Zastosowanie analizy 1SAR w badaniach leków o działaniu

&ARM0RZEGL.AUK†
:ASTOSOWANIEANALIZY13!2WBADANIACHLEKÌW
ODZIAŒANIUSEROTONINERGICZNYM)
!PPLICATIONOF13!2ANALYSISINTHESTUDIESOFSEROTONINERGICDRUGS)
'RA˜YNAˆYDEK%L˜BIETA"RZEZIÊSKA
:AKŒAD#HEMII!NALITYCZNEJ+ATEDRA#HEMII-EDYCZNEJ7YDZIAŒ&ARMACEUTYCZNY
5NIWERSYTET-EDYCZNYW|ODZI
Streszczenie
Abstract
Przeprowadzono analizę ilościowej zależności pomiędzy strukturą i działaniem (QSAR) wybranych 20 leków
działających na receptory serotoninowe (5-HT). W analizie zastosowano parametry fizykochemiczne badanych
związków obliczone przy użyciu programu HyperChem
7.0 oraz dane chromatograficzne. Przeprowadzono chromatografię cienkowarstwową na płytkach pokrytych silikażelem NP 60F254, impregnowanych roztworami pochodnych aminokwasów wiążących w kompleksie lek-receptor
serotoninowy oraz ich mieszanin (S1-S7), w obecności
dwóch faz rozwijających – w celu uzyskania modelu interakcji lek-receptor 5-HT. Związek pomiędzy aktywnością
biologiczną a danymi chromatograficznymi i deskryptorami molekularnymi badano analizą regresji wielokrotnej.
Ustalono modele analityczne zależności pomiędzy działaniem badanych związków i ich interakcją ze środowiskiem biochromatograficznym (S1-S7). Zaproponowane
równania regresji oparte na wynikach badań biochromatograficznych, mogą służyć jako skuteczne narzędzie analizy QSAR do wstępnego przewidywania kierunku działania związków w obrębie receptorów serotoninowych.
Quantitative structure-activity relationships (QSAR) analysis of the selected 20 drugs with serotonin (5-HT) receptors affinities was carried out. A set of physicochemical
parameters calculated by HyperChem 7.0 program and
chromatographic data were applied in this analysis. Thin
layer chromatography was performed on silica gel NP
60F254 plates impregnated with solutions of amino acids
analogues and their mixtures (S1-S7), with two mobile
phases – the system were chosen as models of drug-5-HT
receptor interaction. Relationships between chromatographic data and molecular descriptors and biological activity data were found by use of regression analysis. The
correlations obtained for the compounds with serotoninergic activity represent their interaction with the proposed
biochromatographic models (S1–S7). The presented regression models based on biochromatographic studies
can be an efficient tool in the QSAR analysis for initial
prediction of compound activity direction within 5-HT
receptors.
Słowa kluczowe: receptory serotoninowe, biochromatografia, chromatografia cienkowarstwowa, analiza QSAR,
analiza regresji
Wstęp
Znajomość budowy i funkcji farmakodynamicznej określonego celu biologicznego może być podstawą poszukiwania modelu analitycznego do pośredniej obserwacji zachowania związków chemicznych w warunkach fizjologicznym. Do tego celu służyć może tak zwane środowisko biochromatograficzne, wykorzystujące funkcjonalne elementy
struktury celu biologicznego. Stanowi ono, w pewnym sensie, laboratoryjną imitację środowiska naturalnego działania
potencjalnego leku. Dostępne informacje na temat miejsc
wiążących ligandy w obrębie receptora serotoninowego
(5-HT) pozwalają na wyposażenie modelu biochromatograficznego w elementy chemiczne środowiska biologicznego,
bezpośrednio odpowiedzialne za tworzenie kompleksu lek-receptor. Informacje te stwarzały możliwość zbudowania
Keywords: serotonin receptors, biochromatography, thin
layer chromatography, QSAR analysis, regression analysis
analitycznego modelu interakcji związków chemicznych
z tym receptorem, dla wstępnego przewidywania aktywności biologicznej potencjalnych jego ligandów.
Receptory serotoninowe to długie, nierozgałęzione, zbudowane z kilkuset reszt aminokwasowych, łańcuchy białkowe. Dowody na istnienie różnych typów (klas) receptorów
serotoninergicznych zostały przedstawione przez J. H. Gadduma i Z. Picarellego w 1957 roku [1]. Obecnie receptory
te dzielimy na 7 typów, które dalej dzielą się na podtypy:
5-HT1 (5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT1D, 5-HT1E, 5-HT1F), 5-HT2
(5-HT2A, 5-HT2B, 5-HT2C), 5-HT3, 5-HT4 (5-HT4(a), 5-HT4(b),
5-HT4(c), 5-HT4(d)), 5-HT5 (5-HT5A, 5-HT5B), 5-HT6, 5-HT7.
Wszystkie należą do receptorów metabotropowych z wyjątkiem rodziny 5-HT3, która zaliczana jest do klasy receptorów
jonotropowych. Obecnie wiadomo, że reszta kwasu asparaginowego (Asp155), znajdująca się w III domenie trans
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
NH
H3C
OH
O
OH
CH3
N
N
O
H3C
N
N
CH3
H3C
N
N
F
S
O
F
O
F
1. Tiapryd
F
CH3
S
N
Cl
S
4. Trifluoperazyna
3. Flupentiksol
CH3
N
N
N
S
Cl
2. Klopentiksol
N
N
CH3
N
N
H
N
N
O
F
N
H
5. Klozapina
CH3
N
6. Risperidon
N
CH3
S
7. Olanzapina
N
O
N
N
F
N
F
N
N
N
CH3
N
O
O
NH
O
10 . Trazodon
8. Tropisetron
H3C
S
N
Cl
9. Cyproheptadyna
N
N
O
N
N
N
N
N
N
N
11 . Mianseryna
13 . Mirtazapina
12 . Pizotifen
NH
H
N
N
N
S
H3C
O
N
15 . Sumatriptan
N
H3C
CH3
H3C
O
O
Cl
N
18 . Cisaprid
HO
N
17 . Zolmitriptan
CH3
CH3
Materiał i metody
Substancje badane
Oznaczeń dokonano na grupie znanych leków (zw. 1-20;
H3C
NH
O
Ryc. 1), będących w sprzedaży
OH
aptecznej, o aktywności skierowanej na receptory seroto20 . Propranolol
ninowe. Izolowanie substancji
aktywnych z preparatów farmaceutycznych przeprowadzono
metodami opisanymi według monografii szczegółowych
przedstawionych w FP i informacji dostępnych w The
Merck Index Twelfth Edition, 1996. Dane o właściwościach
farmakologicznych i kierunku działania poszczególnych
związków, zaczerpnięte z baz danych (PubMed, DrugBank,
ChemBank, Organon), przedstawiono w Tabeli I.
CH3
H
N
NH2
NH
N
H
CH3
16 . Rizatriptan
CH3
F
H
N
O
CH3
N
O
O
O
CH3
H
N
O
14 . Buspiron
H3C
N
wano również elementy wiążące ligandy związane z TM5.
Była to treonina (Thr196) [16].
W innych odmianach receptora
5-HT treoninie odpowiadała alanina (Ala). W obu przypadkach
sugeruje się tworzenie wiązania
wodorowego z atomem azotu
liganda. Oddziaływania z receptorami 5-HT umożliwia również
reszta asparaginy (Asn333).
Poznanie dokładnej sekwencji aminokwasów w łańcuchu
białkowym receptorów oraz
przeprowadzanie ich mutacji,
pozwala na dokładne zbadanie
ich powinowactwa do poszczególnych
neuroprzekaźników
oraz ligandów [17-24]. Ułatwia
to znacznie procesy projektowania nowych leków.
Celem przeprowadzonych badań w niniejszej pracy jest określenie możliwości wykorzystania
techniki chromatograficznej oraz
analizy QSAR do opracowania
równań matematycznych, umożliwiających wstępne przewidywanie wiązalność z receptorem
(pKi), aktywność agonistyczną
(pD2) oraz antagonistyczną (pA2)
związków o potencjalnym działaniu na receptory serotoninowe.
NH2
O
19 . Serotonina
Ryc. 1. Struktury badanych związków 1-20.
membranowej (TM3), tworzy wiązania jonowe z grupami
aminowymi ligandów [2-8]. Udział w tworzeniu kompleksu
z cząsteczkami bierze również reszta seryny (Ser159), zlokalizowana w TM5, która tworzy wiązanie wodorowe z grupami hydroksylowymi ligandów [9] oraz reszta fenyloalaniny (Phe340) w TM6, która poprzez pierścień aromatyczny
stabilizuje cząsteczkę serotoniny [10-11]. Stabilizowanie
pierścieni aromatycznych w receptorach metabotropowych
(GPCR) odbywa się również poprzez reszty aminokwasowe
tryptofanu (Trp200, Trp336, Trp367) i tyrozyny (Tyr370).
Stabilizacja ta jest zwykle oparta na prostych oddziaływaniach hydrofobowych. W przypadku tryptofanu sugeruje
się również możliwość stabilizacji podstawników dodatnio
naładowanych amin alifatycznych [12-15]. W niektórych
odmianach receptora serotoninowego (5-HT6) zaobserwo-
Analiza chromatograficzna
Substancje badane 1-20 zostały poddane analizie chromatograficznej w powtarzalnych warunkach. Podczas doświadczeń został ustalony skład fazy organicznej mieszaniny. Fazę wodną stanowi bufor (octan amonu 0,02 mol/L)
o pH 7,4, zgodnym z warunkami badań biologicznych.
Chromatografię przeprowadzono przy użyciu dwóch rodzajów fazy ruchomej:
&ARM0RZEGL.AUK
Tab. I. Aktywności biologiczne dla związków 1-20
Zw.
pKi1
pD22
pA23
1
7,97
5,10
2
7,60
7,99
7,30
3
7,00
7,88
6,90
4
7,90
8,04
5,70
5
6,00
7,50
6
9,90
8,16
6,69
7
8,10
8,10
7,20
8
8,40
6,50
9
8,22
8,73
10
7,40
8,79
11
9,70
8,09
7,50
12
7,40
9,20
13
8,40
6,88
7,99
14
7,70
7,70
6,35
15
6,60
5,80
16
6,37
6,30
17
6,64
6,20
18
7,40
7,60
7,30
19
6,40
20
7,50
6,00
pKi – powinowactwo leku do receptora
pD2 – aktywność agonistyczna
3
pA2 – aktywność antagonistyczna
1
2
(i) acetonitryl : metanol : bufor pH 7,4 (DSA; 40:40:20,
v/v/v)
(ii) acetonitryl : metanol : chlorek metylenu : bufor pH 7,4
(DSB; 60:10:10:20, v/v/v/v).
Jako fazy stacjonarnej użyto płytek aluminiowych z żelem krzemionkowym (NP TLC 60F254, 20x20 cm, Merck,
Darmstadt Germany). Analiza prowadzona w normalnym
układzie faz (NP TLC). Fazę stacjonarną modyfikowano
poprzez nasycenie roztworami pochodnych aminokwasów
wiążących dla uzyskania zaplanowanych środowisk biochromatograficznych. W każdym wariancie fazy ruchomej
(DSA i DSB) i stacjonarnej przeprowadzano badanie dwukrotnie.
Do impregnacji płytek wykorzystano 0,03 mol/L roztwory kwasu propionowego, alkoholu etylowego, etylobenzenu,
4-hydroksyetylobenzenu, amidu kwasu propionowego oraz
alkoholu izopropylowego. Alkoholu etylowego i izopropylowego użyto tylko do sporządzenia roztworów wieloskładnikowych.
Płytki poddano wstępnemu pasażowaniu (w obecności
odpowiedniej fazy ruchomej DSA lub DSB) w warunkach
chromatografii przez 1,5 godziny, następnie płytki suszono
na powietrzu. Suche płytki, które zostały poddane procedurze pasażowania, impregnowano przy użyciu spryskiwacza
(GS1, Desaga) przygotowanymi roztworami uzyskując odpowiednie modele biochromatograficzne:
a) kwas propionowy – model S1
b) etylobenzen - model S2
c) 4-hydroksyetylobenzen – model S3
d) amid kwasu propionowego – model S4
e) kwas propionowy i alkohol etylowy (1:1; v:v) – model
S5
f) kwas propionowy, alkohol etylowy oraz etylobenzen
(1:1:1; v:v:v) – model S6
g) amid kwasu propionowego i alkohol izopropylowy (1:1;
v:v) – model S7.
Płytki po impregnacji suszono przy dostępie powietrza.
W celu wykonania analizy porównawczej, po dwie płytki
dla fazy DSA i DSB przygotowano bez roztworów S1-S7 –
płytki kontrolne (C).
Badane związki 1-20 odważono na wadze analitycznej
z dokładnością do 0,1 mg, a następnie rozpuszczono w metanolu w celu uzyskania stężenia 1 mg/mL. Za pomocą mikrostrzykawki Hamilton na wszystkie użyte w doświadczeniu płytki nanoszono badane związki (1-20) w ilości 1,0 μL.
Odległość pomiędzy nanoszonymi związkami wynosiła 0,8
cm, a średnica powstałych plamek około 2 mm. Zachowano odstęp od brzegu płytki w odległości 2,0 cm. Linia startu znajdowała się 2,0 cm powyżej dolnej krawędzi płytki.
Chromatogramy rozwijano na wysokość 10 cm licząc od
linii startu. Czas rozwijania chromatogramów wynosił dla
fazy DSA – 45 ± 2 min, dla fazy DSB – 38 ± 2 min.
Rozwijanie chromatogramu przeprowadzono w poziomej komorze chromatograficznej z dozownikiem eluentu,
DS-II-20x20 (CHROMDES, Lublin, Poland). Wykonano
analizę densytometryczną uzyskanych chromatogramów
z użyciem aparatu Desaga CD 60, przy długości fali 280
nm. Podstawowym parametrem, który wyznacza się z chromatogramu jest współczynnik opóźnienia Rf (ang. Retardation Factor), definiowany jako stosunek drogi przebytej
przez substancję chromatografowaną (od punktu startu do środka plamki - a) do drogi przebytej przez fazę
ruchomą (od linii startu do czoła fazy ruchomej - b);
Rf = a/b. Otrzymane wyniki analizy nie wykazały rozbieżności, a otrzymane wartości danych (Rf) dawały
średnią z dwóch kolejnych pomiarów. Współczynnik
opóźnienia Rf stanowił podstawę do wyliczenia współczynnika RM (jego logarytmicznej funkcji) z zależności
[25]: R M = log (1/R f – 1). Wartość współczynnika R f (R M)
jest charakterystyczna dla danej substancji, w konkretnym układzie chromatograficznym.
Wartości RM(S1-7) i RM(C) analizowanych związków opisano kolejno jako: S1-7 i C, natomiast pochodne tych wyników oznaczono odpowiednio jako: S1-7/C i C – S1-7.
Otrzymane wyniki z analizy chromatograficznej zostały
przedstawione w Tabeli II.
Parametry fizykochemiczne
Obliczenia parametrów fizykochemicznych wykonano
wykorzystując program HyperChem 7.0 i ACD/Labs 8.0.
Otrzymane wyniki zostały zestawione w Tabeli III. Podczas
obliczania parametrów: energia całkowita (ET [kcal·mol-1]),
energia wiązania (EB [kcal·mol-1]), ciepło tworzenia (HF
[kcal·mol-1]), moment dipolowy (μ [D]), energia orbitalu
HOMO (EHOMO [eV]), energia orbitalu LUMO (ELUMO [eV]),
pole powierzchni van der Waals’a (GSA [Å2]), objętość van
der Waals’a (MV [Å3]), energia hydratacji (EH [kcal·mol-1]),
współczynnik podziału oktanol/woda (logP), refrakcja mo-
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
Tab. II. Wartości RM otrzymane dla analizy przeprowadzonej z zastosowa- trybucji (logD), wartość równowagi kwasowoniem fazy rozwijającej DSA i DSB
zasadowej alifatycznego atomu azotu liganda
(pKa), polarne pole powierzchni cząsteczki
Zw,
C
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
liganda (PSA, [Å2]), liczba donorów (HD) oraz
Faza rozwijająca DSA
akceptorów (HA) wiązań wodorowych zosta1
0,720 0,644 0,704 0,673 0,659 0,689 0,704 0,689 ły wyliczone za pomocą programu ACD/Labs
2
0,140 -0,070 0,158 0,176 -0,026 0,158 0,131 0,017 8.0.
3
0,052 -0,167 0,105 0,105 -0,176 0,087 0,114 -0,087
Analiza regresji wielokrotnej (MR – Multi4
0,410 0,358 0,432 0,421 0,368 0,410 0,410 0,399
ple Regression)
5
0,122 0,070 0,194 0,194 0,043 0,158 0,149 0,070
Uzyskane dane chromatograficzne wraz
6
0,176 0,203 0,231 0,222 0,222 0,185 0,203 0,158 z obliczonymi komputerowo za pomocą pro7
0,443 0,432 0,537 0,562 0,454 0,513 0,525 0,443 gramu HyperChem 7.0 oraz ACD/Labs 8.0 de8
0,704 0,602 0,673 0,616 0,630 0,673 0,673 0,673 skryptorami fizykochemicznymi zostały pod9
0,389 0,149 0,358 0,327 0,052 0,347 0,368 0,368 dane analizie chemometrycznej.
Zależność pomiędzy zachowaniem się bada10 -0,525 -0,489 -0,466 -0,421 -0,477 -0,466 -0,477 -0,489
nych związków działających na receptory sero11 -0,087 -0,167 0,009 0,026 -0,149 0,000 -0,061 -0,105 toninowe (zw. 1-20) w środowiskach chroma12 0,399 0,105 0,389 0,347 0,308 0,368 0,389 0,368 tograficznych S1-S7 (zaproponowanych jako
13 0,140 0,149 0,213 0,240 0,158 0,194 0,203 0,167 analityczne modele aktywności serotoninowej)
14 -0,410 -0,399 -0,337 -0,278 -0,399 -0,368 -0,358 -0,389 i właściwościami fizykochemicznymi a ich
15 0,602 0,489 0,575 0,550 0,489 0,575 0,589 0,589 wiązalnością z receptorem (pKi), aktywnością
agonistyczną (pD2) i antagonistyczną (pA2)
16 0,845 0,771 0,826 0,845 0,771 0,865 0,865 0,845
badano z wykorzystaniem liniowej i wielokrot17 0,659 0,550 0,689 0,602 0,562 0,659 0,644 0,630 ną analizę regresji (metoda – analiza krokowa
18 -0,454 -0,575 -0,410 -0,432 -0,537 -0,466 -0,399 -0,489 postępująca). Analizę regresji przeprowadzo19 0,501 0,298 0,602 0,602 0,337 0,466 0,501 0,421 no przy wykorzystaniu programu STATISTI20 0,288 -0,537 0,167 0,096 -0,501 0,158 0,213 0,176 CA 8.0. W opisanej analizie statystycznej jako
zmienne niezależne zastosowano: dane chroFaza rozwijająca DSB
matograficznej (C, S1-S7, S1-7/C, C – S1-7)
1
0,602 0,513 0,562 0,562 0,454 0,575 0,589 0,575 oraz obliczone deskryptory fizykochemiczne.
2 -0,140 -0,231 -0,149 -0,158 -0,213 -0,167 -0,167 -0,203 Jako zmienne zależne użyto miary aktywno3 -0,231 -0,298 -0,213 -0,213 -0,278 -0,259 -0,240 -0,259 ści biologicznej analizowanych związków:
4 -0,105 -0,167 -0,131 -0,122 -0,213 -0,122 -0,122 -0,185 pKi, pD2 oraz pA2. Obliczenia statystyczne
5 -0,105 -0,158 -0,096 -0,114 -0,176 -0,114 -0,114 -0,149 przeprowadzono przy 95% poziomie ufności
(p<0,05). Parametry statystyczne dla uzyska6
0,259 0,203 0,278 0,250 0,194 0,231 0,240 0,231
nych równań regresji: współczynnik korelacji
7
0,298 0,203 0,269 0,278 0,194 0,288 0,288 0,240 (R), współczynnik determinacji (R2), wartości
8
0,250 0,176 0,250 0,259 0,167 0,278 0,231 0,240 F-statystyki (F), poziom istotności statystycz9 -0,167 -0,288 -0,203 -0,213 -0,288 -0,194 -0,213 -0,231 nej (p), standardowy błąd estymacji (s) zostały
10 -0,443 -0,466 -0,399 -0,421 -0,443 -0,489 -0,454 -0,421 przedstawione w Tabeli IV. Użycie więcej niż
jednej zmiennej w równaniach regresji wie11 -0,308 -0,368 -0,298 -0,327 -0,368 -0,347 -0,337 -0,327
lorakiej uzasadnione jest zbadaniem korelacji
12 -0,176 -0,278 -0,194 -0,194 -0,298 -0,222 -0,176 -0,250 cząstkowych między parametrami. Uwzględ13 0,052 -0,026 0,061 0,026 -0,026 0,035 0,043 0,000 niono tylko takie korelacje cząstkowe, które
14 -0,259 -0,327 -0,231 -0,250 -0,337 -0,278 -0,269 -0,278 posiadały wartości mniejsze od 0,70. Korelacje
15 0,432 0,203 0,378 0,317 0,269 0,378 0,399 0,337 cząstkowe powyżej wspomnianej wartości da16 0,826 0,720 0,826 0,788 0,771 0,826 0,826 0,865 wały zbyt wysoki współczynnik R (zbyt dobre
równanie korelacji) i byłyby nieadekwatne do
17 0,550 0,347 0,525 0,477 0,368 0,537 0,525 0,525
równań oczekiwanych, a więc i wynik końco18 -0,410 -0,443 -0,399 -0,389 -0,421 -0,477 -0,454 -0,399 wy analizy byłby zafałszowany.
19 0,501 0,194 0,525 0,421 0,231 0,368 0,358 0,317
Walidacja
20 -0,158 -0,259 -0,176 -0,167 -0,250 -0,185 -0,185 -0,185
Przeprowadzono badanie wartości predykcyjnej ustalonych modeli regresyjnych.
lowa (MR [Å3]), polaryzowalność (α [Å3]), masa cząstecz- Z powodu mało licznej grupy badanej, modele poddano
kowa (Mass [g·mol-1]) oraz ładunek elektryczny na atomie weryfikacji testem Leave-One-Out Cross Validation (LOO
azotu aminy alifatycznej (QN) za pomocą programu Hyper- CV) w celu niezależnej oceny metody. Cały zbiór danych
Chem 7.0 zastosowano metodę półempiryczną AM1 z algo- dzielono wielokrotnie na dwa podzbiory, przy czym jeden
rytmem postępowania Polak-Ribiere’a. Współczynnik dys- podzbiór służący do budowy modelu składał się z n-1 ele-
&ARM0RZEGL.AUK
1
1
1
0
1
0
1
1
0
0
0
0
0
0
2
1
2
3
4
2
6
3
3
3
4
6
4
4
1
6
2
1
3
7
5
5
5
7
3
3
HD
PSA
pKa
9,660
3,400
3,400
8,210
7,140
7,890
6,080
10,000
8,950
6,730
8,260
9,040
8,100
6,730
9,490
9,490
9,520
7,770
10,310
9,140
logD
QN
Mass
328,426
400,966
434,519
407,497
326,829
410,491
312,433
284,358
287,404
371,869
264,370
295,442
265,358
385,509
295,400
269,349
287,362
465,952
176,218
259,348
31,512
44,971
44,605
41,841
36,471
43,543
35,900
31,530
36,028
39,935
32,258
35,742
31,549
42,114
29,339
31,130
31,820
47,392
20,147
30,251
α
MR
91,230
125,836
126,334
119,657
103,527
118,480
100,059
85,350
102,757
109,910
91,207
99,089
87,078
109,352
85,919
87,268
86,026
122,436
56,325
83,380
-1,561
-0,058
0,734
-0,189
-0,730
0,631
-0,268
-0,379
1,772
0,398
0,940
0,498
1,159
1,179
-1,533
-1,307
-1,013
2,246
-2,208
0,680
logP
EH
-5,377
-7,202
-7,158
-1,068
-2,846
-3,954
-2,750
-4,731
-1,137
-3,394
-0,671
-0,785
-1,557
-1,853
-7,570
-6,377
-6,126
-8,507
-15,763
-7,250
299,487
362,081
375,931
353,227
297,108
374,259
908,509
268,608
290,432
336,505
264,061
285,550
259,656
371,810
270,642
264,074
275,043
412,469
168,406
260,891
MV
GSA
363,122
390,649
428,401
397,66
332,898
417,973
534,025
306,24
320,589
386,683
294,118
315,584
289,582
427,837
327,288
312,82
320,462
480,4
204,407
311,485
-0,8138675
-0,8795735
-0,6107714
-0,5433432
-0,3728039
-0,6652046
-0,4581621
-0,1467351
-0,2251996
-0,5326552
0,4595214
0,05507502
0,1338292
0,1302918
-0,5024017
0,05110605
-0,00465511
-0,1129853
0,13555862
-0,5060177
ELUMO
EHOMO
-9,223006
-7,679547
-8,185675
-7,748451
-8,120341
-8,884932
-8,203828
-8,832393
-8,51944
-8,490873
-8,560602
-8,663204
-8,712882
-8,767308
-8,354092
-8,535871
-8,489959
-8,756364
-8,307039
-8,774205
5,419
1,296
3,341
3,373
4,266
2,832
2,471
5,200
0,930
3,651
1,693
0,518
1,400
4,108
2,301
5,473
6,508
3,887
3,411
2,205
μ
HF
-114,41802
66,706707
-126,83314
-77,028567
103,02242
-3,6329411
101,99217
-14,166268
78,665389
104,46058
78,003214
59,580266
82,984902
-34,379971
-16,01921
139,35663
-22,21843
-162,07634
1,2205941
-55,71855
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
-4458,85
-5376,37
-5768,48
-5378,24
-4443,93
-5930,86
-4363,58
-4306,45
-4717,17
-4942,24
-4266,06
-4460,87
-4151,08
-5922,35
-4027,14
-3978,93
-4308,72
-6228,62
-2618,46
-4116,22
ET
-95473,516
-102871,32
-130832,64
-121985,47
-86841,847
-121479,92
-80076,438
-80841,486
-73412,657
-102872,02
-69008,062
-72005,618
-70511,878
-110495,96
-81555,823
-74102,912
-82988,146
-140797,97
-50258,522
-73460,184
Zw.
EB
-0,283
-0,264
-0,260
-0,243
-0,257
-0,251
-0,258
-0,219
-0,243
-0,253
-0,254
-0,259
-0,247
-0,261
-0,268
-0,266
-0,280
-0,267
-0,350
-0,302
-1,480
5,060
4,420
4,210
3,280
2,270
2,680
1,070
4,860
1,580
2,760
4,490
1,970
3,350
-1,380
-1,100
-0,440
2,600
-2,200
1,370
84,090
52,010
52,010
35,020
30,870
61,940
59,110
45,330
3,240
42,390
6,480
31,480
19,370
69,640
73,580
44,810
57,360
86,050
62,040
41,490
HA
Tab. III. Obliczone parametry fizykochemiczne dla związków 1-20
mentów, natomiast element, który nie brał udziału w budowaniu modelu był stosowany do jego weryfikacji. Obliczono współczynnik walidacji Q2 przy użyciu wzoru [26]:
n
(y – y )2
Q2 = 1 – Σi=1n exp,i pred,i2
Σi=1(yexp,i – ŷ)
gdzie
yexp – wartość badanej cechy uzyskana z pomiarów (eksperymentalna), ypred – wartość badanej cechy obliczona na
podstawie modelu (predykcyjna), ŷ – wartość średnia yexp.
Model posiada tym większe zdolności prognostyczne,
jeżeli współczynnik determinacji R2>0,60 [26], oraz różnica
pomiędzy R2 i Q2 nie przekracza 0,2-0,3 [27].
Wyniki badań
Na podstawie informacji bibliograficznych mówiących
o wykorzystaniu danych chromatograficznych w analizie
QSAR dla receptorów β-adrenergicznych [28-29] oraz histaminowych [30-33] postanowiono przeprowadzić analogiczne badania dla receptorów serotoninowych. W niniejszej pracy badano możliwości wykorzystania metod chromatograficznych i danych fizykochemicznych do ustalenia
wiązalności z receptorem (pKi) , aktywności agonistycznej
(pD2) oraz antagonistycznej (pA2) wybranych 20 związków o udowodnionym działaniu na receptory serotoninowe.
W badaniach wykorzystano dane o budowie i funkcji tego
receptora [2-24]. Dane te dowodzą, że największe znaczenie dla wiązania ligandów odgrywają aminokwasy: kwas
asparaginowy (Asp155), seryna (Ser159), fenyloalanina
(Phe340), asparagina (Asn333), tyrozyna (Tyr370), treonina (Thr196), oraz tryptofan (200, 236, 367) zlokalizowane w obrębie receptora 5-HT. Informacje te, umożliwiły
stworzenie hipotetycznego modelu interakcji lek-receptor
serotoninowy, gdzie do środowiska chromatograficznego
(faza stacjonarna S1-S7) zostały wprowadzone tzw. analogi aminokwasów. Aminokwasy używane do modyfikacji
fazy stacjonarnej [28-31] posiadają reaktywne grupy aminowe i karboksylowe, które w warunkach biologicznych nie
uczestniczą w tworzeniu kompleksu aktywnego. Pozostają
one w strukturze białkowej tworząc wiązanie peptydowe.
Obecność tych grup funkcyjnych w środowisku chromatograficznym może prowadzić do dodatkowych (niespecyficznych dla różnych aminokwasów) interakcji z badanymi
związkami. Zastosowane analogi mają więc budowę wybranych aminokwasów, pozbawionych podstawników (karboksylowego i aminowego) przy α-atomie węgla. I tak, kwas
asparaginowy (Asp) zastępuje kwas propionowy, serynę
(Ser) – alkohol etylowy, fenyloalaninę (Phe) – etylobenzen,
tyrozynę (Tyr) – 4-hydroksyetylobenzen, asparaginę (Asn)
– amid kwasu propionowego a treoninę (Thr) – alkohol izopropylowy. Zastosowanie alkoholu etylowego i izopropylowego jako substancji modyfikujących fazę stacjonarną samodzielnie jest bezcelowe. Zostały one użyte tylko w wieloskładnikowych roztworach do impregnacji płytek. Wartość
pH 7,4 środowiska chromatografii odpowiadała warunkom
fizjologicznym.
Zależność między zachowaniem się badanych związków
działających na receptory serotoninowe (zw. 1-20) w środowiskach chromatograficznych S1-S7 a ich wiązalnością
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
Tab. IV. Zależności pomiędzy wartościami aktywności biologicznej (pKi, pD2, pA2) a danymi
i deskryptorami molekularnymi
Nr
Zmienne niezależne – dane chromatograficzne
rów.
Faza rozwijająca DSA
pKi =
R
R2
F
s
(1)
a - b S5/C + c C-S6
0,48
0,23
2,4331
0, 97008
pD2 =
(2)
a - b C-S3 + c C-S7 - d C-S4
0,82
0,68
6,3321
0, 54929
pA 2 =
(3)
a - b S6
0,30
0,092
1,4152
1,1202
Faza rozwijająca DSB
pKi =
(4)
a - b C-S1 + c S2/C - d S4/C + e S3/C
0,72
0,52
3,7927
0, 82045
pD2 =
(5)
a - b C-S1 - c C-S4 + d S1/C
0,91
0,83
14,796
0, 39777
pA2 =
(6)
a - b S7 - c S6/C + d C-S3
0,72
0,52
4,4169
0, 87524
Zmienne niezależne – dane fizykochemiczne
pKi =
0,83
0,69
11,047
0,63866
(7)
a + b QN - c μ - d logD
pD2 =
0,83
0,69
6,6237
0,54091
(8)
a + b logD - c ELUMO - d EHOMO
pA2 =
(9)
a + b HF - c μ + d MR
0,83
0,69
8,8893
0,70727
Zmienne niezależne – dane chromatograficzne i fizykochemiczne
Faza rozwijająca DSA
pK i
0,85
0,73
9,3246
0, 61869
(10) a + b QN - c μ - logD - d S5/C
pD2 =
0,85
0,72
7,8794
0, 50873
(11)
a + b logD - c ELUMO - d S5/C
pA2 =
(12) a + b HF - c μ + d S5/C
0,84
0,70
9,2961
0, 69637
Faza rozwijająca DSB
pKi =
0,86
0,75
10,325
0, 59588
(13) a + b QN - c μ - d S5/C + e C-S6
pD2 =
0,94
0,88
21,295
0, 34044
(14) a - b C-S1 + c C-S4 - d pKa
pA2 =
(15) a + b HF - c S5 + d C-S5
0,85
0,72
10,311
0, 67122
z receptorem (pKi), aktywnością agonistyczną (pD2) i antagonistyczną (pA2) badano z zastosowaniem analizy regresji.
Badanie zależności pomiędzy pKi, pD2 i pA2 a danymi
(C), z chromatografii w środowisku kontroli, wykazało brak
korelacji. Obliczony współczynnik korelacji (R) wynosił:
0,22 i 0,28 (pKi, n=19, odpowiednio dla fazy DSA i DSB),
0,47 i 0,55 (pD2, n=13, odpowiednio dla fazy DSA i DSB) oraz
0,31 i 0,50 (pA2, n=16, odpowiednio dla fazy DSA i DSB).
Analiza zależności pomiędzy danymi o aktywności biologicznej badanych związków do receptora serotoninowego
i parametrami chromatograficznymi z udziałem fazy DSA
nie przyniosła interesujących wyników (równania 1-3, Tabela IV). Jedyne istotne statystycznie równanie (2) uzyskano dla związków działających agonistycznie (pD2, R=0.82;
n=13). Korzystniejsze okazało się zastosowanie fazy DSB.
Wielozmienne, istotne statystycznie zależności odnaleziono
chromatograficznymi
p
0, 11951
n
19
0, 01344
13
0,253977
16
0, 02722
19
0,00080
13
0, 02598
16
0,00044
19
0,01177
13
0,00224
16
0,00069
19
0,00691
13
0,00187
16
0,00042
19
0,00020
13
0,00122
16
dla wszystkich typów oznaczonej aktywności biologicznej (równania 4-6). Powinowactwo związków do receptora 5-HT pKi opisane jest udziałem modeli S1, S2, S3 i S4
(równanie 4). Otrzymana zależność wyjaśniają maksymalnie 52% wariancji i równocześnie opisują możliwe interakcje pomiędzy ligandami i resztami aminokwasów: Asp155,
Phe340, Asn333 i Tyr370. Reprezentowane są tu wszystkie
rodzaje interakcji pomiędzy elementami strukturalnymi
kieszeni hydrofobowej receptora i związkiem chemicznym
w kompleksie lek-receptor – wiązania jonowe, wodorowe
oraz stabilizowanie pierścieni aromatycznych ligandów siłami hydrofobowymi. Badanie aktywności antagonistycznej
ligandów receptora serotoninowego 5-HT pA2 osiągnęło
ten sam poziom istotności. Równanie (6) wyjaśnia również
52% wariancji całkowitej i opisuje oddziaływania ligandów
z aminokwasami: fenyloalaniną, kwasem asparaginowym,
seryną oraz asparaginą i treoniną (S3, S6, S7) uwidocznia-
&ARM0RZEGL.AUK
jąc wpływ wszystkich rodzajów oddziaływań pomiędzy elementami strukturalnymi kieszeni hydrofobowej receptora
i związkiem chemicznym w kompleksie lek-receptor. Analiza zależności pomiędzy parametrami chromatograficznymi i poziomem aktywności agonistycznej 5-HT badanych
związków, przeprowadzono z udziałem 13 przypadków
z oznaczoną wartością pD2, ponownie okazała się najkorzystniejsza. Stwierdzono bardzo dobrą korelację pomiędzy
poziomem aktywności agonistycznej badanych związków
do receptorów serotoninowych 5-HT i danymi chromatograficznymi (równanie 5). pD2 = 7,80(±0,36) - 17,22(±3,47)
C-S1 + 9,80(±3,93) C-S4 + 0,43(±0,22) S1/C (5)
Uwidocznił się tu wpływ oddziaływań ligandów z kwasem asparaginowym oraz asparaginą. Aminokwasy te reprezentują oddziaływania typu jonowego oraz wodorowego.
Uzyskane równanie opisuje 83% wariancji całkowitej.
Model ten może stanowić równanie o walorach predykcyjnych. Przeprowadzono badanie wartości predykcyjnej tego
modelu regresji. Zgodnie z opisem przedstawionym w części doświadczalnej pracy obliczono współczynnik walidacji
Q2, który dla równania 5 wyniósł 0,70. Różnica pomiędzy
wartością R2 dla tego równania i współczynnikiem walidacji
równa 0,13 potwierdza wiarygodność tego modelu.
Znaczenie klasycznej analizy QSAR, skutecznej w większości analiz potencjalnego działania substancji czynnej,
potwierdzono dla badanej grupy (1-20).
W celu przeprowadzenia poniższej analizy, wszystkie
związki 1-20, poddano badaniom strukturalnym i wyznaczono dla nich wartości deskryptorów molekularnych (Tabela III). Badanie objęło wszystkie deskryptory molekularne jako zmienne niezależne, kształtujące powinowactwo
do receptorów grupy 5-HT. Uzyskane w analizie korelacje
przedstawiono w Tabeli IV. Ujawniły się wyraźne wpływy
parametrów molekularnych (QN, μ, EHOMO, ELUMO, HF)
i termodynamicznych (MR, logD) przypadków (równania
7-9). Uzyskane modele matematyczne dla wszystkich typów aktywności biologicznej (pKi, pD2 i pA2) wyjaśniają
69% zmienności całkowitej i kształtują się na tym samym
poziomie współczynnika korelacji R = 0,83 (współczynnik
determinacji R2 = 0,69 potwierdza zdolność predykcyjną
równań). Biorąc pod uwagę znaczenie deskryptorów molekularnych w przewidywaniu aktywności biologicznej,
założono możliwość ich wykorzystania łącznie z danymi
chromatograficznymi we wspólnej analizie QSAR. Udział
deskryptorów molekularnych może uzupełnić obserwację
przypadków o cechy nieujawniające się w analizie chromatograficznej (wartości energetyczne, trwałość, rozkład ładunków, parametry steryczne). W rezultacie powstać mogą
bardziej efektywne narzędzia projektowania leków.
W pierwszej kolejności zbadano udział parametrów fizykochemicznych w analizie modeli chromatograficznych
typu DSA. Wyniki tej analizy, dla kolejnych zmiennych zależnych, przedstawiono w Tabeli IV (równania 10-12). Dla
wszystkich rodzajów aktywności biologicznej uzyskano
istotne statystycznie korelacje. Powstałe modele matematyczne wyjaśniają ponad 70% zmienności całkowitej.
Badanie zależności dla fazy rozwijającej DSB dało ponownie lepsze wyniki analizy regresji dla aktywności biologicznej (równania 13 - 15). Najlepszą, prawie pełną korelację uzyskano dla zmiennej zależnej pD2 (równanie 14).
Widoczne jest, że połączenie danych fizykochemicznych
z danymi chromatograficznymi przyniosło poprawę wyników analizy QSAR. Na podstawie tych analiz zaproponować
można równania matematyczne opisujące wszystkie rodzaje
interakcji ligandów z receptorami 5-HT (powinowactwem,
pobudzeniem i hamowaniem):
pK i = 18,28(±2,07) + 30,70(±6,92) QN - 0,36(±0,09)
μ - 1,95(±1,02) S5/C + 11,41(±6,77) C-S6 (13)
pD2 = 9,19(±0,36) - 18,44(±2,90) C-S1 + 12,66(±3,50)
C-S4 - 0,15(±0,05) pKa (14)
pA 2 = 6,66(±0,29) + 0,01(±0,002) HF – 1,12(±0,74)
S5 + 15,78(±10,79) C-S5 (15)
Przeprowadzono badanie wartości predykcyjnej modelu
regresji dla równania 14. Obliczono współczynnik walidacji
Q2, który wyniósł w tym przypadku 0,79. Różnica pomiędzy
wartością R2 dla tego równania i współczynnikiem walidacji Q2
równa 0,09 potwierdza znaczną wiarygodność tego modelu.
Równania 5 i 14 posiadają również wartość predykcyjną
wynikającą z porównania obserwowanych i obliczonych na
ich podstawie wartości pD2 (R = 0,91 dla równania 5 i 0,94
dla równania 14; n=13; wyników nie zamieszczono) i mogą
zostać użyte do przewidywania poziomu aktywności biologicznej potencjalnych nowych leków o różnej budowie,
wykazujących działanie na receptory serotoninowe. Wysoka wartość współczynnika determinacji dla równań 5 i 14,
odpowiednio 0,83 i 0,88, świadczy o ich wysokich zdolnościach predykcyjnych (R2>0,6) [26].
Wnioski
Przeprowadzono analizę statystyczną w celu ustalenia
modeli regresji wielokrotnej opisującej zmienność aktywności 5-HT grupy związków pochodnych o różnej budowie
(zw. 1-20). Założono, że modele te mogą być budowane na
podstawie interakcji badanych związków ze środowiskiem
chromatograficznym zawierającym chemiczne elementy
struktur wiążących leki, charakterystyczne dla receptorów
serotoninowych. Zmienne niezależne (objaśniające) zastosowane w tej analizie opisywały więc zachowanie badanych
związków w środowisku biochromatograficznym z udziałem elementarnych struktur chemicznych odpowiedzialnych za interakcję lek-receptor 5-HT (L- aminokwasów:
Asp, Ser, Phe, Tyr, Asn i Thr) poprzez analogi tych aminokwasów: kwasu propionowego, etanolu, etylobenzenu,
4-hydroksyetylobenzenu, amidu kwasu propionowego i izopropanolu, naśladujących funkcję aminokwasów w zakresie
interakcji z lekiem. Dodatkowo wprowadzono do analizy
zmienne objaśniające w postaci wartości parametrów fizykochemicznych badanych związków, charakteryzujące oddziaływania hydrofobowe, elektronowe i steryczne analitów. We
wszystkich opisanych powyżej typach układów chromatograficznych odnaleziono modele regresji oparte na interakcji
badanych związków z substancjami modyfikującymi skład
fazy stacjonarnej. Ustalono tym samym, że zaproponowane układy biochromatograficzne opisywać mogą interakcję, która jest możliwa pomiędzy ligandem i odpowiednimi
aminokwasami. Udowodniono równocześnie brak korelacji
pomiędzy aktywnością badanych związków i ich zachowaniem w środowisku kontrolnym chromatografii (bez udziału
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
aminokwasów lub ich analogów), co potwierdziło znaczenie obecności związków modyfikujących fazę stacjonarną
układów chromatograficznych w budowaniu modeli analitycznych interakcji lek-receptor. Na podstawie porównania
użytych układów chromatograficznych stwierdzić można, że
zastosowanie fazy stacjonarnej typu NP TLC i fazy rozwijającej DSB prowadziło do uzyskania najlepszych wyników. Było
to prawdopodobnie spowodowane najlepszym dopasowaniem warunków chromatografii do właściwości lipofilowych
wszystkich badanych związków o różnej budowie.
Przedstawione modele wytypowano na podstawie najkorzystniejszych wartości współczynnika determinacji R2
i testów statystycznych (F, p), jako reprezentację każdej
z grup doświadczeń chromatograficznych i rodzaju badanej aktywności ograniczoną do jednego tylko równania. Są
one propozycją zastosowania konkretnych metod przewidywania aktywności ligandów receptora 5-HT. Zastosowanie
w analizie przypadków badanych (zw. 1-20) o różnej budowie potwierdza uniwersalny charakter powstałych modeli.
Badania wykonano w ramach tematu badawczego finansowanego przez Uniwersytet Medyczny w Łodzi
Nr 502-13-779.
Piśmiennictwo
1. Gaddum JH and Picarelli ZP. Two kinds of tryptamine
receptors. Br J Pharmac Chemother 1957; 12: 323-328.
2. Luo X, Zhang D, Weinstein H. Ligand-induced domain motion in the activation mechanism of a G-proteincoupled receptor. Protein Eng 1994; 7: 1441-1448.
3. Zhang D, Weinstein H. Signal transduction by a 5-HT2 receptor: a mechanistic hypothesis from molecular dynamics
simulations of the three-dimensional model of the receptor
complexed to ligands. J Med Chem 1993; 36: 934-938.
4. Strader CD i wsp. Identification of residues required for
ligand binding to the beta-adrenergic receptor. Proc Natl
Acad Sci U S A 1987; 84: 4384-4388.
5. Strader CD i wsp. Conserved aspartic acid residues
79 and 113 of the beta-adrenergic receptor have different roles in receptor function. J Biol Chem 1988; 263:
10267-10271.
6. Ho BY i wsp. The role of conserved aspartate and serine residues in ligand binding and in function of the
5-HT1A receptor: A site-directed mutation study. FEBS
Lett 1992; 312: 259-262.
7. Fraser CM i wsp. Site-directed mutagenesis of m1 muscarinic acetylcholine receptors: conserved aspartic
acids play important roles in receptor function. Mol
Pharmacol 1989; 36: 840-847.
8. Gray TM, Matthews BW. Intrahelical hydrogen bonding of serine, threonine and cysteine residues within
α-helices and its relevance to membrane-bound proteins. J Mol Biol 1984; 175: 75-81.
9. Almaula N i wsp. Mapping the binding site pocket
of the serotonin 5-Hydroxytryptamine2A receptor.
Ser3.36(159) provides a second interaction site for the
protonated amine of serotonin but not of lysergic acid
diethylamide or bufotenin. J Biol Chem 1996; 271:
14672-14675.
10. Choudhary MS, Craigo S, Roth BL. A single-point mutation (Phe340 Leu340) of a conserved phenylalanine
abolishes 4-[125I]-iodo-(2,5-dimethoxy)phenylisopropylamine and [3H]mesulergine but not [3H]ketanserin binding to 5-hydroxytryptamine2 receptors. Mol Pharmacol
1993; 43: 755-763.
11. Choudhary MS i wsp. Differential ergoline and ergopeptine binding to 5-hydroxytryptamine2A receptors: ergolines require an aromatic residue at position 340 for high
affinity binding. Mol Pharmacol 1995; 47: 450-457.
12. Edvardsen O, Sylte I, Dahl SG. Molecular dynamics of
serotonin and ritanserin interacting with 5-HT2 receptor.
Brain Res Mol Brain Res 1992; 14: 166-178.
13. Kristiansen K, Edvardsen O, Dahl SG. Molecular modelling of ketanserin and its interactions with the 5-HT2
receptor. Med Chem Res 1993; 3: 370-385.
14. Hibert MF i wsp. Three-dimensional models of neurotransmitter G-binding protein-coupled receptors. Mol
Pharmacol 1991; 40: 8-15.
15. Kristiansen A , Dahl SG. Molecular modeling of serotonin, ketanserin, ritanserin and their 5-HT2c receptor
interactions. Eur J Pharmacol 1996; 306: 195-210.
16. Boess FG i wsp. Interaction of tryptamine and ergoline
compounds with threonine 196 in the ligand binding site
of the 5-hydroxytryptamine6 receptor. Mol Pharmacol
1997; 52: 515-523.
17. Wesołowska A. In the search for selective ligands of
5-HT5 ,5-HT6 and 5-HT7 serotonin receptors. Pol J Pharmacol 2002; 54: 327- 341.
18. Shih JC, Chen KJ-S, Gallaher TK. Molecular biology of
serotonin receptors. Psychopharmacology – The Fourth
Generation of Progress. American College of Neuropsychopharmacology, 2000.
19. Aghajanian GK, Sanders-Bush E. Serotonin. Neuropsychopharmacology: The Fifth Generation of Progress.
American College of Neuropsychopharmacology, 2002.
20. Spier AD, Lummis SC. The role of tryptophan residues
in the 5-Hydroxytryptamine(3) receptor ligand binding
domain. J Biol Chem 2000; 275: 5620–5625.
21. Muntasir HA i wsp. Identification of a key amino acid of
the human 5-HT2B serotonin receptor important for sarpogrelate binding. J Pharmacol Sci 2007; 104: 274-277.
22. Braden MR i wsp. Molecular interaction of serotonin
5-HT2A receptor residues Phe339(6.51) and Phe340(6.52)
with superpotent N-benzyl phenethylamine agonists.
Mol Pharmacol 2006; 70: 1956-1964.
23. Manivet P i wsp. The serotonin binding site of human
and murine 5-HT2B receptors. J Biol Chem 2002; 227:
17170-17178.
24. Beene DL i wsp. Tyrosine residues that control binding
and gating in the 5-hydroxytryptamine3 receptor revealed by unnatural amino acid mutagenesis. J Neurosci
2004; 24: 9097-9104.
25. Bate-Smith EC, Westall RG. Chromatographic behavior
and chemical structure I. Some naturally occurring phenolic substances. Biochim Biophys Acta 1950; 4: 427440.
26. Afantitis A i wsp. A novel QSAR model for predicting
induction of apoptosis by 4-aryl-4H-chromenes. Bioorg
Med Chem 2006; 14: 6686-6694.
&ARM0RZEGL.AUK
27. Kiralj R, Ferreira MMC. Basic validation procedures for
regression models in QSAR and QSPR studies: theory
and application. J Braz Chem Soc 2009; 20: 770-787.
28. Brzezińska EO. An application of TLC chromatographic
data in QSAR assay of TIQs derivatives with β2-adrenergic
activity. Part 1. Acta Pol Pharm 1996; 53: 383-388.
29. Brzezińska E. An application of TLC chromatographic
data in QSAR assay of TIQs derivatives with B102adrenergic activity. Part 2. Acta Pol Pharm 1996; 53:
389-392.
30. Brzezińska E, Kośka G, Walczyński K. Application of
thin-layer chromatographic data in quntitative structureactivity relationship assay of thiazole and benzothiazole
derivatives with H1-antihistamine activity. I. J Chromatogr A 2003; 1007: 145-155.
data otrzymania pracy: 19.10.2010 r.
data akceptacji do druku: 10.11.2010 r.
Adres do korespondencji:
dr n. farm. Grażyna Żydek
Zakład Chemii Analitycznej, Katedra Chemii Medycznej
Wydział Farmaceutyczny, Uniwersytet Medyczny w Łodzi
90-151 Łódź, ul. Muszyńskiego 1
Tel. +48 42 677 92 15
e-mail: [email protected]
31. Brzezińska E, Kośka G, Klimczak A. Application of
thin-layer chromatographic data in quntitative structureactivity relationship assay of thiazole and benzothiazole
derivatives with H1-antihistamine activity. II. J Chromatogr A 2003; 1007: 157-164.
32. Brzezińska E, Kośka G. TLC chromatographic data in
QSAR assay of thiazole and benzothiazole derivatives
with H1-antihistamine activity. Part I. J Planar Chromatogr Modern TLC 2003; 16: 451-457.
33. Brzezińska E, Kośka G. TLC chromatographic data in
QSAR assay of thiazole and benzothiazole derivatives
with H1-antihistamine activity. Part II. J Planar Chromatogr Modern TLC 2004; 17: 40-45.