywane są karboksypeptydazami, zaś te, które odszczepiają aminokwas N-końcowy – aminopeptydazami. Znane są także omega peptydazy rozrywające wiązania peptydowe, którymi przyłączone są potranslacyjnie zmodyfikowane aminokwasy położone zarówno
przy N-, jak i C- końcu peptydu.
Na podstawie mechanizmu katalizy endopeptydazy podzielono na następujące podpodklasy:
serynowe (EC 3.4.21), cysteinowe (EC 3.4.22), aspartylowe (EC 3.4.23), treoninowe (EC 3.4.25),
metaloproteinazy (EC 3.4.24) oraz proteinazy o nieznanym mechanizmie katalizy (EC 3.4.99).
Ze względu na miejsce działania, peptydazy dzieli się także na wewnątrzkomórkowe (lizosomalne/wakuolarne i cytozolowe) oraz pozakomórkowe (peptydazy wydzielane przez komórki bakteryjne oraz zwierzęce peptydazy trawienne wydzielane do przewodu pokarmowego).
Biologiczna rola peptydaz pozakomórkowych działających w przewodzie pokarmowym zwierząt polega na wstępnej hydrolizie białek pokarmowych. Do tej grupy enzymów zalicza się: pepsynę,
chymozynę, trypsynę, chymotrypsynę, karboksypeptydazę A i elastazę.
Endopeptydazy charakteryzują się niską specyficznością substratową, wykazują jednak preferencje wobec charakteru łańcuchów bocznych aminokwasów tworzących rozkładane wiązanie peptydowe. Przykładowo chymotrypsyna hydrolizuje wiązania peptydowe powstałe z udziałem grupy karboksylowej aminokwasów aromatycznych (fenyloalanina, tyrozyna, tryptofan) lub aminokwasów o
dużych, hydrofobowych łańcuchach bocznych np. metionina czy leucyna. Elastaza natomiast rozszczepia wiązania peptydowe utworzone przez aminokwasy o niewielkich, pozbawionych ładunku łańcuchach bocznych. Z kolei pepsyna wykazuje aktywność wobec wiązań peptydowych utworzonych z
udziałem grupy aminowej aminokwasów aromatycznych i kwaśnych oraz między waliną
i leucyną (Bańkowski 2006). Stąd też aktywność konkretnej endopeptydazy wobec konkretnego białka substratowego uwarunkowana jest zarówno składem aminokwasowym, jak i przestrzenną strukturą tego białka. Struktura ta może w sposób znaczący utrudniać działanie enzymów proteolitycznych.
Dostępność wiązań peptydowych w białku substratowym zwiększyć można przez jego częściową lub
całkowitą denaturację, dlatego niektóre produkty spożywcze będące doskonałym źródłem pełnowartościowych białek poddaje się obróbce termicznej przed spożyciem. Ponadto termiczna denaturacja
prowadzi do inaktywacji białkowych inhibitorów endopeptydaz towarzyszących białkom roślinnym,
szczególnie tym zgromadzonym w nasionach roślin strączkowych, w celu ochrony przed peptydazami trawiennymi szkodników magazynowych.
1
Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie.
Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.
Peptydazy trawienne syntetyzowane są w postaci nieaktywnych prekursorów ulegających aktywacji proteolitycznej najczęściej inicjowanej przez trypsynę.
Trypsyna (EC 3.4.21.4). Enzym ten, podobnie jak chymotrypsyna i elastaza, jest zaliczany do
podpodklasy proteinaz serynowych, których centrum aktywne tworzą łańcuchy boczne seryny, kwasu asparaginowego i histydyny. Trypsyna katalizuje hydrolizę wiązań peptydowych, w których grupy karbonylowe należą do argininy lub lizyny (rys. 1A).
+
H3 N
+
A)
Lys
CH
H
CH2 OH
C
C
Arg
er
HN
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
O
N
NH3
NH
CH
O
C
NH
O
Ser
CH
O
CH2
NH
CH2
CH
C
NH
O
CH2
S
B)
C
NH
trypsyna
CH C
HC
OH
CH3
Thr
Met
CH3
trypsyna
Ser – Ala – Asp – Gly – Lys – Met – Trp – Gly – Arg – Gly – Ala – Lys – Cys – Gly
trypsyna
Ser – Ala – Asp – Gly – Lys
Met – Trp – Gly – Arg
Gly – Ala – Lys – Cys – Gly
Rys. 1 Działanie trypsyny na białko: A) wiązania peptydowe hydrolizowane przez trypsynę, B) uwalnianie peptydów
różnej długości.
Produktem działania trypsyny na białko są peptydy o różnej długości łańcucha z resztą lizyny
lub argininy na C-końcu (Rys. 1B).
Trypsyna jest syntetyzowana przez komórki trzustki w postaci nieaktywnego prekursora (proenzymu) – trypsynogenu (pojedynczy łańcuch polipetydowy zawierający 247 reszt aminokwasowych), który ulega w jelicie cienkim aktywacji pod wpływem enterokinazy jelitowej (syn. enteropeptydaza). Proces aktywacji polega na odłączeniu sześcioaminokwasowego odcinka prekursorowego,
co powoduje zmiany konformacyjne prowadzące do uzyskania przez cząsteczkę właściwości katalitycznych. Zaktywowane w ten sposób cząsteczki trypsyny aktywują kolejne cząsteczki trypsynogenu
oraz prekursory innych peptydaz wydzielanych przez komórki trzustki do światła jelita cienkiego.
Optimum pH działania trypsyny zawiera się w granicach 7–9.
Ze względu na specyficzność działania, enzym ten jest stosowany do rozszczepiania białek na
peptydy przed ich sekwencjonowaniem metodą Edmana – metoda ta pozwala na poprawne ustalenie
sekwencji peptydów zbudowanych maksymalnie z 50 aminokwasów.
Metody oznaczania aktywności endopeptydaz bazują na fotometrycznym pomiarze ilości
peptydów (produktów reakcji) uwolnionych z substratu białkowego przez enzym. Pomiaru tego dokonuje się po usunięciu z mieszaniny poreakcyjnej, przez wirowanie lub sączenie, pozostałości substratu:
 bezpośrednio:
- wiązania peptydowe oraz pierścienie aromatyczne łańcuchów bocznych aminokwasów pochłaniają promieniowanie elektromagnetycznego o długości fali 280 nm
- produkty hydrolizy barwnych białek azowanych 1 pochłaniają promieniowanie elektromagnetycznego o długości fali 340 nm
1
białka poddane reakcji sprzęgania z diazowanym kwasem sulfanilowym podstawianym do reszt histydyny i tyrozyny
2
Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie.
Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.

pośrednio, po przeprowadzeniu reakcji zachodzącej pomiędzy łańcuchami bocznymi aminokwasów zawartych w uwolnionych peptydach a odczynnikami dającymi barwny produkt.
Zasada metody Ansona. Metoda ta polega na pomiarze ilości tyrozyny i tryptofanu zawartych
w peptydach uwolnionych przez enzym z substratu (np. kazeina, białka soi). Peptydy te, w odróżnieniu od białek, nie ulegają wytrąceniu pod wpływem 3% kwasu trichlorooctowego. Natomiast wytrącone kwasem białka usuwa się z mieszaniny przez wirowanie lub sączenie.
Enzymatyczną hydrolizę białka (substratu) prowadzi się w pH 8,6 i temp. 37°C. Oznaczenie
zawartości tyrozyny i tryptofanu w uwolnionych przez enzym peptydach wykonuje się przy użyciu
odczynnika Folina. Końcowa barwa, której natężenie jest wprost proporcjonalne do ilości tyrozyny
i tryptofanu w próbie, jest wynikiem redukcji odczynnika fosforomolibdenofosforowolframowego
(odczynnik Folina) w środowisku zasadowym do błękitu fosforomolibdenowego, zachodzącej pod
wpływem wymienionych aminokwasów. Stężenie barwnego produktu w próbie oznacza się mierząc
pochłanianie (absorbancję) promieniowania świetlnego o długości fali 670 nm.
Miarą aktywności trypsyny będzie ilość μmoli tyrozyny zawarta w uwolnionych peptydach.
Odczynniki
1.
2.
3.
4.
5.
6.
0,1 M bufor Tris–HCl o pH 8,6
1% roztwór kazeiny w 0,1 M buforze Tris-HCl o pH 8,6
1% roztwór denaturowanych białek soi w 0,1 M buforze Tris-HCl o pH 8,6
Odczynnik Folina (Ciocalteu)
0,5 M NaOH
7,5 % TCA
Wykonanie
A. Oznaczenie aktywności kazeinolitycznej trypsyny
1. Hydroliza enzymatyczna kazeiny.
Otrzymany w kolbie miarowej na 10 ml roztwór trypsyny (zadanie kontrolne) dopełnić do kreski 0,1 M buforem Tris-HCl (1) i dobrze wymieszać. Do trzech enzymatycznie czystych probówek
(dwie próby pełne i jedna materiałowa) odmierzyć po 2 ml roztworu kazeiny (2) i umieścić je w łaźni wodnej w temp. 37°C. Po około 5 minutach do dwóch probówek z kazeiną (próby pełne), nie wyjmując ich z łaźni wodnej, dodać po 1 ml enzymu z kolby z zadaniem kontrolnym, szybko wymieszać
i inkubować wszystkie trzy próbyw temp. 37°C dokładnie przez 15 minut. Następnie do wszystkich
trzech prób dodać po 2 ml TCA (6), wyjąć probówki z łaźni wodnej i do próby materiałowej dodać
1 ml enzymu z kolby z zadaniem kontrolnym. Wszystkie trzy próby wymieszać i pozostawić przez
30 minut w temperaturze pokojowej w celu całkowitego wytrącenia osadu białka. Po tym czasie próby przesączyć do czystych probówek przez sączki bibułowe.
2. Fotometryczne oznaczanie tyrozyny w produktach hydrolizy enzymatycznej
W celu oznaczenia ilości tyrozyny w produktach hydrolizy enzymatycznej należy do kolejnych
trzech czystych probówek odmierzyć po 1 ml klarownego przesączu z dwóch prób pełnych i z próby
materiałowej. Do wszystkich trzech probówek dodać po 2 ml 0,5 M NaOH (5) oraz po 0,6 ml odczynnika Folina (4) - zawartość probówek dobrze wymieszać. Po 10 minutach odczytać absorbancję
3
Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie.
Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.
prób pełnych i materiałowej w fotometrze przy długości fali 670 nm ustawionym na zero wobec
wody destylowanej.
B. Oznaczenie aktywności trypsyny wobec białek soi.
Oznaczenie wykonać wg opisu zamieszczonego w punkcie A stosując w miejsce roztworu
kazeiny (2) roztwór denaturowanych białek soi (3)
Obliczenie aktywności trypsyny
1. Obliczyć średnią wartość absorbancji prób pełnych.
2. Obliczyć różnicę średniej absorbancji prób pełnych i próby materiałowej.
3. Posługując się obliczoną różnicą absorbancji odczytać z krzywej wzorcowej ilość μmoli tyrozyny
zawartej w 1 ml przesączu.
4. Obliczyć aktywność enzymu w μmolach tyrozyny zawartej w peptydach uwolnionych w warunkach metody w ciągu 1 min przez 1 mg trypsyny [μmole tyrozyny × min.-1 × mg-1 trypsyny]
uwzględniając:
a. schemat rozcieńczeń trypsyny podany przez prowadzącego zajęcia
b. czas trwania enzymatycznej hydrolizy substratu.
Przykładowe obliczenia:
Absorbancja Absorbancja Średnia ab- Absorbancja
Różnica
próby
próby
sorbancji
próby
absorbancji
pełnej nr 1
pełnej nr 2
prób
materiałopełnych
wej
0,212
0,218
0,215
0,030
0,185
Ilość µmoli tyrozyny
odczytana z krzywej
wzorcowej dla
różnicy absorbancji
0,2
Różnica absorbancji wynosi 0,185, czyli w 1 ml przesączu znajduje się 0,2 µmola tyrozyny. Ponieważ do reakcji barwnej pobrano 1 ml z 5 ml przesączu, ilość tyrozyny zawartej w peptydach uwolnionych z substratu przez 1 ml trypsyny wynosi 1 µmol. Aktywność trypsyny, zawartej w 10 ml roztworu, jest więc równa 10 µmolom tyrozyny. Wiedząc, że przed uzupełnieniem do objętości 10 ml
kolbka zawierała 2 ml roztworu trypsyny przygotowanego przez rozpuszczenie 7 mg tego enzymu
w 40 ml buforu możemy obliczyć aktywność trypsyny w następujący sposób:
• aktywność 2 ml wyjściowego roztworu trypsyny wynosi 10 µmoli tyrozyny
• aktywność 7 mg trypsyny jest równa 200 µmoli tyrozyny
• aktywność 1 mg trypsyny wynosi 28,57 µmoli tyrozyny, a po uwzględnieniu czasu trwania
reakcji enzymatycznej wynoszącego 15 minut, aktywność ta będzie równa 1,91 µmola tyrozyny × min.-1 × mg-1 trypsyny
Pytania
1. Jakie kryteria podziału stosuje się wobec peptydaz?
2. Czym różnią się karboksypeptydazy od aminopeptydaz? Przedstaw wzór dowolnego tripeptydu i wskaż wiązanie peptydowe, które może zhydrolizować aminopeptydaza?
3. Wymień endopeptydazy działające w przewodzie pokarmowym i krótko je scharakteryzuj.
4. Podaj miejsce syntezy trypsynogenu i omów jego aktywację.
5. Jaką rolę w aktywacji trypsynogenu pełni enterokinaza?
6. Jakie praktyczne zastosowanie znalazła trypsyna w badaniach biochemicznych?
4
Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie.
Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.
7. Omów metodę oznaczania aktywności trypsyny na ćwiczeniu. Jaką rolę spełnia w tej metodzie kwas trichlorooctowy (TCA)?
8. Przedstaw, używając trzyliterowych skrótów nazw aminokwasów, fragment łańcucha polipeptydowego i wskaż miejsce działania trypsyny.
Literatura
1. Anson, M.L. (1938) J. Gen. Physiol. 22, 79-89.
2. Chen J-M., Kurko Z., Le Marechal C., Toth C., Tsakiris L., Raguenes O., Ferec C., Sahin-Toth M. (2003) Mol. Biol. Evol. 20(11), 1767-1777
3. Bańkowski E., Biochemia, MedPharm Polska, Wrocław 2006
5