Synteza cyklicznych pochodnych tryptofanu

Synteza peptydów o strukturze helikalnej do badania
dalekozasięgowego transportu elektronów
Karolina Świątek
Pracownia Peptydów
Kierownik pracy: dr hab. Aleksandra Misicka
Cele pracy
 Synteza trzech peptydów o strukturze helikalnej z dwiema
terminalnymi grupami tiolowymi, aby umożliwić wytworzenie
wiązań kowalencyjnych z powierzchnią złota i igłą
skaningowego mikroskopu tunelowego
 Opracowanie procedury formowania samoorganizujących
się monowarstw na powierzchni złotej elektrody ze ściśle
ukierunkowanym ułożeniem peptydów
 Zbadanie helikalności otrzymanych peptydów za pomocą
dichroizmu kołowego
 Pomiar przewodnictwa pojedynczych cząsteczek peptydów
za pomocą skaningowej mikroskopii tunelowej
Synteza i oczyszczanie peptydów
Monowarstwy peptydów
 Syntezę przeprowadzono na nośniku polimerycznym – żywica
cysteamino-4-metoksytrytylowa
 Do czasowej ochrony grupy aminowej zastosowano grupę
9-fluorenylometoksykarbonylową - strategia Fmoc
 Do ochrony grup funkcyjnych w łańcuchach bocznych zastosowano:
w kwasie glutaminowym – grupę t-butylową (t-Bu), w lizynie –
grupę t-butoksykarbonylową (Boc), w cysteinie
– grupę
acetamidometylową (Acm)
 Sprzęganie prowadzono w chlorku metylenu przy użyciu
diizopropylokarbodiimidu (DIC) i N-hydroksybenzotriazolu (HOBt)
 Peptydy zdjęto z żywicy 95% TFA, w tych warunkach zdjęto również
grupy ochronne w łańcuchach bocznych lizyny (Boc) i kwasu
glutaminowego (tBu), nie naruszając grupy ochronnej Acm
blokującej grupę tiolową cysteiny
Zsyntezowane
peptydy
użyto
do
przygotowania monowarstw na powierzchni
złota.
 Otrzymane peptydy oczyszczono
za
pomocą
wysokosprawnej
chromatografii
cieczowej
z kolumną Nucleosil C18,
w układzie acetonitryl/0,05% TFA
w wodzie, w gradiencie 5-60%
40
35
30
25
20
 Poprawność
otrzymanych
peptydów
potwierdzono
za
pomocą spektrometrii mas.
15
10
Sekwencje modelowych peptydów
0
5
Efektywność transportu elektronów badano za pomocą skaningowej
mikroskopii tunelowej. Pomiar polega na wytworzeniu powtarzających
się podczas skanowania złota igłą mikroskopu molekularnych połączeń
igła-cząsteczka-elektroda.
0,044
0,039
10
15
Igła STM (Au)
Złącze tunelowe Au-peptyd-Au, V = +100mV
0,034
0,029
20
e-
0,024
Chromatogram oczyszczonego
peptydu – 15 aa
It
0,019
0,014
+
_
0,009
e-
0,004
Au
-0,001
Badanie helikalności
0
2
eliptyczność*10
400
Peptyd 15 aa – 54%
Peptyd 16 aa – 89%
Peptyd 17 aa – 97%
200
0
17 aa
16 aa
15 aa
-200
-400
210
230
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
d [nm]
Peptydy, w przeciwieństwie do białek, rzadko mają zdefiniowaną
strukturę drugorzędową i tylko część populacji wykazuje tzw.
helikalność. Za pomocą dichroizmu kołowego obliczono procent
helikalności otrzymanych peptydów.
190
250
długość fali [nm]
Model zaprojektowanych peptydów
Badania transportu elektronów
min
0
[degcm -1 dmol -1 ]
HS(CH2)2NHA K A A A E K A A A E K A A C(Acm)NH2
HS(CH2)2NHA K A A A E K A A A E K A A A C(Acm)NH2
HS(CH2)2NHA K A A A E K A A A E K A A A EC(Acm)NH2
Grupę Acm usunięto po wytworzeniu
monowarstwy, bez naruszania jej struktury.
Warunki odblokowania: Hg2+ w roztworze
wodnym pH=4.
45
5
Zaprojektowano trzy peptydy o długości 15, 16 i 17 aminokwasów.
W sekwencji przeważa alanina (A), aminokwas, który wykazuje
największą tendencję do wytwarzania struktury helikalnej. W sekwencji
występuje również lizyna (K) i kwas glutaminowy (E), oddalone od
siebie o cztery aminokwasy, wytwarzające mostki solne dodatkowo
stabilizujące helisę.
Podczas chemisorpcji i samoorganizacji
grupa tiolowa cysteiny była chroniona grupą
Acm,
co
umożliwiło
ukierunkowaną
adsorpcję peptydów.
I [nA]
Transport elektronów stanowi podstawę większości procesów
komórkowych. Ze względu na trudności jakie sprawia śledzenie
układów biologicznych, uczestniczących w przekazywaniu elektronów
konieczne jest tworzenie prostszych układów modelowych. Obecnie
duży nacisk kładzie się na badania układów syntetycznych
zawierających wiązania peptydowe. Tego rodzaju cząsteczki,
odpowiednio zaprojektowane, dają możliwość modelowania różnych
ścieżek transportu elektronowego w białkach, zachodzącego przez
wiązania kowalencyjne i wiązania wodorowe obecne w strukturach
α-helisy i β-kartki.
Widmo dichroizmu kołowego zsyntetyzowanych peptydów
Charakterystyka
prądowa
tunelowego Au-peptyd-Au
złącza
Schemat pomiaru – cząsteczka
peptydu pomiędzy elektrodą a igłą
mikroskopu
Podsumowanie
 Zaprojektowano modelowe peptydy o strukturze helikalnej
 Przeprowadzono syntezę i oczyszczono zaplanowane
peptydy
 Zbadano helikalność otrzymanych peptydów
 Opracowano wygodną procedurę wytwarzania monowarstw
o jednoznacznym ukierunkowaniu adsorpcji peptydów
 Zsyntezowane peptydy zostały przebadane pod kątem
przewodnictwa elektronowego w Pracowni Teorii
i Zastosowania Elektrod przez dr Sławomira Sęka
 Wyniki zostały opublikowane w: Sęk S, Swiątek K, Misicka A
(2005) Electrical behavior of molecular junctions
incorporating alpha-helical peptide. J Phys Chem B.
109(49):23121-4.