PCR

Definicje
Białka rekombinowane
(ang. recombinant proteins, r-proteins)
Białka, które powstały w żywych
organizmach (lub liniach komórkowych)
w wyniku ekspresji rekombinowanego DNA.
Ukierunkowana mutageneza
Rekombinowany DNA jest efektem
złożenia za pomocą wybranych technik
laboratoryjnych fragmentów materiału
genetycznego pochodzących
z różnych źródeł/organizmów.
Utworzone w ten sposób sekwencje DNA
nie występują naturalnie w przyrodzie.
Jednak dzięki obecności odpowiednich
elementów regulatorowych mogą być
powielane oraz mogą ulegać ekspresji
po wprowadzeniu do komórek gospodarza.
(ang. site-directed/site-specific
mutagenesis)
Technika, umożliwiająca wprowadzenie
mutacji w ściśle określonym miejscu
łańcucha DNA. Aby można ją było
zastosować, konieczna jest znajomość
wyjściowej sekwencji nukleotydów
w genie.
Obecnie, ukierunkowaną mutagenezę
przeprowadza się standardowo w oparciu
o łańcuchową reakcję polimerazy (PCR)
i odpowiednio zmodyfikowane
oligonukleotydy (startery).
PCR
Powielany fragment DNA
Cykl 1
Cykl 3
powielany odcinek DNA
5’
5’
3’
3’
5’
Denaturacja (95°C)
5’
5’
3’
5’
3’
5
’
3’
3’
5’
przyłączenie starterów
(45-65°C)
i wydłużanie nici DNA
(72°C)
Cykl 2
5
’
3
’
3
’ 5
3 ’
’ 5
3’
5’
’
3
5
’
3’
5’
’ 3
5
’
’ 3
5’
’
3
’
3
’
3
’5
3’
’
3
’
3
5
’
3’
5’
’ 3
5’
3 ’
5’
’ 3
5 ’
’ 3
5’
’3
5 ’
’ 3
5’
’
5
’
5
’
5
3’
5 ’
3’
’ 5
3’
5’
’
matrycowy DNA
produkt reakcji z cyklu 1
produkt reakcji z cyklu 2
produkt reakcji z cyklu 3
PCR, w praktyce wygląda to tak…
Powielany fragment DNA
5’
3’
5’
3’
sekwencja startera 1 (forward, left) pokrywa się
3’ z sekwencją nici sensownej (kodującej)
5’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
Sekwencja startera 2 (reverse, right) pokrywa się
z sekwencją nici antysensownej (matrycowej)
Mutageneza ukierunkowana, Overlap extension PCR
OE PCR, metoda wydłużania nakładających się odcinków
5’
3’
PCR 1
3’
5’
3’
5’
3’
5’
PCR 2
A
5’
3’
5’
3’
3’
B
5’
5’
3’
5’
PCR 3
C
5’
3’
5’
D
3’
3’
A
3’
B
5’
3’
5’
3’
5’
Mutageneza ukierunkowana, Overlap extension PCR
5’
3’ się odcinków
OE PCR, metoda
3’ wydłużania nakładających
5’
5’
3’
PCR 1
5’
3’
A
PCR 2
3’
5’
3’
starter A
5’
5’3’
3’
5’
3’
5’
produkt reakcji
1
5’
3’
3’
C
3’
starter D
5’
3’
denaturacja rehybrydyzacja
5’
3’
5’
5’
A
produkt reakcji 2
zmieszanie
5’
3’
5’
5’
5’
D
starter B 3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
PCR 3
reakcja 2
reakcja 1
starter C
3’
3’
B
5’
3’
5’
3’ 3’ nie ulega wydłużeniu
dNTP, polimeraza, starteryBB i A
3’
ulega wydłużeniu
5’
3’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
3’
3’5’
5’
3’ produkt reakcji 3
5’
Wprowadzanie modyfikacji na końcach genów
Wykorzystanie zmodyfikowanych starterów
do wprowadzania mutacji na 5’ i 3’ końcu genu
3’
5’
3’
5’
3’
5’
5’
3’
Wprowadzenie/usuwanie sekwencji Shine-Dalgarno/Kozak, kodonu STOP,
kodonu START, miejsc cięcia dla enzymów restrykcyjnych
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
Modyfikacje DNA, wprowadzanie delecji przy pomocy PCR
Na początku lub na końcu genu
5’
3’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
W środku genu
PCR 1 – startery A i C
3’
5’
3’
3’
5’
A
5’
3’
5’
C
PCR 2 – startery D i B
B
5’
5’
5’
3’
3’
D
3’
3’
PCR 3 – startery A i B
5’
3’
5’
3’
5’
Mutageneza ukierunkowana c.d., metoda Quik Change ®
1. Wektor z genem
wyizolowany
z bakterii dam+,
docelowe miejsce
wprowadzenia
mutacji
2. Startery
wprowadzające
mutację
są do siebie
komplementarne
3. Powielanie
dwóch nici
wektora,
wprowadzenie
mutacji
Stratagene
4. Trawienie
bakteryjnego DNA,
usunięcie nici
nie zawierających
mutacji
Większość szczepów E. coli prowadzi metylację dam+.
Endonukleaza DpnI rozpoznaje i trawi jedynie metylowaną
sekwencję 5´-Gm6ATC-3´.
Quik Change ® – warunki reakcji
A
QC PCR
Etap
Cykl
Temperatura
Czas
1
1
95°C
30 sek.
2
12–18
95°C
55°C
68°C
30 sek.
1 min
1 min/1kz DNA
Etap
Cykl
Temperatura
Czas
1
1
95°C
3 min
2
25–30
95°C
55°C
72°C
30 sek.
1 min
1 min/1kz DNA
B
Normalny
PCR
1A – denat. 94°C/60 sek.
2A – denat. 94°C/30min/bez DNA matrycowego/test. aktywności polimerazy
3A – denat. 94°C/10 sek./z DNA matrycowym
W wysokiej temperaturze DNA może ulegać depurynacji. Proporcjonalnie,
dłuższe matryce będą bardziej uszkodzone niż krótkie. Przy powielaniu
długich fragmentów DNA istotne jest skrócenie czasu denaturacji oraz
obniżenie temperatury wydłużania.
Klonowanie klasyczne
wektor
fragment DNA zawierający
interesujący nas gen
fragment DNA (wstawka)
po trawieniu enzymami
restrykcyjnymi
BamHI i EcoRI
ligacja (ligaza DNA)
wektor pocięty
enzymami restrykcyjnymi
BamHI i EcoRI
wektor po wklonowaniu wstawki
– rekombinowanego DNA
Enzymy restrykcyjne a metylacja DNA
Enzymy restrykcyjne (endonukleazy) występują naturalnie u sinic i bakterii. Razem
z komplementarnymi metylazami tworzą
system restrykcji-modyfikacji, dzięki któremu
mikroorganizmy bronią się przed wnikaniem
obcego DNA, np. bakteriofagów.
Specyficzna metylacja własnego DNA służy ochronie przed
restryktazami syntetyzowanymi przez organizm – obcy DNA,
niemetylowany według określonego wzoru, ulega degradacji.
Enzymy restrykcyjne
EcoRI
EcoRV
PstI
Izoschizomery – enzymy pochodzące z różnych organizmów, rozpoznające te same
sekwencje i tnące je w ten sam sposób, np. MspI i HpaII
5'...C^C G G...3'
3'...G G C^C...5'
Neoizoschizomery – enzymy pochodzące z różnych organizmów, rozpoznające te
same sekwencje, ale tnące je w różny sposób,
np. SmaI 5'...C C C^G G G...3‘ i XmaI 5'...C^C C G G G...3‘
3'...G G G^C C C...5‘
3'...G G G C C^C...5‘
Metoda OE PCR cloning – klonowanie przy pomocy PCR
Wektor,
do którego
chcemy
wprowadzić
gen
Projektujemy startery,
częściowo komplementarne
do genu
a częściowo
komplementarne
do wektora
Tak zmodyfikowany gen
wykorzystywany jest
w kolejnej reakcji PCR,
gdzie służy za starter
Gen, który chcemy
wprowadzić do wektora
W wyniku reakcji PCR otrzymujemy gen,
na którego końcach
znajdują się
sekwencje
komplementarne do wektora
Po zakończeniu reakcji
zmetylowany wektor,
który służył jako matryca
zostaje pocięty
za pomocą enzymu DpnI
Namnożony,niezmetylowany
wektor z wklonowanym
genem zostaje
wprowadzony
do komórek
gospodarza,
gdzie gen może
ulec ekspresji
Termostabilne polimerazy DNA
Pochodzenie
Aktyw.
5’ – 3’
egzonukl.
Aktyw.
3’ – 5’
egzonukl.
Częstość
błędów
[1x10-6]a
Wydłużanie
3’-końca
Termostabilność
Procesywnośćb
Thermus
aquaticus
tak
nie
22
tak
9’ w 97,5°C
50
Pwo
Pyrococcus
woesei
nie
tak
3,2
nie
>2h w 100°C
20–30
Pfu 1991
Pyrococcus
furiosus
nie
tak
2,6
nie
4h w 95°C
Pyrococcus
szczep GB-D
nie
tak
5
nie
8h w 100°C
nie
tak
0,44
nie
Polimeraza
Taq 1976
DeepVent
Phusion
a
częstość błędów: ilość błędów/pz/cykl
b
ilość nukleotydów przyłączonych zanim polimeraza odłączy się od matrycy
PCR – ogólne zasady projektowanie starterów
Długość starterów – od 18 do 30 zasad, krótsze startery mogą się niespecyficznie
wiązać z matrycą
3’ koniec startera – nie powinien zawierać więcej niż 3 zasady G i/lub C, gdyż mogą
one stabilizować niespecyficzne oddziaływania starter–matryca
5’ koniec startera – jest mniej krytyczny dla specyficznego przyłączania startera do
matrycy dlatego może być modyfikowany
Zawartość GC – zasady GC powinny stanowić od 40 do 60 % sekwencji
Hybrydyzacja – 3’ koniec starterów nie powinien tworzyć struktury spinki do włosów,
startery używane w reakcji nie powinny tworzyć homo- i/lub heterodupleksów
hybrydyzacja starterów
na końcu 3’
Temperatura topnienia – startery używane w reakcji powinny
temperaturę topnienia (różnica 2–5°C), optymalnie – nieco powyżej 60°C
mieć zbliżoną
Optymalizacja warunków PCR
Stężenie starterów: końcowe stężenie każdego ze starterów powinno się
zawierać w przedziale między 0,1 a 0,5 µM (6×1012 – 3×1013 cząsteczek).
Wyższe – zwiększa prawdopodobieństwo powstania niespecyficznych
produktów
Stężenie matrycy DNA: ilość używanego matrycowego DNA zależy od jego
pochodzenia. Zwykle stosuje się 100–250 ng genomowego i 20–50 ng
plazmidowego DNA na 50 µl reakcji
Stężenie nukleotydów: końcowe stężenie poszczególnych nukleotydów
powinno wynosić ok. 0,2 mM (ilość, która pozwala uzyskać ok. 6–6,5 µg DNA)
Ilość cykli – od 25 do 35, w zależności od pochodzenia DNA i ilości matrycy
Czas wydłużania starterów – zwykle przyjmuje się regułę 60 sek/1000 zasad
Optymalizacja warunków PCR
Bufor
– standardowy bufor zawiera 50 mM KCl i 10 mM Tris-HCl,
pH 8,3. Podniesienie stężenia KCl do 70–100 mM może zwiększyć wydajność syntezy
fragmentów o długości <500 pz. Niektóre bufory obok jednowartościowych jonów K+
zawierają jony NH4+ (obecność jonów NH4+ minimalizuje potrzebę optymalizacji stężenia
jonów Mg2+ oraz temperatury przyłączania starterów.
temp °C
produkt PCR
niespecyficzne
produkty PCR
Stężenie jonów magnezu
Critical Factors, for Successful PCR, Users Manual, Qiagen
– im wyższe, tym większa wydajność reakcji ale także ilość produktów niespecyficznych
Temperatura przyłączania starterów (annealing temperature)
– im wyższa, tym bardziej specyficzny produkt reakcji
Obliczanie temperatury topnienia starterów
Tm = 2°C × (A + T) + 4°C × (G + C)
Dla dłuższych oligonukleotydów (do 70
zasad), gdy stężenie kationów jest ≤ 0,4 M
można zastosować równanie:
Jednoniciowy DNA
Absorbancja przy 260 nm
Dla starterów liczących nie więcej niż 20
nukleotydów temperaturę topnienia (melting
temperature) można wyliczyć wg empirycznej
zasady Wallace’a:
Częściowo
rozwinięty DNA
Tm=69 °C
Dwuniciowy DNA
Temperatura [°C]
Tm = 81°C + 16,6 (log10 [K+]) + 0,41(%[G + C])
Temperatura hybrydyzacji (annealing temperature) jest na ogół
o 5–10°C niższa od Tm, należy ją ustalić empirycznie.
Czynniki wpływające negatywnie na PCR
Wysoka zawartość zasad GC jest odpowiedzialna za powstawanie
struktur drugorzędowych w obrębie DNA, co prowadzić może do
zahamowania aktywności polimerazy. Glicerol, DMSO (2–10%), chlorek
tetrametyloamonu (0,01–10 mM), formamid (5–20%) poprawiają
wydajność tego typu reakcji PCR.
Zanieczyszczenia związkami używanymi przy oczyszczaniu
matrycowego DNA Do związków hamujących aktywność polimerazy
należą: SDS (>0,005% w/v), fenol (>0,2% v/v), etanol (> 1% v/v),
izopropanol (>1% v/v), octan sodu (>5 mM), EDTA (> 0,5 mM).
Czystość starterów zależy od sposobu ich oczyszczenia po syntezie.
Standardowo startery oczyszcza się stosując sączenie molekularne.
Startery o długości powyżej 70 zasad powinny być oczyszczane za
pomocą HPLC.
Wektory plazmidowe
Plazmidy
―
―
―
―
―
naturalnie występujące u bakterii pozachromosomalne, koliste, dwuniciowe
cząsteczki DNA, 1–200 kpz.
ich replikacja przebiega niezależnie od chromosomalnego DNA
posiadają mechanizmy umożliwiające zachowanie stałej liczby cząsteczek
w komórce gospodarza oraz odpowiednią segregację do komórek potomnych
replikacja i transkrypcja genów plazmidowych przebiega zwykle w oparciu
o enzymy gospodarza
w plazmidach naturalnych zawarta jest informacja decydująca o:
oporności/produkcji antybiotyków, syntezie bakteriocyn, enterotoksyn,
wytwarzaniu enzymów restrykcyjnych, rozkładzie złożonych związków
organicznych, oporności na jony metali ciężkich, zdolności do koniugacji, itp.
Wektory plazmidowe
― stworzone na potrzeby klonowania i/lub ekspresji genów
― posiadają m. in:
• polilinker, MCS (multi cloning site)
• ori (origin) miejsce startu replikacji
• marker selekcyjny: np. gen oporności na antybiotyk
• promotor
− dodatkowo mogą zawierać sekwencje kodujące metki ułatwiające
oczyszczanie lub sekwencje białek wykorzystywanych jako partnerzy
fuzyjni
Wektor do tworzenia
białek fuzyjnych (Clontech)
Wektor do równoległej ekspresji dwóch białek (Invitrogen)