Wp³yw β-glukanu (Leiber ®Beta-S) na nieswoiste humoralne

KOMUNIKATY RYBACKIE
Nr 3 (128)/2012, 14 – 17
Andrzej K. Siwicki, Krzysztof Kazuñ, Barbara Kazuñ, Edward G³¹bski, Agnieszka Lepa
Zak³ad Patologii i Immunologii Ryb Instytutu Rybactwa Œródl¹dowego w Olsztynie
Wp³yw â-glukanu (Leiber ®Beta-S) na nieswoiste
humoralne mechanizmy obronne u narybku karpia
(Cyprinus carpio)
Wstêp
raln¹
W podchowach kontrolowanych ryb istnieje stale
zagro¿enie chorobami, wynikaj¹ce z obni¿enia odpornoœci
powodowanej
stresem
polietiologicznym.
Wynikiem
takiego stanu jest wzrost zachorowalnoœci na choroby
wirusowe, bakteryjne czy grzybicze. W profilaktyce chorób
ryb coraz wiêkszego znaczenie nabieraj¹ preparaty naturalne i syntetyczne wykazuj¹ce dzia³anie moduluj¹ce na
nieswoiste mechanizmy obronne (Siwicki i in. 1998).
Liczne badania potwierdzi³y, ¿e â-glukany wykazuj¹
w³aœciwoœci antyoksydacyjne oraz immunomoduluj¹ce
(Brown i Gordon 2003, Chen i Seviour 2007, Lull i in. 2005,
Ma³aczewska i in. 2010, Siwicki i in. 2009). Na uwagê
zas³uguje równie¿ fakt, ¿e â-D-glukany zaliczane s¹ do
istotnych prebiotyków stymuluj¹cych z jednej strony
wzrost i aktywnoϾ naturalnej flory jelitowej, a z drugiej
wykazuj¹ dzia³anie hamuj¹ce rozwój drobnoustrojów chorobotwórczych ( Sadula i in. 1999, Silke i in. 2007, Yadav
i Schorey 2006). Istotn¹ cech¹ â-glukanów jest równie¿ ich
zdolnoϾ do stymulacji biosyntezy kolagenu przez pobu-
odpowiedŸ
immunologiczn¹.
Liczne
badania
doœwiadczalne na zwierzêtach wykaza³y, ¿e â-glukany
zwiêkszaj¹ aktywnoœæ metaboliczn¹ i fagocytarn¹ komórek MN i PMN oraz odpowiedŸ proliferacyjn¹ limfocytów T
i B stymulowanych mitogenami (Brown i Gordon 2003,
Chen i Seviour 2007, Ma³aczewska i in. 2010, Siwicki i in.
2009, Tsipali i in. 2001, Wójcik i in. 2009, Wójcik 2010). Na
rynku pojawi³o siê wiele preparatów w sk³ad których
wchodz¹ â-glukany o ró¿nej budowie i rozpuszczalnoœci
w wodzie (Leiber-Beta S, Biolex-Beta HP, MacroGard). Ich
dzia³anie immunomoduluj¹ce wykazano w badaniach in
vivo na ró¿nych gatunkach zwierz¹t. Najbardziej efektywne jest podawanie â-glukanów per os przez okres 30
dni w dawkach od 200 do 500 mg na kg paszy (Ma³aczewska i in. 2010, Siwicki i in. 2009, Wójcik 2010).
Celem badañ by³o okreœlenie wp³ywu â-glukanu
(Leiber ®Beta-S) na nieswoiste humoralne mechanizmy
obronne u narybku karpia (Cyprinus carpio).
Materia³ i metody
dzone fibroblasty. Dziêki tym w³aœciwoœciom, â-glukany
Badania przeprowadzono na narybku karpia o masie
przyspieszaj¹ procesy regeneracji tkanek oraz uczestnicz¹
cia³a 15-17 g, który by³ w dobrej kondycji, klinicznie
w gojeniu ran. Liczne badania pokaza³y, ¿e â-glukany izolowane z dro¿d¿y Saccharomyces cerevisiae wykazuj¹
zdrowy, a badaniami mikrobiologicznymi wykluczono
dzia³anie immunotropowe i zaliczane s¹ do grupy natural-
(CyHV-3), wirusa wiosennej wiremii karpia (SVCV) oraz
nych preparatów immunostymuluj¹cych. â-Glukany s¹
aktywatorami funkcji uk³adu siateczkowo-œródplazmatycznego, wp³ywaj¹ stymuluj¹co na komórkowe i humo-
bakterii z rodzaju Aeromonas. Ryby pochodzi³y z Rybackiego Zak³adu Doœwiadczalnego IRS w ¯abieñcu. Po 2-tygodniowej adaptacji, ryby podzielono na 4 grupy po 100
ralne mechanizmy obronne oraz odpornoϾ przeciwwiru-
sztuk i przetrzymywano w basenach 1000-litrowych z obie-
sow¹, przeciwbakteryjn¹, przeciwgrzybicz¹ i przeciwnowotworow¹. Efektem powodowanej przez â-glukany aktywacji uk³adu immunologicznego jest wzmo¿enie mobiliza-
giem wody i napowietrzaniem w temperaturze 20-22°C.
cji komórek tego uk³adu, w miejscu pojawienia siê czynnika
który zosta³ zamkniêty w granulacie metod¹ pró¿niow¹
chorobotwórczego. Dzia³anie immunostymuluj¹ce â-glukanów jest wynikiem przy³¹czania siê tych cz¹steczek do
w dawce 100, 200 oraz 400 mg na kg granulatu. Natomiast
obecnoœæ patogennych wirusów: herpeswirusa karpia 3
Ryby grupy doœwiadczalnej karmiono pasz¹ komercyjn¹
(Bestfed, Polska) z dodatkiem â-glukanu (Leiber ®Beta-S),
specyficznych receptorów obecnych na powierzchni
ryby grupy kontrolnej karmiono pasz¹ bez dodatku â-glukanu. Karpie wszystkich grup doœwiadczalnych i kontrolnej
komórek immunokompetentnych, tj. makrofagach, mono-
karmiono jeden raz dziennie przez okres 30 dni, w iloœci
cytach, neutrofilach oraz limfocytach T i B. Komórki te,
odpowiedniej dla masy cia³a i temperatury wody. Krew do
dziêki obecnoœci swoistych receptorów, rozpoznaj¹ strukturê â-glukanów, co zapocz¹tkowuje komórkow¹ i humo-
badañ immunologicznych pobierano od 10 sztuk ryb ka¿dej grupy doœwiadczalnej i kontrolnej po 14 i 30 dniach
14
KOMUNIKATY RYBACKIE
3/2012
4
*
*
*
*
*
90
60
30
0
*
*
*
*
-1
*
*
AktywnoϾ lizozymu w surowicy (mg l )
A kty w n o œ æ M P O (ca ³ko w ita )
120
*
3
2
1
0
14
dni podawania b-glukanu (Leiber ®BetaS)
Grupa kontrolna
100 mg
200 mg
30
14
400 mg
Rys. 1. Wp³yw ró¿nych dawek â-glukanu (Leiber ®BetaS) na 1 kg
paszy na aktywnoϾ mieloperoksydazy (MPO) w neutrofilach
krwi u narybku karpia (wartoœci œrednie ±SD, n = 10, * – ró¿nice statystycznie istotne, P£0,05).
dni podawania b-glukanu (Leiber ®BetaS)
Grupa kontrolna
100 mg
200 mg
30
400 mg
Rys. 2. Wp³yw ró¿nych dawek â-glukanu (Leiber ®BetaS) na 1 kg
paszy na aktywnoϾ lizozymu w surowicy u narybku karpia
(wartoœci œrednie ±SD, n = 10, * – ró¿nice statystycznie istotne, P£0,05).
80
podawania preparatu. Przed pobraniem krwi z ¿y³y ogonopreparatem Propiscin (IRS Olsztyn).
Badania nieswoistych humoralnych mechanizmów
obronnych obejmowa³y ocenê aktywnoœci lizozymu, mieloperoksydazy i ceruloplazminy oraz bia³ka ca³kowitego
i poziomu immunoglobulin w surowicy. Z pe³nej œwie¿ej krwi
AktywnoϾ Cp w surowicy (IU)
wej ryby by³y wprowadzane w stan znieczulenia ogólnego
przygotowywano preparaty do oznaczania mieloperoksy-
60
40
20
0
dazy w neutrofilach, a nastêpnie po odwirowaniu krwi,
14
w surowicy oznaczano aktywnoϾ lizozymu i cerulopla-
dni podawania b-glukanu (Leiber ®BetaS)
Grupa kontrolna
100 mg
200 mg
30
400 mg
zminy oraz ca³kowity poziom immunoglobulin (Ig). Aktywnoœæ mieloperoksydazy (MPO) oznaczano metod¹ opisan¹
przez Siwickiego i in. (1993a). AktywnoϾ lizozymu w suro-
Rys. 3. Wp³yw ró¿nych dawek â-glukanu (Leiber ®BetaS) na 1 kg
paszy na aktywnoœæ ceruloplazminy (Cp) w surowicy u narybku karpia (wartoœci œrednie ±SD, n = 10).
wicy oznaczano metob¹ turbidymetryczn¹ opisan¹ przez
64
Siwickiego i Anderson (1993b) oraz aktywnoϾ cerulopla-
*
*
*
*
*
*
tryczn¹ przy u¿yciu zestawu firmy Sigma Diagnostics Kits
(Siwicki i Anderson 1993b) oraz ca³kowity poziom Ig oznaczano metod¹ spektrofotometryczn¹ przy u¿yciu glikolu
48
-1
Poziom bia³ka ca³kowitego oznaczano metod¹ koloryme-
Bia³ko ca³kowite (g l )
zminy metod¹ spektrofotometryczn¹ (Siwicki i in. 2003).
32
16
etylenowego 10000 (Sigma) opisan¹ przez Siwickiego
i Andersona (1993b).
0
14
Uzyskane wyniki badañ poddano analizie statystycznej
okreœlaj¹c wartoœci œrednie, odchylenie standardowe (SD)
przy u¿yciu programu Statistica for Windows 7.1 (Stat-Soft,
Inc 2004) oraz istotnoœæ ró¿nic na poziomie P<0,05 przy
zastosowaniu
jednoczynnikowej
analizy
wariancji
(ANOVA).
30
dni podawania b-glukanu (Leiber ®BetaS)
Grupa kontrolna
100 mg
200 mg
400 mg
Rys. 4. Wp³yw ró¿nych dawek â-glukanu (Leiber ®BetaS) na 1 kg
paszy na poziom bia³ka ca³kowitego w surowicy u narybku
karpia (wartoœci œrednie±SD, n = 10, * – ró¿nice statystycznie
istotne, P£0,05).
wp³ywu ró¿nych dawek â-glukanu (Leiber ®Beta-S) poda-
Wyniki i dyskusja
wanego w paszy na nieswoiste humoralne mechanizmy
W ostatnich latach obserwuje siê w hodowli karpia
pojawienie siê nowych chorób wirusowych i bakteryjnych,
które powoduj¹ znacz¹ce straty ekonomiczne (Siwicki
obronne w intensywnym podchowie narybku karpia. Uzyskane wyniki badañ przedstawiono na rycinach 1-5. W 14
dniu podawania â-glukanu (Leiber ®Beta-S) w dawkach
2011, Siwicki i in. 2012). Równie¿ intensyfikacja produkcji
100, 200 i 400 mg kg-1 obserwowano statystycznie istotnie
materia³u zarybieniowego oraz zmiany ¿ywieniowe predys-
(P<0,05) wy¿sze, w porównaniu z grup¹ kontroln¹, aktyw-
ponuj¹ do wystêpowania stresu, który ma negatywny
noœci mieloperoksydazy w neutrofilach krwi (rys. 1) oraz
wp³yw na nieswoiste mechanizmy obronne i odpornoœæ
lizozymu w surowicy (rys. 2), przy braku zmian w aktywno-
przeciwzakaŸn¹. Badania w³asne mia³y na celu okreœlenie
œci ceruloplazminy (rys. 3), istotnego dla ryb bia³ka ostrej
3/2012
KOMUNIKATY RYBACKIE
15
*
*
-1
Ca³kowity poziom Ig w surowicy (g l )
15
*
*
*
*
u pstr¹ga têczowego, co jednoznacznie wskazuje, ¿e
badany â-glukan zwiêksza efektywnoœæ szczepieñ u ryb.
Podjête badania mia³y na celu poszukiwanie nowych,
10
wysoce efektywnych i ma³o toksycznych metod ochrony
zdrowia karpia, szczególnie w okresach najwiêkszego
zagro¿enia chorobami. Przewiduje siê dalsze intensywne
5
badania nad mo¿liwoœci¹ stosowania â-glukanu (Leiber
®Beta-S) nie tylko w podchowach kontrolowanych, ale rów0
14
dni podawania b-glukanu (Leiber ®BetaS)
Grupa kontrolna
100 mg
200 mg
nie¿ w chowie stawowym karpia. Wczeœniejsze badania
30
wykaza³y, ¿e patogennoœæ CyHV-3 zwi¹zana jest z indukcj¹
400 mg
immunosupresji na poziomie komórkowym i humoralnym,
Rys. 5. Wp³yw ró¿nych dawek â-glukanu (Leiber ®BetaS) na 1 kg
paszy na poziom Ig w surowicy u narybku karpia (wartoœci
œrednie ±SD, n = 10, * – ró¿nice statystycznie istotne,
P£0,05).
co przyspiesza rozwój choroby i zwiêksza straty hodowlane
fazy. Równie¿ obserwowano statystycznie istotny (P<0,05)
latorów, do których zaliczamy badany â-glukan (Leiber
wzrost poziomu bia³ka ca³kowitego (rys. 4) i ca³kowitego
®Beta-S). Badania w tym zakresie bêd¹ kontynuowane.
spowodowane masowymi œniêciami ( Siwicki i in. 2012).
Jedn¹ z metod ograniczaj¹cych straty powodowane tym
wirusem mo¿e byæ stosowanie naturalnych immunostymu-
poziomu Ig (rys. 5) we wszystkich badanych grupach
doœwiadczalnych, w porównaniu z grup¹ kontroln¹. Natomiast w 30 dniu podawania â-glukanu (Leiber ®Beta-S)
obserwowano dalszy statystycznie istotny wzrost aktywnoœci mieloperoksydazy w neutrofilach (rys. 1) oraz aktywnoœci lizozymu w surowicy (rys. 2), przy braku zmian w aktywnoœci ceruloplazminy (rys. 3), w porównaniu z grup¹ kontroln¹. Równoczeœnie obserwowano dalszy statystycznie
istotny wzrost poziomu bia³ka ca³kowitego (rys. 4) i Ig
(rys. 5) w surowicy. Analiza uzyskanych wyników wykaza³a,
¿e najwy¿szy wzrost badanych parametrów obserwowano
w grupach karpi, które otrzymywa³y dawki 200 i 400 mg na
kg paszy. Natomiast nie stwierdzono istotnych ró¿nic
w badanych parametrach miêdzy grupami ryb, które otrzymywa³y â-glukan (Leiber ®Beta-S) w dawce 200 i 400 mg
na kg paszy, co mo¿e sugerowaæ, ¿e dawka 200 mg kg-1
jest optymalna dla narybku karpia w podchowach kontrolowanych. Obserwacje kliniczne prowadzone w trakcie
doœwiadczenia wykaza³y, ¿e dwukrotnie wy¿sza dawka nie
mia³a negatywnego wp³ywu na stan kondycyjny i zdrowotny
badanych ryb oraz nie spowodowa³a statystycznie istotnych zmian w oznaczanych parametrach nieswoistej
odpornoœci humoralnej, w porównaniu z dawk¹ 200 mg na
kg paszy.
Uzyskane wyniki badañ jednoznacznie wykaza³y, ¿e
â-glukan (Leiber ®Beta-S) podawany w paszy w dawce
optymalnej 200 mg na kg paszy aktywuje nieswoiste humoralne mechanizmy obronne u narybku karpia. Badania
innych autorów wykaza³y, ¿e podawanie glukanów wyizolowanych z Saccharomyces cerevisiae w paszy wp³ywa
pozytywnie na stan kondycyjny, wzrost oraz obraz histologiczny przewodu pokarmowego i w¹troby ryb (Bricknell
i Dalmo 2005, Sakai 1999). Równie¿ Siwicki i in (2011)
wykazali, ¿e â-glukan (Leiber ®Beta-S) w dawce 100 i 200
mg na kg paszy podwy¿sza swoist¹ odpowiedŸ immunologiczn¹ po podaniu szczepionki przeciwko Yersinia ruckeri
16
Literatura
Bricknell I., Dalmo R.A. 2005 – The use of immunostimulats in fish larval aquaculture – Fish Shellfish Immunol. 19: 457-472
Brown G., Gordon S. 2003 – Fungal â-Glucans and mammalian immunity –
Immunity 19: 311-315.
Chen J., Seviour R. 2007 – Medicinal importance of fungal â-(1,3-1,6)-glucans – Mycological Research 111: 635-652.
Lull C., Wichers H.J., Savelkoul H.F.J. 2005 – Antiinflamatory and immunomodulating properties of fungal metabolites – Mediators of Inflammation 2: 63-80.
Ma³aczewska J., Wójcik R., Jung L., Siwicki A.K. 2010 – Effect of Biolex
â-HP on selected parameters of specific and non-specific humoral
and cellular immunity in rats – Bull. Vet. Inst. Pulawy 54: 75-80.
Sadula J., Kogan G., Kacurkowa M., Machova E. 1999 – Microbial 1,3-D-glucans, their preparation, physico-chemical characterization and
immunomodulatory activity – Carbohydrate Polymers 8: 247-253.
Sakai M. 1999 – Current research status of fish immunostimulants – Aquaculture 172: 63-92.
Silke C.J., Rohn S., Kroch L.W., Kurz T. 2007 – In vitro potential antioxidant
activity of -1,3-1,6-D-glucan and protein fractions from Saccharomyces cerevisiae cell walls – Agric. Food. Chem. 55: 4710-4716.
Siwicki A.K. 2011 – Important infectious diseases of common carp (Cyprinus
carpio L.) – Training Network on Protective Immune Modulation in
Warm Water Fish by Feeding Glucans, PAN Go³ysz: 11-15.
Siwicki A.K., Anderson D.P., Antychowicz J. 1993a – Nonspecific defence
mechanisms assay in fish I. Phagocytic index, adherence and phagocytic ability of neutrophils (NBT test) and myeloperoxidase activity
test – Fish Disease Diagnosis and Preventions Methods. Wyd. IRS
Olsztyn: 95-103.
Siwicki A.K., Anderson D.P. 1993b – Nonspecific defence mechanisms
assay in fish II. Potential killing activity of neutrophils and monocytes,
lysozyme activity in serum and organs and total immunoglobulin (Ig)
level in serum – Fish Disease Diagnosis and Preventions Methods.
Wyd. IRS Olsztyn: 105-111.
Siwicki A.K., Kazuñ K., Lepa A., Kazuñ B. 2011 – Influence of 1,3-1,6-D-glucan (Leiber Beta–S) in diets on the effectiveness of anti-Enteric Redmouth Disease (AquaVac ERM) vaccine in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) – Centr. Eur. J. Immunol. 36: 212-214.
Siwicki A.K., Lepa A., Terech-Majewska E., Kazuñ K., Kazuñ B., G³¹bski E.
2012 – Herpeswirus karpia –3 (CyHV-3): aktualny stan wiedzy oraz
wp³yw CyHV-3 na nieswoiste humoralne mechanizmy obronne karpia
(Cyprinus carpio L.) – Komun. Ryb. 2: 11-16.
Siwicki A.K., Morand M., Klein P. 1998 – Modulation of nonspecific defence
mechanisms and protection against diseases in fish – Acta Vet. Brno
67: 323-328.
Siwicki A.K., Zakêœ Z., Trapkowska S., Terech-Majewska E., Czerniak S.,
G³¹bski E., Kazuñ K. 2003 – Nonspecific cellular and humoral defence
mechanisms in pikeperch (Sander lucioperca) grown in a intensive
system of culture – Arch. Pol. Fish. 11: 207-212.
Siwicki A.K., Zakêœ Z., Terech-Majewska E., Kazuñ K., Lepa A., G³¹bski E.
2009 – Dietary Macrogard reduces Aeromanas hydrophila mortality in
KOMUNIKATY RYBACKIE
3/2012
tench (Tinca tinca) through the activation of cellular and humoral
defence mechanisms – Rev. Fish Biol. Fisheries DOI
10.1007/s11160-009-9133-2.
Tsipali E., Whaley S., Kalbfleisch J., Ensley H.E., Browder W., Williams D.L.
2001 – Glucans exhibit weak antioxidant activity, but stimulate
macrophage free radical activity – Free Rad. Biol .Med. 30: 393-402.
Wójcik R., Janowska E., Ma³aczewska J., Siwicki A.K. 2009 – Effect of â-1,3/
1,6-D-glucan on the phagocytic activity and oxidative metabolism of
peripheral blood granulocytes and monocytes in rats – Bull. Vet. Inst.
Pulawy 53: 241-246.
Wójcik R. 2010 – Effect of Biolex Beta-HP on phagocytic activity and oxidative metabolism of peripheral blood granulocytes and monocytes in
rats intoxicated by cyclophosphamide – Pol. J. Vet. Sciences 13:
181-188.
Yadav M., Schorey J. 2006 – The beta-glucan receptor dectin-1 functions
together with TLR2 to mediate macrophage activation by mycobacteria – Blood 108: 3168-3176.
Przyjêto do druku: 11.06.2012 r.
INFLUENCE OF ß-GLUCAN (LEIBER ®BETA-S) ON NONSPECIFIC HUMORAL DEFENSE MECHANISMS IN FINGERLING
CARP, CYPRINUS CARPIO L.
Andrzej K. Siwicki, Krzysztof Kazuñ, Barbara Kazuñ, Edward G³¹bski, Agnieszka Lepa
ABSTRACT. Nutritional support is important for optimum health in fish as it provides the building blocks of innate defense
mechanisms and thus protection against infectious diseases. In the present study, we determined the influence of ß-glucan (Leiber
®Beta-S) delivered with food on the nonspecific humoral defense mechanisms in fingerling carp. The fish weighed 15-17 g. Four
tanks in a recirculation system were stocked with 100 fish each. The water temperature was 20-22°C. The fish were fed daily with
commercial pellets containing ß-glucan (Leiber ®Beta-S) at doses of 100, 200, and 400 mg per kg of pellets. The feed was prepared
by the carp protocol used at the Inland Fisheries Institute. The control group was fed glucan-free pellets. On days 14 and 30 of the
experiment, blood was drawn from 10 fish from each group and the nonspecific humoral defense mechanism parameters were
examined. The results showed that ß-glucan (Leiber ®Beta-S) at doses of 100, 200, and 400 mg per kg of pellets increased the
myeloperoxidase activity in blood leukocytes and lysozyme activity in the serum. Total protein and immunoglobulin (Ig) levels were
also increased in the serum. The optimal stimulating effect was observed following 30 days of application at a dose of 200 mg of
ß-glucan (Leiber ®Beta-S) on kg of pellets in fingerling carp.
Keywords: carp, ß-glucan (Leiber ®Beta-S), innate humoral immunity
3/2012
KOMUNIKATY RYBACKIE
17