Wyróżniona praca w formacie pdf

Porównywanie rozwoju szczepów dzikich i
mutantów E.coli na płytkach z inhibitorem
gyrazy - enzymu odpowiedzialnego za
superskręty negatywne w chromosomie
bakteryjnym”.
„
Autor: Krzysztof Sroka kl. III b
I Akademickie Liceum Ogólnokształcące w Gdyni
Opiekun: mgr inż. Leszek Ciesielski
Streszczenie
Pracę tą mogłem zrealizować dzięki uprzejmości pani dr Moniki Glinkowskiej oraz jej
Zespołowi z Katedry Biologii Molekularnej Uniwersytetu Gdańskiego. Proces replikacji DNA
u Escherichia coli (pałeczka okrężnicy) jest ściśle regulowany w zależności od warunków
wzrostu bakterii. Komórki bakteryjne w sprzyjających okolicznościach (bogate podłoże,
optymalna temperatura) dzielą się szybciej, zaś w niekorzystnych warunkach spowalniają
wzrost i tempo podziałów. Przed każdym podziałem chromosomalny DNA bakterii, będący
nośnikiem informacji genetycznej, musi zostać precyzyjnie powielony, aby mógł zostać
przekazany do potomnych komórek. Za rozpoczęcie procesu powielania materiału
genetycznego u E.coli i wielu innych bakterii odpowiedzialne jest białko dnaA.
Zidentyfikowano mutacje dnaA46 w genie kodującym białko dnaA, mające wyraźne odbicie w
fenotypie bakterii. Uszkodzone białko zachowuje wystarczającą funkcjonalność, aby zapewnić
rozwój i podział bakterii tylko w określonych, sprzyjających warunkach (30°C). U bakterii
niosących mutację dnaA46 stwierdza się między innymi zahamowanie wzrostu w temperaturze
powyżej 39°C oraz wysoką wrażliwość na antybiotyk - nowobiocynę. Podczas badań nad
mechanizmami kontroli replikacji DNA, zaobserwowano ciekawe zjawisko polegające na tym,
iż bakterie posiadające mutacje w genie dnaA (dnaA46) oraz w jednym z genów szlaku
metabolizmu węglowego są odporne na podwyższoną temperaturę. A zatem zmiana w genach
należących do centralnego metabolizmu węgla znosi temperaturowrażliwy fenotyp mutantów
dnaA. W związku z tym wysunięto hipotezę, iż procesy związane z centralnym metabolizmem
węgla w komórce mają bezpośredni wpływ na proces replikacji DNA.
W mojej pracy podjąłem próbę zweryfikowania powyższej hipotezy, badając czy
podwójne mutanty dnaA46 z delecjami genów metabolizmu węgla w komórce: pta i ack.A
wykażą identyczną odporność na nowobiocynę jak szczep dziki. Nowobiocyna hamuje
aktywność enzymu niezbędnego w przebiegu replikacji DNA – gyrazy DNA, która jest jednym
z białek odpowiedzialnych za utrzymanie właściwej struktury chromosomalnego DNA bakterii.
Porównywałem rozwój różnych szczepów E.coli na płytkach z pożywką stałą zawierającą
nowobiocynę w różnych stężeniach. Podczas doświadczeń wcierałem w płytki próby
pochodzące z seryjnych rozcieńczeń hodowli bakteryjnych szczepu dzikiego, mutanta dnaA46,
mutanta z wydeletowanym genem jednego ze szlaków metabolizmu węglowego: ackA, pta
oraz dwóch podwójnych mutantów dnaA46 ∆pta i dnaA46 ∆ackA. Wszystkie przeprowadzone
przeze mnie próby potwierdziły hipotezę o związku procesu replikacji z cyklem
metabolicznym węgla w komórce E.coli. Podwójne mutanty posiadały odporność równą
szczepu dzikiemu oraz samym mutantom cyklu węglowego. Wskazuje to na supresję efektu
uszkodzonego genu dnaA46 przez delecje genów pta i ackA.
Choć sam fakt wpływu obecności mutacji w metabolizmie bakterii na replikacje jej
materiału genetycznego jest niezaprzeczalny, to niestety nie wiemy, na czym bezpośrednio
polega ta relacja. Czy to brak białek ackA i pta wywołał supresję uszkodzonego genu dnaA46,
czy też nagromadzenie pośrednich metabolitów wpłynęło na reakcję bakterii, która pozwoliła
jej przeżyć i namnażać się. Niemniej, moja praca była częścią rzeczywistego projektu
badawczego, który wkrótce być może, da nam odpowiedź na te pytania.
Wstęp
Poznanie praw rządzących procesem replikacji jest niezwykle ważne dla pełnego
zrozumienia fenomenu życia. Jest to bowiem podstawowy proces pozwalający na powielenie
informacji genetycznej w celu jej przekazania potomnym komórkom lub organizmom. Ten
energochłonny proces jest ściśle regulowany, gdyż jego zaburzenia mogą prowadzić do
wprowadzenia mutacji do materiału genetycznego, skutkujących zaburzeniami procesów
komórkowych, a nawet śmiercią komórki lub zainicjowaniem procesu nowotworzenia u
organizmów wyższych. Nasuwa się pytanie, w jaki sposób komórka dowiaduje się, kiedy
należy się dzielić, a kiedy zbierać energię i skupić się na przeżyciu? Mechanizmy takie
funkcjonują przecież już u najbardziej pierwotnych form życia - prokariontów, które ze
względu na często zmieniający się stan środowiska, rozwinęły mechanizmy pozwalające
dopasować replikację DNA do warunków wzrostu. Zagadnieniom tym poświęcono wiele lat
badań w licznych laboratoriach, a mimo to wciąż niewiele o nich wiemy. Odkrycie tej
tajemnicy pozwoliłoby nam prawdopodobnie na skuteczniejszą walkę z rakiem i patogenami, a
także być może rozwiązałoby problem przeszczepów. Ostatnie doniesienia z literatury
fachowej wskazują na istnienie bezpośredniej zależności między procesami metabolitycznymi
a replikacją. W swojej pracy badałem związek między metabolizmem węgla w komórce a
procesem replikacji DNA chromosomalnego E.coli. Escherichia coli jest bakterią Gram
ujemną powszechnie występującą w jelicie grubym zwierząt stałocieplnych (w tym człowieka).
W większości przypadków nie wywołuje chorób, choć niektóre szczepy są zdolne do produkcji
groźnych toksyn wywołujących m.in. skazę krwotoczną lub kolonizację dróg moczowych,
powodując ich stan zapalny. Ponadto jej genotyp i metabolizm jest dobrze poznany, co w
połączeniu z krótkim cyklem rozwojowym i niskimi wymaganiami życiowymi, czyni z niej
organizm modelowy wykorzystywany przez laboratoria na całym świecie. Materiałem
badawczym były różne szczepy E.coli, które poddawałem warunkom uniemożliwiającym
wzrost komórek zawierających mutację w genie dnaA (dnaA46), kodującym białko związane
z replikacją.
Metoda i materiał
Badania prowadziłem na 6 różnych szczepach bakterii E.coli :
• szczepie dzikim (WT – ang. Wild Type),
• szczepie z mutacją w genie dnaA - dnaA46 i genem oporności na tetracyklinę (marker
genetyczny zastosowany podczas konstrukcji szczepów, umożliwiający ich łatwą
selekcję na podłożu z antybiotykiem),
• szczepie ze znokautowanym genem ackA (∆ackA) i genem oporności na kanamycynę,
• szczepie ze znokautowanym genem pta (∆pta) i genem oporności na kanamycynę,
• szczepie zawierającym podwójne mutacje: dnaA46, oraz ∆ackA oraz genami oporności
na tetracyklinę i kanamycynę,
• szczepie zawierającym podwójne mutacje: dnaA46 oraz ∆pta oraz genami oporności na
tetracyklinę oraz kanamycynę.
Białko dnaA46 rozplata heliksę DNA inicjując proces replikacji DNA. Jest ono także
ważnym czynnikiem regulującym ekspresje genów w komórce bakterii. Niejako przygotowuje
komórkę do podziału. Badany mutant w genie dnaA objawia się fenotypowo między innymi
przez zahamowanie rozwoju w temperaturze powyżej 39°C oraz nadwrażliwością na
nowobiocynę. Geny ackA oraz pta kodują enzymy biorące udział w metabolizmie węgla
bakterii.
Stosowane podłoża mikrobiologiczne:
– LA ang. Luria Agar (0,5% ekstrakt drożdżowy, 1% trypton, 1% NaCl w wodzie
bidestylowanej z dodatkiem 1,5% agarozy).
– LA z dodatkiem roztworu wodnego nowobiocyny o stężeniu wyjściowym 50 mg/ml.
Bakterie wysiewałem na szalki Petriego zawierające standardową stałą pożywkę.
Nowobiocyna jest inhibitorem gyrazy odpowiedzialnej za powstawanie superskrętów
negatywnych w strukturze DNA prokariontów. Odpowiedni poziom superskręcenia DNA jest
niezbędny do życia i podziału komórek bakteryjnych. Schemat doświadczenia przedstawiam
dokładnie poniżej.
Przed każdym eksperymentem zaszczepiałem pojedynczą kolonię odpowiednich szczepów
E.coli do świeżej pożywki LB (ang. Luria Broth - 0,5% ekstrakt drożdżowy, 1% trypton, 1%
NaCl w wodzie bidestylowanej) i hodowałem z wytrząsaniem w temperaturze 30°C. Nazajutrz
hodowle nocne bakterii były odmładzane w płynnych pożywkach z odpowiednimi
antybiotykami (np. mutant dnaA46 odmładzany był w pożywce z tetracykliną), natomiast
szczep dziki jako jedyny nie posiadający genu odporności na antybiotyki odmładzany był w
czystej pożywce (bez antybiotyku). Odmłodzone hodowle były inkubowane w wytrząsarce
wodnej z napowietrzaniem (180 obrotów/minutę) w temperaturze 30°C, dzięki temu bakterie
mogły się rozwijać w warunkach tlenowych. Wprawdzie bakterie E.coli są fakultatywnie
beztlenowe, więc mogą rozwijać się w warunkach
beztlenowych, ale metoda badania zakładała
wykorzystanie bakterii o fenotypie bakterii
tlenowych. Po upływie około 1,5 godziny od
momentu odmłodzenia hodowli, za pomocą
spektrofotometru (fot.1) oszacowywałem stopień
namnożenia bakterii w hodowlach. W tym celu
wykonywałem pomiar gęstości optycznej hodowli
przy długości fali λ=600 nm (OD600, od ang. Optical
Density), pozwalający ocenić stopień zmętnienia
pożywki bakteryjnej, a tym samym – wnioskować o
ilości komórek bakteryjnych obecnych w jednostce
objętości pożywki. Hodowle po osiągnięciu wartości
0,2 OD600 do 0,3 OD600 były wykorzystywane do doświadczeń lub inkubowane w lodzie, aby
zahamować ich dalszy rozwój. Z uzyskanych hodowli, za pomocą metody seryjnych
rozcieńczeń (Jackie Reynolds, Mark Farinha, 2005), uzyskiwałem zawiesinę bakterii
zawierającą ilość komórek w określonej objętości pożywki, pozwalającą na późniejsze
zliczenie kolonii na płytce (rozcieńczenia 105 oraz 106). Następnie za pomocą pipety
automatycznej przenosiłem 100 µl z wybranego rozcieńczenia na szalkę Petriego. Głaszczką
odkażoną w etanolu i opaloną nad palnikiem, wcierałem w podłoże agarowe zawiesinę
bakterii. Wszystkie powyższe czynności wykonywałem w odległości ok. 25 cm od palnika,
aby zapewnić względną aseptyczność powietrza. Po dokładnym wtarciu płynu w podłoże
płytki, wkładałem ją na 24 godziny do cieplarki nastawionej na temperaturę 30°C. Po tym
czasie kolonie na płytkach były przeze mnie zliczane, a wynik poddawany analizie.
Wyniki
Moje pierwsze doświadczenie przedstawia zależność pomiędzy stężeniem nowobiocyny
w podłożu a wzrostem badanych szczepów, co pozwoliło na ocenę, w jakim stężeniu
nowobiocyny objawia się fenotyp nadwrażliwości na ten antybiotyk bakterii z uszkodzonym
fragmentem dnaA46 (wykres 1).
Z poniższych danych wynika, iż stężenie 80 µg/ml jest już poza zakresem tolerancji dla
szczepu zmutowanego, podczas gdy pozostałe szczepy rosną w dalszym ciągu.
Wykres nr 1
Liczba kolonii bakteryjnych
1400
Wrażliwość badanych szczepów na nowobiocynę
w zależności od jej stężenia
1200
1000
Wt
dna A46
∆ pta
∆ ack.A
dna A46 ∆ pta
dna A 46 ∆ ack.A
800
600
400
200
0
0 µg\ml
40 µg\ml
60 µg\ml
80 µg\ml
Stężenie nowobiocyny
W następnych doświadczeniach łącznie wykonałem:
• 5 prób korzystając z rozcięczenia 106 w przypadku szczepu dzikiego, ∆ackA i ∆pta,
• 4 próby w przypadku rozcięczenia 106 dla szczepu mutanta dnaA46, dnaA46 ∆ackA i
dnaA46 ∆pta,
• 3 próby dla rozcięczenia 105 wszystkich szczepów.
Średnią ilość kolonii uzyskanych dla danego szczepu na płytkach nie zawierających
antybiotyku przyjąłem jako 100%. W stosunku do niej porównywałem średnią ilości kolonii
danego szczepu uzyskaną z płytek zawierających nowobiocynę.
Uzyskane wyniki podsumowałem w wykresie nr 2.
Wykres nr 2
Procet
Wrażliwość badanych szczepów na nowobiocynę
w odniesieniu do rozwoju bez antybiotyku
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
wt
dnaA46
Δpta
ΔackA
dnaA46 Δpta dnaA46 ΔackA
Szczep bakterii
Mutacje w genach kodujących białka zaangażowane w centralny metabolizm węgla
znoszą nadwrażliwość szczepów zawierających mutacje dnaA46 na nowobiocynę.
Zaprezentowane wartości stanowią średnią z trzech niezależnych eksperymentów. Słupki
błędów oznaczają odchylenie standardowe (świadczące o rozrzucie wyników, o zakresie w
jakim wartości uzyskane z poszczególnych eksperymentów odbiegają od średniej).
Dyskusja
Replikacja jest złożonym procesem wymagającym zaangażowania wielu
specjalistycznych białek, nukleotydów i ogromnych nakładów energetycznych. Dlatego przed
podjęciem wysiłku zmobilizowania aparatu replikacyjnego komórka musi mieć pewność, iż
uda jej się, w panujących warunkach, ukończyć proces powielania materiału genetycznego.
Zatem proces replikacji jest ściśle regulowany, aby zapewnić wytworzenie wiernych kopii
materiału genetycznego. Od niedawna badana jest bezpośrednia relacja pomiędzy
metabolizmem a procesem replikacji. Dawniej uważano, iż relacja ta istnieje, ale tylko
pośrednio. Wzrost produktów energetycznych metabolizmu miał pobudzać i zasilać
energochłonny proces transkrypcji i replikacji DNA w komórce. Uzyskane przez naukowców
wyniki wskazują jednak na bezpośredni wpływ metabolizmu węgla na aparat replikacyjny, co
potwierdzają również moje badania.
Zarówno w doświadczeniu wstępnym (patrz tab.1) jak i w kolejnych doświadczeniach
(patrz wykres 1) mutant dnaA46 nie przeżywał w stężeniu 80 µg novobiocyny na 1 ml pożywki
stałej. Mutanty podwójne czyli dnaA46 ∆pta i dnaA46 ∆ack.A, pomimo produkowania
wadliwego białka dnaA wykazywały odporność na nowobiocynę. Różnice w rozwoju między
szczepem dzikim a mutantami ∆pta i ∆ack.A są niewielkie i mieszczą się w granicach błędu
statystycznego. Powyższe spostrzeżenia są zgodne z wcześniej poczynionymi obserwacjami
nad supresją temperaturowrażliwego fenotypu mutanta dnaA przez delecję tych samych genów
należących do centralnego metabolizmu węgla (Barańska i wsp.,2013). Jest mało
prawdopodobne, aby delecje dwóch różnych genów zaangażowanych w metabolizm węgla w
komórce mogły niezależnie zwiększyć zakres tolerancji bakterii na wysoką temperaturę i
stężenie antybiotyku - nowobiocyny. Wskazuje to jednoznacznie na to, iż delecja genów
metabolizmu węgla w komórce supremuje źródło badanych fenotypów czyli obecność
uszkodzonego fragmentu DNA kodującego białko dnaA46. W jaki jednak sposób zachodzi ten
proces, niestety jeszcze nie wiemy.
Dyskusja o tym, jak dokładnie wygląda wpływ metabolizmu na replikacje trwa. Istnieje
jednak kilka hipotez które próbują wyjaśnić otrzymane wyniki.
Pierwsza hipoteza zakłada bezpośredni związek białek cyklu obiegu węgla w komórce z
procesem replikacji. Być może same enzymy szlaków metabolicznych wpływają na aktywność
białek replikacyjnych oddziałując z nimi fizycznie w komórce bakteryjnej. Ich brak wywołałby
odpowiednią zmianę w procesie replikacji (np. spowolniając ją), tym samym supresując
wadliwe białko dnaA46.
Inną możliwością jest wpływ nadmiernego nagromadzenia się pośrednich metabolitów
spowodowany brakiem jednego z enzymów. Niewykorzystane metabolity byłyby sygnałem do
włączenia reakcji umożliwiającej przeżycie bakterii pomimo defektu białka dnaA46 lub
wyłączenia reakcji szkodliwej dla bakterii w zaistniałej sytuacji. Podobnie ma się sprawa przy
odwrotnym założeniu, iż sygnałem dla komórki jest brak produktów z wyłączonego fragmentu
szlaku metabolicznego. Być może w taki sposób delecja genów ackA i pta wywołała reakcje
stresową komórki, przez co ta zmieniła swoją strategię regulacji replikacji materiału
genetycznego. W moich badaniach stwierdziłem, iż mutacje w genach centralnego
metabolizmu węgla prowadzą do zniesienia nadwrażliwości szczepu produkującego
defektywne białko replikacyjne na antybiotyk hamujący enzym odpowiedzialny za utrzymanie
odpowiedniej struktury DNA. Może to świadczyć o bezpośrednim wpływie białek
zaangażowanych w centralny metabolizm węgla na strukturę DNA.
Odkrycie czynników regulujących replikacje od strony metabolizmu komórki może
niebywale przyczynić się do rozwoju medycyny i farmakologii. Choć sam sposób organizacji
informacji genetycznej u prokarionta i eukarionta jest różny, to wiele mechanizmów
genetycznych ma swoje funkcjonalne odzwierciedlenie u obu grup. Z tego powodu przed
testami nad organizmami wyżej zorganizowanymi (w tym także nami ludźmi) należy dokładnie
poznać mechanizmy występujące u bakterii. Poza perspektywami opracowania zupełnie
nowych antybiotyków, wiedza ta może w przyszłości zaowocować znalezieniem nowych
metod leczenia raka, gdyż komórki nowotworowe odznaczają się utratą prawidłowej kontroli
procesu replikacji DNA. Pierwsze przesłanki o współzależności metabolizmu komórki a
zmianami nowotworowymi zapostulował laureat nagrody Nobla z 1931r. Otto Wagburg.
W swoich badaniach udowodnił on między innymi, iż komórki nowotworowe zużywają
znacznie mniej tlenu niż pozostałe zdrowe komórki. Obecnie wiemy, że spowodowane jest to
zmianą strategii uzyskiwania energii przez komórkę nowotworową z oddychania
mitochondrialnego na o wiele mniej efektywną beztlenową glikolizę. Istnieją więc duże
nadzieje związane z prowadzonymi badaniami na temat oddziaływania metabolizmu na
replikacje, gdyż prawdopodobnie pozwoliłoby to nie tylko na skuteczną walkę z nieustannie
replikującymi się komórkami rakowymi, ale także na skuteczniejszą prewencję chorób
nowotworowych. Bezsprzecznie dieta ma wpływ na metabolizm. Nasuwa się więc jasna
konkluzja, że nasze nawyki żywieniowe mają o wiele większy wpływ na kancerogenezę niż
dotychczas sądziliśmy.
Potencjalne możliwości jakie daje nam studium nad procesem regulacji replikacji są
fascynujące. Moja praca jest częścią większego trwającego obecnie projektu prowadzonego
przez naukowców z Katedry Biologii Molekularnej na Uniwersytecie Gdańskim. W tym
miejscu pragnąłbym szczególnie podziękować Pani dr Monice Glinkowskiej oraz jej
Zespołowi, którzy zapewnili mi warunki do przeprowadzenia badań oraz wsparli swą wiedzą i
doświadczeniem praktycznym.
Piśmiennictwo:
1. Alicja .Wegrzyn,Grzegorz .Wegrzyn, (2001) Inheritance of the replication complex: a
2.
3.
4.
5.
6.
7.
unique or common phenomenon in the control of DNA replication? Arch Microbiol. ,
175:86-93.
Anne-Francoise Monnier, Armelle Cabin i in.(2008) From metabolic hyperstructures to
DNA replication complexes and back again, Modelling Complex Biological Systems in
the Context of Genomics, str.161-174.
Sylwia Barańska, Monika Glinkowska, Anna Herman-Antosiewicz, Monika MaciągDorszyńska, Dariusz Nowicki, Agnieszka Szalewska-Pałasz, Alicja Węgrzyn i Grzegorz
Węgrzyn (2013) Replicating DNA by cell factories: roles of central carbon metabolism
and transcription in the control of DNA replication in microbes, and implications for
understanding this process in human cells, Microbial Cell Factories, 12:55.
Jackie Reynolds, Mark Farinha (2005), Counting Bacteria.
Eldra P. Solomon, Linda R. Berg, Diana W. Martin (2005), Biologia.
Wikipedia, the free encyclopedia, (13 wrzesień 2013), Warburg effect.
zdrowosfera.pl (2 wrzesień 2013), Dr Otto Warburg i jego badania nad tlenem