Wpływ hialuronianu na funkcje transportowe otrzewnej in vitro

PRACE
ORYGINALNE
Wp³yw hialuronianu na funkcje transportowe
otrzewnej in vitro: analizy porównawcze
Teresa GRZELAK
Beata SZARY
Czynniki cytoprotekcyjne mog¹ zmieniaæ strukturê otrzewnej i w³aœciwoœci
transportowe b³ony. Celem analiz by³o porównanie transportu mocznika (0,02
g/dl), kreatyniny (0,1 g/dl), kwasu moczowego (0,02 g/dl), insuliny (0,1 g/dl), ikodekstryny (7,5 g/dl) oraz albuminy (1 g/dl) w warunkach kontrolnych i po wprowadzeniu hialuronianu (0,4 g/dl). Eksperymenty przeprowadzono z zastosowaniem otrzewnej œciennej królika, zmodyfikowanej komory Ussinga i matematycznego modelu transportu masy. Wielkoœci transferu, skierowanego ze œródmi¹¿szowej do mezotelialnej strony b³ony (I®M) oraz w kierunku przeciwnym
(M®I) wyra¿ano jako wspó³czynniki przepuszczalnoœci dyfuzyjnej P [cm/s]. W
przypadku ka¿dej moleku³y wykonano dwie odrêbne serie badawcze. W pierwszej z nich analizowano dwukierunkowy transport w warunkach kontrolnych
(przez 120 min), w drugiej zaœ parametry transferu przed (15-60 min) i po (75-120
min) zastosowaniu hialuronianu po mezotelialnej stronie b³ony. W serii kontrolnej wykazano stabilnoœæ dwukierunkowego transportu mocznika, kreatyniny,
kwasu moczowego, insuliny i albuminy (I®M oraz M®I) oraz pasa¿u ikodekstryny, skierowanego z mezotelialnej do œródmi¹¿szowej strony b³ony (M®I).
Œrednie wartoœci wspó³czynników przepuszczalnoœci P±SEM wynosi³y dla mocznika: 2,293 ± 0,211 [10-4; cm/s] i 2,621 ± 0,457 [10-4; cm/s], dla kreatyniny: 1,522 ±
0,102 [10-4; cm/s] i 1,865 ± 0,244 [10-4; cm/s], dla kwasu moczowego: 1,936 ± 0,324
[10-4; cm/s] i 2,078 ± 0,186 [10-4; cm/s], dla insuliny: 0,145 ± 0,033 [10-4; cm/s] i
0,146±0,022 [10-4; cm/s] oraz dla albuminy: 0,271 ± 0,056 [10-4; cm/s] i 0,315 ±
0,057 [10-4; cm/s], odpowiednio w przypadku I®M i M®I transportu oraz 0,194 ±
0,035 dla transferu polimeru glukozy, skierowanego z mezotelialnej do œródmi¹¿szowej strony b³ony. Natomiast w kierunku przeciwnym (I®M) obserwowano wzrost transportu ikodekstryny o 50%. Wartoœci wspó³czynników P wynosi³y
0,280 ± 0,038 [10-4; cm/s] w pierwszej godzinie eksperymentu i 0,394 ± 0,046 [104
; cm/s] w kolejnej. Wykazano asymetriê transportu polimeru glukozy zwi¹zan¹
z przewag¹ I®M pasa¿u. Hialuronian obni¿a³ dwukierunkowy transfer mocznika œrednio o 12% i eliminowa³ wspomnian¹ asymetriê transferu ikodekstryny.
Po zastosowaniu tego zwi¹zku nie stwierdzono bowiem nasilenia transportu
polimeru glukozy w kierunku I®M, obserwowanego w kontrolnej serii analiz.
Badany glikozaminoglikan nie zmienia³ natomiast wspó³czynników przepuszczalnoœci P w przypadku dwukierunkowego transferu pozosta³ych cz¹steczek.
Otrzymane wyniki wskazuj¹, ¿e in vitro hialuronian modyfikuje przeotrzewnowy
transport mocznika i ikodekstryny, ale nie wp³ywa na przepuszczalnoœæ b³ony
dla kreatyniny, kwasu moczowego, insuliny i albuminy.
(NEFROL. DIAL. POL. 2007, 11, 112-117)
Krystyna CZY¯EWSKA
Katedra Chemii i Biochemii Klinicznej
Uniwersytetu Medycznego
im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
Kierownik: Prof. dr hab. Lech Torliñski
S³owa kluczowe:
• hialuronian
• transport dyfuzyjny
• b³ona otrzewnowa
Key words:
• hyaluronan
• diffusive transport
• peritoneal membrane
Influence of hyaluronan on transport properties
of the peritoneum in vitro: comparative analyses
Cell-protective factors may alter the peritoneal structure and transport properties of the membrane. The purpose of the studies was to compare the urea
(0.02 g/dL), creatinine (0.1 g/dL), uric acid (0.02 g/dL), insulin (0.1 g/dL), icodextrin
(7.5 g/dL) and albumin (1 g/dL) transport in control conditions and after application of hyaluronan (0.4 g/dL). The experiments were undertaken with use of
rabbit parietal peritoneum, modified Ussing type chamber and mathematical
model of mass transport. Values of the transfer, directed from the interstitial to
mesothelial side of the membrane (I®M) and in the opposite direction (M®I)
were expressed as coefficients of diffusive permeability P [cm/s]. In the case of
each mmolecule, two separate series of the experiments were done. In the first
one transperitoneal transport in the control conditions (during 120 min) was
analyzed, and in the second transfer parameters before (15-60 min) and after
hyaluronan application on the mesothelial side of the peritoneal membrane (75120 min) were examined. Stability of urea, creatinine, uric acid, insulin and
112
Adres do korespondencji:
Dr n. med. Teresa Grzelak
Katedra Chemii i Biochemii Klinicznej
Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego
w Poznaniu,
Pracownia Patofizjologii B³on Biologicznych,
ul. Œwiêcickiego 6, 60-781 Poznañ
Tel.: (61) 854-64-76, Fax: (61) 854-64-77
e-mail: [email protected]
T. Grzelak i wsp.
albumin transport (in the case of both transfer directions) and icodextrin passage (only M®I direction) was observed in the control studies. The diffusive
permeability coefficients (P ± SEM) amounted at mean for urea: 2.293 ± 0.211
[10-4; cm/s] and 2.621 ± 0.457 [10-4; cm/s], for creatinine: 1.522 ± 0.102 [10-4; cm/
s] and 1.865 ± 0.244 [10-4; cm/s], for uric acid: 1.936 ± 0.324 [10-4; cm/s] and 2.078
± 0.186 [10-4; cm/s], for insulin: 0.145 ± 0.033 [10-4; cm/s] and 0.146 ± 0.022 [10-4;
cm/s] and for albumin: 0.271 ± 0.056 [10-4; cm/s] and 0.315 ± 0.057 [10-4; cm/s],
respectively in the case of I®M and M®I transport and 0.194 ± 0.035 for glucose
polymer transfer, directed from the mesothelial to the interstitial side of the
membrane. Next, in opposite direction (I®M) it was showed as an increase of
icodextrin transport by 50%. Values of P coefficient amounted to 0.280 ± 0.038
[10-4; cm/s] in the first hour of the experiment and 0.394 ± 0.046 [10-4; cm/s] in the
next one. One observed also asymmetry of glucose polymer transfer with I®M
passage domination. Hyaluronan decreased bi-directional urea transport by a
mean of 12%. The analyzed glycosaminoglycan eliminated also asymmetry of
icodextrin passage. After use this compound one did not reveal intensification
of glucose polymer transport in I®M direction. Hyaluronan did not change coefficients of diffusive permeability P in the case of other molecules. The obtained
results show that in vitro hyaluronan modifies dynamics of transperitoneal urea
and icodextrin transport, but does not influence permeability of membrane for
creatinine, uric acid, insulin and albumin.
(NEPHROL. DIAL. POL. 2007, 11, 112-117)
Wstêp
Stosowanie p³ynów dializacyjnych o niskiej biozgodnoœci indukuje morfologiczne i
funkcjonalne zmiany b³ony otrzewnowej
[3,14]. Dlatego coraz wiêksze zainteresowanie wzbudzaj¹ zagadnienia zwi¹zane z cytoprotekcyjnym oddzia³ywaniem na otrzewn¹, m.in. glikozaminoglikanów, fosfolipidów
i antyoksydantów [2,12,16,17]. Wskazuje siê
na korzyœci zastosowania w p³ynach dializacyjnych kwasu hialuronowego, polianionowego polisacharydu zbudowanego z u³o¿onych naprzemiennie reszt N-acetyloglukozaminy i glukuronianu [16,17]. Wielkocz¹steczkowe frakcje hialuronianu (HA) s¹ istotnymi sk³adnikami macierzy pozakomórkowej wiêkszoœci tkanek organizmu, w tym
b³ony otrzewnowej. Wykazano zdolnoœæ fibroblastów i komórek mezotelialnych otrzewnej do produkcji tego zwi¹zku. Obserwowano nawet 10-krotne zwiêkszenie zawartoœci HA w tkance œródmi¹¿szowej i dializacie podczas zapalenia otrzewnej [14,16,20].
Wzrost syntezy hialuronianu stwierdzono
tak¿e po d³ugookresowym wprowadzaniu do
jamy otrzewnowej szczurów p³ynu dializacyjnego z dodatkiem N-acetyloglukozaminy
[7].
Hialuronian wykazuje wielokierunkowe
dzia³anie na b³onê otrzewnow¹ [2,13].
Uczestniczy w komunikacji miêdzykomórkowej i bierze udzia³ w homeostazie p³ynu
otrzewnowego [13,18]. Wielkocz¹steczkowe frakcje tego zwi¹zku hamuj¹ proces
w³óknienia otrzewnej poprzez modyfikacjê
aktywnoœci inhibitorów zewn¹trzkomórkowych proteinaz [27]. Osmotycznie czynny
glikozaminoglikan bierze udzia³ w remodelingu i regeneracji otrzewnej, wp³ywaj¹c na
ró¿nicowanie, proliferacjê i adhezjê komórek [3,18,20]. Po dodaniu wysokocz¹steczkowego hialuronianu do hodowli komórek
mezotelialnych, izolowanych z dializatu osób
poddanych dializie otrzewnowej, wykazano
obni¿enie stê¿eñ mediatorów zapalenia i
uszkodzenia komórek, m.in. bia³ka chemotaktycznego monocytów (MCP-1), naczyniowego œródb³onkowego czynnika wzrostu
(VEGF), rozpuszczalnej miêdzykomórkowej
cz¹steczki adhezyjnej (s-ICAM) i fibronektyny [2]. W³aœciwoœci antyoksydacyjne HA
nasuwaj¹ przypuszczenie, ¿e mechanizm
oddzia³ywania tego glikozaminoglikanu jest
zwi¹zany z obni¿eniem aktywnoœci wolnych
rodników, a przez to ograniczeniem peroksydacji lipidów b³onowych podczas dializoterapii. Kilkudniowa dializa otrzewnowa u
szczurów z zastosowanie hialuronianu (w
stê¿eniu 0,01 g/dl) obni¿y³a bowiem stê¿enie malonodialdehydu w homogenizatach
otrzewnej, w porównaniu do wartoœci otrzymanych w przypadku dwóch grup zwierz¹t
dializowanych roztworem NaCl z/lub bez dodatku HA o ni¿szym stê¿eniu (0,001 g/dl) [26].
Oddzia³ywanie hialuronianu sodowego
na transport zwi¹zków nisko- i wysokocz¹steczkowych przez b³onê otrzewnow¹ poznane jest w ma³ym zakresie [1,16,17]. W
zwi¹zku z powy¿szym, celem podjêtych badañ by³a analiza porównawcza dynamiki
przezotrzewnowego transportu zwi¹zków o
niskiej masie cz¹steczkowej (mocznika, kreatyniny i kwasu moczowego) i makromoleku³ (insuliny, ikodekstryny i albuminy) w
warunkach kontrolnych oraz wywo³anej dzia³aniem wysokocz¹steczkowego hialuronianu sodowego.
Materia³ i metody
W doœwiadczeniach zastosowano otrzewn¹,
zaliczan¹ do tzw. z³o¿onych uk³adów b³onowych,
któr¹ wykorzystuje siê m.in. jako model do badañ
transportu biologicznego [6,7]. B³ona otrzewnowa
by³a izolowana z przedniej œciany brzucha królików rasy nowozelandzkiej, bia³ej i umieszczana w
zmodyfikowanej komorze Ussinga (zezwolenie nr
22/2006 Lokalnej Komisji Etycznej ds. Badañ nad
Zwierzêtami w Poznaniu). Uk³ad modelowy, sk³adaj¹cy siê z dwóch pó³komór o czynnej powierzchni
b³ony równej 1,1 cm2, ³¹czono za pomoc¹ przewodów polietylenowych z rezerwuarem p³ynu oraz
pomp¹ perystaltyczn¹, a nastêpnie wype³niano
p³ynem Hanksa o osmolalnoœci 300 mOsm/kg H2O.
Odpowiednie utlenowanie i sta³¹ wartoœæ pH p³ynu (równ¹ 7,4) utrzymywano przez ci¹g³e wprowadzanie do uk³adu doœwiadczalnego mieszani-
Nefrologia i Dializoterapia Polska • 2007 • 11 • Numer 3
ny gazu zawieraj¹cej 95% O2 i 5% CO2. Objêtoœæ
roztworu, kr¹¿¹cego przy pomocy pompy, wynosi³a 13 lub 15 ml, a szybkoœæ jego przep³ywu 11 ml/
min. We wszystkich eksperymentach próbki (0,51,1 ml) pobierano regularnie co 15 minut, a nastêpnie uzupe³niano p³yn, kr¹¿¹cy po obydwu stronach b³ony, do pierwotnej objêtoœci. Ca³y uk³ad
eksperymentalny umieszczano w komorze termostatycznej o temperaturze 37°C.
Badania eksperymentalne sk³ada³y siê z
dwóch, odrêbnych serii doœwiadczeñ. W pierwszej,
kontrolnej, wyznaczano wielkoϾ przezotrzewnowego transportu mocznika (POCH - Gliwice - Polska, m.cz. 60 Da), kreatyniny (Sigma - Chemical,
St. Louis - USA, m.cz. 113 Da), kwasu moczowego (SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg Niemcy, m.cz. 168 Da), insuliny (Sigma-Chemical,
St. Louis - USA m.cz. 5,8 kDa), ikodekstryny (ML
Laboratories PLC, Liverpool - Wielka Brytania,
m.cz. 14,6 kDa) i albuminy (wo³owej, Frakcji V, Sigma-Chemical, St. Louis - USA, m.cz. 68 kDa), skierowanego ze œródmi¹¿szowej (I) do mezotelialnej
(M) strony b³ony oraz w odwrotnym kierunku w
czasie 120 minut. Cz¹steczkê, dla której okreœlano dynamikê dwukierunkowego transferu wprowadzano do p³ynu po œródmi¹¿szowej lub mezotelialnej stronie b³ony. Pocz¹tkowy gradient stê¿eñ
wynosi³ w przypadku mocznika 0,02 g/dl, kreatyniny 0,1 g/dl, kwasu moczowego 0,02 g/dl, insuliny 0,1 g/dl, ikodekstryny 7,5 g/dl, a albuminy 1 g/
dl. Analogiczny schemat postêpowania zastosowano w drugiej serii eksperymentalnej, która dotyczy³a zmian parametrów przepuszczalnoœci dyfuzyjnej P dla nisko- i wysokocz¹steczkowych zwi¹zków wywo³anych dzia³aniem hialuronianu (sól sodowa, SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg
- Niemcy, m.cz. 2 x 106 Da). Przez 60 minut analizowano dynamikê transferu poszczególnych
zwi¹zków. Po godzinie doœwiadczenia wprowadzano do uk³adu eksperymentalnego hialuronian sodowy (stê¿enie pocz¹tkowe 0,04 g/dl) po mezotelialnej stronie b³ony i przez kolejne 60 minut przeprowadzano pomiary transportu wymienionych
moleku³.
113
Wyniki badañ
W warunkach kontrolnych dynamika
dwukierunkowego transportu mocznika, kreatyniny, kwasu moczowego, insuliny i albuminy oraz transferu ikodekstryny, skierowanego z mezotelialnej do œródmi¹¿szowej
strony b³ony (M®I) by³a stabilna. Wspó³czynniki przepuszczalnoœci dyfuzyjnej (I®M
i M®I) wynosi³y œrednio P±SEM dla mocznika: 2,293 ± 0,211 [10-4; cm/s] i 2,621 ±
0,457 [10-4; cm/s]; dla kreatyniny: 1,522 ±
0,102 [10-4; cm/s] i 1,865 ± 0,244 [10-4; cm/
s]; dla kwasu moczowego: 1,936 ± 0,324
[10-4; cm/s] i 2,078 ± 0,186 [10-4; cm/s], dla
insuliny: 0,145 ± 0,033 [10-4; cm/s] i 0,146 ±
0,022 [10-4; cm/s] oraz dla albuminy: 0,271
± 0,056 [10-4; cm/s] i 0,315 ± 0,057 [10-4;
cm/s]. W przypadku transportu polimeru glukozy, skierowanego z mezotelialnej do œródmi¹¿szowej strony b³ony, wartoœæ P wynosi³a 0,194 ± 0,035 [10-4; cm/s]. Natomiast w
kierunku przeciwnym (I®M) wykazano
wzrost transferu ikodekstryny o 50% w czasie 120 min. doœwiadczenia. Œrednie wartoœci wspó³czynnika przepuszczalnoœci dy-
114
I
M
M
I
300
P/P contr. [%]
250
200
150
n=17
n=17
n=21
100
114±6
50
100
0
98±19
108±9
100
15-60
91±14
101±5
103±5
75-120
75-120
75-120
kontrola
mocznik (0,02 g/dl)
kreatynina (0,1 g/dl)
control stage
urea (0.02 g/dL )
creatinine (0.1 g/dL )
kwas moczowy (0,2 g/dl)
uric acid (0.2 g/dL)
Czas [min]
T ime [min]
Rycina 1
Dynamika otrzewnowego transportu mocznika, kreatyniny i kwasu moczowego in vitro, skierowanego ze
œródmi¹¿szowej (I) do mezotelialnej (M) strony b³ony oraz w kierunku przeciwnym, w warunkach kontrolnych.
Dynamics of in vitro urea, creatinine and uric acid peritoneal transport, directed from the interstitial (I) to the
mesothelial (M) side of the membrane and in the opposite direction in control conditions.
Za 100% przyjêto œrednie wartoœci wspó³czynników przepuszczalnoœci dyfuzyjnej P (±SEM) uzyskane w
pierwszej godzinie doœwiadczenia.
I
300
M
M
I
p < 0,01
250
P/P contr. [%]
Stê¿enie zwi¹zku, dla którego okreœlano wielkoœæ przepuszczalnoœci dyfuzyjnej P, oceniano
metodami biochemicznymi i enzymatycznymi. W
przypadku mocznika zastosowano kilkuetapow¹
metodê enzymatyczno-kinetyczn¹, z ureaz¹ i dehydrogenaz¹ glutaminow¹. Stê¿enie kreatyniny i
kwasu moczowego oznaczano z wykorzystaniem
testów Liquick Cor-CREATININE (opartego na
zmodyfikowanej metodzie Jaffe`go, bez odbia³czania) i Liquick Cor-UA (metoda enzymatyczna z urikaz¹ i peroksydaz¹), (Cormay, Lublin - Polska). Z
kolei, stê¿enia insuliny i albuminy ustalano dziêki
zastosowaniu testu Protein Assay Kit (Sigma-Chemical, St. Louis - USA), opartego na zmodyfikowanej mikrometodzie Lowry. W celu okreœlenia
stê¿enia ikodekstryny wykorzystano kilkuetapow¹
metodê enzymatyczn¹ z amyloglukozydaz¹ (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis - USA), oksydaz¹ glukozow¹ i peroksydaz¹ (Cormay, Lublin - Polska). Metoda ta zosta³a zaproponowana przez Wang R. i
wsp. [Perit. Dial. Int. 2001, 21, 269] oraz dostosowana do potrzeb prezentowanych badañ in vitro
[21,22].
Do analizy wielkoœci transferu zastosowano
model matematyczny, który zak³ada dyfuzyjny charakter transportu, a tak¿e dobre mieszanie p³ynu
wewn¹trz komory Ussinga [4]. Otrzymane wyniki
wyra¿ano w postaci wspó³czynnika przepuszczalnoœci dyfuzyjnej P w cm/s. Modyfikacje w transporcie cz¹steczek okreœlano w procentach wartoœci kontrolnych Pbadane/Pkontrolne, przyjmuj¹c za 100%
œrednie wielkoœci transferu uzyskane przed zmian¹ warunków doœwiadczenia. Procentowe wartoœci P wyznaczano oddzielnie dla ka¿dego eksperymentu, a nastêpnie podawano œredni¹ dla ca³ej
serii doœwiadczeñ. Ze wzglêdu na zró¿nicowanie
grup badawczych pod wzglêdem liczebnoœci obliczano b³¹d standardowy œredniej (SEM - standard
error of the mean). Ocenê statystyczn¹ otrzymanych wartoœci wspó³czynników transportu przeprowadzano przy u¿yciu programu Statistica 7.1 (StatSoft, Inc. Tulsa, OK, USA) i testów t-Studenta oraz
Wilcoxona dla zmiennych powi¹zanych. Do analizy rozk³adów danych u¿yto testu Shapiro -Wilka.
Jako istotn¹ statystycznie przyjêto wartoœæ p<0,05.
p < 0,05
200
n=24
n=26
n=18
150
100
150±11
50
0
100
100
116±20
95±9
111±11
88±11
125±8
15-60
kontrola
75-120
insulina (0,1 g/dl)
75-120
ikodekstryna (7,5 g/dl)
75-120
albumina (1 g/dl)
control stage
insulin (0.1 g/dL)
icodextrin (7.5 g/dL)
albumin (1 g/dL)
Czas [min]
Time [min]
Rycina 2
Dynamika otrzewnowego transportu insuliny, ikodekstryny i albuminy in vitro, skierowanego ze œródmi¹¿szowej (I) do mezotelialnej (M) strony b³ony oraz w kierunku przeciwnym, w warunkach kontrolnych.
Dynamics of in vitro insulin, icodextrin and albumin peritoneal transport, directed from the interstitial (I) to
the mesothelial (M) side of the membrane and in the opposite direction in control conditions.
Za 100% przyjêto œrednie wartoœci wspó³czynników przepuszczalnoœci dyfuzyjnej P (±SEM) uzyskane w
pierwszej godzinie doœwiadczenia.
fuzyjnej wynosi³y 0,280 ± 0,038 [10-4; cm/s]
dla pierwszej godziny eksperymentu i 0,394
± 0,046 [10-4; cm/s] dla kolejnej. Obserwowano tak¿e asymetriê transferu polimeru
glukozy polegaj¹c¹ na przewadze pasa¿u
skierowanego ze œródmi¹¿szowej do mezotelialnej strony b³ony (por. rycina 1, 2).
Hialuronian sodowy obni¿a³ o 11% trans-
port mocznika, skierowany ze œródmi¹¿szowej do mezotelialnej strony b³ony, a w kierunku odwrotnym o 12% (por. rycina 3). Badany glikozaminoglikan zmniejsza³ tak¿e
I®M transport ikodekstryny, w porównaniu
do serii kontrolnej, nie wp³ywaj¹c na pasa¿
w kierunku przeciwnym. W zwi¹zku z tym
hialuronian sodowy eliminowa³ asymetriê
T. Grzelak i wsp.
300
M
M
I
hialuronian sodowy
(0,04 g/dl)
250
p < 0,04
P/P contr. [%]
Omówienie
Przeprowadzone badania in vivo oraz
in vitro wskazuj¹ na z³o¿onoœæ przezotrzewnowego transportu ma³ych i du¿ych moleku³. Transfer cz¹steczek, zachodz¹cy w
dwóch przeciwstawnych kierunkach pomiêdzy ³o¿yskiem naczyniowym a jam¹ brzuszn¹, jest ograniczony przez struktury b³ony
otrzewnowej, które stanowi¹ odrêbne bariery anatomiczne. Nale¿¹ do nich: endotelium
naczyniowe i mezotelium wraz z b³onami
podstawnymi oraz interstitium. Nie bez znaczenia s¹ tak¿e warstwy p³ynu stagnacyjnego, przylegaj¹ce do struktur granicznych
otrzewnej, tj. endotelialnej i mezotelialnej.
Podczas dializy otrzewnowej transport moleku³ zachodzi g³ównie na drodze prostej
dyfuzji i konwekcji, wywo³anych gradientem
stê¿eñ substancji miêdzy dializatem a krwi¹,
a tak¿e ró¿nic ciœnieñ hydrostatycznych,
osmotycznych i/lub onkotycznych [5,14]. Nie
mo¿na tak¿e wykluczyæ transcellularnej drogi przezotrzewnowego transferu cz¹steczek, dyfuzji u³atwionej oraz komponenty
transportu aktywnego, przebiegaj¹cego niezgodnie z równowag¹ termodynamiczn¹.
Zale¿noœæ pomiêdzy wielkoœciami
wskaŸników transferu cz¹steczek i ich w³aœciwoœciami fizyko-chemicznymi jest wieloczynnikowa. Szybkoœæ transportu moleku³,
skierowanego z ³o¿yska naczyniowego do
jamy otrzewnowej, uwarunkowana jest
mas¹ cz¹steczkow¹, kszta³tem, gêstoœci¹,
rozpuszczalnoœci¹ w wodzie i t³uszczach,
obecnoœci¹ otoczki hydratacyjnej i ³adunków
elektrycznych oraz zdolnoœci¹ do agregacji
i wi¹zania z innymi zwi¹zkami. Warto podkreœliæ, i¿ w przypadku zwi¹zków wielkocz¹steczkowych pasa¿ z jamy otrzewnowej do
krwi, zachodzi g³ównie na drodze limfatycznej i nie zale¿y od wielkoœci transportowanych moleku³ [5,14,19].
W prezentowanych badaniach in vitro
najwy¿sze wartoœci przepuszczalnoœci dyfuzyjnej wykazano w przypadku najmniejszych moleku³, tj. mocznika (o masie cz¹steczkowej 60 Da), kreatyniny (m.cz. 113
Da) i kwasu moczowego (m.cz. 168 Da).
Œrednie wielkoœci wspó³czynników P±SEM
wynosi³y odpowiednio: 2,467 ± 0,257 [10-4,
cm/s]; 1,724 ± 0,153 [10-4, cm/s] i 2,017 ±
0,171 [10-4, cm/s]. Wielokrotnie ni¿sze by³y
parametry transportu w przypadku insuliny
(m.cz. 5,8 kDa), ikodekstryny (m.cz. 14,6
kDa) i albuminy (m.cz. 68 kDa), odpowiednio: 0,146 ± 0,019 [10-4, cm/s]; 0,251 ± 0,028
[10-4, cm/s] i 0,293 ± 0,039 [10-4, cm/s]. Nie
stwierdzono jednak odwrotnie proporcjonalnej zale¿noœci pomiêdzy mas¹ cz¹steczkow¹ i wielkoœciami transferu. Nale¿y podkreœliæ, i¿ badane moleku³y oprócz masy czasteczkowej, ró¿ni³y siê miêdzy sob¹ np.
przestrzenn¹ budow¹, obecnoœci¹ ³adunków elektrycznych i zdolnoœci¹ do agregacji, co utrudnia bezpoœrednie analizy porów-
I
200
p < 0,05
n=23
150
n=28
n=28
100
104±6
50
100
0
96±4
89±5
100
15-60
75-120
100±3
99±5
88±5
kontrola
mocznik (0,02 g/dl)
75-120
kreatynina (0,1 g/dl)
75-120
kwas moczowy (0,02 g/dl)
control stage
urea (0.02 g/dL)
creatinine (0.1 g/dL)
uric acid (0.02 g/dL)
Czas [min]
Time [min]
Rycina 3
Zmiany w otrzewnowym transporcie mocznika, kreatyniny i kwasu moczowego, skierowanym ze œródmi¹¿szowej (I) do mezotelialnej (M) strony b³ony oraz w kierunku przeciwnym, wywo³ane hialuronianem sodowym w warunkach in vitro.
Changes of in vitro urea, creatinine and uric acid peritoneal transport, directed from the interstitial (I) to the
mesothelial (M) side of the membrane and in the opposite direction, caused by sodium hyaluronan.
Za 100% przyjêto œrednie wartoœci wspó³czynników przepuszczalnoœci dyfuzyjnej P (±SEM) uzyskane przed
zmian¹ warunków doœwiadczenia.
I
300
M
M
I
hialuronian sodowy
(0,04 g/dl)
250
P/P contr. [%]
transferu polimeru glukozy. W serii kontrolnej obserwowano bowiem wzrost transportu tej makrocz¹steczki, skierowanego ze
œródmi¹¿szowej do mezotelialnej powierzchni b³ony, czego nie stwierdzono po zastosowaniu glikozaminoglikanu (por. rycina 4).
Hialuronian sodowy nie zmienia³ wspó³czynników przepuszczalnoœci dyfuzyjnej P dla
kreatyniny, kwasu moczowego, insuliny i albuminy (por. rycina 3, 4).
200
n=18
n=25
n=18
150
100
94±11
50
0
100
100
107±13
112±2
95±6
127±16
102±11
15-60
kontrola
75-120
insulina (01 g/dl)
75-120
ikodekstryna (7.5 g/dl)
75-120
albumina (1 g/dl)
control stage
insulin (0.1 g/dL)
icodextrin (7.5 g/dL)
albumin (1 g/dL)
Czas [min]
Time [min]
Rycina 4
Zmiany w otrzewnowym transporcie insuliny, albuminy i ikodekstryny, skierowanym ze œródmi¹¿szowej (I)
do mezotelialnej (M) strony b³ony oraz w kierunku przeciwnym, wywo³ane hialuronianem sodowym w warunkach in vitro.
Changes of in vitro insulin, icodextrin and albumin peritoneal transport, directed from the interstitial (I) to the
mesothelial (M) side of the membrane and in the opposite direction, caused by sodium hyaluronan.
Za 100% przyjêto œrednie wartoœci wspó³czynników przepuszczalnoœci dyfuzyjnej P (±SEM) uzyskane przed
zmian¹ warunków doœwiadczenia.
nawcze. Na przyk³ad, stosunkowo niskie
parametry dwukierunkowego transferu w
przypadku insuliny wi¹za³y siê prawdopodobnie z jej specyficzn¹ zdolnoœci¹ do ³atwego tworzenia (poprzez wi¹zania wodorowe) di- i heksamerów o wysokiej masie
Nefrologia i Dializoterapia Polska • 2007 • 11 • Numer 3
cz¹steczkowej i obszernej przestrzennie
strukturze.
Przeprowadzone analizy wykaza³y, i¿ w
warunkach kontrolnych wartoœci wspó³czynników przepuszczalnoœci dyfuzyjnej w przypadku mocznika, kreatyniny, kwasu moczo-
115
wego, insuliny i albuminy nie zmienia³y siê
w czasie i by³y zbli¿one dla obydwu kierunków transferu. Natomiast parametry te dla
ikodekstryny i pasa¿u skierowanego ze
œródmi¹¿szowej do mezotelialnej strony b³ony charakteryzowa³y siê tendencj¹ wzrostow¹ w czasie 120 min. doœwiadczenia (nasilenie transportu o 50%). Ponadto, zwraca
uwagê asymetria transferu polimeru glukozy, charakteryzuj¹ca siê przewag¹ pasa¿u
skierowanego ze œródmi¹¿szowej do mezotelialnej powierzchni b³ony nad transportem
w odwrotnym kierunku. Wzrost I®M transferu tego zwi¹zku w czasie eksperymentu,
jest trudny do wyjaœnienia na podstawie
przeprowadzonych analiz. Prawdopodobnie
móg³ on wynikaæ z czêœciowej depolimeryzacji ikodekstryny na mniejsze cz¹steczki,
zmiany osmolalnoœci p³ynu i/lub strukturalnych i funkcjonalnych modyfikacji otrzewnej, wywo³anych polimerem glukozy lub produktami jego rozpadu [8,10,15,22,23].
U szczurów poddanych dializie otrzewnowej stwierdzono wzrost osmolalnoœci roztworu dializacyjnego z 290 do 350 mOsmol/
kg H2O w zwi¹zku z enzymatyczn¹ degradacj¹ ikodekstryny do fragmentów o mniejszej masie cz¹steczkowej (g³ównie maltozy
i maltotriozy) [15]. Nale¿y podkreœliæ, i¿
prawdopodobnie w zwi¹zku z heterogennoœci¹ miedzygatunkow¹ aktywnoœci amylazy (odpowiedzialnej za rozk³ad polimeru do
oligosacharydów) nie obserwowano takich
zmian w przypadku dializy otrzewnowej u
ludzi, z wykorzystaniem p³ynów opartych na
polimerze glukozy [15,23]. Wstêpne badania in vitro nie wykaza³y wysokiej aktywnoœci amylazy w p³ynie op³ukuj¹cym izolowan¹ otrzewn¹ œcienn¹ królika, umieszczon¹
w uk³adzie eksperymentalnym (dane niepublikowane). Mo¿na przypuœciæ, i¿ zmiany
dynamiki transferu ikodekstryny s¹ wynikiem przemieszczania siê wody w kierunku
M®I, której nie towarzyszy³ transport polimeru, nieenzymatycznej degradacji cz¹steczki lub modyfikacji struktury otrzewnej
wywo³anej ikodekstryn¹.
Niektóre badania sugeruj¹, i¿ dootrzewnowe wprowadzanie polimeru glukozy mo¿e
wywo³ywaæ zaburzenia strukturalne w obrêbie poszczególnych struktur otrzewnej (o
charakterze chemicznego zapalenia), prowadz¹ce do zmian jej w³aœciwoœci transportowych [8,10]. Podczas zabiegu dializy
otrzewnowej u zwierz¹t obserwowano m.in.
zmniejszenie objêtoœci oraz obni¿enie ¿ywotnoœci komórek mezotelialnych ju¿ po 2
godzinach ekspozycji na ikodekstrynê. Wi¹za³o siê to z przemieszczaniem wody z przestrzeni wewn¹trz- do pozakomórkowej. W
przypadku d³u¿szych doœwiadczeñ (15-dniowych) stwierdzono obecnoœæ tzw. olbrzymich komórek mezotelialnych (o du¿ym promieniu i polu powierzchni oraz zwiêkszonym
indeksie j¹dro/cytoplazma). Powy¿sze zaburzenia utrzymywa³y siê przez 2 miesi¹ce
po zaprzestaniu dializy u zwierz¹t. Opisywane zmiany prawdopodobnie by³y wynikiem indukowanej przez ikodekstrynê peroksydacji lipidów warstwy mezotelialnej [10].
Zaburzenia morfologiczne w obrêbie struktur otrzewnej zwi¹zane z oddzia³ywaniem
polimeru glukozy mog¹ przyczyniaæ siê do
modyfikacji transportu nisko- i wysokocz¹steczkowych zwi¹zków przez b³onê otrzewnow¹. Miêdzy innymi obserwowano wzrost
116
klirensu bia³ka ca³kowitego po jednorazowym
oraz d³ugoterminowym stosowaniu polimeru glukozy u dializowanych szczurów [8].
Ponadto, we wczeœniejszych badaniach in
vitro z zastosowaniem otrzewnej królików
stwierdzono modyfikacjê przezotrzewnowego transportu kwasu moczowego i albuminy
pod wp³ywem ikodekstryny [11].
Wyniki badañ in vivo oraz in vitro, dotycz¹cych wp³ywu hialuronianu na funkcje
transportowe b³ony otrzewnowej, s¹ zró¿nicowane i zale¿¹ od masy cz¹steczkowej, stê¿enia oraz czasu stosowania tego zwi¹zku.
Glikozaminoglikan o niskiej masie cz¹steczkowej (0,5 x 106 Da) w p³ynie dializacyjnym
zwiêksza³ utratê bia³ek do jamy otrzewnowej
[24]. Z kolei, wysokocz¹steczkowe frakcje HA
(o m.cz. powy¿ej 1,6 x 106 Da) obni¿a³y lub
nie wp³ywa³y na przezotrzewnowy transport
nisko- i wysokocz¹steczkowych zwi¹zków, a
efekty dzia³ania nasila³y siê wraz z wyd³u¿aniem czasu ekspozycji oraz wzrostem zastosowanego stê¿enia glikozaminoglikanu (w
zakresie 0,01-0,1 g/dl) [1,16,17,24].
Kliniczne badania wykaza³y brak wp³ywu
wysokocz¹steczkowych frakcji hialuronianu
(m.cz. 2 x 106 Da) w stê¿eniach 0,01 g/dl i
0,05 g/dl, podanych jednorazowo do otrzewnej wraz ze standardowym p³ynem dializacyjnym, na klirensy mocznika, kreatyniny i
albuminy po 3 i 6 godzinach leczenia dializ¹
[16]. Podobnie, dootrzewnowe wprowadzenie p³ynu glukozowego (3,86 g/dl) z wysokocz¹steczkowym hialuronianem (0,01 g/dl) u
dializowanych przez 4 godziny zwierz¹t doœwiadczalnych nie wp³ywa³o na dwukierunkowy transport albuminy [20]. Zastosowanie
natomiast u szczurów p³ynu z dodatkiem
0,025 g/dl HA (m.cz. 1,6 x 106 Da) podczas
7-dniowej dializy otrzewnowej obni¿a³o
wskaŸniki K BD (Diffusive Mass Transport
Coefficient) mierzone po 4 godzinach równowa¿enia w przypadku sodu, potasu, mocznika i glukozy, a tak¿e wielkoœæ absorpcji albuminy z jamy otrzewnowej do otaczaj¹cych
tkanek, w porównaniu do zwierz¹t dializowanych standardowym p³ynem opartym na glukozie. Nie wykazano zaœ ró¿nicy tych parametrów w stosunku do wyników otrzymanych
w grupie kontrolnej (niedializowanej). W przypadku wskaŸników transferu bia³ka ca³kowitego stwierdzono zaœ spadek transportu po
zastosowaniu hialuronianu, zarówno w stosunku do zwierz¹t kontrolnych, jak i dializowanych standardowym p³ynem glukozowym
[13].
W innych badaniach, wielkocz¹steczkowy polisacharyd (m.cz. powy¿ej 1 x 106 Da)
w wysokim stê¿eniu (0,05 g/dl) podany jednorazowo, nie wp³ywa³ na absorpcjê, ale
zmniejsza³ otrzewnowy klirens albuminy u
zwierz¹t doœwiadczalnych. Zastosowanie
zaœ hialuronianu w stê¿eniu 0,1 g/dl wywo³ywa³o obni¿enie transferu bia³ka ca³kowitego w obu kierunkach [20]. Spadek wskaŸników otrzewnowego klirensu i absorpcji dla
protein wykazano tak¿e w przypadku wyd³u¿enia do czterech tygodni dializy otrzewnowej u szczurów, u których stosowano p³yn
glukozowy z dodatkiem HA (m.cz. 1, 6 x 106
Da) w niskim stê¿eniu (0,01 g/dl), w porównaniu do grupy kontrolnej dializowanej standardowym p³ynem opartym na glukozie [17].
Wprowadzony do jamy otrzewnowej hialuronian tworzy sieæ gêsto u³o¿onych, ujemnie na³adowanych ³añcuchów polisacharydo-
wych (tzw. „filter cake”) wp³ywaj¹cych na
homeostazê wodn¹ [13,20,25]. U dializowanych szczurów zastosowanie HA wywo³ywa³o wzrost ultrafiltracji netto, w zwi¹zku
ze zmniejszeniem reabsorpcji p³ynu z przestrzeni wewn¹trzotrzewnowej, zwi¹zanej z
obni¿eniem przewodnoœci hydraulicznej
tkanki œródmi¹¿szowej [1,17,25]. Struktura przestrzenna hialuronianu (obecnoœæ
du¿ej liczby grup hydroksylowych oraz ³adunków ujemnych) umo¿liwia wi¹zanie
wody, a przez to stanowi dodatkow¹ barierê dla swobodnego przep³ywu cz¹steczek
[3,20]. Prezentowane wyniki badañ in vitro
wskazuj¹, i¿ wprowadzenie do uk³adu doœwiadczalnego wysokocz¹steczkowego
hialuronianu wp³ywa na pasa¿ moleku³ o niskiej masie cz¹steczkowej, których parametry transportu przez b³on¹ otrzewnow¹
s¹ najwy¿sze. W przedstawionych analizach HA (m.cz. 2 x 106 Da) w stê¿eniu 0,04
g/dl obni¿a³ bowiem wskaŸnik przepuszczalnoœci dyfuzyjnej P w przypadku dwukierunkowego transferu mocznika, œrednio
o 12%. Nie stwierdzono natomiast zmian
w dwukierunkowym transporcie zwi¹zków
o wy¿szej ni¿ mocznik masie czasteczkowej, takich jak: kreatynina, kwas moczowy,
insulina i albumina oraz transferze polimeru glukozy, skierowanym z mezotelialnej do
œródmi¹¿szowej strony b³ony. Niewykluczone, ¿e obni¿enie I®M transportu ikodekstryny (w porównaniu do serii kontrolnej)
po zastosowaniu HA, wi¹za³o siê z hamowaniem transferu niskocz¹steczkowych
produktów degradacji polimeru glukozy
przez wspomniany filtr hialuronianu. W
przypadku przezotrzewnowego pasa¿u ikodekstryny, wysokocz¹steczkowe frakcje badanego glikozaminoglikanu mog³y przywracaæ integralnoœæ b³ony, naruszon¹ przez
dzia³anie wysokich stê¿eñ polimeru glukozy i/lub jego produktów rozpadu, a przez to
wp³ywaæ poœrednio na przepuszczalnoœæ
otrzewnej.
Warto podkreœliæ, i¿ wraz ze wzrostem
stê¿enia hialuronianu (w zakresie 0,01-0,1
g/dl), zastosowanego w p³ynie dializacyjnym, zwiêksza siê lepkoœæ roztworu (od 1,5
do 4,8 cP) i zgodnie z I prawem Ficka
zmniejsza siê dyfuzja cz¹steczek rozpuszczonych w tym roztworze [3,19,20]. Prawdopodobnie zwiêksza siê tak¿e gruboœæ
warstwy stagnacyjnej p³ynu, stykaj¹cego siê
ze strukturami granicznymi b³ony [20].
Wp³ywaæ to mo¿e na obni¿enie transportu
w zwi¹zku z wyd³u¿on¹ drog¹, jak¹ musz¹
pokonaæ moleku³y. Znaczenie tej bariery w
przezotrzewnownowym transferze nisko- i
wysokocz¹steczkowych zwi¹zków potwierdzono poœrednio w badaniach klinicznych,
w których wykazano, ¿e znaczna prêdkoœæ
(100 ml/min) przep³ywu roztworu dializacyjnego, zastosowana podczas wysokowydajnej, automatycznej dializy otrzewnowej,
zwiêkszy³a o 60% klirens mocznika oraz o
25% klirens b2-mikroglobuliny po 8 godzinach zabiegu, w porównaniu do wartoœci
uzyskanych podczas nocnej, przerywanej
dializy otrzewnowej [9].
Wnioski
1. In vitro dynamika przezotrzewnowego transportu mocznika, kreatyniny, kwasu
moczowego, insuliny i albuminy jest stabilna, natomiast pasa¿ ikodekstryny wykazu-
T. Grzelak i wsp.
je asymetriê, zwi¹zan¹ z przewag¹ transferu ze œródmi¹¿szowej do mezotelialnej strony b³ony, nad transportem w kierunku przeciwnym.
2. Wysokocz¹steczkowa frakcja hialuronianu sodowego in vitro nie zmienia dynamiki przezotrzewnowego transferu kreatyniny, kwasu moczowego, insuliny i albuminy,
ale obni¿a dwukierunkowy transfer mocznika i jednokierunkowy (I®M) ikodekstryny.
Piœmiennictwo
1. Brêborowicz A., Po³ubiñska A., Pawlaczyk K. et
al.: Intraperitoneal hyaluronan administration in conscious rats: absorption, metabolism, and effects on
peritoneal fluid dynamics. Perit. Dial. Int. 2001, 21,
130.
2. Brêborowicz A., Pyda M., Moberly J., et al.: Effect
of hyaluronan-supplemented dialysate on in vitro
function of human peritoneal mesothelial cells. Am.
J. Nephrol. 2004, 24, 316.
3. Cohen M., Klein E., Geiger B., Addadi L.: Organization and adhesive properties of the hyaluronan
pericellular coat of chondrocytes and epithelial cells.
Biophysical J. 2003, 85, 1996.
4. Czy¿ewska K., Szary B., Waniewski J.: Transperitoneal transport of glucose in vitro. Artif. Organs 2000,
24, 857.
5. Czy¿ewska K., Szary B.: Przezotrzewnowy transport glukozy. Studium funkcji i efektów. Wydawnictwa
Akademii Medycznej im. Karola Marcinkowskiego w
Poznaniu, Poznañ 2001.
6. Czy¿ewska K., Szary B., Grzelak T.: Peritoneal transport dynamics of glucose and icodextrin: the in vitro
comparative studies. Adv. Perit. Dial. 2005, 21, 53.
7. Flessner M.F., Lofthouse J., Williams A.: Chronic
alteration of subperitoneal tissue and peritoneal
transport. Adv. Perit. Dial. 2002, 18, 12.
8. Frajewicki V., Kushnir D., Wajsbrot V. et al.: Peritoneal transport after long-term exposure to
icodextrin in rats. Nephron 2002, 92, 174.
9. Freida P., Issad B.: Continuous flow peritoneal dialysis: assessment of fluid and solute removal in a
high-flow model of "fresh dialysate single pass". Perit.
Dial. Int. 2003, 23, 348.
10. Gotloib L., Wajsbrot V., Shostak A.: Mesothelial
dysplastic changes and lipid peroxidation induced
by 7.5% icodextrin. Nephron 2002, 92, 142.
11. Grzelak T., Szary B., Czy¿ewska K.: Effect of
icodextrin on transperitoneal uric acid and albumin
transport in vitro. Adv. Perit. Dial. 2004, 20, 47.
12. Grzelak T., Czy¿ewska K., Szary B.: Wp³yw
hialuronianu na przepuszczalnoœæ b³ony otrzewnowej dla makrocz¹steczek in vitro. Pol. Arch. Med.
Wewn. 2005, 6, 1163.
13. Guo Q., Peng W., Cheng H. et al.: Hyaluronan preserves peritoneal membrane transport properties.
Perit. Dial. Int. 2001, 21, 136.
14. Krediet R.T.: Peritoneal physiology - impact on solute and fluid clearance. Adv. Ren. Replace Ther.
2000, 7, 271.
15. Moberly J.B., Mujais S., Gehr T., et al.: Pharmacokinetics of icodextrin in peritoneal dialysis patients.
Kidney Int. 2002, 62 (Suppl. 81), S23.
16. Moberly J.B., Sorkin M., Kucharski A. et al.: Effects of intraperitoneal hyaluronan on peritoneal fluid
and solute transport in peritoneal dialysis patients.
Perit. Dial. Int. 2003, 23, 63.
17. Po³ubiñska A., Pawlaczyk K., KuŸlan-Pawlaczyk
M. et al.: Dialysis solution containing hyaluronan:
Effect on peritoneal permeability and inflammation
in rats. Kidney Int. 2000, 57, 1182.
18. Reijnen M.M.P.J., Falk P., van Goor H., Holmdahl
Nefrologia i Dializoterapia Polska • 2007 • 11 • Numer 3
L.: The antiadhesive agent sodium hyaluronate increases the proliferation rate of human peritoneal
mesothelial cells. Fertil. Steril. 2000, 74, 146.
19. Rippe B., Krediet R.T.: Peritoneal physiology - transport of solutes. W: The Textbook of Peritoneal Dialysis. Gokal R., Nolph K.D., Red., Kluwer Academic
Publishers, Netherlands, 1994, 69.
20. Rosengren B.-I., Carlsson O., Rippe B.: Hyaluronan and peritoneal ultrafiltration: A test of the "Filtercake" hypothesis. Am. J. Kidney Dis. 2001, 37, 1277.
21. Szary B., Czy¿ewska K., Grzelak T., Kêdzierski
S.: Przezotrzewnowy transport ikodekstryny: badania
czynnoœciowe i morfologiczne. Nefrol. Dial. Pol. 2005,
9, 74.
22. Szary B., Grzelak T., Czy¿ewska K.: Icodextrin peritoneal transport in vitro: Effect of sodium deoxycholate, glucose, and methylglyoxal. Artificial Organs
2007, 31, 140.
23. de Waart D.R. Zweers M.M., Struijk D.G., Krediet
R.T.: Icodextrin degradation products in spent dialysate of CAPD patients and the rat, and its relation
with dialysate osmolality. Perit. Dial. Int. 2001, 21, 269.
24. Wang T., Cheung H., Heimburger O., et al.:
Hyaluronan prevents the decreased net ultrafiltration
caused by increased peritoneal dialysate fill volume.
Kidney. Int. 1998, 53, 496.
25. Wang T., Cheng H., Heimburger O., et al.:
Hyaluronan decreases peritoneal fluid absorption:
Effect of molecular weight and concentration of
hyaluronan. Kidney Int. 1999, 55, 667.
26. Wieczorowska K., Brêborowicz A., Martis L.,
Oreopoulos D.G.: Protective effect of hyaluronic acid
against peritoneal injury. Perit. Dial. Int. 1995, 15, 81.
27. Yung S., Li F.K., Chan T.M.: Peritoneal mesothelial
cell culture and biology. Perit. Dial. Int. 2006, 26, 162.
117