pobierz skrypt - Uniwersytet Warszawski

GENETYKA BAKTERII
Materiały do ćwiczeń
Przygotowane przez zespół pracowników
Zakładu Genetyki Bakterii
Zakład Genetyki Bakterii
Instytut Mikrobiologii
Wydział Biologii
Uniwersytet Warszawski
2016
1
SPIS TREŚCI
1.
Mutageneza transpozonowa
1.1. Przeprowadzenie koniugacji szczepu zawierającego plazmid z Tn1 ze
szczepami biorców E. coli lub S. marcescens dającymi możliwość
eliminacji z mieszaniny koniugacyjnej szczepu dawcy
1.2. Wyselekcjonowanie transkoniugantów, do których został przeniesiony
plazmid zawierający transpozon Tn1
Odszukanie wśród transkoniugantów (drogą analizy fenotypu) frakcji
1.3
klonów, w których insercja kasety transpozycyjnej spowodowała
inaktywację genu poddawanego mutagenezie
1.4. Potwierdzenie obecności transpozonu w genomach mutantów
transpozonowych z wykorzystaniem procedury odzyskania plazmidu
2. Mutageneza spontaniczna i indukowana
2.1. Zbadanie częstości rewersji spontanicznych w szczepie E. coli
AB1157 oraz w szczepie z mutacją w genie mut
2.2. Zbadanie częstości mutacji indukowanych UV, MMS i EMS w
szczepie AB1157 i w AB1157 z delecją umuDC
Test „Rec-assay” z wykorzystaniem wybranych szczepów E. coli
3.
3.1. Badanie zwiększonego działania letalnego związków mutagennych
na komórki E. coli posiadające mutacje w genach rec
4. Biofilmy bakteryjne
4.1. Metoda barwienia fioletem krystalicznym
5. Transdukcja ogólna przy udziale faga P1
5.1. Otrzymanie lizatu fagowego o odpowiednio dużym mianie faga i
możliwie dużej zawartości cząstek transdukujących, mianowanie lizatu
5.2. Zainfekowanie lizatem fagowym odpowiedniego szczepu biorcy.
Zbadanie wpływu fenotypu szczepu biorcy (Rec+ lub Rec-) na wynik
przekazywania genów chromosomowych i plazmidowych.
Szczegółowa
analiza
transduktantów
(weryfikacja
fenotypu
5.3
oczyszczonych transduktantów, stwierdzenie występowania kotrandukcji
pewych cech).
6. Oczyszczanie białek bakteryjnych i badanie ich zdolności do interakcji z
DNA
6.1. Nadprodukcja zrekombinowanego białka antytoksyny
6.2. Przygotowanie żelu poliakryloamidowego i elektroforeza białek
7. Badanie interakcji białek
7.1. Reakcja sieciowania białek za pomocą aldehydu glutarowego
7.2. Wizualizacja produktów reakcji sieciowania białek
8. Podłoża
9. Metody
10. Zalecana literatura
str. 3
str. 6
str. 8
str. 9
str. 10
str. 13
str.16
str. 18
str. 19
str. 24
2
1.
Mutageneza transpozonowa
Wykorzystanie wektora niosącego kasetę transpozycyjną do mutagenizacji genu gfp
zlokalizowanego na plazmidzie E.coli oraz genów chromosomowych Serratia marcescens
Transpozony (Tn) należą do elementów transpozycyjnych, a więc ruchomych elementów
genetycznych zdolnych do zmiany miejsca w genomie w wyniku procesu zwanego transpozycją.
Transpozycja jest typem rekombinacji nieuprawnionej, która nie wymaga homologii sekwencji
nukleotydowych cząsteczek DNA uczestniczących w tym procesie i zależy od enzymu transpozazy
kodowanej przez Tn. Wyróżnia się dwa mechanizmy transpozycji: konserwatywny i replikacyjny.
Tn zwykle niosą geny warunkujące różne cechy fenotypowe. Dzielimy je na transpozony
złożone, charakteryzujące się obecnością na obu końcach sekwencji insercyjnych, które okalają
część centralną, niosącą geny niezwiązane z transpozycją, i Tn niezłożone, przypominające budową
sekwencje insercyjne, lecz niosące geny kodujące cechy fenotypowe.
Plazmid samobójczy pDSTn1 wykorzystywany na ćwiczeniach niesie kasetę transpozycyjną
Tn1 zawierającą gen oporności na kanamycynę. Nośnik kasety transpozycyjnej jest plazmidem
mobilizowalnym. Dodatkowo jest wyposażony w gen lewanosacharazy (sacB), co pozwala na
eliminację z puli uzyskanych mutantów klonów, w których doszło do integracji całego plazmidu z
genomem biorcy. Schemat plazmidu pDSTn1 przedstawiono na rycinie 1.
tnp
KmR
ori R6K
IR
IR
PDSTn1
9,3 kpz
sacB
ori R6K
Mob
CmR
Ryc. 1. Schemat plazmidu samobójczego do mutagenezy transpozonowej
Celem ćwiczenia jest wykorzystanie mutagenezy transpozonowej do:
1. insercyjnej inaktywacji genu gfp występującego w obrębie plazmidu szczepu E. coli TG1
2. insercyjnej inaktywacji genów chromosomowych Serratia marcescens,
3. stworzenia fuzji transkrypcyjnej z genami chromosomowymi warunkującymi ruchliwość
Pseudomonas aeruginosa
3
Ćwiczenie 1, 2, 3 - mutageneza transpozonowa
Wykorzystanie wektorów niosących kasety transpozycyjne do mutagenizacji genu gfp
zlokalizowanego na plazmidzie E. coli, genów chromosomowych Serratia marcescens
i Pseudomonas aeruginosa
Eksperyment obejmuje następujące etapy:
1) Przeprowadzenie koniugacji
1. szczepu E. coli S-17 zawierającego plazmid z Tn1 ze szczepem biorcy S. marcescens
2. szczepu E. coli S-17 niosącego kasetę Tn5 ze szczepem P. aeruginosa.
2) Przeprowadzenie transformacji szczepu E. coli gfp+ plazmidem pDSTn1 niosącym Tn1
3) Wyselekcjonowanie transkoniugantów/transformantów, do których został przeniesiony
plazmid zawierający transpozon Tn1 lub Tn5
4) Odszukanie wśród transkoniugantów/transformantów (drogą analizy fenotypu) frakcji
klonów, w których insercja kasety transpozycyjnej spowodowała inaktywację genu
poddawanego mutagenezie.
5) Potwierdzenie obecności transpozonu w genomach mutantów
z wykorzystaniem procedury odzyskania plazmidu lub PCR.
Szczepy:
E. coli S17-1 (pDSTn1; KanR)
E. coli TG1 (pSB1A2gfp; RifR, AmpR)
E.coli S17-1 (pSUP101Tn5-B22; GmR)
S. marcescens (RifR)
P. aeruginosa ATCC 10145 (AmpR)
transpozonowych
Podłoża, roztwory i inne:
- podłoże LB i LA
- roztwory rifampicyny, ampicyliny,
kanamycyny, gentamycyny, sacharozy
- roztwory do izolacji totalnego DNA
- roztwory do izolacji plazmidowego DNA
- roztwory do transformacji metodą
wapniowo-rubidową
- ligaza, bufor do ligazy
- endonukleaza restrykcyjna MluI
Dzień 1
1) Przeprowadzić koniugację szczepu E. coli S17-1 (pDSTn1; KanR), będącego dawcą, ze
szczepem biorcy S. marcescens (RifR)
 Koniugację wykonać poprzez zmieszanie logarytmicznych hodowli biorcy i dawcy
(hodowle odpłukane od antybiotyków) w proporcji 1:1 (0,5 ml biorcy i 0,5 ml dawcy).
Mieszaniny koniugacyjne inkubować 2-3 godzin w 30°C na szalce Petriego
z podłożem LA.
 Po inkubacji mieszaniny koniugacyjne wysiać na podłoże selekcyjne:
LA
4
z kanamycyną, rifampicyną (50 μg/ml) i sacharozą (20%). Płytki inkubować przez 24
godz. w 30°C.
 Transkoniuganty będą następnie selekcjonowane na podstawie różnic w zabawieniu
kolonii w porównaniu z koloniami biorców. Wybrane transkoniuganty zostaną przesiane
na szalki z odpowiednim podłożem.
2) Przeprowadzić koniugację szczepu E. coli S17-1 (pSUP101Tn5-B22; GmR), będącego dawcą,
ze szczepem biorcy P. aeruginosa (AmpR)
 Koniugację wykonać poprzez zmieszanie logarytmicznych hodowli biorcy i dawcy
(hodowle odpłukane od antybiotyków) w proporcji 1:10 (0,1 ml biorcy i 1 ml dawcy).
Mieszaniny koniugacyjne inkubować 2-3 godzin w 30°C na szalce Petriego
z podłożem LA.
 Po inkubacji mieszaninę koniugacyjną wysiać na podłoże selekcyjne: LA z gentamycyną
(10 μg/ml), ampicyliną (100 μg/ml), X-gal (50 μg/ml). Płytki inkubować przez 24 godz.
w 37°C.
 Koniuganty P. aeruginosa będą selekcjonowane na podstawie różnic w zabawieniu
kolonii (kolonie białe i niebieskie). Wybrane transkoniuganty zostaną przesiane na
szalki z odpowiednim podłożem.
3) Przygotować komórki kompetentne E. coli TG1 (pSB1A2gfp; RifR, AmpR) metodą wapnioworubidową. Komórki transformować otrzymanym plazmidem pDSTn1; KanR, będącym donorem
transpozonu Tn1.
 Po transformacji komórki wysiać na podłoże selekcyjne: LA z kanamycyną (50 μg/ml),
ampicyliną (100 μg/ml), rifampicyną (50 μg/ml). Płytki inkubować 24 godz. w 37°C.
 Transformanty będą selekcjonowane na podstawie różnic w zabawieniu kolonii
w porównaniu z koloniami szczepy wyjściowego. Wybrane transformanty zostaną
przesiane na szalki z odpowiednim podłożem.
Dzień 2
1. Z wyselekcjonowanych uprzednio klonów mutantów S. marcescens wyizolować totalne
DNA.
2. Wykonać trawienie totalnego DNA S. marcescens endonukleazą restrykcyjną MluI,
a następnie autoligację strawionego DNA.
3. Przygotować komórki kompetentne E. coli DH5αλpir transformować mieszaniną ligacyjną,
następnie wysiać na podłoże selekcyjne: szalki LA z kanamycyną, 50 μg/ml i inkubować 24
h w 37°C.
4. Wykonać testy fenotypowe wyselekcjonowanych koniugantów P. aeruginosa: sprawdzić
zmiany w zdolności mutantów do ruchu typu „swimming” i „twiching” w porównaniu ze
szczepem dzikim:
Hodowle nocne wyselekcjonowanych mutantów transpozonowych pobrać z płytki
Petriego za pomocą sterylnej wykałaczki i zaszczepić podłoże LA zestalone 0,3%
agarem przez wkłucie wykałaczki (badanie zdolności do ruchu typu swarming).
Inkubować 24 h w 37°C..
Za pomocą sterylnej wykałaczki, jak powyżej, punktowo zaszczepić płytkę z podłożem
LA zestalonym 1% agarem dotykając wykałaczką dna szalki (badanie zdolności do
ruchu typu twiching). Inkubować 24 h w 37°C.
5
Dzień 3
1. Analiza wyników mutagenezy transpozonowej E. coli TG1 z wykorzystaniem transformacji:
a) Wyizolować plazmidowe DNA z komórek E. coli TG1 uzyskanych po mutagenezie.
b) DNA plazmidowe E. coli TG1 przeanalizować elektroforetycznie pod kątem wielkości
plazmidu względem wielkości plazmidu szczepu wyjściowego.
2. Analiza wyników mutagenezy transpozonowej S. marcescens z wykorzystaniem koniugacji:
a) Sprawdzić wydajność przeprowadzonej transformacji DNA S. marcescens, z
uzyskanych kolonii wyizolować DNA plazmidowe.
b) DNA plazmidowe E. coli DH5αλpir przeanalizować elektroforetycznie pod kątem
wielkości plazmidów otrzymanych po autoligacji DNA genomowego S. marcescens.
c) Zsekwencjonować DNA plazmidu i określić lokalizację kasety transpozycyjnej.
3. Analiza wyników mutagenezy transpozonowej P. aeruginosa z wykorzystaniem
transormacji:
a) Odczytać wyniki testów sprawdzających zdolność mutanów P. aeruginosa do ruchu:
ruch typu swimming: po 24-godzinnej inkubacji w 37°C odczytać wyniki zdolności do
ruchu transkoniugantów w porównaniu do szczepu dzikiego.
ruch typu twiching: po 24-godzinnej inkubacji w 37°C zdjąć warstwę agaru a na szalkę
nakroplić 2 ml 0,1% fioletu krystalicznego. Nadmiar barwnika odpłukać wodą
destylowaną.
b) Sprawdzić miejsce integracji Tn5 za pomocą metody odwróconego PCR i przez
sekwencjonowanie.
6
2.
Mutageneza spontaniczna i indukowana
Mutageneza spontaniczna ma u swojej podstawy pomyłki replikacyjne polimeraz DNA,
głównie polimerazy III DNA, prowadzące do wstawienia niekomplementarnej zasady do nowo
syntetyzowanej nici DNA. Mutageneza indukowana różnymi czynnikami fizycznymi lub
chemicznymi wynika głównie z modyfikacji zasad azotowych, a co za tym idzie zmiany w
tworzeniu wiązań wodorowych z zasadą komplementarną. Powstające w DNA zmiany pierwotne,
spontaniczne lub indukowane, jeśli nie zostaną naprawione, stanowią przyczynę mutacji, które
zostają utrwalone zazwyczaj po dwóch rundach replikacyjnych. Escherichia coli, podobnie jak inne
bakterie, wykształciła wiele systemów naprawczych. Pomyłki replikacyjne polimeraz DNA
naprawiane są przez ich aktywność egzonukleolityczną oraz przez system naprawy
niedopasowanych nukleotydów, w którym biorą udział białka Mut. Zmiany indukowane
naprawiane są przez wiele systemów naprawy, np. naprawę bezpośrednią, naprawę przez
wycinanie, naprawę rekombinacyjną, które odtwarzają pierwotną strukturę DNA, oraz przez
jeden system naprawy za wszelką cenę tzn. „naprawę błędną”, w której kluczową rolę pełnią
białka Umu.
Celem eksperymentu jest porównanie częstości:
1)
mutacji (tu mutacji powrotnych czyli rewersji) spontanicznych w szczepie E. coli AB1157
oraz w tym szczepie z mutacją w genie mut (którego produkt MutT bierze udział w naprawie
mutacji spontanicznych);
2)
mutacji indukowanych UV, MMS i EMS w szczepie AB1157 i w AB1157 z delecją umuDC
(co prowadzi do inaktywacji „naprawy błędnej”).
Szczepy:
E. coli AB1157 thr-1 leuB6 hisG4 (oc) arg E3 (oc)
AB1157 thr-1 leuB6 hisG4 (oc) arg E3 (oc) mut T
AB1157 thr-1 leuB6 hisG4 (oc) arg E3 (oc) umuDC
Podłoża:
1) Minimalne Davisa – stałe
a) bez treoniny (selekcja Thr+)
b) bez argininy (selekcja Arg+)
c) bez histydyny (selekcja His+)
2) LB
Wykonanie:
1) Nocne hodowle badanych szczepów (w LB) rozcieńczyć 1:50 (OD600 ~ 0,1) świeżym podłożem
LB (objętość końcowa około15 ml) i hodować z wytrząsaniem w 37 oC przez 1,5 – 2,5 h – do
osiągnięcia fazy logarytmicznej (OD600 ~ 0,6).
2) Przygotowane hodowle logarytmiczne podzielić w następujący sposób:
a) hodowlę AB1157 podzielić na cztery części po 2 ml, a następnie:
cz 1 -2 ml, pozostawić w 37oC, 30 min (kontrola - mutageneza spontaniczna);
7
cz 2 -2 ml, dodać 17 l MMS (stężenie końcowe MMS 100 mM), a następnie inkubować próbę
15 min w 37oC;
cz 3 -2 ml, dodać 106 l EMS (stężenie końcowe EMS 0,5 M), a następnie inkubować próbę 30
min w 37oC;
cz 4 -2 ml hodowli odwirować w chłodzie, zlać supernatant, a osad zawiesić w 2 ml jałowego
buforu Davisa; przenieść hodowlę na plastikową szalkę Petriego i naświetlać 30 s UV (szalkę, a
w dalszej części doświadczenia probówki z próbami po UV chronić przed światłem);
b) 2 ml hodowli AB1157 mutT pozostawić w 37oC, 30 min
c) hodowlę AB1157 umuDC podzielić na cztery części po 2 ml, a następnie:
cz 1 - 2 ml, pozostawić w 37oC, 30 min (kontrola - mutageneza spontaniczna);
cz 2 -2 ml, dodać 17 l MMS (stężenie końcowe MMS 100 mM), a następnie inkubować próbę
15 min w 37oC
cz 3 -2 ml, dodać 106 l EMS (stężenie końcowe EMS 0,5 M), a następnie inkubować próbę 30
min w 37oC
cz 4 -2 ml hodowli odwirować w chłodzie, zlać supernatant, a osad zawiesić w 2 ml jałowego
buforu Davisa; przenieść hodowlę na plastikową szalkę Petriego i naświetlać 30 s UV (szalkę, a
w dalszej części doświadczenia probówki z próbami po UV chronić przed światłem);
3) Następnie wszystkie próby przenieść do 8 ml podłoża LB i inkubować w 37 oC z wytrząsaniem 1
h.
4) Komórki odwirować w 4oC przez 10 min na wirówce Sorval przy 8000 rpm., osad przemyć 5 ml buforu Davisa, ponownie odwirować i zawiesić
w 1 ml buforu Davisa. Odpowiednie rozcieńczenia wysiewać na podłoża:
a) LB – 10-5, 10-6; inkubować 24 h w 37oC
b) minimalne Davisa His+ - 10o, 10-1
Arg+ - 10o, 10-1
Thr+ - 10o, 10-1
płytki inkubować 2-3 doby w 37oC
5) Obliczyć liczbę kolonii rewertantów wyrosłych na poszczególnych podłożach selekcyjnych, oraz
liczbę kolonii wyrosłych na podłożu LB. Policzyć częstość mutacji w przeliczeniu na 10 8
komórek ze wzoru:
ilość poszczególnych mutantów /ml x 108
ilość komórek na LB /ml
8
3. Test „Rec-assay” z wykorzystaniem wybranych szczepów E. coli
Test „Rec-assay” pozwala na badanie letalnego działania związków mutagennych na komórki
E. coli posiadające mutacje w genach rec. Komórki tych mutantów nie mają zdolności do naprawy
uszkodzeń w DNA za pomocą rekombinacji, w przeciwieństwie do szczepów dzikich. Mają też
osłabione pozostałe mechanizmy naprawcze, dlatego nawet niewielkie uszkodzenia w DNA
powodują zahamowanie ich wzrostu.
Szczepy:
Podłoże:
LA
E. coli CSH51 – szczep dziki
E. coli CSH52 (recA-)
E. coli SK7881 ( recB)
E. coli JC5703 (recC-)
E. coli SK7885 (recBC-)
E. coli JC5519 (recBCD-)
E. coli SK7892 (recBC-sbcB-)
E.coli JC7623 (recBC-socB-)
Wykonanie:
1. W centralnej części powierzchni płytki Petriego z LA za pomocą sterylnej pęsety umieścić krążek
bibuły filtracyjnej.
2. Pobrać
ezą
inoculum
z
całonocnej
hodowli
szczepu
E.
coli
(mutanta)
i rozprowadzić w postaci pasma od brzegu krążka bibuły (ryc.1). Podobnie posiać na tej samej
płytce szczep dziki, pod kątem ok. 90o względem poprzedniego posiewu.
3. Na krążek nanieść 10 μl roztworu MMS, EMS lub 5 μl rifampicyny (5 mg/ml).
Uwaga!
Praca
ze
związkami
mutagennymi,
NALEŻY
PAMIĘTAĆ
O RĘKAWICZKACH.
4. Szalki inkubować 24 godziny w temperaturze 37oC.
5. Po zakończeniu inkubacji zmierzyć długość strefy zahamowania wzrostu obu szczepów
(od brzegu krążka do początku wzrostu). Porównać badany wzrost obu szczepów.
Ryc.1. Sposób nanoszenia hodowli
na płytkę w teście „Rec-assay”
9
4. Biofilmy bakteryjne
Większość bakterii w środowisku naturalnym występuje w postaci biofilmu. Dotyczy to
również bakterii patogennych, ponad 80% infekcji w ludzkim organizmie wywoływanych jest przez
drobnoustroje, głównie bakterie, rosnące w tej właśnie postaci. Powszechnie uważa się że biofilm to
osiadła społeczność komórek nieodwracalnie związana z jakąś powierzchnią, otoczona matriks
złożoną najczęściej z polisacharydów. W matriks mogą znajdować się substancje nie mające
komórkowego pochodzenia, jak np.: kryształy minerałów, cząsteczki gliny czy komórki. Biofilmy
tworzą się nie tylko na powierzchniach stałych (biotycznych lub abiotycznych) lecz również na
granicy faz np. woda/powietrze. W definicji biofilmu zawarte jest również stwierdzenie, że
komórki, które go tworzą, wykazują zmieniony fenotyp, szczególnie jeśli chodzi o szybkość
wzrostu oraz transkrypcję genów chromosomowych w porównaniu z bakteriami swobodnie
żyjącymi. Dla przykładu, proteom komórek Pseudomonas aeruginosa rosnących w biofilnie jest
inny niż wolnożyjących komórek tego gatunku, w przypadku komórek osiadłych dodatkowo silnie
zależy on od charakteru podłoża.
Biofilmy bada się różnymi metodami, począwszy od metod mikroskopowych, przez barwienie
fioletem krystalicznym, po metody luminometryczne umożliwiające ocenę liczby żywych komórek
w wytworzonym już biofilnie przez pomiar wydzielanego ATP (np. poprzez utlenianie lucyferazy
w obecności ATP i tlenu cząsteczkowego). W ramach ćwiczeń, stosując klasyczną metodę
barwienia fioletem krystalicznym, zbadamy zdolność do tworzenia biofilmów przez wybrane
szczepy bakteryjne oraz sprawdzimy wrażliwość powstałych biofilmów na klasyczne i alternatywne
środki antybakteryjne jak: antybiotyki- np. ampicylinę (Ap), związek pochodzenia roślinnego (o
udokumentowanym działaniu antybakteryjnym) – kwas oleanolowy (OA) oraz nanocząstki srebra
(AgNPs).
Celem ćwiczenia jest zbadanie:
1) zdolności do tworzenia biofilmów przez wybrane szczepy bakteryjne
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
Szczepy:
Escherichia coli MG1693
Escherichia coli MG1693 ΔhtpG
Escherichia coli ATCC 23546 ΔdnaKdnaJ
Podłoża
LB
LB + Glc
Wykonanie:
Uzupełnienia
Km (50mg/ml)
Metoda barwienia fioletem krystalicznym
cz. I
Nocna hodowla bakterii w LB lub LB +Km (dla szczepów mutantów), 37oC,
Rozcieńczyć hodowle 1:100 w LB lub LB +Glc nanieść po 200 l na płytki titracyjne, przykryć
wieczkiem i inkubować 48 h w 37oC
niezwiązane komórki usunąć delikatnie wytrząsając
przemyć dołki, w tym celu płytki zanurzyć w wodzie i lekko mieszać, po usunięciu wody
odpłukane dołki barwi się fioletem krystalicznym (125 l r-r 0,1% na dołek) przez 10 min w
temperaturze pokojowej
po 10 min barwnik zlać, a płytki przemyć 2x wodą przez zanurzenie
wodę usunąć, a szalki pozostawić do wyschnięcia
po wysuszeniu płytek barwnik rozpuścić, dodając do każdego dołka 200 l 95 % etanolu i
inkubować pod przykryciem w temperaturze pokojowej przez 15 min
10
8) wykonać pomiar przy długości fali 570 nm (A570).
5. Transdukacja ogólna przy użyciu faga P1
Horyzontalny transfer genów u prokariotów może odbywać się w wyniku bezpośredniego
pobierania DNA ze środowiska (transformacja) lub za pośrednictwem ruchomych elementów
genetycznych, takich jak plazmidy i transpozony koniugacyjne (koniugacja) lub bakteriofagi
(transdukcja).
W transdukcji materiał genetyczny dawcy przenoszony jest do biorcy w kapsydzie
fagowym. Cząstki fagowe niosące w kapsydzie obcy materiał genetyczny nazywamy cząstkami
transdukującymi. Mogą one zawierać DNA fagowy połączony kowalencyjnie z DNA gospodarza
(dzieje się tak w wypadku transdukcji specyficznej) lub wyłącznie materiał genetyczny gospodarza
(transdukcja ogólna).
Do transdukcji specyficznej dochodzi w przypadku fagów, które w czasie szlaku
lizogennego wbudowują swój genom w ściśle określone miejsce chromosomu gospodarza (np.
fag
E. coli . Z chwilą wejścia faga w szlak lityczny, z niewielką częstością, może zajść
nieprawidlowe wycięcie profaga, w związku z czym powstaje hybrydowy DNA zawierający
sekwencje profagowe z odcinkiem chromosomu znajdującym się po jednej bądź drugiej stronie
genomu profaga. Tak więc w tym przypadku tylko ściśle określone geny gospodarza mogą by
przenoszone przez cząstki transdukujące (dla λ są to geny gal lub bio).
W transdukcji ogólnej uczestniczą cząstki transdukujące zawierające wyłącznie materiał
genetyczny gospodarza. Powstają one w wyniku błędnego pakowania materiału genetycznego
bakterii do główek fagowych w trakcie litycznego rozwoju faga. W przypadku takich fagów jak P1
(infekujący E. coli) teoretycznie każdy kawałek DNA, o odpowiedniej wielkości, może być
przeniesiony w kapsydzie wirusa. Ze względu na mechanizm tworzenia cząstek transdukujących,
praktycznie z równym prawdopodobieństwem, przeniesieniu może ulec każdy gen (dlatego proces
ten nosi nazwę transdukcji ogólnej). Odcinek DNA gospodarza przenoszony w cząstkach
transdukujących jest wielkością zbliżony do genomu fagowego. Na przykład genom P1 zawarty w
główce fagowej liczy 100 kpz (co stanowi ponad 2% genomu E. coli) i tej wielkości fragmenty
DNA są przenoszone w procesie transdukcji z jednego szczepu E. coli do innego. Przenoszony
może być zarówno DNA chromosomowy jak i plazmidowy, jednak aby powstały stabilne
transduktanty, w pierwszym przypadku musi dojść do wbudowania, w wyniku rekombinacji
homologicznej, materiału do genomu biorcy, natomiast w drugim przypadku musi zostać
odtworzony funkcjonalny replikon (oczywiście powinien on być zdolny do autonomicznej
replikacji w nowym gospodarzu).
Transdukcja ogólna była kiedyś wykorzystywana do mapowania blisko położonych genów
(prawdopodobieństwo jednoczesnego przeniesienia dwu lub większej liczby genów zależy od ich
odległości od siebie) oraz do konstrukcji szczepów bakterii o określonych cechach.
Koniugacja, transdukcja i transformacja to procesy odgrywające ważną rolę w ewolucji
prokariotów, bowiem w czasie pojedynczego wydarzenia organizmy te mogą uzyskać nowe cechy,
przystosowujące je do zmieniającego się środowiska.
Celem ćwiczenia jest:
1) wykazanie, że w procesie transdukcji mogą być przenoszone:
a) geny chromosomowe,
b) genom plazmidowy.
2) zbadanie wpływu fenotypu szczepu biorcy (Rec+ lub Rec-) na wynik przekazywania genów
chromosomowych i plazmidowych.
11
Cały eksperyment transdukcji składa się z kilku etapów:
1) Otrzymanie lizatu fagowego o odpowiednio dużym mianie faga i możliwie dużej zawartości
cząstek transdukujących poprzez przeprowadzanie co najmniej 2 cykli namnażania faga P1 na
odpowiednim szczepie dawcy DNA (wrażliwym na P1 i niosącym cechę, którą chcemy przenieść).
2) Zainfekowanie lizatem fagowym odpowiedniego szczepu biorcy. Zawartość cząstek
transdukujących w tzw. lizacie transdukującym wynosi nie więcej niż 0,3%, pozostałe cząstki
fagowe to funkcjonalne wirulentne fagi. Fakt ten ma swoje implikacje w przebiegu całego procesu i
wymaga spełnienia odpowiednich warunków technicznych, aby uzyskać pozytywny wynik
transdukcji, np. stosowanie niskiej wielokrotności zakażenia (moi = 0,05, ang. multiplicity of
infection), obecności jonów wapnia tylko w etapie adsorpcji.
Dobór szczepu biorcy musi być przeprowadzony z uwzględnieniem kilku ważnych czynników, w
tym:
a) możliwości przeprowadzenia bezpośredniej selekcji odpowiednich transduktantów,
b) lub możliwości uzyskania odpowiedniej klasy transduktantów poprzez wykorzystanie
zjawiska kotransdukcji,
c) zastosowania biorcy o aktywnym systemie rekombinacji ogólnej (RecA+ RecBCD+) w
przypadku transdukcji genów chromosomowych, ponieważ włączenie wprowadzonego
za pośrednictwem faga fragmentu DNA do chromosomu biorcy następuje w wyniku
procesu rekombinacji homologicznej.
3) Selekcja transduktantów na odpowiednich podłożach selekcyjnych;
4) Szczegółowa analiza transduktantów (weryfikacja fenotypu oczyszczonych transduktantów,
stwierdzenie występowania kotrandukcji pewych cech).
Zadanie I. Transdukcja genów chromosomowych
Celem eksperymentu jest przeniesienie mutacji recB ze szczepu dawcy Escherichia coli SK7881 (
recB/Kmr) do dwóch szczepów biorcy:
(i) E. coli MG1693 (RecB+, Kms, thyA),
(ii) E. coli JC5703 ( recC82 Kms).
Szczepy:
SK7881( recB/Kmr)
MG1693 (RecB+ Kms thyA);
JC5703 (recC82 Kms)
Podłoża i roztwory:
LA
podłoże Davisa stałe
hydrolizat kazeiny (20 %)
roztwór tyminy (1 mg/ml)
roztwór kanamycyny (10 mg/ml)
roztwór chloramfenikolu (50 mg/ml)
roztwory do minilizy alkalicznej
Wykonanie:
Wariant 1 – wykorzystanie szczepu MG1693 (Rec+) jako biorcy
1) Namnożenie faga P1 na szczepie SK7881 (2 pasaże metodą płytek dwuwarstwowych).
2) Oznaczenie miana faga z użyciem E. coli AB1157 jako szczepu wskaźnikowego.
12
3) Infekcja szczepu MG1693 lizatem fagowym otrzymanym w punkcie „1” i selekcja
transduktantów:
a) Kmr
na podłożu LA + Km (50 g/ml);
b) ThyA+
- na podłożu minimalnym Davisa uzupełnionym hydrolizatem kazeiny
(stężenie końcowe 0,2%).
4) Analiza otrzymanych transduktantów metodą replik:
a) transduktanty Kmr (z punktu "3a") replikujemy na podłoża:
- LA zawierające MMS (0,04 %);
- LA zawierające MMS (0,055 %);
- podłoże Davisa + hydrolizat kazeiny (0,2 %).
b) transduktanty Thy+ (z punktu "3b") replikujemy na podłoża:
- LA z kanamycyna;
- LA zawierajace MMS (0,04 %);
- LA zawierające MMS (0,055 %).
5) Zestawienie i omówienie otrzymanych wyników.
Wariant 2. - wykorzystanie szczepu JC5703 (Rec-) jako biorcy
1) Przeprowadzenie infekcji szczepu E. coli JC5703 lizatem transdukującym otrzymanym w
Zadaniu 1. Selekcja transduktantów na podłożu LA z kanamycyną.
2) Porównanie liczby transduktantów Kmr uzyskanych w obu zadaniach.
Zadanie II. Transdukcyjne przenoszenie genomów plazmidowych
Plazmid pWMK3 zawarty w szczepie SK7297 ma wielkość 25 kb. Został skonstruowany przez
sklonowanie fragmentu (o wielkości 19 kb) chromosomu E. coli, niosącego dzikie allele genów
recBCD, w wektorze pochodnym pBR325 (6 kb) w miejsce BamHI. Markerem selekcyjnym
plazmidu pWMK3 jest oporność na chloramfenikol (Cmr).
Szczepy:
E. coli SK7297 (pWMK3) Cmr
E coli SK7881 ( recB/Kmr) Cms
E. coli MG1693 (Rec+KmsthyA) Cms
E. coli AB1157 - szczep wskaźnikowy
Podłoża i roztwory:
LA
roztwór chloramfenikolu (50 mg/ml)
roztwory do minilizy alkalicznej
Wykonanie:
Wariant 1. Przeniesienie plazmidu pWMK3 ze szczepu SK7297 do szczepu MG1693 (Rec+)
Wariant 2. Przeniesienie plazmidu pWMK3 ze szczepu SK7297 do szczepu SK7881 (Rec-).
1) Przygotowanie lizatu transdukującego poprzez namnożenie faga P1 na szczepie SK7297.
2) Oznaczenie miana faga z użyciem szczepu AB1157 jako szczepu wskaźnikowego.
3) Infekcja szczepów MG1693 oraz SK7881 lizatem transdukującym, selekcja transduktantów
Cmr na podłożu LA+ Cm (20 g/ml).
4) Porównanie liczby transduktantów Cmr uzyskanych dla obu biorców.
5) Potwierdzanie obecności plazmidu pWMK3 w transduktantach Cmr poprzez wykonanie
minilizy z 10 transduktantów i analizę elektroforetyczną preparatów DNA. Jako kontrolę
należy zastosować preparaty DNA uzyskane z minilizy szczepu dawcy (SK7297).
6) Sprawdzenie wrażliwości na MMS transduktantów SK7881 Cmr metodą replik. Ponieważ
plazmid pWMK3 niesie dziki allel genu recB winna nastąpić komplementacja chromosomowej
13
mutacji recB obecnej w biorcy SK7881, a więc transduktanty powinny
MMSr.
wykazywać fenotyp
6. Oczyszczanie białek bakteryjnych i badanie ich zdolności do interakcji z
DNA
Ryc. 1. Model organizacji genetycznej i autoregulacji modułu addykcyjnego tad-ata.
pET28b(+)
(5368 pz)
Ryc. 2.
14
Wektor ekspresyjny pET28b(+) wykorzystany do nadprodukcji białka antytoksyny systemu addykcyjnego s045-s044.
Dane na temat wektorów typu pET na stronie: http://www.merckbiosciences.com/g.asp?f=NVG/pETtable.html
Celem ćwiczenia jest:
1) otrzymanie wydajnej nadekspresji białka
2) zapoznanie się z różnymi układami ekspresyjnymi
3) badanie interakcji białka z DNA
Wykonanie:
6.1. Nadprodukcja zrekombinowanego białka antytoksyny
1. Odmłodzić hodowlę w stosunku 1:50.
2. Po godzinie dodać IPTG do stężenia końcowego 0,2 mM.
3. Co 40 min zwirować 1 ml hodowli i zamrażać w -20 °C.
6.2. Przygotowanie żelu poliakryloamidowego i elektroforeza białek
1. Przygotować żel rozdzielający, a po 30 min. zagęszczający.
2. Próbki zawiesić w 100 μl wody dejonizowanej i dodać 100 μl buforu lizującego do białek [2 x
stężony; 0,125 M Tris HCl (pH 6,8), 10 % β-merkaptoetanol, 0,05 % błękit bromofenolowy, 20
% glicerol, 4 % SDS].
3. Próbki inkubować 10 min w 100 °C.
4. Nanieść 10 μl próbki na żel i przeprowadzić elektroforezę SDS-PAGE w 15 % żelu
poliakryloamidowym w buforze glicynowym 1 x stężonym (0,025 M Tris base, 0,192 M glicyna,
0,1 % SDS). Elektroforezę prowadzić przy napięciu 70 V aż do „wejścia” prób w żel
rozdzielający, wtedy należy zmienić napięcie na 150 V.
5.3. Badanie zdolności do interakcji zrekombinowanego białka antytoksyny z DNA
1. Wymieszać:
Ilość
Odczynnik
--
4 μl
--
4 μl
rekombinowane białko Ata
--
próbka nr 1 --> 0 μl
próbka nr 2 --> 0,5 μl z roztworu rozcieńczonego 1:10
próbka nr 3 --> 0,5 μl z roztworu nierozcieńczonego
woda dejonizowana
--
próbka nr 1 --> 11 μl
próbka nr 2 --> 10,5 μl
próbka nr 3 --> 10,5 μl
kompetycyjny DNA
(mieszanina zlinearyzownych plazmidów
pABW3 i pCF430, w stosunku 1:1)
bufor do EMSA
[40 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl2,
100 mM KCl, 1 mM ditiotreitol (DTT), 10%
surowicza albumina wołowa (BSA)]
2. Próby inkubować 10 min. w temp. pokojowej
3. Dodać 1 μl DNA
grupa nr 1 --> fragment DNA oznaczony A
grupa nr 2 --> fragment DNA oznaczony B
grupa nr 3 --> fragment DNA oznaczony C
15
grupa nr 4 --> fragment DNA oznaczony D
4. Próby inkubować 5 min. w temp. 37 °C
5. Po obciążeniu 50 % glicerolem próbki nanieść na 2,4 % żel agarozowy. Elektroforezę prowadzić
w 0,5 x stężonym buforze TBE (89 mM Tris base, 2,5 mM EDTA, 89 mM kwas borowy), w
lodzie. Przez pierwsze 30 min przy napięciu 50 V, następnie przy napięciu 80 V.
6. Po rozdziale elektroforetycznym żel umieścić w wodnym roztworze bromku etydyny o
końcowym stężeniu 0,5 mg/ml (5 min), a następnie płukać w wodzie (5 min). Wyniki rozdziału
DNA analizować z wykorzystaniem transiluminatora UV.
16
7. Badanie interakcji białek
Czynnikami sieciującymi są zarówno homo- jak i heterobifunkcyjne substancje, które mają
odpowiednio identyczne lub różne grupy reaktywne.
Najczęściej używane są odczynniki sieciujące, które: (i) mają identyczne grupy reaktywne
(homobifunkcyjne), oddziałujące z pierwszorzędowymi grupami aminowymi (najczęściej lizyny),
(ii) dobrze rozpuszczają się w środowisku wodnym, (iii) tworzą stabilne wiązania kowalencyjne z
białkami.
Odczynniki sieciujące mające identyczne grupy reaktywne dzielą się na dwie klasy: (i)
odczynniki tworzące trwałe wiązania pomiędzy białkami (np. aldehyd glutarowy i estry imidowe)
oraz (ii) odczynniki [np. ester N-hydroksyimidu kwasu bursztynowego (NHS)] tworzące nietrwałe
wiązania, które mogą zostać przecięte w wyniku działania odpowiedniego czynnika redukującego
[np. β-merkaptoetanol i ditiotreitol (DTT)].
aldehyd glutarowy
Celem ćwiczenia jest:
1) zbadanie zdolności do oddziaływań pomiędzy białkami
2) zapoznanie się z różnymi metodami badań interakcji białek
Wykonanie:
7.1. Reakcja sieciowania białek za pomocą aldehydu glutarowego
1. Wymieszać:
Odczynnik
0,5 M bufor bicyna-NaOH (pH 8,5)
4 M NaCl
1 mM ditiotreitol (DTT)
aldehyd glutarowy
-
zrekombinowane białko Ata
-
woda dejonizowana
RAZEM
-
2.
3.
4.
5.
Ilość
2 μl
2 μl
2 μl
próbka nr 1 →0 μl;
próbka nr 2 → 0,5 μl z roztworu o stężeniu 0,1%;
próbka nr 3 →2 μl z roztworu o stężeniu 0,1%;
próbka nr 4 → 1 μl z roztworu o stężeniu 1%;
grupa nr 1 →2 μl (białko z domeną histydynową na końcu C’);
grupa nr 2 → 3 μl (białko z domeną histydynową na końcu C’);
grupa nr 3 →2 μl (białko z domeną histydynową na końcu N’);
grupa nr 4 →3 μl (białko z domeną histydynową na końcu N’)
dopełnić do 20 μl
20 μl
Inkubować 20 min. w temp. pokojowej.
Dodać 2,5 μl 1,4 M roztworu etanoloamina-HCl (pH 8,0).
Inkubować 20 min. w temp. pokojowej.
Dodać 20 μl buforu lizującego do białek (2 x stężony).
17
6. Próbki inkubować 10 min w 100 °C.
7. Nanieść próbki na żel i przeprowadzić elektroforezę SDS-PAGE w 15 % żelu poliakryloamidowym
w buforze glicynowym 1 x stężonym (0,025 M Tris base, 0,192 M glicyna, 0,1 % SDS).
Elektroforezę prowadzić przy napięciu 70 V aż do „wejścia” prób w żel rozdzielający, wtedy należy
zmienić napięcie na 150 V.
7.2. Wizualizacja produktów reakcji sieciowania białek
1. Po przeprowadzonej elektroforezie umieścić żel na 10 min. w barwniku Coomasie Briliant Blue.
2. Przenieść do roztworu tzw. odbarwiacza mocnego i przeprowadzić 2 płukania po 10 min.
3. Przenieść do roztworu tzw. odbarwiacza słabego.
18
PODŁOŻA
Podłoże LB (Luria broth)
Bacto tryptone
10 g
Bacto yeast Extract
5 g
NaCl
5 g
H2O dest.
do 1000 ml
pH 7,2; sterylizować 15 min w 121oC.
Podłoże LA (Luria agar)
Do 200 ml podłoża LB dodać 3 g Bacto - agaru. Jałowić jak wyżej.
Podłoże minimalne Davisa
sole:
K2HPO4 bezw.
14 g
KH2PO4 bezw.
6 g
(NH4)2SO4 bezw.
2 g
MgSO4 x 7H2O
0,2 g
cytrynian sodu
1,0 g
H2O
400 ml
Rozlać po 40 ml; jałowić 30 min. w 121oC.
agaroid:
agar-agar
3,0 g
H2O dest.
150
ml
glukoza 20%
Podłoże płynne przygotowuje się przez zmieszanie:
150 ml H2O dest.
40 ml soli
4 ml glukozy
Podłoże stałe otrzymuje się przez zmieszanie:
150 ml agaroidu (upłynnionego)
40 ml soli
4 ml 20% glukozy
Bulion odżywczy (BO)
Bulion suchy (Biomed)
15 g
H2O dest.
do 1000 ml
Agar odżywczy (AO)
Do 200 ml bulionu odżywczego dodać 3 g agaru-agaru. Jałowić jak wyżej.
19
METODY
Miniliza alkaliczna (modyfikacja metody Birnboim i Doly, 1979)
W metodzie tej wykorzystuje się fakt, że w wąskim zakresie pH (12,0 - 12,5) zachodzi wybiórcza
denaturacja liniowej formy DNA, ale nie formy CCC. Komórki lizuje się całkowicie traktując je
SDS i NaOH. DNA chromosomowy zostaje wybiórczo zdenaturowany, a kiedy lizat zostaje
zobojętniony przez dodatek kwaśnego roztworu octanu sodu, DNA chromosomowy renaturuje i
tworzy nierozpuszczalne agregaty. Jednocześnie pod wpływem wysokiego stężenia octanu sodu
zachodzi wytrącenie kompleksów białek z SDS, a także wielkokocząsteczkowego RNA. W ten
sposób ko-precypitacji ulegają trzy rodzaje największych makrocząsteczek mogących stanowić
zanieczyszczenie preparatów DNA plazmidowego. Można je następnie usunąć poprzez jedno
wirowanie. Supernatant zawiera przede wszystkim DNA plazmidowy (oraz resztki
drobnocząsteczkowego RNA), który można odzyskać z supernatantu w wyniku wytrącenia
etanolem.
Materiały
1) Roztwór I:
50 mM glukoza
10 mM EDTA
25 mM Tris HCl (pH 8,0)
2) Roztwór II:
0,2 N NaOH
1% SDS
3) Roztwór III:
octan potasu (pH~4,8)
Roztwór III przygotowuje się, mieszając 60 ml 5 M octanu potasu z 11,5 ml lodowatwgo kwasu
octowego i 28,5 ml H2O dest. Otrzymany roztwór jest 3 M względem potasu i 5 M względem
octanu.
Wykonanie:
1) Odwirować w probówce Eppendorfa 1,5 ml nocnej hodowli bakterii w LB (3 min,
mikrowirówka)
2) Dokładnie zlać supernatant, osad zawiesić w 100 l zimnego roztworu I i inkubować 5 min w
temp. pokojowej.
3) Dodać 200 l roztworu II, zawartość eppendorfówki wymieszać przez kilkukrotne odwracanie i
inkubować w lodzie przez 5 min.
4) Dodać 150 l zimnego roztworu III, wymieszać i inkubować w lodzie przez 5 min.
5) Dodać 30 l mieszaniny fenolu z chloroformem i wymieszać łagodnie.
6) Odwirować 10 min. w mikrowirówce w temp. pokojowej.
7) Do zebranej fazy wodnej dodać 2 objętości (1ml) 96% etanolu i trzymać 15 min w zamrażarce.
8) Odwirować wytrącony DNA (10 min. w wirówce z chłodzeniem), zlać supernatant.
10) Przemyć osad 100 l 70% etanolu i odwirować 10 min w wirówce z chłodzeniem.
11) Dokładnie usunąć supernatant, wysuszyć osad (np. przez wstawienie otwartej eppendorfówki na
15 min do termostatu na 65oC).
12) Osad zawiesić w 40 l buforu TE (pH 8,0).
20
Elektroforeza DNA w żelu agarozowym
Elektroforeza DNA w żelu agarozowym jest standardową metodą pozwalającą wykryć obecność
plazmidów w lizatach komórkowych, określić ich liczbę i wielkość, a także rozdzielić fragmenty
DNA otrzymane po trawieniu plazmidów enzymami restrykcyjnymi. Tempo migracji cząsteczek
DNA zależy od ich wielkości a także od użytych parametrów elektroforezy (stężenia agarozy,
przyłożonego napięcia, użytego buforu i temperatury).
Wykonanie:
1) Przygotować bufor elektrodowy Tris-octan (TAE ) o składzie: 0,04 M Tris-octan i 0,001M
EDTA, pH 8,0.
2) Przygotować 0,8% agarozę w buforze elektrodowym, ogrzać do całkowitego rozpuszczenia, a
następnie schłodzić do 60oC.
3) Wlać agarozę do przygotowanego odpowiednio aparatu do elektroforezy z włożonym
grzebieniem (grubość żelu powinna wynosić około 5 mm).
4) Po zestaleniu żelu wyjąć grzebień i wlać bufor elektrodowy w takiej ilości, aby przykrył żel
cienką warstwą.
5) Wymieszać próbki DNA z buforem obciążającym (o składzie 0,25% błękit bromofenolowy, 30%
glicerol) w proporcji 6:1 i nałożyć do studzienek w żelu przy pomocy pipety automatycznej.
6) Prowadzić elektroforezę, ustawiając zasilacz na wartość napięcia 100 V do momentu dojścia
barwnika do 2/3 żelu.
7) Barwić żel przez 10 min. w roztworze bromku etydyny o stężeniu końcowym 0,5 g/ml.
8) Odpłukać bromek etydyny w wodzie destylowanej.
9) Obejrzeć żel pod lampą UV.
Transformacja metodą rubidowo-wapniową (Kushner, 1978)
Metoda ta pozwala uzyskać dla wielu szczepów E. coli wyższą wydajność transformacji niż
standardowa metoda wapniowa.
Podloża i roztwory:
Podłoże LB i LA
Roztwór I do transformacji
10 mM MOPS pH 7,0
10 mM RbCl
Roztwór II do transformacji
100 mM MOPS pH 6,5
50 mM CaCl2
10 mM RbCl
21
Wykonanie:
1) Nocną hodowlę E. coli rozcieńczyć 1 : 50 w świeżym podłożu LB (np. do 10 ml podłoża w
kolbie a 100 ml dodać 0,2 ml hodowli).
2) Inkubować z wytrząsaniem w 37oC do osiągnięcia gęstości około 1 x 108/ml (co trwa około 2
godz.).
3) Odwirować 1,5 ml hodowli w probówkach Eppendorfa (3 min, mikrowirówka, 4oC).
4) Zlać dokładnie supernatant, osad zawiesić w 1 ml jałowego roztworu I i odwirować jak wyżej.
5) Zlać dokładnie supernatant, a osad zawiesić w 0,2 ml jałowego roztworu II.
6) Zawieszone bakterie inkubować 15 min w lodzie.
7) Dodać DNA i trzymać przez dalsze 15 min w lodzie.
8) Przenieść na 50 sek. do łaźni wodnej o temp. 43 - 44oC.
9) Natychmiast dodać 5 ml LB i inkubować w 37oC bez wytrząsania przez 60 min.
10) Wysiać na odpowiednie płytki selekcyjne. Jeśli trzeba, komórki przed wysiewem można
rozcieńczyć bądź zagęścić przez wirowanie.
Izolacja całkowitego DNA (wg Chen i Kuo, 1993)
6) nocną hodowlę bakteryjną (1,5 ml) wirować przez 3 minuty przy 12 000 obr./min.
7) osad zawiesić w 200 ul roztworu TESO, dodać 66 µl 5M NaCl, mieszać intensywnie przy użyciu
worteksu przez 1 minutę i odwirować 4 minuty / 12 tys. obr./min. w temp. pokojowej
8) zebrać supernatant, dodać równą objętość mieszaniny fenol:chloroform (nasyconej 1M Tris HCl
o pH 8,0)
9) mieszać intensywnie przy użyciu worteksu przez minutę i odwirować 5 minut
(12 tys obr./min)
10)
zebrać fazę wodną i dodać równą objętość chloroformu, zworteksować przez minutę
i zwirować 5 minut jw.
11)
do zebranej fazy wodnej dodać 2 objętości etanolu (96%) oraz 1/10 objętości roztworu III
do lizy alkalicznej
12)
DNA wytrącać przez 30 minut w -20°C
13)
preparat odwirować 20 minut w 4°C, 12 tys obr./min.
14)
osad przemyć 2 razy 70% etanolem, wysuszyć i zawiesić w 100 µl buforu TE
TESO:
40 mM Tris-HCl (pH 8,0)
1mM EDTA (pH 8,0)
1% SDS
20 mM NaAc
22
Przygotowanie faga P1 do transdukcji
(metoda płytek dwuwarstwowych)
Materiały:
podłoże płynne LB
podłoże półpłynne LB (tzw."top agar"), zawierające 0,8% agaru.
chloroform
Wykonanie:
1) Zaszczepić 10 ml podłoża LB szczepem dawcy i inkubować przez noc w 37oC bez
wytrząsania.
2) Do hodowli dodać 0,1 ml 0,5 M jałowego roztworu CaCl2 (stęż. końc. 5 mM).
3) Rozlać po 0,5 ml hodowli do 4 probówek i dodać faga P1:
nr 1 - bez faga
nr 2 - 0,1 ml faga nierozcieńczonego
nr 3 - 0,1 ml faga rozcieńczonego w LB do 10-1
nr 4 - 0,1 ml faga rozcieńczonego w LB do 10-2
4) Inkubować 10 min. w termostacie (37oC) - adsorpcja.
5) Dodać 3 ml "top agaru" o temp. 45 – 46oC.
6) Delikatnie wymieszać i wylać na powierzchnię płytki LB.
7) Po zakrzepnięciu agaru, płytkę odwrócić i inkubować w 37oC przez noc.
8) Po inkubacji wybrać płytkę o odpowiednim stopniu lizy (tzw. "confluent lysis", tzn nie widać
pojedynczych łysinek, ale liza nie powinna być kompletna). Zeskrobać jałową bagietką szklaną
górną warstwę agaru półpłynnego, przenieść do jałowej probówki wirowniczej, powierzchnię
agaru przepłukać 2 ml LB, przenieść do tej samej probówki; dodać 0,5 ml chloroformu i mocno
wytrząsać.
9) Odwirować 4000 obrotów na min przez 10 - 15 min.
10) Przenieść supernatant do fiolki zawierającej nieco chloroformu.
11) Powtórzyć cykl namnażania, używając w punkcie 3 lizatu otrzymanego w punkcie 10.
Mianowanie lizatu fagowego
1) Do "nocnej" hodowli szczepu wskaźnikowego E. coli AB1157 lub do hodowli logarytmicznej
dwukrotnie zagęszczonej dodać CaCl2 do końcowego stężenia 5 mM.
2) Przygotować rozcieńczenia lizatu fagowego w LB (zwykle 10oC-5, 10-6 oraz 10-7).
3) Zmieszać w probówce 0,1 ml bakterii wskaźnikowych i 0,1 ml rozcieńczonego lizatu.
4) Inkubować 20 min. w 37oC (etap adsorpcji).
5) Dodać 1,5 - 1,8 ml półpłynnego podłoża LB o temp. 45 - 46oC (mała objętość pozwala
zwiększyć rozmiar łysinek P1, które są małe). Delikatnie wymieszać, i wylać na płytkę LB.
6) Po zakrzepnięciu płytki inkubować w 37o przez noc.
7) Policzyć łysinki i obliczyć miano faga.
Transdukcja
1) Nocną hodowlę szczepu biorcy rozcieńczyć 1 : 50 świeżym podłożem LB i inkubować z
wytrząsaniem do gęstości około 1 x 108/ml.
23
2) Hodowlę (5 ml) odwirować i zawiesić w 1/10 objętości podłoża LB (gęstość 1 x 109/ml).
3) Zmieszać:
- 0,5 ml zagęszczonej hodowli biorcy;
- 0,5 ml lizatu transdukującego rozcieńczonego w LB do gęstości 5 x 107pfu/ml
(co daje moi około 0,05);
- 0,5 ml mieszaniny 0,005 M CaCl2 i 0,03 M MgSO4 (przygotowanej przez
zmieszanie 3,0ml
wody, 0,1 ml 0,5 M CaCl2 i 0,1 ml 1 M MgSO4).
4) Inkubować 20 min. w 37oC.
5) Odwirować, przemyć 5 ml buforu Davisa, zawiesić w 1 ml tego buforu.
6) Wysiać 0,1 ml na płytkę selekcyjna, resztę zawiesiny odwirować, osad zawiesić w 0,1 ml
buforu Davisa i wysiać na płytkę selekcyjną.
7) Inkubować co najmniej 2 dni
Uwaga: Wykonać następujące kontrole:
a) bez dodatku faga (na rewersję);
b) bez bakterii - sprawdzenie, czy lizat fagowy jest pozbawiony bakterii.
24
Zalecana literatura
1)
2)
3)
4)
5)
Kunicki-Goldfinger W.J.H. „Życie bakterii”. PWN, 2001
Salyers A.A, Whitt D.D. „Mikrobiologia”. PWN, 2003
„Biologia molekularna bakterii” PWN, 2006 pod redakcją J. Baj i Z. Markiewicza.
Brown T. A. „Genomy”. PWN, 2007
Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L. „Biochemia”. PWN, 2009
25