Snímka 1

METODY HISTOCHEMICZNE przygotowanie, metody barwienia, określenie
wewnątrzkomórkowych enzymów w tkance
mgr Małgorzata Semik
Politechnika Rzeszowska
HISTOCHEMIA
Cytochemia – dział biochemii zajmujący się badaniem komórek.
Bada skład chemiczny oraz procesy chemiczne zachodzące w poszczególnych
organellach komórkowych oraz w komórce.
Histochemia – nauka z pogranicza histologii i biochemii.
Bada skład chemiczny i procesy biochemiczne w obrębie tkanek, stosując
metody nie uszkadzające struktury badanego obiektu.
Celem histochemii jest identyfikacja i lokalizacja poszczególnych substancji
chemicznych w tkankach i komórkach,

umożliwia śledzenie badanych reakcji dokładnie w miejscu ich powstawania.
HISTOCHEMIA
Dzięki metodom histochemicznym można
precyzyjnie oznaczać w tkankach:
 białka,
 kwasy nukleinowe,
 enzymy,
 węglowodany
Immunohistochemia – jest to metoda wykrywania rozmaitych substancji
antygenowych w skrawkach mikroskopowych przy zastosowaniu przeciwciał
skierowanych przeciwko poszukiwanym składnikom preparatu.
Histologia – nauka badająca czynności, rozwój i budowę tkanek.
PODSTAWY REAKCJI
HISTOCHEMICZNYCH

Reakcje histochemiczne cechuje specyficzność – swoistość.

Oddziaływanie pomiędzy wykrywaną substancją (obecną w materiale
biologicznym a związkami chemicznymi (wprowadzonymi do środowiska
reakcji chemicznej).
Prowadzi to do powstania produktu reakcji chemicznej (w miejscu
występowania wykrywanej substancji).
Ilość powstającego produktu jak i jego lokalizacja wykrywane są w obrazie
mikroskopowym.
wykrywana substancja
odpowiedni związek chemiczny
PRODUKT REAKCJI CHEMICZNEJ
PODSTAWY REAKCJI
HISTOCHEMICZNYCH
Produkt reakcji chemicznej musi spełniać dwa podstawowe warunki:

Musi być widoczny w obrazie mikroskopowym

Powinien być nierozpuszczalny w środowisku reakcji
Końcowa ocena reakcji histochemicznych odbywa się
przy użyciu wszystkich typów mikroskopów świetlnych
i elektronowych.
TYPY REAKCJI
HISTOCHEMICZNYCH

Reakcja bezpośrednia – wykrywana substancja reaguje z odpowiednim substratem,
prowadzi to do powstania barwnego produktu w miejscu lokalizacji danej substancji, np.
uwidacznia reszty tyrozynowe białek

Reakcja specyficznego wiązania niektórych barwników przez określone związki
wysokocząsteczkowe, np. wykrywanie DNA zielenią metylową

Selektywna rozpuszczalność niektórych barwników – identyfikacja lipidów Sudanem III

Reakcja specyficzna wykrywania enzymów – produktów reakcji tych enzymów

Reakcja dwu- lub kilkuetapowa – wykrywanie wielocukrów, w podwójnej reakcji
 reakcja utleniania wielocukrów, zmiana struktury wykrywanej substancji
 reakcja barwna, identyfikację interesującego nas związku chemicznego
PRZYGOTOWANIE MATERIAŁU
Wybór metodyki przygotowywania
histochemicznej zależy od:


materiału
biologicznego
do
reakcji
charakteru badanej substancji
specyficzności reakcji zastosowanej do identyfikacji tej substancji
Trzy podstawowe warunki:
1. Preparat przygotowany z materiału musi być przejrzysty,
2. Odpowiednio skontrastowany (wybarwiony)
3. Struktura komórek i tkanek w preparacie powinna być jak najbardziej zbliżona do
struktury tkanki żywej
Główny cel to: jak najlepsze uwidocznienie interesującej nas substancji, co jest
warunkiem prawidłowej identyfikacji
PRZYGOTOWANIE MATERIAŁU
Metody przygotowywania materiału do badań histochemicznych opierają się na
kilku działaniach laboratoryjnych:
1. POBIERANIE MATERIAŁU,
2. UTRWALANIE MATERIAŁU,
3. UTWARDZENIE I KROJENIE MATERIAŁU – (ZATAPIANIE, MROŻENIE)
4. WYKONANIE PREPARATU I JEGO BARWIENIE
POBIERANIE MATERIAŁU
Materiał tkankowy – fragmenty tkanek lub narządów (rozmazy, szlify,
skrawki), hodowle komórkowe.
Przy pobieraniu materiału ważne jest:

fragment pobranej tkanki powinien być stosunkowo niewielki


5mm – mikroskopia świetlna,
1mm – mikroskopia elektronowa,

tkanki do badań histochemicznych enzymów powinny być przetwarzane jak
najszybciej po zakończeniu pobierania,

natychmiast po pobraniu fragment narządu, tkanki należy utrwalić
UTRWALANIE MATERIAŁU
UTRWALANIE – procedura zachowania materiału w jego pierwotnej
postaci.
Cel utrwalania to:



zatrzymanie procesów metabolicznych w komórkach i tkankach,
precypitacja niektórych zawartych w tkankach substancji rozpuszczalnych,
wstępne utwardzenie materiału i zwiększenie jego odporności,
Rodzaj utrwalacza i czas utrwalania:

wybór utrwalacza powinien być uzależniony od rodzaju identyfikowanego związku
chemicznego, tak aby nie uległ on zmianie pod jego wpływem

czas utrwalania zależy od rodzaju zastosowanego utrwalacza, rodzaju tkanki oraz
wielkości wycinka, zwykle jest nie krótszy niż 12 godzin.
ZATAPIANIE MATERIAŁU
ZATAPIANIE MATERIAŁU – polega na przepojeniu materiału
w twardszym, lecz łatwo skrawalnym i biochemicznie obojętnym materiale.

PARAFINA najpowszechniej stosowana w badaniach histochemicznych, do
wykrywania:



Białek
Kwasów nukleinowych
Węglowodanów

CELOIDYNA (dwunitroceluloza), do zatapiania materiałów twardych

ŻYWICE (epoksydowe, akrylowe)
ZAMROŻENIE MATERIAŁU
TECHNIKA MROŻENIOWA – polega na utwardzeniu preparatu
poprzez jego zamrożenie.
Zamrażanie – metody:



ZAMRAŻANIE W CIEKŁYCH GAZACH
ZAMRAŻANIE PRZY POMOCY ZESTALONEGO CO2
ZAMRAŻANIE W KRIOSTACIE
Szeroko stosowana w histochemii i immunohistochemii.
Zalety:



Krótkotrwała,
Zachowuje w materiale biologicznym wszystkie składniki chemiczne (także lipidy),
Przebiega w niskiej temperaturze (zapobiega denaturacji białek oraz inaktywacji
enzymów)
KROJENIE MATERIAŁU
Do krojenia skrawków histologicznych służą przyrządy zwane MIKROTOMAMI.
Materiał zostaje pokrojony na „plasterki” grubości ok.. 50-100 µm.
Typy mikrotomów:



Mikrotom rotacyjny (wibracyjny), umożliwia
pokrojenie miękkich, niezatopionych tkanek
Mikrotom wahadłowy
Mikrotom saneczkowy
Nowoczesne mikrotomy często wyposażone są w napęd elektryczny oraz układy
elektroniczne umożliwiające regulację szybkości skrawania
BARWIENIE
BARWIENIE MATERIAŁU - ma na celu skontrastowanie struktur
komórkowych i tkankowych za pomocą zróżnicowanych barwników.
BARWNIKI – posiadają dwie istotne dla ich funkcji grupy chemiczne:


Chwytną (odpowiedzialną za wiązanie się cząsteczek barwnika
z odpowiednimi substancjami)
Barwną (decydującą o kolorze)
Barwienie ma niski stopień swoistości, wiele struktur i substancji
w komórkach i tkankach może wiązać ten sam barwnik.
Zazwyczaj używa się wodnych roztworów barwników.
ZAMYKANIE PREPARATU – naniesienie na powierzchnię skrawka
kropili medium zamykającego, końcowe utrwalenie preparatu
(najczęściej żywica, która ulega polimeryzacji):

żywice syntetyczne, balsam kanadyjski
PODSTAWY REAKCJI
HISTOCHEMICZNYCH
Z reguły reakcje histochemiczną przeprowadza się po utrwalenie materiału
biologicznego, a przed jego zatopieniem.
W tkankach lub komórkach w celu identyfikacji różnego rodzaju substancji,
przeprowadza się następujące reakcje histochemiczne:






Reakcje identyfikacji węglowodanów,
Reakcje identyfikacji lipidów,
Reakcje identyfikacji aminokwasów i białek
Reakcje identyfikacji enzymów (fosfataz, esteraz, dehydrogenaz, peptydaz)
Reakcje identyfikacji kwasów nukleinowych,
Reakcje identyfikacji wielu innych substancji (aldehydy, ketony,
metaloproteiny, jony – Fe, Cd,)
IDENTYFIKACJA POLISACHARYDÓW
W identyfikacji polisacharydów stosuje się następujące reakcje:

Identyfikacja
alcjanowym

Reakcja PAS

Identyfikacja
koloidalnym

Metachromazja
kwaśnych
glikozaminoglikanów
błękitem
kwaśnych
glikozaminoglikanów
żelazem
IDENTYFIKACJA POLISACHARYDÓW

BŁĘKIT ALCJANOWY, błękit alcjański
(ang. alcian blue (AB).

Barwnik kationowy, barwi kwaśne
mukopolisacharydy i glikozaminoglikany
na kolor błękitny,

Swoistość zabarwienia jest zależna od pH
barwnika

Kwas hialuronowy (ze względu na swoją
niewielką kwasowość) barwi się przy pH
2,5
wybarwiony kwaśny mukopolisacharyd
IDENTYFIKACJA POLISACHARYDÓW
– reakcja PAS

Reakcja PAS (ang. Periodic acid-Schiff)

Najczęściej stosowana reakcja histochemiczna.

Reakcja dwuetapowa

I etap – materiał poddaje się utlenianiu w 1% kwasie nadjodowym, powoduje
to przekształcenia grup glikolowych w grupy aldehydowe

II etap – grupy aldehydowe uwidacznia się przy użyciu odczynnika Schiffa
(odbarwiona forma fuksyny zasadowej)

Wynik reakcji – purpurowy barwny produkt
REAKCJA PAS
Dodatnią reakcję PAS dają:

Wszystkie nierozpuszczalne polisacharydy – glikogen, skrobia,

Związki takie jak: mukopolisacharydy, glikoproteiny, glikoproteidy,

Wszystkie struktury komórkowe i tkankowe wykazujące obecność
większych ilości nierozpuszczalnych polisacharydów (błony podstawne,
wewnątrzkomórkowe złogi glikogenu, glikoproteidowe i śluzowe ziarna
wydzielnicze),

Niektóre lipidy – sfingomielina (utlenianie kwasem powoduje powstanie
grup aldehydowych),
REAKCJA PAS
Reakcja PAS bardzo często używana jest
do identyfikowania erytroleukemii,
Erytroleukemia - rzadko występująca
choroba nowotworowa niedojrzałych
czerwonych krwinek
Wynik barwienia – glikogen (obojętny
polisacharyd), barwi się na kolor
czerwono-fioletowy
REAKCJA PAS
Obraz histologiczny komórek przerzutu
mięsaka Ewinga
Wymaz – wybarwione na purpurowo
ziarna glikogenu
IDENTYFIKACJA BIAŁEK
Większość histochemicznych metod wykrywania białek opiera się na reakcjach
barwnych z resztami określonych aminokwasów.
 Reakcja Miltona z kwasem azotowym, azotanem rtęci i azotanem sodu (wykrywa
reszty tyrozyny).

Reakcja z dwunitrofluorobenzenem (wykrywa reszty tyrozyny, -SN, -NH2),

Rekacja z naftolo-etylenodwuaminą (wykrywa reszty tryptofanu),

Reakcja z dwuchloronaftolem (wykrywa reszty argininy),

Reakcja z błękitem rtęciowo- bromofenolowym (wykrywa większość białek)
Te klasyczne metody histochemiczne służące do wykrywania białek są obecnie rzadko
wykorzystywane z uwagi na możliwość stosowania bardziej swoistych metod
immunohistochemicznych.
IDENTYFIKACJA BIAŁEK
Amyloid - kwasochłonne, nierozpuszczalne, nieaktywne biologicznie białko, którego
nieprawidłowe pozakomórkowe odkładanie się w narządach (nerkach, wątrobie, mózgu)
prowadzi do amyloidozy (skrobiawicy).
Rodzaj barwnika: czerwień Kongo
Wynik barwienia: amyloid – wszystkie typy amyloidu barwią się na kolor czerwony
amyloidoza serca
amyloidoza nerek
IDENTYFIKACJA LIPIDÓW
Do histochemicznego wykrywania lipidów używa się głównie barwników
wykazujących niską rozpuszczalność w wodzie i alkoholu, natomiast wysoką
w tłuszczach (barwnik rozpuszcza się w tłuszczu powodując jego zabarwienie):



Sudan III, Sudan IV,
 Barwią kwasy tłuszczowe, trójglicerydy
 Wynik – czerwone zabarwienie
czerń sudanowa
 barwią kwasy tłuszczowe, trójglicerydy
 Wynik barwienia – czarne zabarwienie
czerwień oleista
Zanurzenie skrawka tkanki zawierających skupiska lipidów do wodnego
roztworu jednego z tych barwników, powoduje (zgodne ze stopniem
rozpuszczalności) przejście barwnika z fazy rozpuszczalnika do fazy lipidowej.
IDENTYFIKACJA LIPIDÓW
Inne ściśle histochemiczne metody barwienia lipidów, odznaczają się wyższą
swoistością i używane są do różnicowania poszczególnych klas lipidów.
Należą tu:




Reakcja z kwasem fosforomolibdenowym (wykrywa lipidy bogate w holinę)
Reakcja z dwufenylokarbozonem i rtęcią (wykrywa lecytyny i sfingomieliny)
Reakcja bromkowo – srebrowa (wykrywa lipidy nienasycone)
Reakcja z ftalocyjanianem miedzi (wykrywa fosfolipidy)
Lipidy wybarwione
czerwienią oleistą
IDENTYFIKACJA KWASÓW
NUKLEINOWYCH
Do reakcji służących do wykrywania kwasów DNA i RNA należy:
Reakcja Feulgena – służy do wykrywania DNA.





Składa się z dwóch etapów
I etap – tkankę poddaje się hydrolizie w 1N kwasie solnym, powoduje
to pękniecie pierścienia pentozowego dezoksyrybozy i wytworzenie
grupy aldehydowej
II etap – wykrywanie wolnej grupy aldehydowej odczynnikiem Schiffa
DNA barwi się na zczerwono
Nie służy do wykrywania RNA (hydroliza nie powoduje pęknięcia
pierścieni rybozy)
IDENTYFIKACJA KWASÓW
NUKLEINOWYCH
Reakcja Bracheta – służy do różnicowego wykrywania DNA i RNA
w tym samym materiale, za pomocą tzw. polichromu Unny
(mieszanina zieleni metylenowej i pyroniny)

Zieleń metylenowa wykazuje powinowactwo do DNA

Pyronina swoiście wiąże się z RNA

Efekt barwienia – czerwono zabarwione rejony komórki bogate w RNA
(obszary chromatyny zawierające rybosomy, jąderko),
zielono-fioletowy odcień chromatyny jądrowej
IDENTYFIKACJA KWASÓW
NUKLEINOWYCH

Metody fluorescencyjne – z wykorzystaniem różnych
barwników fluorescencyjnych które swoiście wiążą się do
DNA:



DAPI (dwuaminofenyloindol)
Hoechst 33342
Hoechst 33258
DNA w jądrze wybarwione DAPI

Barwniki te przepuszczane przez błony komórkowe, wiążą się preferencyjne
do rejonu par zasad adenina-tymina w DNA
IDENTYFIKACJA ENZYMÓW

W zawiesinie komórkowej lub hodowli można dokonać
identyfikacji komórek, stosując testy na obecność enzymów
specyficznych dla danych komórek, np. dehydrogenaz,
reduktaz, czy oksydaz,

Histochemiczne wykrywanie enzymów nie polega na
identyfikacji ich jako konkretnych substancji (umożliwia to
zastosowanie techniki immunohistochemicznej), lecz na
uwidocznieniu produktu ich aktywności (wykrywany jest
produkt reakcji histochemicznej).
IDENTYFIKACJA ENZYMÓW

Wykrywany enzym musi
przygotowywania materiału.



być
czynny,
odpowiednie
procedury
Barwienie tkanki bezpośrednio po pobraniu
Zaniechanie metod utrwalania materiału
Reakcja histochemiczna pozwalająca na wykrycie aktywności enzymu to
INKUBACJA, środowisko reakcji to PŁYN INKUBACYJNY (pH,
temperatura optymalna dla działania enzymu):
 zawiera specyficzny dla wykrywanego enzymu substrat,
 jony stymulujące aktywność danego enzymu
 dodatkowe składniki biorące udział w reakcji – koenzymy
IDENTYFIKACJA ENZYMÓW

Kilka podstawowych typów reakcji histochemicznych wykrywających
aktywność enzymów
1. Identyfikacja hydrolaz:

Reakcja precypitacji z kationami metali – reakcja Gomoriego
 Pod wpływem enzymu obecnego w tkance dochodzi do
rozszczepienia substratu, a następnie wytrąceniu rozszczepionego
substratu (jonami metali Cu 2+, Pb 2+)
 Tworzy się nierozpuszczalna sól, widoczna w mikroskopie
elektronowym, do celów mikroskopii świetlnej należy przeprowadzić
dodatkowo reakcje barwną
IDENTYFIKACJA ENZYMÓW

Reakcja sprzęgania do związków azotowych
 Pod wpływem obecnego w tkance enzymu dochodzi do
rozszczepienie substratu (zazwyczaj jest to pochodna naftolu)
 Dochodzi do przekształcenia pochodnej naftolu w barwny
i nierozpuszczalny produkt

Reakcja indygogenna
 Pod wpływem obecnego w tkance enzymu dochodzi do
rozszczepienie substratu (zazwyczaj jest to pochodna indoksylu)
 Dochodzi do utleniania substratu, produkt reakcji ma zabarwienie
indygo
IDENTYFIKACJA ENZYMÓW
Przykłady barwienia hydrolaz

ATPaza - enzym katalizujący rozpad wiązania wysokoenergetycznego
w ATP, występuje m.in. w siateczce śródplazmatycznej komórek mięśni
szkieletowych i wewnętrznej błonie mitochondrialnej
IDENTYFIKACJA ENZYMÓW
Przykłady barwienia hydrolaz

kwaśna fosfataza - występuje w dużych stężeniach w gruczole
krokowym człowieka.

Aktywność jej bardzo wzrasta w
chorobie nowotworowej
tego gruczołu, co wykorzystuje się
w diagnostyce do wczesnego
rozpoznawania tej postaci raka.
IDENTYFIKACJA ENZYMÓW
2. Identyfikacja dehydrogenaz.

Reakcja z udziałem soli tetrazolowych
 Sole tetrazolowe w postaci utlenionej są bezbarwne i rozpuszczalne
w wodzie, w formie zredukowanej przekształcają się w formazany,
produkty reakcji histochemicznej (barwne i nierozpuszczalne)
 Płyn inkubacyjny – zawiera swoisty substrat (np. mleczan
bursztynianu), koenzymy, sól tetrazolową

Wyniki: w miejscu aktywności
dehydrogenazy –
niebiesko-purpurowe zabarwienie
IDENTYFIKACJA JONÓW

Wykrywanie jonów żelaza ( Fe3+).
 Fragmenty tkanki inkubowano w mieszaninie z żelazocyjankiem
potasu, kwasem solnym i eozyną
 Wyniki inkubacji: ciemny niebieski osad nierozpuszczalnych
żelazocyjanków
 Wykorzystywane w diagnostyczne chorób związanych z odkładaniem
żelaza w tkankach (hemochromatozach)
hemochromatoza
mięśnia sercowego
IDENTYFIKACJA PIGMENTÓW
Pigmenty są barwne substancje w organizmie:


Pigmenty endogenne, wytwarzane przez organizm
 endogenne barwniki krwi, hematogenne
np. hemosyderyna (powstaje
w wyniku rozpadu hemoglobiny, białko zawierające żelazo w formie
koloidalnej, występuje w wątrobie, śledzionie, szpiku),
 inne barwniki endogenne np. melanina
Pigmenty egzogenne, przedostają się do organizmu z środowiska zewnętrznego
hemosyderyna
skóra człowieka, wybarwiona melanina
(m.Fontana-Masson)
IMMUNOHISTOCHEMIA
Metody immunohistochemiczne polegają na wykrywaniu i lokalizacji
składników komórek i tkanek oraz substancji na zasadzie reakcji antygenprzeciwciało.
Immunocytochemia – zajmuje się wykrywaniem w komórkach substancji o
charakterze antygenowym
Immunohistochemia – zajmuje się wykrywaniem substancji o charakterze
antygenowym w tkankach

Pierwsze reakcje immunohistochemiczne prowadził Coons, który wykrył
antygeny przy pomocy przeciwciał znakowanych cyjankim fluoresceiny
(fluorochrom),

Później fluorochromy były stopniowo zastępowane przez inne znaczniki, jak
enzymy (peroksydaza), barwniki zawierające metale (ferrytyna), złoto
koloidalne
IMMUNOHISTOCHEMIA
Założenia immunohistochemii:

Każda struktura komórkowa czy tkankowa w skład której wchodzą białka
(lub inne substancje zdolne do wywołania odpowiedzi immunologicznej) ma
potencjalne własności antygenowe

Immunohistochemiczne uwidacznianie antygenu w materiale biologicznym
wymaga uzyskania go w czystej postaci, a następnie otrzymania swoistych dla
tego antygenu przeciwciał

Wyizolowany różnego rodzaju metodami preparatyki biochemicznej antygen
służy do immunizacji (pobudzenia układu immunologicznego) zwierząt
laboratoryjnych, które stanowią źródło swoistych przeciwciał.
IMMUNOHISTOCHEMIA

Uwidocznienie miejsca wiązania się przeciwciała z antygenem zlokalizowanym
w komórce czy tkance możliwe jest jedynie pod warunkiem odpowiedniego
znakowania przeciwciała

Przeciwciała mogą być znakowane:
 Fluorochromami
–
metoda
immunofluorescencji,
barwniki
fluorescencyjne, preparat ogląda się w mikroskopie fluorescencyjnym
(czerwień teksańska TR - czerwona fluorescencja)
 Enzymami – metody immunoenzymatyczne, preparat ogląda się
w mikroskopie świetlnym lub elektronowym (peroksydaza, fosfataza
zasadowa)
 Metalami – preparat ogląda się w mikroskopie elektronowym - ferrytyna
(białko zawierające żelazo), koloidalne złoto (mikroskopijne ziarenka
metalicznego złota, widoczne w mikroskopie w postaci kontrastowych
czarnych punktów)
IMMUNOHISTOCHEMIA
PRZEBIEG REAKCJI IMMUNOHISTOCHEMICZNEJ MIKROSKOPIA ŚWIETLNA






Reakcje immunohistochemiczną przeprowadza się na szkiełkach
podstawowych lub nakrywkowych
Blokowanie miejsc nieswoiście wiążących (inkubacja preparatów z
nieaktywną immunologicznie surowicą)
Inkubacja ze znakowanymi przeciwciałami w komorze wilgotnej, temp.
pokojowa
Wypłukanie niezwiązanych przeciwciał buforowaną solą fizjologiczną
Dodatkowe podbarwienie skrawków (w celu skontrastowania pozostałych
struktur)
Zamykanie preparatu (sól fizjologiczna, glicerol, alkohol)
IMMUNOHISTOCHEMIA
PRZEBIEG REAKCJI IMMUNOHISTOCHEMICZNEJ –
MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA

METODA PRZED ZATOPIENIEM MATERIAŁU (preembedding)




Przeprowadza się na małych fragmentach tkanek lub grubych skrawkach
Po przeprowadzeniu reakcji materiał zatapia się i kroi na ultramiktotonie
Do mikroskopii elektronowej nadają się tylko skrawki z powierzchownych
obszarów materiału (najbardziej intensywne wiązanie antygenu tkankowego z
przeciwciałem)
METODA NA SKRAWKACH ULTRACIENKICH (postembedding)




Przeprowadza się po zatopieniu tkanki
Zatapianie metodą mrożeniową, lub żywicą akrylową (nie blokuje miejsc
wiążących antygenu)
Ultracienkie skrawki zbiera się na siatki niklowe lub złote
Siatki poddaje się inkubacji w komorze wilgotnej, kładąc je na powierzchni
roztworu przeciwciał
IMMUNOHISTOCHEMIA
A. Neurony (czerwone) - detekcja przy
użyciu przeciwciał ß-tubulin III i
astrocyty (zielone) przy użyciu GFAP
B. Dendrocyty (zielone) - detekcja
przy pomocy markera znakowanego
fluorochromem
IMMUNOHISTOCHEMIA
Wizualizacja sieci mikrotubul w komórkach nerki. Przeciwcialo I-rzędowe wyznakowane
barwnikiem Alexa 486, co umożliwia wybarwienie tubuliny, a przeciwciało II-rzędowe
wyznakowane barwnikiem Alexa 546, co umożliwia wybarwienie aktyny.
CYTOCHEMIA
Komórki hodowane in vitro stanowią bardzo dobry model do
badań rozmieszczenia organelli komórkowych.
Stosowane metody:





Immunocytochemiczne
Z użyciem fluorochromów (wiążą się specyficznie do błon organelii
komórkowych, wyznaczają ich obecność i położenie)
Pierwszy obraz mikrofilamentów
w komórce uzyskał F. Wieland
Barwnik rodamino-falloidyne
Obecnie związek ten jest komercyjnie
dostępny jako falloidyna sprzężona
z izotiocyjaninem fluoresceiny.
HISTOLOGICZNE METODY
IMPREGNACJI TKANEK
Techniki impregnacji tkanek – zaawansowane metody barwienia



wizualizacja komponentów komórek i tkanek niewidocznych
w barwieniu przeglądowym (włókna nerwowe, komórki glejowe)
impregnacja solami metali (srebra, złota, chromu)
metody impregnacji są bardzo pracochłonne, muszą być przestrzegane
pewnych zasad np.



nie używa się metalowych narzędzi,
z fragmentów tkanek muszą być dokładnie usunięte
utrwalacze)
impregnuje się zamrożone skrawki lub bezpośrednio
pobrane, które kroi się (mikrotomy) przed zamrożeniem
astrocycty po impregnacji srebrem
POPULARNE METODY
BARWIENIA W HISTOLOGII
BARWIENIE H+E
Rutynowa metoda barwienia preparatów w histologii (szybka, prosta, uniwersalna).
HEMATOKSYLINA – niebieski barwnik zasadowy (jądra komórkowe)
EOZYNA – czerwony barwnik o charakterze kwasowym, (cytoplazma, włókna
kolagenowe, ziarna wydzielnicze w komórkach) - czerwone
Rozmaz PAP – służy do wykrywania
odmian wirusa brodawczaka ludzkiego
 w diagnostyce raka szyjki macicy
Ałunowe barwienie H&E
 Hematoksylina ałunowa – wybarwia
struktury na fioletowo
Miąższ płuca
pacjenta z
rozedmą
(barwienie H-E)
MAY-GRUNWALD-GIEMSA
Barwienie ziarnistości i substancji wewnątrzkomórkowych.


Rozmazy szpiku i krwi obwodowej (utrwalone)
Skrawki narządów (bloczki parafinowe)
Mieszanina barwników:
 barwniki anilinowe
 eozyna
Wynik barwienia:
 ciemnoniebieskie jądra
 czerwone ziarnistości w eozynofilach
 pomarańczowe erytrocyty i komórki nabłonkowe
 czerwono-fioletowa chromatyna jądrowa
Rozmaz szpiku kostnego
BARWIENIE van GIESONA


Metoda barwienie jest przydatne w diagnostyce marskości wątroby
Uwidacznia pasma tkanki łącznej miedzy guzkami miąższu narządu
Barwniki:
 kwas pikrynowy
 kwaśna fuksyna.
Wynik barwienia:
 jądra - bordowo-czarne, czarne
 kolagen (tkanka łączna włóknista) - różowy
 mięśnie, cytoplazma - żółte.
BARWIENIE GOMORIEGO
Barwienie trichromem Gomoriego – metoda barwienia tkanki
łącznej.


metoda opisana przez George Gömöri.
w metodzie tej stosuje się hematoksylinę i roztwór zawierający
chromotrop 2R i jasnozielony barwnik lub błękit anilinowy.

włókna mięśniowe barwią się na czerwono,
kolagen na zielono lub niebiesko,
jądra komórkowe są czarne lub niebieskie.

metoda znajdująca zastosowanie
m.in. w ocenie patologii mięśni.,
Preparat łożyska barwiony trichromem
BARWIENIE ORCEINĄ
Barwienie orceiną – służy do wizulalizacji włókien elastyny
• koralikowaty układ włókien
elastyny wybarwionych orceiną,
• z rozmazu guza okolicy
podłopatkowej
BARWIENIE wg MASSONA


Barwienie komórek zróżnicowanych tkanki łącznej, szeroko stosowane
w histologii,
metoda trójbarwna (struktury barwią się odmiennymi barwnikami) uzyskując
zróżnicowany obraz cytologiczny
Barwnik: trichrom Massona
 Hematoksylina, kwaśna fuksyna, błękit anilinowy
Wynik barwienia:
 jądra – kolor czarny
 cytoplazma – kolor czerwony
 włókna kolagenowe, substancje śluzowate – kolor niebieski
Barwnik: zielony trichrom Massona
 Hematoksylina, kwaśna fuksyna, green SF
Wynik barwienia:
 jądra- kolor niebieski na czarny
 mięśnie - kolor czerwony
 kolagen - kolor zielony
BARWIENIE wg MALLORYE’GO
Barwienie stosowane w różnicowaniu
różnicowaniu komórek w nerce.
Barwnik:


Fuksyna kwaśna
Barwnik Malloryego: błękit anilinowy, oranż G
Wynik barwienia:
 jądra – kolor czerwony
 cytoplazma – różowo-czerwona
 włókna kolagenowe – kolor niebieski
 mięśnie - pomarańczowoczerwone
tkanki
mięśniowej,
łącznej,
BARWIENIE HISTOCHEMICZNE W
MIKROBIOLOGII
BARWIENIE GRAMMA



Standardowa metoda barwienie bakterii
Pozwala doświadczalnie zróżnicować bakterie na dwie duże grupy (Gram+ i Gram-) ze
względu na różnice w budowie ściany komórkowej oraz, różnice w fizjologii i podatności
na leki.
Barwienie pozwalające wykryć różne mikroorganizmy w tkankach.
BARWIENIENIE HISTOCHEMICZNE
W MIKROBIOLOGII
BARWIENIE ZIEHLA-NEELSENA


barwienie różnicujące opisane przez lekarza bakteriologii Franza Ziehl Neelsena
służy do identyfikacji kwasoopornych organizmów, w szczególności z rodzaju
Mycobacterium


Barwnik:
 fuksyna,
 błękit metylenowy
Wynik barwienia:
 bakterie kwasooporne –
kolor czerwony (fuksyna)
 bakterie niekowasooporne –
kolor niebieski (błekit metylenowy)
Mycobacterium tuberculosis
Dziękuję za uwagę