HS PCR Kit 1000 U 5 U_PL

1000 U
5 U/µl
nr kat. 1205-1000H
HS-PCR Kit
H
S
z hot start Taq DNA polimerazą
A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, 81-451 Gdynia, Poland
tel. +48 58 6982194, fax +48 58 6228578, www.aabiot.com, [email protected]
HS-PCR Kit
HS-PCR Kit
z hot start Taq DNA polimerazą
z hot start Taq DNA polimerazą
Typowy protokół przygotowywania reakcji hot start PCR
* Kompletny zestaw odczynników polecany do
rutynowych reakcji amplifikacji w technice hot start
* Zestaw zawiera najczęściej używaną termostabilną
Taq DNA polimerazę dla hot start PCR
1. Całkowicie rozmrozić i wymieszać wszystkie komponenty
niezbędne do nastawienia reakcji PCR. Składniki krótko
zwirować i wstawić do lodu.
2. Przykładowy protokół reakcji hot start PCR:
Oczyszczana ze szczepu E.coli niosącego plazmid
z wklonowanym genem kodującym polimerazę DNA
z Thermus aquaticus.
Składnik
Enzym katalizuje dołączanie deoksynukleotydów do
końca 3’ dwuniciowego DNA w obecności jonów Mg2+
w temperaturze 70-80 °C.
Polimeraza jest efektywnie blokowana przez przeciwciało
monoklonalne. Wymagany czas aktywacji od 2 do 5 min.
Nie zaleca się dłuższych czasów aktywacji.
Polimeraza Taq nie posiada aktywności egzonukleazy
3’ do 5’, posiada natomiast słabą aktywność egzonukleazy
5’ do 3’.
Bufor KU zwiększa swoistość reakcji PCR dla matryc o
zwiększonej ilości struktur drugorzędowych i zawartości
par GC. Przy zastosowaniu buforu KU zawsze należy
wykonać kontrolne reakcje bez buforu KU.
Bufor reakcyjny I zawiera jony Mg2+ o stężeniu
zapewniającym satysfakcjonujące wyniki większości
układów doświadczalnych.
Optymalizacja stężenia jonów Mg2+ w reakcji:
Istnieje możliwość zastosowania buforu rekacyjnego III
(bez jonów Mg2+) i dodania do niego odpowiedniej ilości
jonów Mg2+ w postaci załączonego do zestawu MgCl2.
nr kat. 1205-1000H
objętość reakcji 25 μl
10x bufor reakcyjny I lub III
dNTP Mix (10 mM)
starter 1 oraz 2
HS-RUN DNA Polimeraza
matryca DNA
opcjonalnie 5x bufor KU
opcjonalnie MgCl2
opcjonalnie 6x bufor obciążający
woda jałowa, uzupełnić do
2,5 μl
200-250 μM (0,5-0,6 μl)
0,1-0,5 μM
1-5 U
10 pg -1 μg
2,5-5 µl
w zależności od potrzeb
w zależności od potrzeb
25 µl
3. Mieszaninę reakcyjną delikatnie wymieszać i zwirować.
4. Probówkę umieścić w termocyklerze.
Przykładowy profil amplifikacji produktu o
długości do 1000 pz:
wstępna denaturacja: 95 °C - 3-5 min
25-45 cykli: 95 °C - 15 s, 50-68 °C - 30-60 s, 72 °C - 60 s
wydłużanie końcowe: 72 °C - 10 min
5. Otrzymane produkty PCR przechowywać w lodówce lub
zamrażarce do czasu dalszych analiz.
nr kat. 1205-1000H
HS-PCR Kit
z hot start Taq DNA polimerazą
Skład zestawu:
1000 U HS-RUN DNA polimeraza - stężenie: 5 U/μl
4 x 200 µl 10 mM dNTP’s mix
4 x 1,5 ml 10x bufor I, bufor reakcyjny z jonami Mg2+
100 mM KCl, 100 mM (NH4)2SO4, 200 mM Tris-HCl pH 8,5,
15 mM MgCl2, 1% Triton X-100
4 x 1,5 ml 10x bufor III, bufor reakcyjny bez jonów Mg2+
100 mM KCl, 100 mM (NH4)2SO4, 200 mM Tris-HCl pH 8,5, 1% Triton
X-100
4 x 2 ml 5x bufor KU zwiększający specyficzność reakcji
nie zawiera DMSO ani związków toksycznych
1 ml 6x bufor obciążający
20% Ficol, 0,02% bromophenol blue, 0,02% xylene cyanole FF
2 x 1,5 ml 25 mM MgCl2
Uwaga: Odczynniki przed użyciem należy całkowicie
rozmrozić i starannie wymieszać przez odwracanie
probówki!
Produkt opracowany, sprzedawany i przeznaczony
wyłącznie do badań naukowych.
przechowywać w -20 °C
nr kat. 1205-1000H