Wpływ kolonizacji grzybów Candida na gojenie zmian zapalnych
Transkrypt
Wpływ kolonizacji grzybów Candida na gojenie zmian zapalnych
PRACE ORYGINALNE Ma³gorzata ZWOLIÑSKA-WCIS£O Tomasz BRZOZOWSKI Alicja BUDAK Zbigniew LIWOWSKI Danuta DROZDOWICZ S³awomir KWIECIEÑ Danuta TROJANOWSKA Lucyna RUDNICKA-SOSIN Tomasz MACH Stanis³aw J. KONTUREK Wies³aw W. PAWLIK Aneta TARGOSZ Wp³yw kolonizacji grzybów Candida na gojenie zmian zapalnych b³ony luzowej jelita grubego w modelu zwierzêcym colitis ulcerosa Katedra Fizjologii Klinicznej i Dowiadczalnej Collegium Medicum Uniwersytetu Jagielloñskiego w Krakowie Kierownik: Prof. dr hab. med. Wies³aw W. Pawlik Wspó³czesne zasady leczenia nieswoistych zapaleñ przewodu pokarmowego (NZPP) wynikaj¹ z lepszego zrozumienia ich patofizjologii, wskutek rozwoju badañ podstawowych. Do niedawna badania nad wp³ywem drobnoustrojów na gojenie siê zmian zapalnych w jelicie grubym koncentrowa³y siê na roli bakterii. W ostatnich latach wzros³o zainteresowanie obecnoci¹ grzybów w przewodzie pokarmowym. W niniejszych badaniach na modelu zwierzêcym wrzodziej¹cego zapalenia jelita grubego przeprowadzono analizê wp³ywu kolonizacji grzybiczej jelita grubego na nasilenie zmian zapalnych w jelicie oraz przebieg gojenia owrzodzeñ w dowiadczalnym modelu colitis ulcerosa. W ocenie ró¿nic w gojeniu pomiêdzy badanymi grupami brano pod uwagê kryteria makroskopowe i mikroskopowe oraz wagê badanych fragmentów jelita grubego. Badano parametry wskazuj¹ce na nasilenie zmian zapalnych w jelicie poprzez ocenê jelitowego przep³ywu luzówkowego (CBF) i poziom MPO, jak równie¿ poziom interleukiny (IL-1b) i czynnika martwicy guzów (TNF-a). Podanie doodbytnicze szczurom haptenu kwasu trinitrobenzenosulfonowego (TNBS) indukowa³o w 3 dobie nekrotyczne uszkodzenia b³ony luzowej jelita grubego oraz wzrost masy zmienionego zapalnie odcinka jelita grubego, spadek luzówkowego przep³ywu krwi i 45 krotny wzrost aktywnoci MPO. Znamienna kolonizacja grzybicza Candida w jelicie grubym szczurów opóni³a gojenie siê zmian zapalnych wywo³anych TNBS i efekt ten korelowa³ z obserwowanym spadkiem CBF w obszarze owrzodzeñ, wraz z towarzysz¹c¹ wzmo¿on¹ ekspresj¹ cytokin IL-1b i TNF-a w surowicy krwi. Podanie leku przeciwgrzybiczego (flukonazol) lub probiotyku (Lacidofil) u szczurów infekowanych przez Candida przyspiesza³o gojenie siê zmian zapalnych w jelicie grubym. Powierzchnie owrzodzeñ w tych grupach by³y statystycznie istotnie mniejsze w porównaniu z Klinika Gastroenterologii i Hepatologii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagielloñskiego w Krakowie Kierownik: Prof. dr hab. med. Tomasz Mach Zak³ad Mikrobiologii Farmaceutycznej Collegium Medicum Uniwersytetu Jagielloñskiego w Krakowie Collegium Medicum Uniwersytetu Jagielloñskiego w Krakowie Kierownik: Prof. dr hab. Alicja Budak Katedra Patomorfologii Klinicznej i Dowiadczalnej Collegium Medicum Uniwersytetu Jagielloñskiego w Krakowie Kierownik: Prof. dr hab. med. Jerzy Stachura Dodatkowe s³owa kluczowe: Candida jelito grube zapalenie jelita grubego szczury Additional key words: Candida colon colitis rats Adres do korespondencji: Prof. dr hab. n. med. Tomasz Brzozowski Katedra Fizjologii Klinicznej i Dowiadczalnej CM UJ 31-501 Kraków, ul. Grzegórzecka 16 e-mail: mpbrzozo@ cyf-kr.edu.pl 124 Studies on the influence of Candida fungal colonization on the healing process of inflammatory lesions in the colon in rat animal model Przegl¹d Lekarski 2007 / 64 / 3 Present- day methods of successful treatment of inflammatory bowel diseases (IBD) result from a better understanding of their pathophysiology due to advances in preclinical studies in this area of knowledge. Until recently microbiological studies have been focused on the bacterial aspects in pathogenesis of GI disorders, however in the last years an interest in the presence of fungi in the gastrointestinal tract has also increased. In this study using an animal model of ulcerative colitis, the impact of fungal colonization of the colon on the intensity of inflammatory changes in the colonic mucosa and the course of their healing was carried out. The macroscopic and microscopic criteria relating to the changes of weight of examined fragments of the colon were evaluated while assessing differences between groups tested. The intensity of intestinal inflammatory changes was determined by assessment of such parameters, as colonic blood flow (CBF), the level of MPO as a marker of colonic neutrophil infiltration intensity and the plasma levels of IL-1b; and TNF-a concentrations. Results at the 3rd day after TNBS rectal administration revealed an increase of weight of isolated segments of inflammed colon, a decrease of CBF and the 4-5 fold increase of plasma MPO activity. Candida colonization of colon mucosa of rats delayed healing of colonic ulcers, induced by TNBS and this was associated with the increased expression of plasma IL-1b and TNF-a levels. Administration of antifungal (fluconazole) or probiotic (Lacidofil) treatment to C. albicans infected rats exerted favorable effect on healing of inflammatory changes in the colon because the area of ulcerations in groups of rats treated with fluconazole or Lacidofil was significantly smaller in comparison with those inoculated with Candida solution only. Administration of fluconazole or Lacidofil significantly decreased the weight of colon segments, the MPO M. Zwoliñska-Wcis³o i wsp. grup¹ kontroln¹ lub otrzymuj¹c¹ wy³¹cznie Candida albicans. Podanie flukonazolu lub probiotyku spowodowa³o spadek wagi bioptatów z jelita grubego w porównaniu z grup¹ zwierz¹t zaka¿onych przez Candida. Wyniki niniejszych badañ dowodz¹ przed³u¿enia gojenia zmian zapalnych wywo³anych przez TNBS w szczurzym jelicie grubym pod wp³ywem Candida. W tych warunkach implementacja probiotyku przyspiesza gojenie uszkodzeñ b³ony luzowej jelita grubego poprzez redukcjê zmian zapalnych wyra¿onych wskanikami zmian makro- i mikroskopowych, spadkiem wagi badanego odcinka jelita a tak¿e zahamowaniem aktywnoci MPO, TNF-a i IL-1b w surowicy krwi. Wstêp Wrzodziej¹ce zapalenie jelita grubego oraz choroba Leniowskiego-Crohna nale¿¹ do nieswoistych zapaleñ przewodu pokarmowego (NZPP). Wspó³czesne zasady skutecznej terapii tych chorób wynikaj¹ z lepszego zrozumienia ich patofizjologii, wskutek rozwoju badañ dowiadczalnych, zmierzaj¹cych do stworzenia dowiadczalnego modelu colitis ulcerosa, naladuj¹cego zmiany w jelicie grubym towarzysz¹ce temu schorzeniu u ludzi [2,3,18,23,25]. Uwa¿a siê, ¿e w etiopatogenezie NZPP bior¹ udzia³ trzy podstawowe czynniki, takie jak: osobnicza podatnoæ b³ony luzowej jelita na uszkodzenia, mikroflora przewodu pokarmowe go oraz w³asnoci immunologiczne b³ony luzowej przewodu pokarmowego [8,11,23]. W ostatnim czasie wzros³o zainteresowanie udzia³em drobnoustrojów w etiopatogenezie tych chorób [1,4,6,9, 23,27]. Mikroflora przewodu pokarmowego mo¿e ulegaæ modyfikacji pod wp³ywem czynników wewn¹trzpochodnych, takich jak wydzielanie kwasu solnego, motoryka ¿o³¹dka i jelit, uk³ad immunologiczny gospodarza lub czynników zewn¹trzpochodnych, w tym g³ównie przyjmowanych leków, przebytych infekcji bakteryjnych i grzybiczych oraz diety [15-17,21,24]. Istotn¹ rolê czynnika mikrobiologicznego w etiopatogenezie NZPP wydaj¹ siê potwierdzaæ wyniki badañ eksperymentalnych na zwierzêtach, które wskazuj¹ na brak mo¿liwoci prawid³owej oceny tych zmian w modelu zapalenia jelita grubego w warunkach ja³owego rodowiska przewodu pokarmowego [25]. Do niedawna obserwacje mikrobiologiczne koncentrowa³y siê g³ównie na roli zaka¿enia bakteryjnego w jelicie, lecz w ostatnich latach wzros³o zainteresowanie tak¿e obecnoci¹ grzybów w przewodzie pokarmowym. Przewód pokarmowy jest g³ównym rezerwuarem grzybów z rodzaju Candida, które zalicza siê do saprofitów przewodu pokarmowego [1,5,7]. Cohen i wsp. wykazali obecnoæ gatunku Candida w jamie ustnej, jelicie czczym i krêtym u odpowiednio 30%, 54% i 55% zdrowych osób [7]. Wraz z zainteresowaniem udzia³em drobnoustrojów w etiopatogenezie nieswoistych zapaleñ przewodu pokarmowego, zanotowano wzrost zainteresowania rol¹ probiotyków, które nale¿¹ do drobnoustrojów wystêpuj¹cych w po¿ywieniu. Stwierdzono, ¿e probiotyki poprzez zmianê uk³adu mikroflory przewodu Przegl¹d Lekarski 2007 / 64 / 3 activity and the plasma IL-1band TNF-a levels, as compared with respective values in the group receiving Candida only. The results of our studies indicate the deteriorating influence of Candida on the healing process of inflamed colon in the animal model of ulcerative colitis. Concomitant therapy with probiotic or antifungal treatment improved healing of colonic lesions, decreased the weight of inflamed colonic tissue and also attenuated the MPO activity and plasma proinflammatory cytokines IL-1b and TNF-a levels. pokarmowego, a zapewne tak¿e poprzez aktywacjê uk³adu immunologicznego, mog¹ wywieraæ korzystny wp³yw na leczenie i ewentualn¹ profilaktykê nawrotu objawów choroby. Wstêpne wyniki badañ eksperymentalnych wskazuj¹ na korzystny wp³yw probiotyków na przebieg eksperymentalnego zapalenia jelita grubego u szczurów [1, 23]. Równie¿ u ludzi wykazano korzystny wp³yw probiotyków w profilaktyce nawrotu pouchitis u chorych po przebytej kolektomii [12,14]. Naturalny przebieg wrzodziej¹cego zapalenia jelita grubego oraz choroby Leniowskiego-Crohna polega na naprzemiennych zaostrzeniach i remisjach. Zaostrzenie mo¿e byæ wywo³ane przez czynniki zewn¹trzpochodne, takie np. jak niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ), czy lokalne zmiany w sk³adzie mikroflory jelita. Celem naszej pracy by³a ocena wp³ywu zaka¿enia grzybami z gatunku Candida, a tak¿e porównanie leczenia probiotykiem (Lacidofil) i lekiem przeciwgrzybiczym (flukonazol) na proces gojenia wrzodziej¹cych zmian zapalnych w jelicie grubym szczurów, wywo³anych doodbytniczym podaniem kwasu trinitrobenzenosulfonowego (TNBS). Skoncentrowano siê g³ównie na ocenie makro- i mikroskopowych efektów terapii Lacidofilem i flukonazolem na szybkoæ gojenia zmian zapalnych w jelicie grubym, u zwierz¹t zaka¿onych przez grzyby rodzaju Candida. Ponadto badano wp³yw zaka¿enia jelita grubego przez Candida albicans oraz równolegle prowadzonej terapii Lacidofilem i flukonazolem, na zmiany jelitowego przep³ywu krwi, wagê badanego zapalnego fragmentu jelita grubego oraz aktywnoæ mieloperoksydazy (MPO), jako wskanika aktywnoci neutrofili i prozpalnych cytokin IL-1b i TNF-a w osoczu krwi. Materia³ i metody Badania wykonywano na szczurach p³ci mêskiej, rasy Wistar, o wadze 180-220 g, które mia³y swobodny dostêp do wody i po¿ywienia i by³y przystosowane do warunków laboratoryjnych oraz do cyklów 12 godzinnych dzieñ/noc przez 7 dni. Badania na zwierzêtach by³y prowadzone zgodnie z miêdzynarodowymi wytycznymi, dotycz¹cymi opieki nad zwierzêtami laboratoryjnymi i zosta³y zaakceptowane przez Komisjê ds. Bioetyki Dowiadczeñ na Zwierzêtach Uniwersytetu Jagielloñskiego w Krakowie. Wywo³ywanie zapalenia jelita grubego Wrzodziej¹ce zapalenie jelita grubego u szczurów, wywo³ywano przez doodbytnicze podanie TNBS (Sig- ma Pharmaceutical, Slough UK) w dawce 10 mg/kg, rozpuszczonego w 50% roztworze etanolu wed³ug metody opisanej przez Reutera i Kennedy [21]. W myl za³o¿enia tej metody [21] zwierzêta usypiano za pomoc¹ pentobarbitalu, podawanego w dawce 60 mg/kg dootrzewnowo, a nastêpnie przystêpowano do doodbytniczej aplikacji TNBS, który by³ wprowadzany do jelita grubego za pomoc¹ miêkkiego polietylenowego cewnika na g³êbokoæ 8 cm od ujcia zwieracza odbytu. Po wstêpnych wynikach badañ z wieloma rozcieñczeniami TNBS ustalono, ¿e optymaln¹ do wywo³ywania owrzodzeñ w jelicie grubym by³¹ dawka 10 mg/ kg, któr¹ podawano w objêtoci 0,25 ml/dla ka¿dego zwierzêcia. Do momentu wybudzenia, zwierzêta by³y u³o¿one w pozycji Trendelenburga, aby zapobiec utracie roztworu TNBS przez wyciek z odbytu. Zwierzêta z grupy kontrolnej otrzyma³y analogiczn¹, jak w przypadku TNBS objêtoæ 0,9% roztworu soli fizjologicznej. Nastêpnie po wybudzeniu podawano czêci zwierz¹t kontrolnych i tym z wywo³anymi owrzodzeniami przez TNBS, zawiesinê grzybów Candida albicans (C. albicans), wed³ug schematu opisanego poni¿ej. Po 1 godzinie od podania Candida zwierzêta uzyska³y normalny dostêp do wody i po¿ywienia. Badania nad rozwiniêciem modelu zwierzêcego colitis ulcerosa przeprowadzono w Katedrze Fizjologii Collegium Medicum UJ w Krakowie (Kierownik Prof. dr hab. med. W. Pawlik). Wp³yw kolonizacji grzybiczej na przebieg i nasilenie zmian zapalnych w jelicie grubym Zwierzêta z wywo³anymi TNBS zmianami zapalnymi jelita grubego zosta³y przydzielone do nastêpuj¹cych grup badawczych, licz¹cych po 10 szczurów ka¿da, którym podawano do¿o³¹dkowo poczynaj¹c od 1 doby eksperymentu przez kolejne 8 dni zawiesinê C.albicans 109 CFU/w objêtoci/1 ml soli fizjologicznej, w nastêpuj¹cych kombinacjach: A. grupa kontrolna: sól fizjologiczna (vehiculum), B. C. albicans 109 CFU/ml C. C. albicans 109 CFU/ml+ Lacidofil 108 CFU/ml, D. C. albicans 109 CFU / ml + flukonazol 10 mg/kg domiêniowo(i.m.). Szczepy grzybów Candida uprzednio wyizolowane i nastêpnie zastosowane w tych dowiadczeniach pochodzi³y z biopsji jelita grubego pobranych od chorych na wrzodziej¹ce zapalenie jelita grubego oraz chorobê Leniowskiego-Crohna. W grupie C, na dwie godziny przed podaniem zawiesiny C. albicans, dodawano do wody pitnej 5% roztwór Lacidofilu w dawce 108 CFU/ ml, przygotowanej uprzednio przez wytr¹canie przez 3 godziny w temperaturze 370 C. Natomiast w grupie D, zastosowano leczenie przeciwgrzybicze flukonazolem, w dawce10 mg/kg domiêniowo (i.m.). Zwierzêta usypiano w 14 dobie od podania TNBS. Celem czynnociowej oceny wp³ywu inokulacji Candida albicans, osobno lub w kombinacji z Lacidofilem i flukonazolem na przebieg gojenia wrzodów jelitowych, natychmiast po otwarciu jamy brzusznej i wy³onieniu jelita grubego mierzono jelitowy przep³yw krwi (CBF) w obszarze b³ony luzowej nie objêtym zmianami zapalnymi, stosuj¹c technikê laserow¹ Dopplera, szczegó³owo opisan¹ uprzednio dla pomiaru ¿o³¹dkowego prze- 125 * 90 600 + *+ * 400 60 *+ 30 200 + Pla c e bo Ca ndid a Alb ic ans Ca ndida Alb ic ans + La c id ofil 0 Ca ndida Alb ic ans + Fluko na zo l Inde ks uszko dze jelitowych ñ je lito wyc h Indeks uszkodzeñ Rycina 1 Wp³yw inokulacji grzybów Candida z lub bez podanego lacidofilu i/lub flukonazolu na powierzchniê zmian zapalnych w jelicie grubym, indukowanych TNBS oraz jelitowy przep³yw krwi. 14 doba obserwacji od wywo³ania zmian zapalnych. The influence of Candida fungi inoculation with or without addition of lacidofil or fluconazole on the area of colonic lesions, induced with TNBS and colonic blood flow (CBF). 14th day of observation after induction of inflammatory lesions. 8 6 *+ 4 + 2 0 Pla c e bo Ca ndid a Alb ic a ns Ca ndid a Alb ic a ns + La c id ofil Ca ndid a Alb ic a ns + Fluko na zo l Rycina 3 Wp³yw grzybów Candida z/lub bez podanego lacidofilu i/lub flukonazolu na indeks uszkodzeñ w jelicie grubym szczurów, indukowanych TNBS. 14 doba obserwacji. The inlfuence of Candida inoculation with or without addition of lacidofil or fluconazole on the index of colonic lesions induced with TNBS in rats.14th day after induction of inflammatory lesions. p³ywu krwi [6]. Jelitowy przep³yw krwi u badanych zwierz¹t by³ wyra¿ony odsetkowo w stosunku do przep³ywu luzówkowego krwi u szczurów nie poddanych dzia³aniu TNBS, natomiast otrzymuj¹cych w zamian sól fizjologiczn¹. Usuniêty omiocentymetrowy odcinek jelita grubego by³ otwierany wzd³u¿ d³ugiej osi. Nasilenie makroskopowych zmian zapalnych by³o oceniane przy pomocy metody planimetrycznej (Morphomat, Carl Zeiss, Berlin, Niemcy) przez dwóch niezale¿nych badaczy, zgodnie z kryteriami podanymi przez Reutera i wsp.[21]. Nastêpnie usuniêty odcinek jelita wa¿ono. Fragmenty zmienionego zapalnie jelita grubego wielkoci ok. 20 mm pobierano, utrwalano w formalinie i zatapiano w parafinie, a nastêpnie barwiono rutynowo hematoksylin¹ i eozyn¹ (H-E). Histologiczne zmiany w b³onie luzowej jelita grubego badano w mikroskopie wietlnym, bior¹c pod uwagê nastêpuj¹ce kryteria: obecnoæ, powierzchnia i g³êbokoæ owrzodzenia, obecnoæ i nasilenie nacieków zapalnych, owrzodzeñ, obecnoæ w³óknienia, pos³uguj¹c siê punktowan¹ skal¹, zaproponowan¹ przez Vilaseca i wsp. [26]. 126 1200 *+ + 600 0 Pla c e bo Ca ndid a Alb ic ans Ca ndid a Alb ic ans + La c ido fil Ca ndid a Alb ic ans + Fluko na zo l Rycina 2 Wp³yw grzybów Candida z/lub bez podanego lacidofilu i/lub flukonazolu na wagê zmienionej zapalnie tkanki jelita grubego szczurów. 14 doba obserwacji. The influence of Candida fungi with or without addition of lacidofil or fluconazole on the weight of inflamed colonic tissue. 14th day after induction of inflammatory lesions. Za pa le nie je lita g rub e g o induko wa ne TNBS * Za p a le nie je lita g rube g o ind uko wa ne TNBS * Histologiczny indeks Histo lo g ic zny inde ksuszkodzeñ uszko dze ñ 0 1800 Wa gWaga a tkatkanki nki jejelita lita grubego g rube g(mg) o (mg ) Za pa le nie je lita g rub e g o ind uko wa ne TNBS Je lito wyprzep³yw prze p³yw krwi (% ko ntro li) Jelitowy krwi (% kontroli) re dnia po wie rzc hnia uszko dze ñ rednia powierzchnia uszkodzenia 800 Za pa le nie je lita g rub e g o induko wa ne TNBS 6 * *+ 4 + 2 0 Ve h Ca ndid a Alb ic ans Ca ndid a Alb ic ans + Lac id o fil Ca ndid a Alb ic ans + Fluko na zo l Rycina 4 Wp³yw inokulacji grzybów Candida z/ lub bez podanego lacidofilu lub flukonazolu na histologiczny indeks uszkodzeñ zmian zapalnych w jelicie grubym wywo³anych TNBS. 14 doba obserwacji. The influence of Candida inoculation with or without lacidofil or fluconazole on the histological index of inflammatory lesions in the colon, induced with TNBS. 14th day after induction of inflammatory lesions. Preparaty histologiczne z b³ony luzowej jelita grubego szczurów by³y barwione dodatkowo metod¹ Giemzy, w celu oceny stopnia zaka¿enia grzybiczego w tkance jelitowej. Badania histologiczne by³y wykonywane w Katedrze Patomorfologii Klinicznej i Dowiadczalnej CM UJ w Krakowie (Kierownik: prof. dr hab. med. J. Stachura). Badania mikologiczne, jakociowe i ilociowe w celu obecnoci Candida w b³onie luzowej jelita grubego wykonywano zgodnie z metodyk¹ Mullera [19]. Wycinki homogenizowano w 4 ml sterylnej soli fizjologicznej, a nastêpnie inkubowano wytrz¹saj¹c z 0,25% roztworem trypsyny. Roztwór homogenatu by³ wysiewany na pod³o¿u Sabourauda (DifcoLab. USA), zawieraj¹cym 50 ug/ ml chloramfenikolu. Iloæ kolonii Candida by³a liczona po uprzedniej inkubacji wysianego materia³u przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni. Identyfikacja gatunków grzybów by³a przeprowadzona zgodnie ze standardami laboratoryjnymi, w oparciu o morfologiê kolonii, charakterystykê enzymatyczn¹, z u¿yciem testów Candida ID, pasków ID32C (system ATB, Bio Merieux). Badania te by³y wykonywane w Zak³adzie Mikrobiologii Farmaceu- Przegl¹d Lekarski 2007 / 64 / 3 tycznej CM UJ w Krakowie (Kierownik: prof. dr hab. Alicja Budak). Celem oceny nasilenia nacieków neutrofilowych w zmienionej zapalnie b³onie luzowej jelita grubego oznaczano aktywnoæ MPO w tkance jelita grubego o masie oko³o 200 mg, któr¹ po pobraniu zamra¿ano do momentu rozpoczêcia pomiaru aktywnoci MPO w temperaturze -80 oC. Aktywnoæ MPO oznaczano za pomoc¹ zestawu Biosource, Dortmund Germany. Wyniki Wp³yw zaka¿enia grzybami Candida na wielkoæ uszkodzeñ jelita grubego. Efekty leczenia Lacidofilem Podanie doodbytnicze TNBS wywo³a³o zmiany zapalne w jelicie grubym, z rozleg³ymi owrzodzeniami b³ony luzowej. Zmiany makroskopowe jelita, obserwowane w 3 dobie od momentu podania TNBS, by³y porównywalne we wszystkich badanych gru- M. Zwoliñska-Wcis³o i wsp. Za pa le nie je lita g rub e g o induko wa ne TNBS *+ 10 2 + 600 10 0 Ko ntrola Pla c e bo LACIDOFIL 1 10 0 FLUCONAZOL (pg / ml) 10 3 * 1200 Stê¿enie w wosoczu krwi Stê ¿e nieIL-1b osoc zu krwi IL-1ß 10 4 60 * 45 * + + 30 + 15 0 Ko ntrola Pla c e bo LACIDOFIL FLUCONAZOL 90 45 60 30 30 15 (% kontroli) + 60 Je lito wy prze p ³yw krwi Jelitowy przep³yw krwi (% ko ntro li) * * 45 Aktywno æ e nzymu MPO (ng / ml) re dnia p o wie rzc hnia uszko dze ñ rednia powierzchnia uszkodzeñ 2 (mm ) 60 8 6 + 15 2 Ko ntro la Pla c e bo LACIDOFIL FLUCONAZOL 0 + CANDIDA ALBICANS Za pa le nie je lita g rube g o induko wa ne TNBS + + 4 0 Rycina 5 Miano grzybów w b³onie luzowej jelita grubego oraz waga tkanki jelita w 14 dobie od wywo³ania zmian zapalnych w jelicie grubym u szczurów inokulowanych grzybami z/lub bez podania lacidofilu lub flukonazolu. The titre of Candida in colonic mucosa and the weight of colonic tissue on the 14th day after inoculation of inflammatory lesions in rats. + + + 30 + CANDIDA ALBICANS * 10 StêStê¿enie ¿e nie TNF o soc zu krwi TNFa osoczu krwi a ww (pg / ml) Za pa le nie je lita g rub e g o indukowa ne TNBS CANDIDA ALBICANS (CFU/ g ) WaWaga g a tka nki je lita grubego g rube g (mg) o (mg ) tkanki jelita 1800 Rycina 6 Wp³yw inokulacji Candida z/lub bez podanego lacidofilu lub flukonazolu na powierzchniê zmian zapalnych w jelicie grubym szczurów, wywo³anych TNBS oraz na aktywnoæ enzymu MPO w surowicy krwi i CBF. 14 doba obserwacji. The influence of Candida inoculation with or without addition of lacidofil or fluconazole on the inflammatory lesions induced with TNBS in colon mucosa, and on the activity of MPO in the serum and CBF on the14th day after induction of lesions. Rycina 7 Wp³yw inokulacji Candida z/lub bez podanego lacidofilu lub flukonazolu na stê¿enie Il1-b oraz TNF-a w osoczu krwi u szczurów ze zmianami zapalnymi w jelicie grubym, indukowanymi TNBS, w 14 dobie obserwacji. The influence of Candida inoculation with or without lacidofil or fluconazole addition, on the serum IL-1b and TNF-a level in rats with inflammatory colonic lesions induced with TNBS. 14th day after induction of lesions. 0 + CANDIDA ALBICANS pach zwierz¹t i obejmowa³y rozleg³e zmiany o charakterze martwicy i krwotocznej. Histologicznie stwierdzono obecnoæ obrzêku podluzówkowego, mikrozakrzepów, ostrych neutrofilowych nacieków zapalnych oraz martwicy b³ony luzowej jelita grubego. W 14 dobie badania, a wiêc w fazie gojenia zmian makroskopowych w jelicie obserwowano znamienne ró¿nice w poszczególnych grupach zwierz¹t, które wyra¿ono za pomoc¹ rednich wartoci powierzchni uszkodzeñ w badanych grupach, ciê¿arem tkanki pobranej z jelita grubego oraz zmianami przep³ywu krwi w jelicie grubym. rednia powierzchnia owrzodzeñ w grupie B szczurów, które otrzymywa³y do¿o³¹dkowo zawiesinê Candida wynosi³a ok. 731 mm2. U zwierz¹t zaka¿onych Candida, które otrzymywa³y jednoczenie Lacidofil (grupa C) lub flukonazol (grupa D) powierzchnia owrzodzeñ by³a statystycznie znamiennie mniejsza w porównaniu z grup¹ kontroln¹ (grupa A) (rycina 1). U zwierz¹t zaka¿onych Candida zaobserwowano statystycznie znamienny wzrost redniej wagi tkanki jelita grubego, w porównaniu z grup¹ kontroln¹. W 14 dobie badania waga ta osi¹gnê³a wartoæ odpowiednio ok.1567 mg u zwierz¹t zaka¿onych Przegl¹d Lekarski 2007 / 64 / 3 Candida i 727 mg w grupie kontrolnej. U zwierz¹t, którym podawano Lacidofil w wodzie pitnej lub flukonazol, rednia waga tkanki jelita grubego osi¹gnê³a statystycznie ni¿sz¹ wartoæ w porównaniu z grup¹ szczurów zaka¿onych przez Candida (rycina 2). Analiza wskaników uszkodzenia b³ony luzowej jelita grubego u szczurów, przeprowadzona w 14 dobie badania w oparciu o kryteria podane przez Reutera i wsp. [21], wykaza³a, ¿e podawanie do¿o³¹dkowe Candida albicans (grupa B) statystycznie znamiennie zwiêkszy³o redni¹ powierzchniê uszkodzeñ jelitowych. Leczenie Lacidofilem lub flukonazolem spowodowa³o statystycznie znamienne obni¿enie redniej powierzchni uszkodzeñ jelitowych, przy czym spadek by³ bardziej widoczny w grupie zwierz¹t otrzymuj¹cych otrzymuj¹cych Lacidofil, w porównaniu z grup¹ leczon¹ flukonazolem (rycina 3). Ocena histologiczna wg skali punktowej nasilenia zmian mikroskopowych w badanym jelicie u szczurów zosta³a dokonana w oparciu o klasyfikacjê zaproponowan¹ przez Vilaseca i wsp. w 14 dobie badania [26]. Najwiêksze nasilenie zmian zapalnych obserwowano u zwierz¹t zaka¿onych przez Candida albicans (grupa D). Po uwzglêdnieniu takich kryteriów, jak: wielkoæ owrzodzeñ, nasilenie nacieków zapalnych, g³êbokoæ owrzodzeñ, w³óknienie, obecnoæ ziarniniaków, redni wskanik zmian histopatologicznych wynosi³ w tej grupie 5,5 i wartoæ ta by³a statystycznie znamiennie ni¿sza ni¿ odpowiadaj¹ca jej wartoæ w grupie kontrolnej (rycina 4). Lacidofil i flukonazol znamiennie zredukowa³y wartoæ indeksu uszkodzeñ w porównaniu do wartoci tego indeksu u zwierz¹t zaka¿onych Candida. Wp³yw zaka¿enia grzybami Candida bez i w kombinacji z Lacidofilem i flukonazolem na miano grzybów w b³onie luzowej jelita grubego Badania mikologiczne treci jelita grubego badanych zwierz¹t przeprowadzone w 4 dobie stwierdzi³y, ¿e miano grzybów Candida wynosi³o powy¿ej 104 CFU/ml w grupie zwierz¹t zaka¿onych Candida albicans, podczas gdy w grupie zwierz¹t zaka¿onych Candida albicans i leczonych Lacidofilem, zanotowano spadek miana Candida, które osi¹gnê³o wartoæ poni¿ej 102 CFU/ml. W tej ostatniej grupie szczurów stwierdzono jednoczenie wysokie miano grzybów Saccharomyces cerevisiae, ok.104 CFU/ml, ilo- 127 ciowo znacznie przewy¿szaj¹ce miano tych grzybów w grupie kontrolnej. Miano Candida w biopsjach jelitowych pobranych od szczurów otrzymuj¹cych flukonazol ró¿ni³o siê od koncentracji grzybów w grupie leczonej Lacidofilem nieznamiennie (poni¿ej 103CFU/ml), chocia¿ osi¹gnê³o wy¿sz¹ wartoæ od obserwowanego w grupie kontrolnej (rycina 5). Wp³yw zaka¿enia grzybami Candida na zmiany CBF, aktywnoæ MPO i cytokin prozapalnych Il-1b, TNF-a Zgodnie z danymi zawartymi na rycinie 6, stwierdzono spadek przep³ywu jelitowego krwi (CBF) oraz 4-5 krotny wzrost aktywnoci MPO we krwi oraz w tkance ze zmienionego zapalnie jelita grubego. Kolonizacji grzybiczej jelita grubego towarzyszy³ wzrost poziomu IL-1b i TNF-a w osoczu tych zwierz¹t. U szczurów otrzymuj¹cych C. albicans obserwowano wybitne przed³u¿enie gojenia siê uszkodzeñ b³ony luzowej jelita grubego nawet po 14 dniach obserwacji, wraz z towarzysz¹cym spadkiem CBF i znamiennym wzrostem MPO w tkance zapalnej (rycina 6, 7). Podanie Lacidofilu spowodowa³o znamienny wzrost CBF i spadek aktywnoci MPO oraz cytokin prozapalnych w porównaniu z grup¹ otrzymuj¹c¹ wy³¹cznie Candida albicans. Dyskusja Wraz z doniesieniami na temat mo¿liwoci terapeutycznego dzia³ania probiotyków wzros³o zainteresowanie udzia³em flory korzystnej dla przewodu pokarmowego w etiopatogenezie NZPP [17,23,25 ]. Mikroflora przewodu pokarmowego obejmuje 400 -500 gatunków drobnoustrojów, które wraz ze swoim metabolizmem stanowi¹ dodatkowy narz¹d cz³owieka, dot¹d zaniedbywany, w kontekcie zarówno patogenezy schorzeñ jelita grubego, jak i potencjalnej ochronnej roli, jak¹ pe³ni¹ bakterie o dzia³aniu probiotycznym. Do niedawna obserwacje mikrobiologiczne koncentrowa³y siê g³ównie na roli bakterii w nieswoistych zapaleniach przewodu pokarmowego. W ostatnich latach wzros³o jednak zainteresowanie obecnoci¹ grzybów w przewodzie pokarmowym. Z jednej strony grzyby Candida s¹ czêci¹ flory przewodu pokarmowego, z drugiej za kolonizuj¹c jelito mog¹ przy obni¿onej odpornoci stanowiæ ród³o grzybiczego rozsiewu ogólnoustrojowego [1,4]. Dotychczas mniej uwagi powiêcono obecnoci grzybów Candida w jelicie grubym oraz ich udzia³owi w indukowaniu lub podtrzymywaniu stanu zapalnego przewodu pokarmowego. Dlatego w niniejszych badaniach na modelu zwierzêcym wrzodziej¹cego zapalenia jelita grubego przeprowadzono ocenê wp³ywu kolonizacji grzybiczej jelita grubego na nasilenie zmian zapalnych w b³onie luzowej jelita grubego oraz na przebieg ich gojenia. W ocenie ró¿nic w gojeniu pomiêdzy poszczególnymi badanymi grupami brano pod uwagê kryteria makroskopowe i mikroskopowe zmian oraz ró¿nice wagowe zapalnych fragmentów jelita zapalnych w jelicie poprzez ocenê jelitowego przep³ywu luzówkowego (CBF) i aktywnoci MPO, bêd¹cej wskanikiem nacieczenia b³ony luzowej jelita grubego przez neutrofile, jak równie¿ 128 mierzono poziom prozapalnych cytokin IL1b i TNF-a w osoczu. Ocena wyników zmian zarówno zmian makroskopowych, takich jak uszkodzenia krwotoczne i mikroskopowych, takich jak uszkodzenia struktury jelita o typie obrzêku podluzówkowego, przeprowadzona w 3 dobie od podania TNBS nie wykaza³a znamiennych ró¿nic pomiêdzy badanymi grupami zwierz¹t nie zaka¿onych i zaka¿onych przez Candida. W badaniach mikroskopowych, ocenianych w 3 dobie dominowa³y zw³aszcza zmiany o charakterze martwiczym oraz krwotocznym. Natomiast wyrane ró¿nice w dynamice procesu gojenia zaobserwowano w 14 dobie badania, poniewa¿ u zwierz¹t zaka¿onych przez Candida albicans zaobserwowano utrzymywanie siê statystycznie istotnie wiêkszej powierzchni owrzodzeñ b³ony luzowej jelita grubego, w porównaniu z grup¹ kontroln¹, co wskazuje jednoznacznie na przed³u¿enie procesu gojenia siê tych owrzodzeñ u zwierz¹t zaka¿onych. W³¹czenie leczenia przeciwgrzybiczego lub zawiesiny bakterii probiotycznych u szczurów otrzymuj¹cych zawiesinê Candida wp³ynê³o korzystnie na szybkoæ gojenia siê zmian zapalnych w jelicie grubym. Jednoczenie przep³yw krwi w jelicie grubym by³ znacz¹co wy¿szy u zwierz¹t leczonych Lacidofilem lub flukonazolem ni¿ w odpowiednich grupach kontrolnych, co wskazuje na znaczny udzia³ mikrokr¹¿enia jelitowego w procesach gojenia siê wrzodów jelitowych pod wp³ywem leków przeciwgrzybiczych i niektórych bakterii probiotycznych, w tym g³ównie Lacidofilu. Ocena nasilenia stanu zapalnego w jelicie na podstawie porównania ciê¿aru wyizolowanych odcinków jelita grubego wykaza³a najwy¿sz¹ wagê badanego odcinka jelita w grupie zwierz¹t otrzymuj¹cych zawiesinê Candida, a znacznie ni¿sz¹ w grupie, która nie otrzyma³a leczenia probiotykami. Podanie flukonazolu lub Lacidofilu przyczyni³o siê do zmniejszenia wagi badanych odcinków jelita grubego, przy czym rednia waga badanych odcinków jelit by³a najni¿sza w grupie otrzymuj¹cej Lacidofil, co wskazuje na mo¿liwoæ przyspieszenia gojenia siê tych zmian w jelicie grubym poprzez hamowanie procesu zapalnego przez probiotyki. Analiza zmian makroskopowych w jelicie grubym, oparta na punktowanej skali uwzglêdniaj¹cej wielkoæ i g³êbokoæ owrzodzenia oraz obecnoæ zrostów potwierdzi³a korzystny wp³yw terapii flukonazolem i Lacidofilem, skutkuj¹cy w szybszym gojeniu siê owrzodzeñ pod wp³ywem probiotyku u zwierz¹t, które oprócz zawiesiny Candida otrzymywa³y do¿o³¹dkowo probiotyk. Nasilenie zaawansowania zmian zapalnych w jelicie grubym u szczurów w obrazie mikroskopowym, uwzglêdnia³o takie kryteria jak wielkoæ owrzodzeñ, nasilenie nacieków zapalnych, ich g³êbokoæ, w³óknienie, obecnoæ ziarniniaków. Spadek nasilenia zmian zapalnych stwierdzono u zwierz¹t otrzymuj¹cych probiotyk i w grupie kontrolnej, w porównaniu do grupy otrzymuj¹cej do¿o³¹dkowo tylko i wy³¹cznie zawiesinê grzybów Candida. Potwierdzi³y to równie¿ badania mikologiczne treci jelita grubego stwierdzaj¹ce znamienny spadek miana grzybów Candida, Przegl¹d Lekarski 2007 / 64 / 3 (poni¿ej 102 CFU/g) u zwierz¹t traktowanych Lacidofilem, z jednoczesnym wzrostem, w porównaniu z innymi grupami zwierz¹t grzybów Saccharomyces cerevisiae, bêd¹cych fizjologicznym sk³adnikiem mikroflory przewodu pokarmowego szczurów. Miano Saccharomyces cerevisiae przewy¿sza³o ilociowo miano tych grzybów w grupie kontrolnej. Prawdopodobnie wynika to z uruchamiania pod wp³ywem bakterii probiotycznych dodatkowych mechanizmów obronnych przewodu pokarmowego w postaci wzrostu miana grzybów, bior¹cych udzia³ w przeciwdzia³aniu nadmiernej kolonizacji Candida w jelicie grubym. Rozwiniêcie tych zagadnieñ w modelu dowiadczalnym wymaga jednak dalszych badañ. Wyniki badañ eksperymentalnych potwierdzaj¹ korzystny wp³yw probiotyków na przebieg zapalenia jelita grubego u szczurów [23]. Jak wykazalimy w obecnej pracy, kolonizacja jelita grubego przez grzyby Candida pogarszena proces gojenia siê zmian zapalnych w tym odcinku jelita u szczurów. W³¹czenie probiotyku poprawia³o parametry gojenia zmian zapalnych, wyra¿onych wskanikami zmian makro- i mikroskopowych, spadkiem wagi badanego odcinka jelita, a tak¿e redukcj¹ aktywnoci MPO i prozapalnych cytokin TNF-a i IL-1b w osoczu. Wartym szczególnej uwagi jest fakt, ¿e zmniejszenie nasilenia stanu zapalnego, a co za ty idzie przyspieszenie gojenia siê owrzodzeñ jelitowych pod wp³ywem bakterii probiotycznych by³o wiêksze w porównaniu z efektem przeciwzapalnym po podaniu leku przeciwgrzybiczego flukonazolu. Wnioski 1. Podanie doodbytnicze szczurom TNBS, powoduje w 3 dobie zmiany makroskopowe w jelicie grubym oraz wzrost masy zmienionego zapalnie odcinka jelita, spadek przep³ywu luzówkowego i 4-5 krotny wzrost aktywnoci MPO. 2. Znamienna kolonizacja grzybicza Candida w jelicie grubym szczurów opónia gojenie siê zmian zapalnych wywo³anych za pomoc¹ TNBS. Najpewniej jest to zwi¹zane ze spadkiem CBF w obszarze owrzodzeñ, ponadto wzmo¿on¹ ekspresj¹ cytokin IL-1b i TNF-a we krwi. Terapia probiotykiem mo¿e okazaæ siê skuteczna w leczeniu zaostrzenia wrzodziej¹cego zapalenia jelita grubego, zwi¹zanego z kolonizacj¹ grzybicz¹. 3. Probiotyk (Lacidofil) wydaje siê byæ skuteczniejszy od flukonazolu w indukowaniu gojenia siê zmian zapalnych w jelicie grubym szczurów, z kolonizacj¹ grzybicz¹ Candida. Pimiennictwo 1. Bengmark S.: Ecological control of gastrointestinal tract. The role of probiotic flora. Gut 1998, 42, 2. 2. Berg R.D.: The indigenous gastrointestinal microflora. Trends in Microbiology 1996, 4, 430. 3. Berg R., Bernasconi P., Fowler D. et al.: Inhibition of Candida albicans translocation from the gastrointestinal tract of mice by oral administration of Saccharomyces boulardii. J. Infect. Dis. 1993, 168, 1314. 4. Bernhardt H., Knoke M.: Mycological aspects of gastrointestinal microflora. Scand. J. Gastroenterol. 1997, 32, (Suppl. 222), 102. 5. Blumberg R.S, Saubermann L.J., Strober W.: Ani- M. Zwoliñska-Wcis³o i wsp. mal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease. Current Opinion in Immunology 1999, 11, 648. 6. Brzozowski T., Konturek P.C, Drozdowicz D. et al.: Nitric oxide releasing aspirin protects the gastric mucosa against stress and promotes healing of stress- induced gastric mucosal damage; role of heat shock protein 70. Digestion 2002, 66, 160. 7. Cannon R.D., Holmes A.R., Mason A.B. et al.: Oral Candida, clearence, colonization or candidiasis? J. Dent. Res. 1995, 74 , 1152. 8. Cole G.T, Lynn K.T, Seshan K.R.: An animal model for oropharyngeal, esophageal and gastric candidiasis. Mycoses 1990, 33, 7. 9. D'Haens G.R., Geboes K., Peeters M. et al.: Early lesions of recurrent Crohn'n disease caused by infusion of intestinal contents in excluded ileum. Gastroenterology 1998, 114, 262. 10. Elson C., Sartor B., Tennyson G. et al.: Experimental models of inflammatory bowel disease. Gastroenterology 1995, 109, 1344. 11. Galeazzi F., Blennerhassett P.A., Qiu B. et al.: Cigarette smoke aggravates experimental colitis in rats. Gastroenterology 1999, 117, 877. 12. Gionchetti P., Rizzello F., Venturi A., G. et al.: Oral bacteriotherapy as maintenance treatment in patients with chronic pouchitis: a double- blind, placebo- Przegl¹d Lekarski 2007 / 64 / 3 controlled trial. Gastroenterology 2000, 119, 305. 13. Hoffmann P., Reinshagen M., Zech J.M. et al.: Increased expression of epidermal growth factor receptor in an experimental model of colitis in rats. Scand. J. Gastroenterol. 2000, 11, 174. 14. Isolauri E., Kirjavainen P.V., Salminen S.: Probiotics: a role in the treatment of intestinal infection and inflammation. Gut 2002, 50, (Suppl. III), 54. 15. Kennedy R.J., Hoper M., Deodhar K. et al.: Gardiner. Probiotic therapy fails to improve gut permeability in a hapten model of colitis. Scand. J. Gastroenterol. 2000,12, 1266. 16. Levi S., Shaw- Smith C.: Non- steroidal anti-inflammatory drugs: how do they damage the gut. Br. J. Rheumatol. 1994, 33, 105. 17. Linskens R.K., Huijsdens X.W., Savelkoul P.H.M. et al.: The bacterial flora in inflammatory bowel disease: current insights in pathogenesis and the influence of antibiotics and probiotics. Scand. J. Gastroenterol. 2001, (Suppl. 234), 29. 18. Macpherson A., Maloy K., Bjarnason I.: Intolerance of dirty intestine. Gut 1999, 44, 774. 19. Muller J.: Pathogen identification in indigenous deep mycoses. La Roche an Co. Colimited company, Basle 1986. 20. Rachmilewitz D.: On smoking , rats and inflammatory bowel disease. Gastroenterology 1999, 117, 1008, editorials. 21. Reuter B., Asfaha S., Buret A. et al.: Exacerbation of inflammation- associated colonic injury in rat through inhibition of cyclooxygenase- 2. J. Clin. Invest. 1996, 98, 2076. 22. Samonis G., Anaisse E., Rosenbaum B. et al.: A model of sustained gastrointestinal colonization by Candida albicans in healthy adult mice. Infect. Immun. 1990, 1514. 23. Sandborn W., Targan S.: Biologic therapy of inflammatory bowel disease. Gastroenterology 2002, 122, 1592. 24. Shanahan F.: Inflammatory bowel disease: immunodiagnostics, immunotherapeutics and ecotherapeutics. Gastroenterology 2001, 120, 622. 25. Sartor R.B.: Review article: role of the enteric microflora in the pathogenesis of intestinal inflammation and arthritis. Aliment. Pharmacol. Ther. 1997, 11, (Suppl. 3), 17. 26. Vilaseca J., Salas A., Guarner F.: Participation of thromboxane and other eicosanoid synthesis in the course of experimental inflammatory colitis. Gastroenterology 1990, 98, 269. 27. Zwoliñska-Wcis³o M., Budak A., Trojanowska D. et. al.: Effect of fungal colinization of gastric mucosa on the course of gastric ulcer healing. Med. Sci. Monit. 2001, 7, 266. 129