oznaczanie alkalicznej fosfatazy

FAKULTET - FIZJOLOGIA BAKTERII
Koordynator - dr hab. Magdalena Popowska, prof. UW
ĆWICZENIE: OZNACZANIE ALKALICZNEJ FOSFATAZY
Autor i główny prowadzący dr hab. Magdalena Popowska, prof. UW
Asysta: mgr Marta Piotrowska, mgr Rafał Ostrowski
Wstęp teoretyczny
Fosfatazy należą do enzymów z klasy hydrolaz i podklasy esteraz. Katalizują rozkład estrów
fosforanowych. Do tej grupy enzymów zaliczamy: fosfomonoesterazy, fosfodiesterazy oraz
polifosfatazy, zależnie od typu rozkładanego estru. Najliczniejszą grupę stanowią
fosfomonoesterazy, które dzieli się na: kwaśne (optimum działania w pH-5) oraz zasadowe
(optimum działania w pH - 7-8).
Alkaliczna fosfataza
Jej rola polega głównie na katalizowaniu defosforylacji różnych estrów fosforanowych, w
trakcie reakcji enzymatycznej uwalniane są fosforany. Optymalnie działa w środowisku
zasadowym. Synteza tego enzymu jest indukowana brakiem fosforanów w podłożu.
Przestrzeń peryplazmatyczna u bakterii gramujemnych
Przestrzenią peryplazmatyczną nazywamy obszar pomiędzy błoną cytoplazmatyczną a
peptydoglikanem. Jest to miejsce, w którym występują liczne białka, w tym enzymatyczne,
oraz oligosacharydy, przebiega tu wiele reakcji biochemicznych.
Ze względu na pełnione funkcje, białka peryplazmatyczne można podzielić na 3 grupy:
1. Białka chroniące komórkę przed szkodliwymi czynnikami zewnętrznymi - do tej grupy
należą m.in. enzymy degradujace antybiotyki beta-laktamowe i aminoglikozydowe.
2. Białka degradujące duże i trudno przechodzące przez błonę cytoplazmatyczną cząsteczki
do produktów mniejszych, łatwiej przedostających się do cytoplazmy. Typowe enzymy tej
grupy to: -amylaza degradująca amylozę i dekstryny do glukozy, fosfodiesteraza, fosfataza,
nukleotydaza, karboksypeptydaza i inne.
3. Białka uczestniczące w transporcie do wnętrza komórki takich składników odżywczych
jak: cukry, pepetydy, witaminy i jony nieorganiczne. niektóre białka z tej grupy pełnią
również funkcje receptorowe w procesach chemotaksji.
Metody uwalniania białek peryplazmatycznych
Białka peryplazmy mogą zostać uwolnione z komórki metodą szoku osmotycznego, przez
wytrząsanie z chloroformem oraz, z niektórych bakterii gramujemnych, przez cykl
zamrażania i rozmrażania w ściśle określonych warunkach zmiany temperatury. Metodą
bezpośrednią, uwalniającą wszystkie białka z przestrzeni peryplazmatycznej, jest
sferoplastyzacja w obecności lizozymu i EDTA. Alkaliczna fosfataza Pseudomonas
aeruginosa i niektóre enzymy Escherichia coli są łatwo uwalniane z peryplazmy przez
przemycie komórek roztworem chlorku magnezu lub odpowiednimi buforami.
Metoda szoku osmotycznego - zasada działania
Komórki zawieszone w stężonym roztworze sacharozy z dodatkiem EDTA należy szybko
przenieść do środowiska o niskiej sile osmotycznej (zmiana środowiska z hipertonicznego na
hipotoniczny). Zmiany te powodują nacisk błony cytoplazmatycznej w kierunku błony
zewnętrznej i uwolnienie białek peryplazmy do środowiska. Nie jest to metoda skuteczna w
przypadku izolacji niektórych białek, np. peryplazmatycznej -laktamazy i innych białek
15
wielkocząsteczkowych. Wadą tej metody jest uwalnianie niektórych białek błony
cytoplazmatycznej, co stanowi zanieczyszczenie frakcji peryplazmatycznej.
peryplazma
cytoplazma
błona
cytolazmatyczna
ściana
komórkowa
+ 20% sacharoza + 20 MM EDTA
peryplazma
błona
cytolazmatyczna
H20
ściana
komórkowa
cytoplazma
+ H2 0
peryplazma
cytoplazma
błona
cytolazmatyczna
ściana
komórkowa
Celem tego ćwiczenia jest indukcja i izolacja, metodą szoku osmotycznego, alkalicznej
fosfatazy z komórek E. coli oraz oznaczenie aktywności tego enzymu.
Wykonanie ćwiczenia
1. Przygotować hodowlę logarytmiczną (inoculum 1:20, 50 ml), A600 – 0,8, Escherichia
coli na podłożu:
- niskofosforanowym (skład poniżej)
- Davisa uzupełnionym glukozą
2. Hodowle (4 x 2 ml) odwirować (12 tys. rpm, 5 min) w probówkach typu Eppendofr z
wykorzystaniem mikrowirówki typu Eppendorf.
3. Osad ze wszystkich probówek zawiesić w 1 ml buforu: 50 mM Tris/HCl o pH 7,4,
zawierającego 30 mM NaCl i przenieść do jednej probówki typu Eppendorf, a
następnie ponownie odwirować jw.
4. Po odwirowaniu osad zawiesić w 0,3 ml buforu: 50 mM Tris/HCl o pH=7,4,
zawierającego 20% sacharozę, następnie dodać 50 l 20 mM EDTA o pH=8,0.
5. Próby wytrząsać na worteksie ok. 5-10 min.
6. Odwirować jw.
16
7. Osad zawiesić w 0,5 ml zimnej! wody destylowanej i ponownie wytrząsać na
worteksie ok. 5-10 min.
8. Odwirować jw.
9. Supernatant jest źródłem enzymów – m.in. alkalicznej fosfatazy
WYKONANIE OZNACZENIA
Próba badana:
Zmieszać 0,5 ml supernatantu i 0,5 ml substratu dla alkalicznej fosfatazy (fosforan pnitrofenolu*). Próbę inkubować 5-20 min w temp. 37oC.
Kontrola:
Zamiast 0,5 ml supernatantu dodać wodę destylowaną lub bufor
Wynikiem dodatnim jest pojawienie się żółtego zabarwienia (nitrofenol), które świadczy
o odszczepieniu grupy fosforanowej od fosforanu p-nitrofenolu w wyniku aktywności
alkalicznej fosfatazy.
*UWAGA! Roztwór (0,01 M) fosforanu p-nitrofenolu należy przygotować bezpośrednio
przed ćwiczeniami z wykorzystaniem 0,04 M buforu glicynowego o pH=10,5.
Skład podłoża niskofosforanowego, pH=7,4:
Tris
NaCl
KCl
Na2SO4
MgCl2
CaCl2
Bacto-peptone
Woda dest.
14,53 g
4,67 g
1,49 g
0,425 g
0,2 g
0,01 g
5,0 g
- do 1000 ml
Literatura uzupełniająca:
1.Wykłady z Fizjologii Bakterii. Popowska M., Korsak D.
2.Biologia molekularna bakterii pod redakcją Baj J., Markiewicz Z., PWN 2006, 2015
(nowe wydanie)
3. Struktura i funkcje osłon bakteryjnych. Markiewicz Z., PWN 1993
4. Markiewicz Z., Popowska M. 2011. An Update on Some Structural Aspects of the
Mighty Miniwall Pol. J. Microbiol. 60(3):181-186
17