QUANTA LiteTM dsDNA

NOVA Lite® Skin Antibody
Test przesiewowy autoprzeciwciała przełyku naczelnych
708330
Do diagnostyki in vitro
Złożoność CLIA: Wysoka
Przeznaczenie
NOVA LiteTM SA to pośredni test immunofluorescencyjny do badań przesiewowych i półilościowego oznaczania
autoprzeciwciał skóry w surowicy ludzkiej. Obecność przeciwciał przeciwjądrowych może być stosowana w
połączeniu z objawami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi, aby wspomóc diagnostykę chorób
autoimmunologicznych skóry, zwłaszcza pęcherzycy i pemfigoidu.
Podsumowanie i wyjaśnienie testu
Pojęcie „przeciwciała skóry” opisuje różnorodne przeciwciała, które wchodzą w reakcję ze składnikami skóry i
powierzchni śluzowych. Te przeciwciała występują z wysoką częstością u pacjentów z chorobami
autoimmunologicznymi skóry, zwłaszcza pęcherzycą i pemfigoidem.
Autoprzeciwciała, które reagują z antygenem międzykomórkowym skóry i błony śluzowej występują praktycznie we
wszystkich przypadkach pęcherzycy. 1 Miana tych przeciwciał są równoległe do aktywności choroby i spadają wraz
z pomyślnym leczeniem.2,3,4
Inna ważna choroba autoimmunologiczna skóry, pemfigoid klasyczny, jest charakteryzowana serologicznie przez
sprawdzenie obecności przeciwciał przeciwko strefie błony podstawnej skóry i śluzówki. Przeciwciała krążeniowe
przeciwko strefie błony podstawnej występują u 70–80% pacjentów cierpiących na pemfigoid.5,6,7 Chociaż brak
uderzającej korelacji między ciężkością choroby i ich mianem w przypadku pemfigoidu, pewien związek jednak
istnieje. Podczas remisji (spontanicznej lub po leczeniu) występuje spadek przeciwciał przeciwko strefie błony
podstawnej zazwyczaj do poziomów niewykrywalnych.7 W większości przypadków nawrotowi choroby towarzyszy
ponowne pojawienie się autoprzeciwciał przeciwko strefie błony podstawnej.
Najczęściej stosowaną metodą badania autoprzeciwciał skóry jest pośrednia immunofluorescencja. Najczęściej
stosowane substraty to cienkie skrawki skóry i śluzówki gryzoni lub naczelnych, przy czym substratem z wyboru są
skrawki przełyku naczelnych.8,9,10 Oprócz rodzaju substratu dla wydajności testu autoprzeciwciał skóry kluczowe są
inne czynniki, takie jak: 1) utrwalacz zastosowany podczas przygotowywania preparatu oraz 2) swoistość i
współczynnik fluoresceiny do białka (F/P) użytego koniugatu znakowanego za pomocą FITC. Niektóre utrwalacze
lub ich kombinacje niszczą określone antygeny skóry i należy unikać ich stosowania. Współczynnik F/P koniugatu
określa czułość i stopień barwienia tła. Kluczowe znaczenie ma swoistość substratu. Ogromna większość
autoprzeciwciał to podklasa IgG. Jest wiadome, że gdy autoprzeciwciała występują u zdrowych krwiodawców,
ogólnie należą do podklas IgM i IgG oraz rzadko IgG.11 Z tego powodu koniugaty swoiste dla IgG są bardzie
swoiste wobec choroby. Substrat wybrany do testu przeciwciał skóry NOVA Lite® to optymalnie utrwalony skrawek
przełyku naczelnych. Koniugat to oczyszczone metodą powinowactwa IgG przeciw-ludzkie.
Zasada badania
W przypadku pośredniej techniki immunofluorescencji próbki są inkubowane z substratem antygenu, a
przeciwciała, które nie weszły w reakcję, są wypłukiwane Substrat jest inkubowany ze swoistym koniugatem
znakowanym fluoresceiną, a następnie niezwiązany odczynnik jest wypłukiwany. Próbki zawierające
autoprzeciwciała obserwowane pod mikroskopem fluorescencyjnym będą wykazywać jasnozieloną fluorescencyjną
barwę w miejscach komórki lub jądra, gdzie nastąpiło związanie autoprzeciwciał.
Odczynniki
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Preparaty przeciwciał skóry (przełyk naczelnych), 8 dołków/preparat, z osuszaczem
Koniugat IgG przeciw-ludzkich (kozi), znakowany fluoresceiną w buforze zawierającym błękit Evansa i
0,09% azydku sodu, 7 ml
Kontrola pozytywna pemfigoidu, 1 fiolka buforu zawierającego 0,09% azydek sodu oraz przeciwciała
surowicy ludzkiej przeciw pemfigoidowi, wstępnie rozcieńczona, 0,5 ml
Systemy kontroli negatywnej IFA, 1 fiolka buforu zawierającego 0,09% azydek sodu bez przeciwciał
surowicy ludzkiej przeciw pemfigoidowi, wstępnie rozcieńczone, 0,5 ml
Koncentrat PBS (40x), wystarcza na 1000 ml
Środek do osadzania preparatu, 0,09% azydek sodu, 7 ml
Szkiełka nakrywkowe
Ostrzeżenia
1.
2.
3.
4.
Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały
przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono że nie zawierają przeciwciał
przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku
obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. W związku z tym kontrola pozytywna
pemfigoidu i systemy kontroli negatywnej IFA powinny być obsługiwane w taki sam sposób jak materiał
potencjalnie zakaźny.12
Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku
połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub
miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania
odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do
gromadzenia się azydku.
Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.
Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych
przepisów w zakresie utylizacji odpadów.
1
Środki ostrożności
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Ten produkt jest przeznaczony do zastosowań diagnostycznych in vitro.
Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem
niespójnych wyników.
Niekompletne lub nieskuteczne wypłukanie dołków IFA może spowodować wysoki poziom tła.
Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi
urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w
stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest potwierdzenie, że
wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w akceptowalnych
limitach.
Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową odczynników,
moc lampy używanego mikroskopu, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność płukania
oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga
staranności i precyzji.
Z czasem koniugat IgG przeciw-ludzkiej może zmienić kolor z powodu ekspozycji na światło. Jednak
zmiana barwy nie ma wpływu na wynik badania.
Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej.
Warunki przechowywania
1.
2.
Wszystkie zestawy odczynników przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie zamrażać. Odczynniki są
trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami.
Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 4 tygodnie w temperaturze 2–8°C.
Pobieranie próbek
Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek
analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne
zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub
lipemicznej surowicy albo próbek.
Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument NCCLS H18-A2 zaleca następujące warunki
przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli
badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2–8°C. 3) Jeśli badanie nie
zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20°C
lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane.
Badanie
Dostarczone materiały
10
1
1
1
1
1
1
8-dołkowe preparaty substratu przeciwciał skóry
7 ml koniugatu FITC IgG przeciw-ludzkiej
0,5 ml kontroli pozytywnej pemfigoidu
0,5 ml systemu kontroli negatywnej IFA
25 ml koncentratu PBS (40x)
7 ml środku do osadzania preparatu
10 szkiełek nakrywkowych
Wymagane materiały nie dołączone do zestawu
Mikropipety o pojemności 15-1000 µL
Woda destylowana lub dejonizowana
Gruszki laboratoryjne lub pipety Pasteura
Komora wilgotna
Pojemnik 1 l (do rozcieńczania PBS)
Barwiacz Coplina
Mikroskop fluorescencyjny z filtrem wzbudzającym 495 nm i filtrem barierowym 515 nm
Sposób przygotowania
Przed rozpoczęciem
1.
2.
3.
Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20–26°C) i dobrze wymieszać.
Rozcieńczyć koncentrat PBS: WAŻNE: Rozcieńczyć koncentrat PBS w stosunku 1:40, dodając
zawartość butelki koncentratu PBS do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej i dokładnie wymieszać.
Bufor PBS jest używany do rozcieńczania próbek pacjentów oraz jako bufor do płukania. Rozcieńczony
bufor może być przechowywany maksymalnie przez 4 tygodnie w temperaturze 2–8°C.
Rozcieńczyć próbki pobrane od pacjenta:
a.
Wstępne badanie przesiewowe: Rozcieńczyć próbki pochodzące od pacjenta w stosunku 1:10
rozcieńczonym buforem PBS (tj. dodać 100 µL surowicy do 900 µL buforu PBS).
b.
Miareczkowanie: Z początkowego rozcieńczenia przesiewowego dla wszystkich próbek
pozytywnych wykonać serię 2-krotnych rozcieńczeń za pomocą rozcieńczonego buforu PBS (tj.
1:20, 1:40... 1: 2560).
Procedura badania
1.
Przygotować preparat substratu: Preparaty substratu przed wyjęciem z woreczka muszą osiągnąć
temperaturę pokojową. Oznaczyć ołówkiem i umieścić w odpowiedniej komorze wilgotnej. Dodać 1 kroplę
(70–90µL) nierozcieńczonej kontroli pozytywnej i negatywnej, odpowiednio do dołka 1 i 2. Do pozostałych
dołków dodać 1 kroplę (70-90µL) rozcieńczonych próbek pochodzących od pacjenta.
2
2.
3.
4.
5.
6.
Inkubacja preparatu: Inkubować preparat przez 30 + 5 minut w komorze wilgotnej (zwilżony ręcznik
papierowy włożony na płasko na spodzie zamkniętej torebki lub szklanego pojemnika zapewni odpowiednie
warunki wilgotności). Nie dopuścić do wyschnięcia substratu podczas badania.
Wypłukać preparaty: Po inkubacji użyć plastikowej gruszki laboratoryjnej lub pipety, aby delikatnie
przepłukać surowicę rozcieńczonym buforem PBS. Ustawić preparat oraz strumień bufora PBS w taki
sposób, aby ograniczyć wypłukiwanie próbek między dołkami. Unikać kierowania strumienia
bezpośrednio na dołki, aby nie dopuścić do uszkodzenia substratu. Jeśli jest to wymagane, można
umieścić preparaty na maks. 5 minut w barwiaczu Coplina z rozcieńczonym buforem PBS.
Dodanie koniugatu fluorescencyjnego: Strząsnąć nadmiar buforu PBS. Umieścić preparat z powrotem
w komorze wilgotnej i natychmiast przykryć każdy dołek kroplą koniugatu fluorescencyjnego. Inkubować
preparaty przez dodatkowe 30 +5 minut.
Wypłukać preparaty: Powtórzyć punkt 3.
Szkiełko nakrywkowe: Procedura nakładania szkiełek nakrywkowych różni się w zależności od
laboratorium. Zalecana jest poniższa procedura:
a.
Umieścić szkiełko nakrywkowe na ręczniku papierowym.
b.
Nanieść środek do osadzania preparatu w formie ciągłej linii na dolnej krawędzi szkiełka
nakrywkowego.
c.
Strząsnąć nadmiar buforu PBS i zetknąć dolną krawędź preparatu z krawędzią szkiełka
nakrywkowego. Delikatnie opuścić preparat na szkiełko nakrywkowe, w taki sposób, aby środek do
osadzania preparatu rozpłynął się do górnej krawędzi preparatu bez formowania pęcherzyków
powietrza.
Kontrola jakości
Kontrola pozytywna pemfigoidu i system kontroli negatywnej IFA powinny być oznaczane dla każdego preparatu,
aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury działają prawidłowo. Dodatkowe odpowiednie surowice
kontrolne można przygotować dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze < 70oC. Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli
jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, wyniki badania powinny być traktowane jako nieważne i badanie
powinno zostać powtórzone.
1.
Kontrola pozytywna pemfigoidu musi być >3+.
2.
System kontroli negatywnej IFA musi być negatywny.
Interpretacja wyników
Reakcja negatywna. Próbka jest traktowana jako negatywna, jeśli swoiste zabarwienie obszarów
międzykomórkowych, strefy błony podstawnej i innych struktur jest równe lub mniejsze niż kontroli negatywnej.
Próbki mogą wykazywać różny stopień barwienia tła ze względu na przeciwciała heterofilne lub inne reakcje swoiste
spowodowane przeciwciałami retikuliny, przeciwjądrowymi, przeciwśródmięśniowymi lub przeciwko mięśniom
gładkim.
Reakcja pozytywna dla przeciwciał międzykomórkowych i strefy błony podstawnej. Próbka może być uznana
za pozytywną, jeżeli obserwowane jest swoiste zabarwienie obszarów międzykomórkowych śluzówki przełyku.
Ustalić stopień fluorescencji lub intensywności za pomocą tych kryteriów:
4+
Jaskrawo jasnozielona fluorescencja
3+
Jasna jasnozielona fluorescencja
2+
Wyraźnie rozpoznawalna pozytywna fluorescencja
1+
Najniższa swoista fluorescencja, która umożliwia wyraźne odróżnienie barwienia obszarów
międzykomórkowych lub strefy błony podstawnej od fluorescencji tła
Ograniczenia badania
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Występowanie autoprzeciwciał skóry sugeruje określoną chorobę autoimmunologiczną skóry (pęcherzycę),
ale nie powinno być uznawane za diagnostyczne. Wynik badania autoprzeciwciał powinien być analizowany
w połączeniu z innymi wynikami serologicznymi lub biopsją oraz ogólnym wywiadem klinicznym pacjenta.
Oprócz autoprzeciwciał skóry, z substratem przełyku mogą reagować inne autoprzeciwciała. Niektóre z
nich to autoprzeciwciała przeciwjądrowe (ANA), przeciwmitochondrialne (AMA) oraz przeciwko mięśniom
gładkim i mięśniom szkieletowym. Występowanie tych przeciwciał powinno być zanotowane i ich obecność
potwierdzona oraz miareczkowana z użyciem innych zatwierdzonych substratów.
Należy zauważyć, że w wyniku następstw uszkodzeń tkanki u niektórych pacjentów poparzonych powstają
słabo reaktywne przeciwciała, które także wiążą się do obszarów międzykomórkowych. Te tzw.
przeciwciała „pęcherzyco-podobne” dają słabe i nierównomierne barwienie śluzówki, mają charakter
przejściowy i nie reagują ze skórą pacjenta w warunkach in vivo.13,14,15
Ponieważ śluzówka przełyku może zawierać określone substancje grup krwi, z przełykiem mogą reagować
izoprzeciwciała grup krwi anty-A i anty-B.16 Wzór reaktywności może u niektórych pacjentów przypominać
wzór obserwowany w przypadku pęcherzycowych autoprzeciwciał międzykomórkowych (chociaż
przeciwciała grup krwi będą także barwić kapilary krwi w mięśniach skrawka przełyku). Reaktywność
spowodowana przeciwciałami grup krwi może być absorbowana za pomocą antygenów grup krwi.17
Wiele różnych czynników zewnętrznych ma wpływ na wrażliwość testu, np. typ używanego mikroskopu
fluorescencyjnego, moc i wiek lampy, stosowane powiększenie, system filtrów oraz badacz.
Jeśli zamiast filtra barierowego 515 używany jest filtr środkowo-przepustowy, może wystąpić zwiększone
zabarwienie artefaktowe.
Do opisywania preparatów należy stosować wyłącznie ołówek. Stosowanie innego przyrządu do pisania
może spowodować zabarwienie artefaktowe.
Wszystkie barwiacze Coplina stosowane do płukania preparatów nie powinny zawierać żadnych
pozostałości barwników. Używanie barwiaczy Coplina zawierających pozostałości barwników może
spowodować zabarwienie artefaktowe.
3
9.
10.
Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami
serologicznymi.
Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica.
Spodziewane wartości
Substrat testu przeciwciał skóry NOVA Lite® został użyty do badania pacjentów z chorobami skóry: pęcherzycy i
pemfigoidu jak również do badania 100 losowo wybranych krwiodawców. Wyniki znajdują się poniżej:
Liczba pozytywnych
Grupa pacjentów
Numer
Wewnątrzkomórkowe
Strefa błony podstawowej
Pęcherzyca
24
20
0
Pemfigoid
18
0
12
Normalne
100
0
0
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
Chorzelski TP, Beutner EH, Jablonska S: "The Role and Nature of Autoimmunity of Pemphigus" in Immunopathology of the
Skin, second edition (EH Beutner, TP Chorzelski, SF Bean, eds.) John Wiley and Sons, NY, pp. 183-229, 1979.
Chorzelski TP, von Weiss JF, Lever WF: Clinical significance of autoantibodies in pemphigus. Arch. Dermatol.: 93:570,
1966.
Jablonska S, et.al.: Pathogenesis of pemphigus erythematosus. Arch. Dermatol. Res. 258:135, 1977.
Peck SM, et.al.: Studies in Bullous diseases. Arch. Dermatol. 103:141, 1971.
Jordon RE, et.al.: Basement zone antibodies in bullous pemphigoid. JAMA 200:751, 1967.
Person JR, Rogers RS: Bullous and cicatricial pemphigoid. Mayo Clin. Proc. 52:54,1977.
Chorzelski TP, Jablonska S, Beutner EH: "Pemphigoid" in Immunopathology of the Skin, second edition (EH Beutner, TP
Chorzelski, SF Bean, eds.) John Wiley and Sons, NY, pp. 243-255, 1979.
Sabolinski ML, et.al.: Substrate specificity of anti-ephithelial antibodies of pemphigus vulgaris and pemphigus foliaceous
sera in immunofluorescence tests on monkey and guinea pig esophagus sections. J. Invest. Dermatol. 88:545, 1987.
O'Loughlin S, Goldman GC, Provost TT: Fate of pemphigus antibody following successful therapy. Preliminary evaluation
of pemphigus antibody determination to regulate therapy. Arch. Dermatol. 114:1769, 1978.
Feibeleman C, Stolzner G, Provost TT: Pemphigus vulgaris. Superiority of monkey esophagus in the determination of
pemphigus antibody. Arch. Dermatol. 117:561, 1981.
Wiik A: Antinuclear factors in sera from healthy blood donors. Acta. Path. Microbiol. Scand. 84:215-220, 1976.
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of
Health, Fifth Edition, 2007
Ablin RJ, et.al.: Pemphigus-like antibodies in patients with skinburns. Vox Sang 16:73, 1969.
Quismorio FP, Bland SL, Friou GJ: Autoimmunity in thermal injury: Occurrence of rheumatoid factors, antinuclear
antibodies and antiepithelial antibodies. Clin. Exp. Immunol. 8:701, 1971.
Trifthauser C, et.al.: Fluorescent antibody studies of pemphigus-like antibodies in burn sera. Ann. NY Acad. Sci. 177:227,
1971.
Szulman AE: The histological distribution of blood group substances A and B in man. J. Exp. Medicine 115:977, 1962.
Beutner EH, et. al.: "Defined immunofluorescence-Basic concepts and their application to clinical immunodermatology."
Immunopathology of the Skin, second edition (EH Beutner, TP Chorzelski, SF Bean, eds.) John Wiley and Sons, NY, pp.
29-75, 1979.
NOVA Lite jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc.
Copyright 2011. Wszelkie prawa zastrzeżone©
Wyprodukowano przez:
INOVA Diagnostics, Inc.
9900 Old Grove Road
San Diego, CA 92131
Stany Zjednoczone Ameryki
Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady):
877-829-4745
Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych):
00+ 1 858-805-7950
[email protected]
Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej:
Medical Technology Promedt Consulting GmbH
Altenhofstrasse 80
D-66386 St. Ingbert, Niemcy
Tel.: +49-6894-581020
Faks.: +49-6894-581021
www.mt-procons.com
628330POL
Merzec 2011
Wersja 0
4