QUANTUM RT-PCR Kit

kolumienki.pl
syngen.pl
QUANTUM Probe RT-PCR Kit
QUANTUM Probe + Hi-ROX RT-PCR Kit
QUANTUM Probe + Lo-ROX RT-PCR Kit
QUANTUM Green + Hi-ROX RT-PCR Kit
QUANTUM Green + Lo-ROX RT-PCR Kit
Zawartość opakowania i warunki przechowywania
QUANTUM Probe RT-PCR Kit
2x QUANTUM Probe RT-PCR Mix
20x Reverse Transcriptase
SY570671
1000 ul
200 ul
QUANTUM Probe + Hi-ROX RT-PCR Kit
2x QUANTUM Probe + Hi-ROX RT-PCR Mix
20x Reverse Transcriptase
SY570661
1000 ul
200 ul
QUANTUM Probe + Lo-ROX RT-PCR Kit
2x QUANTUM Probe + Lo-ROX RT-PCR Mix
20x Reverse Transcriptase
SY570651
1000 ul
200 ul
QUANTUM Green + Hi-ROX RT-PCR Kit
2x QUANTUM Green + Hi-ROX RT-PCR Mix
20x Reverse Transcriptase
SY570641
1000 ul
200 ul
QUANTUM Green + Lo-ROX RT-PCR Kit
2x QUANTUM Green + Lo-ROX RT-PCR Mix
20x Reverse Transcriptase
SY570631
1000 ul
200 ul
Zestawy QUANTUM RT-PCR transportowane są w
warunkach chłodniczych, bez suchego lodu. Standardowe
przechowywanie przebiega w temperaturze -20°C.
Zestawy wytrzymują do 30 cykli zamrażania i rozmrażania
bez utraty aktywności. Aby ułatwić pracę w przypadku
używania kitu dzień po dniu, możliwe jest
przechowywanie go do 1 miesiąca w temperaturze +4°C.
Opis komponentów
Zestawy QUANTUM RT-PCR składają się z dwóch miksów:
- 20x Reverse Transcriptase
- 2x QUANTUM RT PCR Mix
Miks 20x Reverse Transcriptase zawiera modyfikowaną
genetycznie odwrotną transkryptazę M-MLV, będącą
wysoce aktywną polimerazą DNA zależną od RNA UniversalScript Reverse Transcriptase. Enzym syntetyzuje
komplementarną nić cDNA na matrycy RNA, począwszy
od specyficznych primerów dodanych do reakcji.
Dodatkowo miks zawiera inhibitor RNaz, co zapobiega
ewentualnej degradacji RNA i pozwala na uzyskanie
pełnowymiarowego cDNA w dużej ilości. Enzym
utrzymuje formę płynną w temperaturze -20°C dzięki
specjalnemu buforowi do przechowywania.
Miksy 2x QUANTUM Probe RT-PCR Mix oraz QUANTUM
Green RT-PCR Mix to gotowe do użycia 2-krotnie stężone
miksy do ilościowej reakcji PCR zawierające polimerazę
oraz wszystkie niezbędne składniki reakcji w optymalnych
stężeniach, poza primerami/sondą, matrycą i wodą.
Uniwersalny bufor reakcyjny został skomponowany tak,
aby zoptymalizować zarówno wydajność procesu
odwrotnej transkrypcji, jak i specyficzność następującej po
nim reakcji PCR. W skład buforu wchodzi MgCl2 w
optymalnym stężeniu, a także mieszanina dNTP. W miksie
QUANTUM Green RT-PCR Mix zawarty jest dodatkowo
nowoczesny barwnik interkalujący, niepowodujący
inhibicji reakcji. Zestawy z oznaczeniem +Hi-ROX i +LoROX zawierają w składzie dodatkowo pasywny barwnik
ROX w stężeniu optymalnym dla poszczególnych
termocyklerów.
Przeznaczenie zestawów
Zestawy
QUANTUM
Probe
RT-PCR
Kit
są
zoptymalizowane do ilościowej reakcji RT-PCR z
zastosowaniem sond. Zestawy są kompatybilne z każdym
rodzajem sond oraz ze wszystkimi termocyklerami,
zarówno płytkowymi, jak i rotorowymi, kapilarnymi i
mikropłytkowymi. Wersje +Hi-ROX i +Lo-ROX
przeznaczone są dla termocyklerów ze zmienną drogą
optyczną, wykorzystujących pasywny barwnik ROX.
W zestawach QUANTUM Green RT-PCR Kit zastosowano
zielony barwnik interkalujący, a także w zależności od
wariantu – barwnik ROX, wykorzystywany przez
termocyklery ze zmienną drogą optyczną. Zestawy są
kompatybilne
ze
wszystkimi
termocyklerami
odczytującymi barwniki typu FAM i SYBR® Green I,
zarówno płytkowymi, jak i rotorowymi, kapilarnymi i
mikropłytkowymi.
Przykłady kompatybilnych termocyklerów
QUANTUM Probe RT-PCR Kit
zestawy kompatybilne z termocyklerami niewymagającymi barwnika referencyjnego ROX, w tym: Bio-Rad
CFX96, CFX384, Opticon™, Opticon™ 2, Chromo 4™,
MiniOpticon, Roche LightCycler® 1.5, 2.0, 480, Bioer
LineGene 9600, 9600 Plus i K, Corbett Rotor-Gene™ 3000 i
6000, QIAGEN Rotor-Gene™ Q, Eppendorf MasterCycler®
ep realplex, Cepheid SmartCycler™, Analytic Jena qTower,
Illumina® Eco™
QUANTUM Probe +Hi-ROX RT-PCR Kit
QUANTUM Green +Hi-ROX RT-PCR Kit
zestawy kompatybilne z termocyklerami wykorzystującymi barwnik referencyjny ROX w wysokiem stężeniu, w
tym: ABI PRISM® StepOne/Plus, GeneAmp 5700, ABI
PRISM® 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT fast,
Stratagene Mx3000P™, Mx3005P™, Mx4000® oraz z
termocyklerami niewykorzystującymi barwnika ROX
QUANTUM Probe +Lo-ROX RT-PCR Kit
QUANTUM Green +Lo-ROX RT-PCR Kit
zestawy kompatybilne z termocyklerami wykorzystującymi barwnik referencyjny ROX w niskim stężeniu, w tym:
Bio-Rad iCycler iQ™, MyiQ, iQ5, ABI PRISM® 7500, 7500
fast, ViiA 7, Stratagene Mx3000P™, Mx3005P™, Mx4000®
oraz z termocyklerami niewykorzystującymi barwnika
ROX
Użytkowanie zestawów QUANTUM
na termocyklerach LightCycler 1.5 i LightCycler 2.0
Ze względu na powinowactwo składników reakcji (w tym
polimerazy) do szkła, z którego wykonane są kapilary
reakcyjne wydajność reakcji może drastycznie spadać. Aby
zablokować to niepożądane zjawisko, zalecamy dodatek
BSA do mastermiksu reakcyjnego.
kolumienki.pl
Mastermiks
Mastermiks należy przygotowywać „na świeżo” i zużyć w
ciągu jednego eksperymentu, nie można go
przechowywać. Przed dodaniem wody do mastermiksu
należy uwzględnić zakres stężeń matrycowego RNA, które
zamierzamy przepisywać. Matrycę dodajemy do
mastermiksu, a nie odwrotnie.
Procedura dla zestawów
QUANTUM Green + Hi-ROX RT-PCR Kit
QUANTUM Green + Lo-ROX RT-PCR Kit
1. Wszystkie składniki należy całkowicie rozmrozić (o ile
przechowywano je w -20°C), zworteksować i zwirować.
2. Przygotować mastermiks wg poniższej tabeli.
syngen.pl
Składnik 1 reakcji
Procedura dla zestawów
QUANTUM Probe RT-PCR Kit
QUANTUM Probe + Hi-ROX RT-PCR Kit
QUANTUM Probe + Lo-ROX RT-PCR Kit
1. Wszystkie składniki należy całkowicie rozmrozić (o ile
przechowywano je w -20°C), zworteksować i zwirować.
2. Przygotować mastermiks wg poniższej tabeli.
Składnik 1 reakcji
2x QUANTUM RT PCR Mix
10 uM Primer F
10 uM Primer R
10 uM Sonda
20x Reverse Transcriptase
Matrycowe RNA
Woda do PCR
Objętość
10 ul
0,8ul
0,8ul
0,4 ul
1 ul*
-
Stężenie w
reakcji
1x
0,4 uM
0,4 uM
0,2 uM
1x*
1 pg – 1 ug
(>10 fg mRNA)
-
dopełnić
do 20 ul
Objętość końcowa
20 ul
* podwojenie zawartości miksu RT wzmocni wynik
odwrotnej transkrypcji, ale zwiększy namnażanie dimerów
primerów.
3. Do poszczególnych probówek reakcyjnych dodać
najpierw mastermiks.
4. Następnie do poszczególnych probówek zawierających
mastermiks dodać matrycowe RNA.
5. Zamknąć probówki, umieścić w termocyklerze
i uruchomić program wg poniższej tabeli.
Krok cyklu
Temp.
Czas
Powt.
Odwrotna
45°C*
10 min.
transkrypcja
Aktywacja polimerazy
95°C
2 min.
hot start
Denaturacja
95°C
5 sek.
40 cykli
Annealing i Elongacja
60-65°C 20-30 sek.**
* Gdy amplikon zawiera skomplikowane struktury
drugorzędowe, można zastosować wyższą temperaturę,
maksymalnie 55°C.
** Czas elongacji nie powinien przekraczać 30 sek.
2x QUANTUM RT PCR Mix
10 uM Primer F
10 uM Primer R
10 uM Sonda
20x Reverse Transcriptase
Matrycowe RNA
Woda do PCR
Objętość
10 ul
0,8ul
0,8ul
0,4 ul
1 ul*
-
Stężenie w
reakcji
1x
0,4 uM
0,4 uM
0,2 uM
1x*
1 pg – 1 ug
(>10 fg mRNA)
-
dopełnić
do 20 ul
Objętość końcowa
20 ul
* podwojenie zawartości miksu RT wzmocni wynik
odwrotnej transkrypcji, ale zwiększy namnażanie dimerów
primerów.
3. Do poszczególnych probówek reakcyjnych dodać
najpierw mastermiks.
4. Następnie do poszczególnych probówek zawierających
mastermiks dodać matrycowe RNA.
5. Zamknąć probówki, umieścić w termocyklerze
i uruchomić program wg poniższej tabeli.
Krok cyklu
Temp.
Czas
Powt.
Odwrotna
45°C*
10 min.
transkrypcja
Aktywacja polimerazy
95°C
2 min.
hot start
Denaturacja
95°C
5 sek.
40 cykli
Annealing i Elongacja
60-65°C 20-30 sek.**
Melting
opcja
* Gdy amplikon zawiera skomplikowane struktury
drugorzędowe, można zastosować wyższą temperaturę,
maksymalnie 55°C.
** Czas elongacji nie powinien przekraczać 30 sek.
Producent
Syngen Biotech Sp. z o.o. Sp. k.
54-116 Wrocław, ul. Ostródzka 13
tel. 71 349 70 13, 71 349 91 66, 71 349 61 67, faks 71 349 70 33
kolumienki.pl, syngen.pl, [email protected]