Czwartorzędowe sole amoniowe kryptando

Nr wniosku: 201809, nr raportu: 12798. Kierownik (z rap.): dr Remigiusz Marcin Bąchor
W ramach realizacji projektu „Czwartorzędowe sole amoniowe kryptando-peptydów. Synteza
i właściwości chemiczne” opracowano wydają metodę syntezy peptydów koniugowanych z kryptandami
przez utworzenie czwartorzędowej soli amoniowej (kryptando-peptydów), na nośniku stałym.
Zaproponowana reakcja obejmuje przekształcenie wolnej grupy aminowej peptydu osadzonego na nośniku
stałym w pochodną jodoacetylowaną, której dalsza reakcja z trzeciorzędową aminą kryptandową pozwala
uzyskać czwartorzędowy koniugat kryptando-peptydu. Tak otrzymany związek może następnie zostać
uwolniony z nośnika stałego z zastosowaniem standardowych metod (roztwór kwasu trifluorooctowego).
W przeprowadzonych eksperymentach zastosowano trzy różne aminy kryptandowe: 4,7,13,18-tetraoksa1,10-diazabicyklo[8.5.5]eikozan (kryptand 211), 4,7,13,16,21-pentaoksa-1,10-diazabicyklo[8.8.5]trikozan
(kryptand 221) oraz 4,7,13,16,21,24-heksaoksa-1,10-diazabicyklo[8.8.8]heksakozan (kryptand 222). Takie
zróżnicowanie miało na celu umożliwienie określenia wpływu budowy uzyskanego znacznika jonizacyjnego
na fragmentację uzyskanych koniugatów w eksperymencie ESI-MS/MS i zdolności do oddziaływania
z wybranymi anionami. Określona została minimalna ilości czwartorzędowych koniugatów kryptandopeptydów, przy których możliwe jest przeprowadzenie wiarygodnej analizy ESI-MS tej nowej klasy
związków. Wyniki przeprowadzonych analiz dla modelowego związku wskazują, że możliwe jest
wykonanie analizy ESI-MS dysponując około 100 fmol koniugatu.
Podczas eksperymentów ESI-MS zauważono, że uzyskane koniugaty kryptando-peptydów mogą
w środowisku kwaśnym ulegać dodatkowej protonacji pomimo braku dodatkowych miejsc protonacji (grup
o charakterze zasadowym) w łańcuchu peptydowym. Można podejrzewać, że protonacja ta następuje w
obrębie cząsteczki kryptandu obejmując trzeciorzędowy atomu azotu lub eterowe atomy tlenu. Jako ciekawą
należy uznać informację, że intensywność piku charakteryzującego jon o ładunku +1 była największa dla
koniugatu peptydu z kryptandem 211, a najmniejsza dla koniugatu z kryptandem 222, co może sugerować
łatwiejszą protonację w obrębie cząsteczki większego kryptandu 222, w którym odległość między dwoma
ładunkami dodatnimi (uprotonowanego i czwartorzędowego atomu azotu) jest większa.
Przeprowadzona analiza ESI-MS/MS zarówno dla jonów M+ oraz [M+H]2+ uzyskanych koniugatów
wykazała obecność serii fragmentów końca N peptydu (a, b), dzięki którym można przeprowadzić analizy
sekwencyjne badanych związków. W toku przeprowadzonych analiz odkryto, że zaproponowany
kryptandowy znacznik jonizacyjny jest pierwszym, który w warunkach fragmentacji indukowanej kolizją
ulega dysocjacji. Może ona przebiegać z odłączeniem fragmentów C2H4O oraz C4H8O2 pochodzących z
aminy kryptandowej. Dodatkowo na uzyskanych widmach ESI-MS/MS zaobserwowano obecność sygnałów
odpowiadających uprotonowanej formie aminy kryptandowej, co może sugerować jej eliminację z cząsteczki
koniugatu na drodze mechanizmu nieopisanego jeszcze w literaturze naukowej. W ramach badań nad
mechanizmami fragmentacji zaproponowanej klasy koniugatów peptydowych niezawierających mobilnych
protonów, odkryto katalizowaną przez N,N,N-trietyloaminę wymianę izotopową wodór deuter, przebiegającą
na atomie węgla α reszt N-metyloglicyny (sarkozyny). Zauważono także, że w tych samych warunkach
wymianie izotopowej H/D ulegają atomy wodoru przy węglu α sąsiadującym z czwartorzędowym atomem
azotu. W ramach przeprowadzonych eksperymentów LC-MS wykazano, że wprowadzone deuterony nie
ulegają wymianie zwrotnej na protony w środowisku kwaśnym i obojętnym a dodatkowo odkryto koelucję
deuterowanych i niedeuterowanych na atomie węgla α izotopologów tych koniugatów. Stwarza to
możliwość zastosowanie takiej wymiany izotopowej w analizie ilościowej tej klasy związków chemicznych.
Przeprowadzona została także analiza zdolności czwartorzędowych koniugatów kryptando-peptydów
do wiązania kationów i anionów. Wyniki eksperymentów wskazują, że modelowy koniugat peptydu
z kryptandem 222 jest zdolny do wiązania anionu SO42-, co potwierdzono za pomocą analizy ESI-MS. W
obecności siarczanu (VI) miedzi (II) nastąpiły wyraźne zmiany w charakterze widma masowego polegające
na zmniejszeniu intensywności sygnału dla jonu M+, podczas gdy nie zaobserwowano żadnych zmian w
intensywności sygnału charakteryzującego jon [M+H]2+. Może to sugerować, że przyłączenie dodatkowego
protonu, które powinno nastąpić w obrębie fragmentu kryptandowego, może prowadzić do zmian
konformacyjnych, które uniemożliwiają oddziaływanie z anionem.
Wyniki przeprowadzonych badań nad syntezą i fragmentacją CID nowej klasy związków
chemicznych, jakimi niewątpliwie są czwartorzędowe koniugaty kryptando-peptydów sugerują, że mogą one
stanowić bardzo interesujący obiekt dalszych analiz. Przeprowadzone badania zwiększyły dotychczasowy
stan wiedzy z zakresu derywatyzacji peptydów za pomocą znaczników jonizacyjnych. Odkrycia i wnioski
płynące z eksperymentów ESI-MS pozwoliły poszerzyć dotychczasową wiedzą z zakresu ścieżek i
mechanizmów fragmentacji w eksperymentach ESI-MS/MS. Związki te mogłyby znaleźć zastosowanie jako
nowej klasy znaczniki jonizacyjne, o potencjalnym zastosowaniu w spektrometrii mas. Obiecującą cechą
czwartorzędowych soli amoniowych kryptando-peptydów jest ich spodziewana zdolność do oddziaływania z
różnymi ligandami, w tym z anionami. Można przypuszczać, że opracowana wydajna metoda syntezy
czwartorzędowych kryptando-peptydów spotka się z dużym zainteresowaniem środowiska naukowego,
poszukującego nowych znaczników jonizacyjnych czy syntetycznych receptorów bioanionów.