Dodatki funkcjonalne do żywności

Transkrypt

RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(12)
OPIS PATENTOWY
(19)
PL
206763
(13) B1
(11)
(21) Numer zgłoszenia: 368846
(22) Data zgłoszenia: 30.10.2002
(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej Polskiej
(54)
30.10.2002, PCT/IB02/004521
(87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
(51) Int.Cl.
C12N 1/20 (2006.01)
A01N 63/00 (2006.01)
A23K 3/00 (2006.01)
A23L 3/3571 (2006.01)
C12R 1/245 (2006.01)
15.05.2003,WO03/040349
Mieszanina bakterii, żywność karma lub lek, sposób wytwarzania żywności,
sposób przechowywania żywności karmy lub leku, zastosowanie mieszaniny bakterii i bakterie
(73) Uprawniony z patentu:
(30) Pierwszeństwo:
06.11.2001, EP, 01125464.6
EIDGENÖSSISCHE TECHNISCHE
HOCHSCHULE ZÜRICH, Zürich, CH
(72) Twórca(y) wynalazku:
(43) Zgłoszenie ogłoszono:
04.04.2005 BUP 07/05
SUSANNE MIESCHER SCHWENNINGER,
Zürich, CH
LEO MEILE, Zürich, CH
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
30.09.2010 WUP 09/10
(74) Pełnomocnik:
PL 206763 B1
rzecz. pat. Urszula Bartnik
2
PL 206 763 B1
Opis wynalazku
Dziedzina wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest mieszanina bakterii, żywność karma lub lek, sposób wytwarzania żywności, sposób przechowywania żywności karmy lub leku, zastosowanie mieszaniny bakterii
i bakterie.
Tło wynalazku
Rozwojowi niepożądanych mikroorganizmów w produktach żywnościowych można zapobiegać
różnymi drogami. Poza obróbką fizyczną i chemiczną szeroko stosuje się traktowanie biologiczne,
takie jak fermentację z wykorzystaniem mikroorganizmów naturalnie występujących w tej żywności
i/lub sztucznie wprowadzonych („starterowych”). Mogą one zmieniać właściwości żywności na takie,
przy których warunki wzrostu organizmów niepożądanych są mniej korzystne bądź wzrost jest całkowicie zahamowany, jak to się dzieje w przypadku wina, piwa, sera lub jogurtu (Holzapfel i wsp., 1995;
Vogel, 1936). Innym systemem indukowanego biologicznie konserwowania żywności jest suplementacja „kulturami ochronnymi” pełniącymi rolę „biokonserwantów”. Uważa się, że kultury te:
a) albo rosną i konkurencyjnie tłumią organizmy niepożądane,
b) albo rosną i wytwarzają substancje przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze (np. bakteriocyny,
kwasy organiczne, diacetyl, nieznane metabolity),
c) bądź też wchodzą w reakcję z psującymi żywność mikroorganizmami według nieznanych
mechanizmów.
Jako że kultury ochronne, będące kulturami starterowymi z reguły nie uczestniczą w specyficznych
procesach modyfikacji żywności, ich zastosowanie można również rozciągnąć na produkty nie żywnościowe.
Właściwości przeciwbakteryjne pałeczek Propionibacterium i pałeczek kwasu mlekowego sprawiają, że znajdują one zastosowanie w przemyśle jako biokonserwanty. Bio Profit (Valio Ltd., Helsinki,
Finlandia; Wiesby GmbH & Co., Niebüll, Niemcy) jest dostępną w handlu ko-kulturą Lactobacillus
rhamnosus LC705 (DSM 7061) (wcześniej Lactobacillus casei subsp. rhamnosus) i Propionibacterium
freudenreichii subsp., shermanii J3 (DSM 7067), oferowaną do kontrolowania drożdży i pleśni (Soumalainen i Mäyrä-Mäkinen, 1999). Obydwa organizmy podano razem i sugerowano, że mogą być
stosowane jako zawierająca komórki brzeczka fermentacyjna hamująca wzrost pleśni i drożdży
w żywności. Szczep Lactobacillus rhamnosus LC705 został zastrzeżony w 1993 roku w patencie europejskim EP 0 576 780 do użycia jako pojedynczy szczep albo w połączeniu z bakterią z rodzaju
Propionibacterium albo z innym szczepem bakteryjnym gatunku Lactobacillus casei. W drugim patencie (DE 19917715) opisane są ochronne kultury zawierające bakterie kwasu mlekowego, hamujące
wzrost bakterii powodujących toksyczność w temperaturach powyżej 7-8°C. Kultury te są przeznaczone do konserwowania żywności i paszy dla zwierząt (karmy) o krótkim okresie składowania w temperaturze poniżej 7-8°C. W przypadkach wzrostu temperatury składowania, kultury te mają hamować
TM
wzrost bakterii powodujących psucie. Odwrotnie, Microgard (Wesman Foods, Inc., Beaverton, Oregon, USA) jest dostępnym w handlu produktem mlecznym fermentowanym przez szczep P. freudenreichii ssp. shermanii, następnie poddanym procesowi pasteryzacji. Deklarowana jest skuteczność produktu w hamowaniu wybranych organizmów powodujących psucie żywności oraz mikroorganizmów
patogennych, o których wiadomo, że wywołują choroby pochodzenia pokarmowego (Daeschel, 1989;
Al-Zoreky i wsp., 1991). MicrogardTM jest dopuszczony do obrotu przez amerykańską agencję Food
and Drug Administration.
Ujawnienie wynalazku
Generalnym celem wynalazku jest dostarczenie ulepszonego, opartego na bakterii, inhibitora
hamującego wzrost grzybów (drożdży, pleśni) i/lub bakterii oraz ich mieszanin.
Przedmiotem wynalazku jest zatem mieszanina bakterii, charakteryzująca się tym, że mieszanina ta jest kulturą nie starterową, wolną od metabolitów i zawierającą co najmniej jedną bakterię
wybraną z gatunku Propionibacterium jensenii i co najmniej jedną bakterię wybraną z rodzaju Lactobacillus.
Tą mieszaninę bakterii będąca kulturą nie starterową według wynalazku wytwarza się sposobem obejmującym następujące etapy:
- wprowadzenia mieszaniny bakterii zawierającej co najmniej jedną bakterię wybraną z gatunku
Propionibacterium jensenii i co najmniej jedną bakterię wybraną z rodzaju Lactobacillus, która to
mieszanina jest wolna od metabolitów, do pożywki albo na powierzchnię pożywki zawartej w pierw-
PL 206 763 B1
3
szym pojemniku w takiej ilości, aby uzyskać stężenie co najmniej 1 x 108 cfu/ml albo 1 x 108 cfu/g albo
1 x 107 cfu/cm2 każdej powyższej pierwszej i drugiej bakterii;
- wprowadzenia czynników skażających do pożywki i/lub na powierzchnię pożywki zawartej
w pierwszym pojemniku;
- wprowadzenia do pożywki i/lub naniesienie na powierzchnię pożywki zawartej w drugim pojemniku tych samych czynników skażających jakie wprowadzono do i/lub naniesiono na powierzchnię
pożywki w pierwszym pojemniku, która to pożywka jest identyczna z pożywką zawartą w pierwszym
pojemniku lecz nie zawiera mieszaniny bakterii;
- oznaczenia hamowania powyższych czynników skażających przez tę mieszaninę bakterii
przez przechowywanie pierwszego i drugiego pojemnika w odpowiedniej temperaturze w odpowiednim czasie przechowywania i porównania ilości i/lub stężenia czynników skażających w pożywce i/lub
na powierzchni pożywki zawartej w pierwszym i w drugim pojemniku, przy czym powyższa mieszanina
hamująca działa w ten sposób, że ilość i/lub stężenie czynników skażających w pożywce i/lub na powierzchni pożywki zawartej w drugim pojemniku jest wyższe od ilości i/lub stężenia w pożywce i/lub na
powierzchni pożywki zawartej w pierwszym pojemniku po przynajmniej części tego okresu przechowywania, przy czym wspomnianą mieszaninę bakterii uznaje się za posiadającą właściwości hamujące, jeśli ilość czynników skażających w pożywce i/lub na powierzchni pożywki zawartej w drugim pojemniku jest o co najmniej log 1 wyższa, korzystnie o co najmniej około log 2 wyższa, bardziej korzystnie o co najmniej około log 3 wyższa, jeszcze korzystniej o co najmniej około log 4 wyższa,
a nawet jeszcze korzystniej o co najmniej około log 5 wyższa, najkorzystniej o co najmniej około log 6
wyższa, od ilości czynników skażających na powierzchni pożywki zawartej w pierwszym pojemniku po
okresie co najmniej 3 dni, korzystnie okresie co najmniej 7 dni, bardziej korzystnie w okresie co najmniej 14 dni, jeszcze korzystniej okresie co najmniej 21 dni a najkorzystniej po okresie 25 dni. W tak
otrzymywanej mieszaninie bakterii według wynalazku, korzystną pożywkę przy wytwarzaniu stanowi
żywność bądź karma lub pożywka agarowa. Natomiast odpowiednią temperaturą jest temperatura
około 6-25°C, korzystnie, odpowiednią temperaturą jest temperatura wybrana co najmniej z grupy
około 6°C, około 12°C, około 25°C a odpowiednim czasem przechowywania jest czas 7-28 dni, korzystnie czas przechowywania jest wybrany przynajmniej z grupy 7 dni, 14 dni, 21 dni, 28 dni.
W mieszaninie bakterii według wynalazku wytwarzanej powyżej opisanym sposobem wspomnianymi czynnikami skażającymi są grzyby lub bakterie albo ich mieszaniny.
Korzystna proporcja bakterii w mieszaninie według wynalazku pomiędzy wspomnianymi bakteriami wynosi od 1:100 do 100:1, korzystnie od 1:10 do 10:1.
W korzystnym wykonaniu wynalazku mieszanina bakterii charakteryzuje się tym, że bakteria
z rodzaju Lactobacillus wybrana jest z grupy obejmującej Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum lub ich mieszanin, jeszcze bardziej korzystnie
bakteria ta jest wybrana spośród jednego lub kilku szczepów Lactobacillus paracasei subsp. paracasei.
W mieszaninie bakterii według wynalazku bakteria z rodzaju Lactobacillus jest korzystnie wybrana z grupy obejmującej Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20, Lactobacillus paracasei
subsp. paracasei SM29, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM63 i ich mieszaniny, a wspomniana bakteria Propionibacterium jensenii korzystnie stanowi Propionibacterium jensenii SM11.
Przedmiotem wynalazku jest również żywność, karma lub lek, charakteryzująca się tym, że
wspomniana żywność, karma lub lek zawiera mieszaninę bakterii jak zdefiniowane powyżej.
W korzystnej realizacji wynalazku żywność jest wybrana z grupy obejmującej produkty mleczne,
korzystnie zakwaszone produkty mleczne i/lub produkty mięsne.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania żywności, karmy lub leku, zwłaszcza
żywności zdefiniowanej w powyżej, polegający na tym, że zawiera etapy:
- dodania mieszaniny bakterii zdefiniowanej powyżej podczas wytwarzania żywności, karmy lub
leku w takiej ilości, aby stężenie co najmniej jednej bakterii Propionibacterium jensenii i co najmniej
jednej bakterii z rodzaju Lactobacillus w tej żywności, karmie lub leku osiągnęło dla każdej bakterii
przynajmniej 1 x 108 cfu/ml albo dla każdej bakterii przynajmniej 1 x 108 cfu/g żywności, karmy lub
leku albo dla każdej bakterii przynajmniej 1 x 107 cfu/cm2 powierzchni żywności, karmy lub leku;
- kontrolowania parametrów wytwarzania podczas procesu wytwarzania, tak, aby stężenie mieszaniny bakterii pozostawało na stałym poziomie.
Korzystnie stężenie bakterii Propionibacterium jensenii w tej żywności, karmie lub leku wynosi
przynajmniej 1 x 109 cfu/ml albo przynajmniej 1 x 109 cfu/g żywności, karmy lub leku albo przynajmniej
1 x 108 cfu/cm2 powierzchni żywności, karmy lub leku a stężenie bakterii z rodzaju Lactobacillus wy-
4
PL 206 763 B1
nosi przynajmniej 1 x 108 cfu/ml żywności, karmy lub leku albo przynajmniej 1 x 108 cfu/g żywności,
karmy lub leku albo przynajmniej 1 x 107 cfu/cm2 powierzchni żywności, karmy lub leku lub vice versa.
W korzystnej odmianie wynalazku sposób obejmuje jedną lub większą ilość etapów fermentacji
i polega na tym, że mieszaninę bakterii dodaje się przed tym jednym lub większą ilością etapów fermentacji i/lub pomiędzy większą ilością etapów fermentacji i/lub po jednym lub większej ilości etapów
fermentacji.
Przedmiotem wynalazku jest też sposób przechowywania żywności, karmy lub leku zdefiniowanych powyżej albo żywności, karmy lub leku zdefiniowanych powyżej, polegający na tym, że zawiera
etap kontrolowania parametrów przechowywania podczas okresu przechowywania, tak aby stężenie
bakterii pozostawało na stałym poziomie.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie mieszaniny bakterii zdefiniowanej powyżej do
hamowania rozwoju mikroorganizmów, wybranych z grupy obejmującej grzyby, bakterie i ich mieszaniny, które to grzyby i bakterie są chorobotwórcze i/lub powodują psucie, zwłaszcza żywności, karmy
lub leków.
Kolejnym przedmiotem wynalazku są bakterie wybrane z grupy obejmującej D3M14513 (Propionibacterium jensenii SM11), DSM14514 (Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20),
DSM14515 (Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM29), DSM14516 (Lactobacillus paracasei
subsp. paracasei SM63) lub ich mieszaniny.
Nieoczekiwanie okazało się, że bakterie wybrane z gatunku Propionibacterium jensenii i/lub rodzaju Lactobacillus, będące kulturami nie-starterowymi i wolnymi od metabolitów są dogodnymi inhibitorami niepożądanych mikroorganizmów. Szczególnie mieszanina bakterii (nazywana mieszaniną
hamiującą albo kulturą ochronną), będąca kulturą nie starterową, wolną od metabolitów i zawierającą
co najmniej jedną bakterię wybraną z gatunku Propionibacterium jensenii i co najmniej jedną bakterię
wybraną z rodzaju Lactobacillus, ma zdolność hamowania co najmniej jednego mikroorganizmu wybranego spośród grzybów i/lub bakterii a także mieszanin grzybów i bakterii, które między innymi są
odpowiedzialne za psucie się żywności i karmy.
Ta mieszanina bakterii posiada wielką zaletę, że jakkolwiek nie występują w niej metabolity
uważane za czynniki odpowiedzialne za aktywność ochronną - ochrona jest równie dobra a nawet
lepsza niż w dotychczas znanych kulturach a niepożądane efekty uboczne związane z obecnością
metabolitów (np. metabolity mogą być toksyczne lub również wpływać ujemnie na smak, barwę i inne
cechy żywności) są znacznie zmniejszone bądź całkowicie wyeliminowane.
Taką mieszaninę bakterii wprowadza się do i/lub nanosi się na powierzchnię żywności poddawanej zabezpieczeniu.
Termin „metabolity” obejmuje wszystkie produkty pochodzące z metabolizmu bakteryjnego zawarte w mieszaninie.
W niniejszym zgłoszeniu, bakterie i grzyby mogące powodować psucie się żywności, karmy lub
leków są również nazywane „mikroorganizmami niepożądanymi”.
Termin „mieszanina bakterii wolna od metabolitów” oznacza, że tylko mieszaninę bakterii (np.
oddzieloną od metabolitów przynajmniej przez odwirowanie, korzystnie przez odwirowanie i przynajmniej jednoetapowe odmywanie), ewentualnie razem z nośnikiem, wprowadza się do i/lub nanosi na
powierzchnię produktu (żywności, karmy, leku) przeznaczonego do zabezpieczenia przed psuciem.
Poza tym, w niniejszym zgłoszeniu patentowym terminy „być hamowanym”, „hamować” i podobne oznaczają przykładowo, że wzrost ale również ilość lub stężenie niepożądanych mikroorganizmów, np. w żywności i/lub na powierzchni żywności zawierającej tę mieszaninę jest niższa niż
w żywności i/lub na powierzchni żywności, która nie zawiera tej mieszaniny.
Termin „mieszanina będąca kulturą nie-starterową” oznacza mieszaninę zawierającą bakterie,
które nie są lub nie są zasadniczo dostosowane do produktu - szczególnie żywności, karmy, leków,
przeznaczonych do zabezpieczenia przez tę mieszaninę, a zatem nie wykazują one wzrostu lub wykazujące jedynie minimalny wzrost. Minimalny wzrost oznacza wzrost najwyżej około 10-krotny.
Korzystną mieszaniną jest mieszanina bakterii opisana powyżej, dająca się uzyskać sposobem
złożonym, z następujących etapów:
Na początku, mieszaninę hamującą, zawierającą co najmniej jedną bakterię Propionibacterium.
jensenii i co najmniej jedną bakterię z rodzaju Lactobacillus, która to mieszanina jest wolna od metabolitów, wprowadza się do pożywki i/lub nanosi się na powierzchnię pożywki zawartej w pierwszym
pojemniku, w takiej ilości, aby uzyskać w tej pożywce i/lub na powierzchni tej pożywki, minimalne stężenie (szczegółowo zdefiniowane poniżej), każdej z wspomnianych bakterii.
PL 206 763 B1
5
Pożywką zawartą w pierwszym i w drugimi pojemniku (drugi pojemnik jest opisany poniżej),
w której to pożywce lub na powierzchni której to pożywki testuje się czynniki skażające, jest korzystnie
żywność lub karma bądź lek albo najkorzystniej zestalona pożywka agarowa.
Bakterie wybiera się z gatunku Propionibacterium jensenii i z rodzaju Lactobacillus.
Jako ślepą próbę przygotowuje się drugi pojemnik zawierający tę samą pożywkę, jaka znajduje
się w pierwszym pojemniku ale nie zawierającą mieszaniny bakterii.
Następnie do pożywek zawartych w pierwszym i w drugim pojemniku wprowadza się lub nanosi
się na ich powierzchnię taką samą ilość czynników skażających.
Termin „czynniki skażające” ma takie samo znaczenie jak termin „niepożądane mikroorganizmy”
i obejmuje grzyby i/lub bakterie a także mieszaniny grzybów i bakterii.
Hamujące działanie mieszaniny wobec czynników skażających oznacza się przez przechowywanie w odpowiednim czasie pierwszego i drugiego pojemnika w odpowiedniej temperaturze.
Zasadniczo, odpowiednia temperatura, w której prowadzi się postępowanie tym sposobem zależy od temperatury, w której określony produkt, zwłaszcza żywność, karma lub lek jest normalnie
przechowywany i/lub produkowany.
Temperaturą, w której zazwyczaj utrzymuje się pierwszy i drugi pojemnik jest temperatura od
5 do 26°C, korzystnie tą temperaturą jest temperatura wybrana co najmniej z grupy obejmującej około
6°C i/lub około 12°C i/lub około 25°C.
Termin „około” oznacza 6 ± 1°C, 12 ± 1°C, 25 ± 1°C.
Czas przechowywania w tej temperaturze zależy od czasu, w którym jest normalnie przechowywany dany produkt (żywność, karma lub lek).
Czas przechowywania wynosi zwykle 7-28 dni, korzystnie czas przechowywania jest wybrany
przynajmniej z grupy 7 dni i/lub 14 dni i/lub 21 dni i/lub 28 dni.
Podczas takiego okresu przechowywania w określonej temperaturze porównuje się ilość lub
stężenie czynników skażających wprowadzonych do pożywki i/lub naniesionych na powierzchnię pożywki zawartej w pierwszym i w drugim pojemniku.
W oparciu o takie porównanie (ilość/stężenie czynników skażających w pierwszymi pojemniku
w określonym czasie względem ilości/stężenia czynników skażających w drugim pojemniku w określonym czasie), można wykreślić pierwszy i drugi wykres w układzie współrzędnych, gdzie np. oś X
oznacza czas przechowywania a oś Y oznacza ilość i/lub stężenie czynników skażających. Pierwszy
wykres przedstawia ilość lub stężenie czynników skażających wprowadzonych do pożywki i/lub naniesionych na powierzchnię pożywki w pierwszym pojemniku a drugi wykres przedstawia ten sam pomiar
w pożywce i/lub na powierzchni pożywki zawartej w drugimi pojemniku.
Jeśli badaniom poddaje się tylko pojedyncze szczepy lub mieszaninę szczepów w obrębie tego
samego gatunku lub rodzaju, można odpowiednio zastosować powyższy sposób.
Uznaje się, że mieszanina ma właściwości hamujące jeśli w etapach czasu przechowywania,
krzywa na drugim wykresie przewyższa krzywą z pierwszego wykresu.
Korzystnie, uznaje się, że mieszanina ma właściwości hamujące jeśli ilość czynników skażających w pożywce i/lub na powierzchni pożywki zawartej w drugim pojemniku jest o co najmniej log 1
wyższa, korzystnie o co najmniej około log 2 wyższa, bardziej korzystnie o co najmniej około log 3
wyższa, jeszcze korzystniej o co najmniej około log 4 wyższa, a nawet jeszcze korzystniej o co najmniej około log 5 wyższa, najkorzystniej o co najmniej około log 6 wyższa, od ilości czynników skażających w pożywce i/lub na powierzchni pożywki zawartej w pierwszym pojemniku w czasie co najmniej
3 dni, korzystnie w czasie co najmniej 7 dni, bardziej korzystnie w czasie co najmniej 14 dni, jeszcze
korzystniej w czasie co najmniej 21 dni a najkorzystniej w czasie 25 dni.
W korzystnym rozwiązaniu wynalazku, co najmniej jedną bakterią Propionibacterium jensenii
jest Propionibacterium jensenii SM11.
W innym korzystnym rozwiązaniu wynalazku, co najmniej jedna wspomniana powyżej bakteria
z rodzaju Lactobacillus jest wybrana z grupy obejmującej Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum i ich mieszaniny.
W kolejnym, bardziej korzystnymi rozwiązaniu, co najmniej jedna bakteria z rodzaju Lactobillus
jest wybrana z jednego lub większej ilości szczepów Lactobacillus paracasei podgatunek paracasei.
W jeszcze bardziej korzystnym rozwiązaniu wynalazku, tą wspomnianą co najmniej jedną bakterią jest Lactobacillus paracasei podgatunek paracasei SM20 i/lub Lactobacillus paracasei podgatunek SM29 i/lub Lactobacillus paracasei podgatunek paraicasei SM63 i ich mieszaniny.
6
PL 206 763 B1
Proporcja pomiędzy co najmniej jedną bakterią Propionibacterium jensenii i co najmniej jedną
bakterią z rodzaju Lactobacillus w tej mieszaninie - czyli wzajemny stosunek stężenia lub ilości tych
bakterii - wynosi korzystnie od 1:100 do 100:1, korzystnie od 1:10 do 10:1.
Opisane powyżej mieszaniny mają tę zaletę, że można nimi hamować rozwój mikroorganizmów
wybranych z grupy obejmującej grzyby, bakterie i mieszaniny grzybów i bakterii, które są lub mogą
być chorobotwórcze dla ludzi i/lub dla zwierząt i/lub które powodują lub mogą powodować psucie np.
żywności, karmy i leków.
Przykładowo, w przypadku żywności, można ograniczyć lub całkowicie wyeliminować sposoby
konserwowania takie jak procesy chemiczne (stosowanie środków konserwujących żywność, wysalanie) i/lub procesy fizyczne (np. działanie ciepłem, promieniowaniem UV, promieniami gamma, promieniami X), pakowanie z użyciem, gazów ochronnych (np. N2, CO2) lub pakowanie próżniowe, bez skracania czasu przechowywania/czasu składowania żywności.
W konsekwencji zwłaszcza, żywność o nikim stopniu przetworzenia lub substancje dodatkowe
o niskim stopniu przetworzenia dodawane do wysoko-przetworzonej żywności mogą być przechowywane przez dłuższe okresy czasu bez rozkładu biologicznego a także, mogą być lepiej eksportowane
do innych krajów.
O ile to potrzebne, mieszaninę można również stosować w połączeniu z wymienionymi powyżej
sposobami konserwowania.
Podstawowym warunkiem zastosowania takich sposobów konserwowania w połączeniu z tą
mieszaniną jest aby mieszanina zachowała właściwości ochronne.
Przykładowo, oznacza to, że po zastosowaniu wspomnianego sposobu konserwowania, w zabezpieczanym produkcie powinny w dalszym ciągu być obecne przynajmniej podane poniżej stężenia
żywych komórek (cfu = jednostka tworząca kolonie).
Minimalne stężenie bakterii w żywności jako stężenie zabezpieczające powinno wynosić przy7
8
najmniej około 1 x 10 cfu/ml, korzystnie przynajmniej około 1 x 10 cfu/ml, bardziej korzystnie przy9
7
najmniej około 1 x 10 cfu/ml albo przynajmniej około 1 x 10 cfu/g, korzystnie przynajmniej około 1 x
108 cfu/g, bardziej korzystnie przynajmniej około 1 x 109 cfu/g, i/lub na powierzchni żywności powinno
wynosić przynajmniej około 1 x 106 cfu/cm2, korzystnie przynajmniej około 1 x 107 cfu/cm2, bardziej
korzystnie przynajmniej około 1 x 108 cfu/cm2 a jeszcze korzystniej przynajmniej około 1 x 109 cfu/cm2.
Jeśli pożądana jest wyższa aktywność przeciw czynnikom skażającym, możliwe są stężenia
osiągające przynajmniej około 1 x 1010 cfu/ml albo przynajmniej około 1 x 1010 cfu/g i/lub przynajmniej
około 1 x 1010 cfu/cm2.
Wymienione powyżej wartości stężeń minimalnych pochodzą z obserwacji eksperymentalnych
wykazujących, że im wyższe stężenie lub ilość kultury ochronnej tym silniejsze jest hamowanie wzrostu grzybów i/lub bakterii oraz ich mieszanin.
Chociaż obserwuje się już pewien poziom zabezpieczenia jeśli bakterie w mieszaninie według
wynalazku występują w ilościach 1 x 107 cfu/ml albo cfu/g to ochrona jest znacznie lepsza jeśli co
najmniej jedna bakteria Propionibacterium jensenii i co najmniej jedna bakteria z rodzaju Lactobacillus, połączone ze sobą w mieszaninę bakterii stanowią około przynajmniej 5 x 107 cfu/ml albo przynajmniej około 5 x 107 cfu/g i/lub przynajmniej 5 x 106 cfu/cm2 dla co najmniej jednej bakterii Propionibacterium jensenii i przynajmniej około 1 x 108 cfu/ml albo przynajmniej około 1 x 108 cfu/g i/lub przynajmniej około 1 x 107 cfu/cm2 dla co najmniej jednej bakterii z rodzaju Lactobacillus. Wysoce zadawalające wyniki uzyskano przy stężeniach przynajmniej około 1 x 108 cpfu/ml albo przynajmniej około
1 x 108 cfu/g i/lub przynajmniej około 1 x 107 cfu/cm2 dla co najmniej jednej bakterii Propionibacterium
jensenii i przynajmniej około 1 x 108 cfu/ml albo przynajmniej około 1 x 108 cfu/g i/lub przynajmniej
około 1 x 107 cfu/cm2 dla co najmniej jednej bakterii z rodzaju Lactobacillus. W realizacji wynalazku
korzystne są stężenia przynajmniej około 5 x 108 cfu/ml albo przynajmniej około 5 x 108 cfu/g
i/lub przynajmniej około 5 x 107 cfu/cm2 dla co najmniej jednej bakterii Propionibacterium jensenii
i przynajmniej około 5 x 108 cfu/ml albo przynajmniej około 5 x 108 cfu/g i/lub przynajmniej około 5 x
107 cfu/cm2 dla co najmniej jednej bakterii z rodzaju Lactobacillus.
Wymienione powyżej minimalne stężenia i stężenia korzystne stosują się również do leków
i karmy.
Oznaczenie stężenia powierzchniowego można przeprowadzić dwiema metodami:
(i) przez pomiar naniesionej ilości, np. naniesionej przez opryskanie albo korzystnie,
(ii) przez pomiar stężenia określonej objętości o dobrze zdefiniowanej powierzchni naniesienia
i stanowiącej całkowitą strefę dyfuzji tej mieszaniny bakterii.
PL 206 763 B1
7
Termin „co najmniej jedna bakteria Propionibacterium jensenii w stężeniu 1 x 107 cfu/ml” oznacza, że ta bakteria i ewentualnie jedna lub większa ilość innych bakterii różniących się od siebie ale
należących do rodzaju Propionibacterium jensenii występują jednocześnie, przy czym wszystkie te
bakterie łącznie dają stężenie 1 x 107 cfu/ml.
Zdefiniowane powyżej minimalne stężenia powinny być stosowane w dowolnym etapie po zakończeniu procesu wytwarzania żywności, karmy lub leku.
W każdym przypadku, stężenie mieszaniny musi być wyższe od albo przynajmniej takie samo
jak stężenie minimalne przed rozpoczęciem okresu przechowywania.
Korzystnie, żywność, karma lub leki zawierają takie stężenie mieszaniny bakterii, przy którym
stężenie bakterii i/lub grzybów lub mieszaniny bakterii i grzybów utrzymuje się na poziomie niższym od
wymagań określonych w przepisach dotyczących żywności w danym kraju, gdzie stosowany jest wynalazek.
Korzystnie ale nie koniecznie, te minimalne stężenia stosują się również do procesu produkcji.
Jeśli stężenie bakterii tej mieszaniny w produkcie i/lub na powierzchni produktu zabezpieczanego spada poniżej stężenia minimalnego podczas prowadzenia procesu produkcji z powodu np. zastosowania procesów konserwowania, które zmniejszają ilość żywych komórek (wysoka temperatura,
promieniowanie UV i podobne) albo w rezultacie zmian stężenia podczas wytwarzania (np. przez dodanie dalszych składników i podobnych) wówczas komórki można dodać podczas prowadzenia procesu produkcji. W sposobach wytwarzania zawierających etap długotrwały ważne jest, aby minimalne
stężenie było utrzymane już podczas tego etapu, takiego jak np. dojrzewanie kiełbasek.
Jeśli podczas przechowywania zmniejsza się stężenie żywych komórek, tak, że już nie jest
utrzymane wymagane minimalne stężenie, wówczas, o ile to możliwe należy dodać dodatkowe żywe
komórki.
W zasadzie, stężenie mieszaniny bakterii w żywności, karmie i w lekach może być wyższe od
stężeń minimalnych podanych powyżej. Jednakże stężenia należy dobrać tak, aby ta żywność, karma
lub lek nie uległy niepożądanemu pogorszeniu. Przykładowo, oznacza to, że mieszanina nie wpłynie
na własności organoleptyczne lub inne cechy jakościowe żywności (np. odbarwienie lub podobne).
Poza opisanymi powyżej mieszaninami, wynalazek dostarcza również sposobu wytwarzania np.
karmy, leków i korzystnie żywności zawierającej takie mieszaniny.
Ten sposób wytwarzania uniemożliwia wzrost niepożądanych mikroorganizmów,
W dalszej części opisu, sposób ten jest opisany w odniesieniu do żywności, nie wyklucza to
jednak zastosowania podanych wyjaśnień do wytwarzania innych produktów, np. karmy i leków.
Sposób ten zawiera następujące etapy:
Na początku, mieszaninę dodaje się podczas wytwarzania żywności w takiej ilości, aby stężenie
co najmniej jednej bakterii Propionibacterium jensenii i co najmniej jednej bakterii z rodzaju Lactobacillus w tej żywności osiągnęło dla każdej bakterii przynajmniej stężenie minimalne wyrażone w jednost2
kach cfu/ml albo cfu/g i/lub przynajmniej stężenie minimalne wyrażone w jednostkach cfu/cm na powierzchni tej żywności.
Generalnie, mieszaninę należy dodać na etapie procesu wytwarzania albo przed przechowywaniem w taki sposób, aby była ona równomiernie rozprowadzona w produkcie i/lub na powierzchni
produktu poddawanego zabezpieczeniu.
Mieszaninę korzystnie stosuje się na etapie przed znaczącym skażeniem niepożądanym mikroorganizmami.
W drugim etapie wytwarzania, czyli po dodaniu mieszaniny, należy kontrolować jeden lub kilka
parametrów sposobu wytwarzania, między innymi to, czy stężenie mieszaniny spada czy korzystnie
pozostaje na stałym poziomie. O ile spadek stężenia można „wyrównać” w sposób opisany powyżej,
to znaczącego wzrostu należy unikać.
Do powyższych parametrów należą przykładowo temperatura, ciśnienie jak również dodatkowe
składniki żywności i podobne.
Termin „na stałym poziomie” oznacza, że po dodaniu mieszaniny do produktu, np. żywności,
karmy lub leku, jej stężenie pozostaje stałe. Tę mieszaninę dodaje się korzystnie w takiej ilości aby
uzyskać przynajmniej stężenie minimalne, zdefiniowane w opisie. Pod terminem „na stałym poziomie”
należy również rozumieć wzrost ilości lub stężenia bakterii tej mieszaniny w wyniku wzrostu tych bakterii co najwyżej 10-krotnie.
W przypadku, gdy sposób wytwarzania zawiera jeden lub kilka etapów fermentacji, mieszanina,
o ile jest dodawana przed fermentacją, nie powinna mieć ujemnego wpływu na mikroorganizmy (np.
8
PL 206 763 B1
bakterie, pleśnie, drożdże lub ich mieszaniny) odpowiedzialne za tę jedną lub kilka fermentacji (nie
powinna obniżać aktywności fermentacyjnej).
Jeśli mieszanina wywiera taki negatywny wpływ na te mikroorganizmy, dodaje się ją po jednym
lub po kilku krytycznych etapach fermentacji albo po zakończeniu procesu produkcji.
Również w sposobach wytwarzania zawierających etapy, w których może zaznaczać się wpływ
tej mieszaniny bakterii, bakterie te dodaje się po tym jednym, lub po tych kilku etapach.
Poza tym, wynalazek dostarcza sposobu przechowywania produktów, zwłaszcza karmy, leków
i korzystnie żywności, w którym to sposobie hamuje się wzrost niepożądanych mikroorganizmów podczas przechowywania.
Ten sposób przechowywania może być zastosowany do przechowywania np. żywności, karmy
lub leków wytwarzanych sposobem według wynalazku albo znanymi sposobami produkcji.
Tylko podczas sposobu wytwarzania według wynalazku, kontroluje się parametr lub parametry
procesu wytwarzania, tak, aby stężenie tej mieszaniny pozostawało na stałym poziomie.
Jeśli stosuje się inne, np. powszechnie przyjęte sposoby produkcji, wówczas kontrola ta nie jest
prowadzona lub jest prowadzona jedynie częściowo. Dlatego w takim. sposobie produkcji, mieszaninę
należy dodać w takim etapie, po którym stężenie jej pozostanie stałe.
Sposób przechowywania zawiera etap kontrolowania parametru lub parametrów przechowywania w czasie przechowywania, tak, aby stężenie co najmniej jednej bakterii Propionibacterium jensenii
i co najmniej jednej bakterii z rodzaju Lactobacillus pozostawało stałe.
Możliwymi parametrami przechowywania są przykładowo temperatura, atmosfera przechowywania wokół produktu, atmosfera przechowywania w opakowaniu produktu i podobne.
Termin „przechowywanie” oznacza czas po zakończeniu produkcji produktu, np. żywności, karmy lub leku, a więc termin ten może przykładowo obejmować również transport.
Mieszanina bakterii według wynalazku korzystnie jest zawarta w i/lub naniesiona na powierzchnię żywności, karmy lub leków.
Taką żywność stanowią korzystnie produkty mleczne, bardziej korzystnie zakwaszone produkty
mleczne.
Poza tym, korzystne są również mięso i produkty mięsne.
Do produktów mlecznych należą przykładowo mleko nieprzerobione, mleko traktowane ciepłymi
albo mleko poddane mikrofiltracji, masło, mleko zsiadłe, kwaśna śmietana, mleko odtłuszczone, śmietanka, jogurt, maślanka, twaróg, ser, kefir, kumys, budynie, kwaśne mleko, mleko zakwaszone bakterią acidophilus, langfil (mleko ciągnące się), mleko zakwaszone bakteriami bifidus, twaróg z serwatką,
masło z kwaśnej śmietany.
Mięsem jest przykładowo porcjowana świeża wołowina, mięso drobiowe lub mięso siekane.
Do produktów mięsnych należą korzystnie gotowe do spożycia kiełbasy, karma dla zwierząt
domowych, mięso traktowane azotynami i azotanami (surowe mięso peklowane), gotowane mięso
solone, surowe kiełbaski i podobne.
Mieszaniną można zabezpieczać takie produkty jak np. sałatki delikatesowe sporządzone
z mięsa, ryb, mięczaków, skorupiaków, warzyw, pasty i ich mieszaniny a także ryby, produkty rybne,
mięczaki, skorupiaki, owoce, produkty owocowe, orzechy, produkty z orzechów oraz warzywa takie jak
ziemniaki, produkty warzywne, kukurydzę, produkty z kukurydzy.
Zakresem, wynalazku objęte są też możliwe kombinacje żywności wymienionej powyżej, zawierające mieszaninę według wynalazku.
Karmę korzystnie stanowią produkty na bazie orzechów, kukurydzy i trawy.
Lekami, które mogą być zabezpieczane mieszaniną są leki naturalne i organiczne.
Zgodnie z wynalazkiem, żywność, karmę lub leki traktuje się proszkiem, zawierającym mieszaninę, który to proszek zawiera ewentualnie odpowiednie substancje nośnikowe. Odpowiednimi substancjami nośnikowymi są przykładowo sacharydy, korzystnie monosacharydy, disacharydy i ich pochodne.
Zgodnie z dalszym korzystnym rozwiązaniem według wynalazku, żywność, karmę lub leki traktuje się ciekłym medium zawierającym tę mieszaninę. To ciekłe medium musi być tak zaprojektowane,
aby gwarantowało przeżywalność mieszaniny. Może to być przykładowo medium wodne, takie jak
ciekły produkt mleczny albo fizjologiczny roztwór chlorku sodu.
Zgodnie z korzystnym rozwiązaniem według wynalazku, mieszaninę wprowadza się do żywności, karmy lub leku przez mieszanie, opryskanie lub w podobny sposób, przy czym przez opryskanie
PL 206 763 B1
9
lub inny odpowiedni typ aplikacji, taki jak zanurzenie, mieszaninę nanosi się na powierzchnię żywności, karmy lub leku.
W przypadku produktów mleczarskich, mieszanina jest korzystnie zawarta w cieczy, przy czym
ciecz tę dodaje się do produktu przeznaczonego do zabezpieczenia. Mieszaninę można również dodać w postaci głęboko zamrożonego lub liofilizowanego koncentratu.
Mieszanina według wynalazku, którą korzystnie wprowadza się do i/lub nanosi na powierzchnię
żywności, karmy lub leku, korzystniej do i/lub na powierzchnię produktów wymienionych powyżej,
umożliwia zwłaszcza hamowanie wzrostu bakterii takich jak Listeria innocua, Listeria monocytogenes,
Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Serratia liquefaciens, Citrobacter
freundii, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus anthracis i mieszanin tych bakterii, niższych organizmów eukariotycznych, takich
jak algi i mieszaniny niższych organizmów eukariotycznych, grzybów, takich jak Candida magnoliae,
Candida parapsilosis, Candida silvicola, Candida valida, Candida pulcherrima, Candida reukaufii,
Candida krusei, Candida sp., Sporobolomyces salmonicolor, Zygosaccharomyces bailii, Penicillium
sp., mieszanin tych grzybów a także mieszanin bakterii i grzybów wymienionych powyżej oraz mieszanin wymienionych powyżej bakterii, grzybów i niższych organizmów eukariotycznych.
Wynalazek nie ogranicza się tylko do bakterii, grzybów, żywności, karmy i leków wymienionych
z nazwy w niniejszym zgłoszeniu.
Krótki opis rysunków
Wynalazek jest zilustrowany załączonymi rysunkami, na których:
Fig. 1 przedstawia kompozycję 82 izolatów na agarze MRS, pochodzących z surowego mleka,
sera, jogurtu, czarnych oliwek, salami oraz z kiszonek kukurydzy i paszowych, wykazujących aktywność przeciw grzybom w teście punktowym na agarze i identyfikowanych metodą API 50 CHL a jako
Lactobacillus paracasei podgatunek paracasei, na podstawie analizy genu 16S rRNA.
Fig. 2 przedstawia 2% żel agarozowy z amplifikacją produktu o długości 290 par zasad uzyskanego przy użyciu oligonukleotydów swoistych dla grupy casei w połączeniu z primerem Y2 (tabela 2).
(A) Lactobacillus paracasei podgatunek paracasei SM20; (B) Lactobacillus paracasei podgatunek
paraqasei SM29; (C) Lactobacillus paracasei podgatunek paracasei SM63; (D) Lactobacillus casei
T
T
DSM 20011 ; (E) Lactobacillus paracasei podgatunek paracasei DSM 5522 i (F) Lactobacillus rhaT
mosus DSM 20021 ; 1, 4, 7, 10, 13, 16, casei/Y2; 2, 5, 8, 11, 14, 17, para/Y2; 3, 6, 9, 12, 15, 18,
rham/Y2; 19 - kontrola negatywna; kb - drabina liniowych DNA uszeregowanych według ilości par
zasad; pUc - marker pUC19-DNA/MspI (Hpall).
Fig. 3 przedstawia poziomy drożdży (Candida pulcherrima 1-50/13) w pięciu różnych partiach
m.odelu żywnościowego z dodatkiem różnych kultur ochronnych, przechowywanych w temperaturze
6°C. (υ) 4.9 x 108 cfu/g Propionibacterium jensenii SM11 i 1,2 x 108 cfu/g Lactobacillus paracasei podgatunek paracasei SM20; (σ) 3,2 x 108 cfu/g Propionibacterium jensenii SM11 i 1,1 x 108 cfu/g Lactobacillus paracasei podgatunek paracasei SM29; (ν) 4,1 x 108 cfu/g Propionibacterium jensenii SM11
i 9,1 x 107 cfu/g Lactobacillus paracasei podgatunek paracasei SM63; (□) 2,7 x 108 cfu/g Propionibacterium jensenii SM11 i 2,1 x 108 cfu/g Lactobacillus plantarum SM17; (◊) 2,7 x 108 cfu/g Propionibacterium jensenii SM11 i 9,3 x 107 cfu/g Lactobacillus plantarum SM39; (λ) brak kultury ochronnej. Ilości
drożdży są wartościami średnimi z dwóch prób.
Fig. 4 przedstawia poziomy drożdży (Candida pulcherrima 1-50/13, Candida magnoliae 1-35/1,
Candida parapsilosis 4-5/1 i Zygosaccharomyces bailii 1-48/1) w siedmiu różnych partiach jogurtu
z różnymi kulturami ochronnymi, przechowywanych w temperaturze 6°C. (◊) 1,5 x 107 cfu/g Propionibacterium jensenii SM11 i 4,3 x 107 cfu/g Lactobacillus paracasei podgatunek paracasei asei SM20;
(υ) 5,5 x 107 cfu/g Propionibacterium jensenii SM11 i 1,7 x 108 cfu/g Lactobacillus paracasei podgatunek paracasei SM20; (□) 2,0 x 107 cfu/g Propionibacterium jensenii SM11 i 3,8 x 107 cfu/g Lactobacillus paracasei podgatunek paracasei SM29; (ν) 2,8 x 108 cfu/g Propionibacterium jensenii SM11 i 1,7 x
108 cfu/g Lactobacillus paracasei podgatunek paracasei SM29; (Δ) 1,6 x 107 cfu/g Propionibacterium
jensenii SM11 i 1,7 x 107 cfu/g Lactobacillus paracasei podgatunek paracasei SM63; (σ) 8,1 x 107
cfu/g Propionibacterium jensenii SM11 i 1,6 x 108 cfu/g Lactobacillus paracasei podgatunek paracasei
SM63; (λ) brak kultury ochronnej. Ilości drożdży są wartościami średnimi z dwóch prób.
Sposoby prowadzenia wynalazku
Przykłady
Materiały i metody
Szczepy bakteryjne i pożywki
10
PL 206 763 B1
Szczepy bakteryjne i grzyby użyte w niniejszym, badaniu są podane w tabeli:
T a b e l a 1. Szczepy bakteryjne użyte w badaniu
Szczep
Istotne cechy
charakterystyczne
Źródło
Warunki hodowli
Temp. (°C)
Pożywka
2
3
4
5
Propionobacterium
jensenii SM11
Aktywność
przeciwbakteryjna
32
NLB
LMEa
Lactobacillus casei
T
DSM 200011
Szczep
typowy
30
MRS
DSMb
SM20
Aktywność
przeciwbakteryjna
32
MRS
To badanie
SM29
Aktywność
przeciwbakteryjna
32
MRS
To badanie
SM63
Aktywność
przeciwbakteryjna
32
MRS
To badanie
Szczep typowy
30
MRS
DSM
SM17
Aktywność
przeciwbakteryjna
32
MRS
To badanie
SM39
Aktywność
przeciwbakteryjna
32
MRS
To badanie
Szczep typowy
37
MRS
DSM
Szczep typowy
30
BHI
DSM
30
BHI
LME
37
BHI
LME
37
BHI
LME
37
BHI
LME
1
Pałeczki
Propionibacterium
i pałeczki mlekowe
Lactobacillus
paracasei
Subsp. paracasei
DSM 5622T
Lactobacillus
plantarum
Lactobacillus
rhamnosus
DSM 20021T
Inne szczepy
Bacillus cereus
DSM 31T
Bacillus subtilis
168
Enterococcus
faecalis
DS5
Staphylococcus
aureus
VF4
Listeria innocua
L17
11
PL 206 763 B1
cd. tabeli 1
1
2
3
4
5
37
BHI
LME
30
BHI
LME
30
BHI
LME
B
37
BHI
LME
SG63
37
BHI
LME
30
BHI
LME
37
BHI
ATCCc
30
BHI
LME
25
YM
Miescher (1999)
25
YM
Miescher (1999)
25
YM
Miescher (1999)
25
YM
Miescher (1999)
25
YM
Miescher (1999)
25
YM
Miescher (1999)
25
YM
Miescher (1999)
25
YM
Miescher (1999)
25
YM
Miescher (1999)
Listeria
monocytogenes
M1
Citrobacter freundii
SG84
Enterobacter
cloacae
SG95
Escherichia coli
Klebsiella
pneumoniae
SG89
Salmonella
typhimurium
ATCC 14028
Serratia
liquefaciens
SG64
Candida sp.
1-50/15
Candida kruse
3-69/2
Candida magnoliae
1-35/1
Candida
parapsilosis
4-5/1
Candida
pulcherrima
1-50/13
Candida reukaufii
4-73/4
Candida silvicola
4-42/1
Candida valida
1-48/8
Sporobolomyces
salmonicolor
3-46/2
12
PL 206 763 B1
cd. tabeli 1
1
2
3
4
5
25
YM
Miescher (1999)
2-21/7
25
YM
Miescher (1999)
2-21/12
25
YM
Miescher (1999)
2-52/2
25
YM
Miescher (1999)
3-58/3
25
YM
Miescher (1999)
Zygosaccharomyces
bailii
1-48/1
Penicillium sp.
a
- Laboratorium Mikrobiologii Żywności, Zurich, Szwajcaria
- Niemiecka Kolekcja Mikroorganizmów i Hodowli Komórkowych, Brunschweig, Niemcy
c
- Muzeum American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA
T
- szczep typowy
b
Wzrost szczepów Propionibacterium prowadzono na pożywce NLB, która zawierała 1% bulionu
sojowego z tryptykazą bez glukozy (BBL Microbiology Systems, Cookeysville, MD, USA), 1% wyciągu
drożdżowego i 1% syropu mleczanu sodu (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), zgodnie z przepisem podanym przez Grinstead'a i Barefoot'a (1992). Pałeczki mlekowe namnażano w pożywce MRS
z dodatkiem 0,1% Tween'u 80 (Biolife, Włochy). Wzrost wszystkich innych szczepów prowadzono
w pożywce BHI (Biolife, Włochy) w warunkach podanych w tabeli 1. Kultury bakteryjne utrzymywano
jako zamrożone kultury podstawowe w temperaturze -80°C, w pożywce zawierającej 30% glicerolu.
Drożdże i pleśnie hodowano w pożywce YM (Difco, MI, USA) i utrzymywano w temperaturze 4°C na
pożywce zestalonej agarem.
Handlowe szczepy wyjściowe do fermentacji jogurtu uzyskano z Danisco Cultor Niebüll GmbH,
Niemcy. Zawierały one różne szczepy Lactobacillus bulgaricus i Streptococcus thermophilus.
Kultury ochronne wyprodukowano przez prowadzenie wzrostu szczepów oddzielnie, w czasie
72 godzin w temperaturze 32°C we wzbogaconym płynie uzyskanym przez filtrację serwatki przez
błony półprzepuszczalne (SWP1), który to płyn zawierał 5,5% filtratu z serwatki (Emmi, Szwajcaria),
1% wyciągu drożdżowego (Becton Dickinson, MD, USA) i 2% hydrolizatu kazeiny (Merck, Niemcy).
Komórki zbierano przez odwirowanie, przemywano raz lub dwa razy w 0,85% roztworze NaCl i zawieszano w tyndalizowanym odtłuszczonym mleku (Difco, Detroit, MI, USA) albo w 0,35% NaCl
w stosownym stężeniu, w granicach od 10- do 100-krotnego. Tyndalizowane odtłuszczone mleko
poddawano uprzednio działaniu wysokiej temperatury trzy razy w 90°C przez 30 minut przez 3 kolejne dni.
Powiększenia skali i optymalizacji procesu dokonano prowadząc wzrost komórek osobno
w bioreaktorze 8-1 albo 19-1 M (typ L1523; Bioengineering, Szwajcaria), w temperaturze 32°C, przy
szybkości mieszania 250 obrotów/minutę, stosując 2% inoculum. Fermentację prowadzono we
wzbogaconym, filtracie serwatki (SWP2) zawierającym. 5,5% filtratu serwatki, 1% wyciągu drożdżowego i 2% glukozy. Utrzymywano wartość pH 6,0 dodając 3M roztwór NaOH. Jednocześnie
z kontrolą pH dodawano składniki odżywcze, 20% wyciąg drożdżowy i 20% roztwór glukozy. Inokulum hodowano we wzbogaconym filtracie serwatki (SWP1) w temperaturze 32°C przez 72 godziny,
bez mieszania. Z partii fermentacyjnych okresowo pobierano próbki i analizowano je pod względem
stężenia komórek i gęstości optycznej przy 650 nm. Szczepy pałeczek mlekowych hodowano przez
72 godziny, pałeczki Propionibacterium przez 90 godzin. Komórki zbierano, przemywano i zatężano
w sposób opisany powyżej.
Izolacja bakterii kwasu mlekowego
Próbki po 10 g żywności trawiono przez 2 minuty w 90 ml buforu do rozcieńczania (0,85%
NaCl, 0,1% peptonu), wykonano rozcieńczenia seryjne i posiano na płytki z agarem MRS z dodatkiem 0,1% Tween'u 80. Próbki mleka bezpośrednio rozcieńczano i posiano na płytki. Płytki inkubowano w warunkach anaerobowych w temperaturze 37°C, przez 3 dni. Z każdej próbki żywności
pobrano wiele różnych kolonii do prób przesiewowych na aktywność przeciw-drobnoustrojową.
Metody przesiewowe na aktywność przeciw-drobnoustrojową
13
PL 206 763 B1
Stosowano dwie metody:
(1) Test punktowy na agarze: Kulturę bakteryjną zaszczepiano punktowo na płytce agarowej
metodą Grinstead'a i Barefoot’a (1992) i inkubowano w optymalnych warunkach wzrostu (tabela 1).
Na każdą płytkę wylewano po 6 ml hartowanego półmiękkiego agaru (0,6%) zawierającego 0,2 ml
kultury indykatorowej, której wzrost prowadzono uprzednio do gęstości 0,2. Gęstość optyczną bakterii
oznaczano przy 650 nm a gęstość optyczną drożdży i pleśni przy 530 nm. Pożywkę agarową, półmiękką pożywkę agarową i warunki inkubacji płytek dobierano stosownie do wymagań organizmów
testowanych i indykatorowych. Hamowanie pasma organizmu indykatorowego monitorowano po 24 do
48 godzin dla bakterii, hamowanie grzybów oznaczano codziennie, po 3 dniach utrzymywania w temperaturze 25°C.
(2) Test dyfuzji w studzienkach agarowych: Z płytek agarowych wycinano studzienki o średnicy
7 mm i wypełniano je wolnymi od komórek supernantami kultur bakteryjnych w sposób opisany przez
Daechel'a (1992). Po zakończeniu dyfundowania cieczy, na płytki nalewano półmiękki agar zawierający organizm indykatorowy w celu oznaczenia aktywności hamującej, jak opisano powyżej. Pożywkę
agarową, półmiękką pożywkę agarową i warunki inkubacji płytek dobierano stosownie do wymagań
organizmów testowanych i indykatorowych.
Charakteryzacja i identyfikacja izolatów bakteryjnych
Izolaty rosnące na agarze MRS, wykazujące aktywność przeciw-drobnoustrojową barwiono
metodą Grama i badano mikroskopowo, określając morfologię komórek. Poza tym, badano je na
aktywność katalazy przez nakraplanie na kolonie 30% nadtlenku wodoru i barwienie zarodników.
Wstępnej identyfikacji szczepów dokonywano stosując test API 50 CHL (BioMerieux, S.A., Marcy
l'Etoile, Francja). Dodatkowo oznaczano proteolizę w agarze MRS, stosując 5% i 10% odtłuszczone mleko i enzymatycznie oznaczano produkcję kwasów organicznych (Boehringer Mannheim,
Niemcy; zestaw do oznaczania kwasu D/L-mlekowego; E1 112 821/zestaw do oznaczania kwasu
octowego: E0 148 261). Ponadto oznaczano warunki wzrostu w pożywce MRS w różnych temperaturach w czasie 72 godzin i przy zawartości soli 5% i 10% temperaturze 32°C przez 72 godziny.
Identyfikacja wybranych szczepów przez sekwencjonowanie 16S rDNA
Amplifikację 16S rDNA przeprowadzono stosując bezpośrednio kolonię odpowiedniego szczepu. Przeprowadzono reakcję PCR z uniwersalnymi oligonukleotydami bak4 (Goldenberger, 1997)
i bak11w (Greisen i wsp., 1994 z modyfikacją Dasen'a i wsp., 1998). Wykonano 40 cykli. Zgrzewanie
prowadzono w temperaturze 56°C przez 30 sekund a wydłużanie z użyciem. Taq DNA polimerazy
(Amersham Pharmacia Biotech, Upsala, Szwecja) w temperaturze 72°C przez 2 minuty. Rozdzielenie
nici DNA prowadzono w 95°C przez 5 sekund. DNA po amplifikacji oczyszczano z użyciem GFX™
PCR DNA i zestawu Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Upsala, Szwecja). Automatyczne cykliczne sekwencjonowanie prowadzono w zestawie analitycznym. Terminator Ready
Reaction Mix (Amersham pharmacia Biotech, Upsala, Szwecja) wobec oligonukleotydów celowanych
na 16S rDNA (tabela 2).
T a b e l a 2. Oligonukleotydy celowane na 16S rDNA
Nazwa
1
Sekwencja
Komentarz
2
Odnośnik
3
4
a
Y2
5’-TGGCTCAGAACGAACGCTAGGCCCG-3’
Konserwatywna 16S rDNA
Young i wsp. (1991)
casei
5’-TGCACTGAGATTCGACTTAA-3’
16S rDNA
z Lactobacillus casei
Ward
i Timmins (1999)
para
5’-CACCGAGATTCAACATGG-3’
16S rDNA z Lactobacillus
paracasei subsp. paracasei
Ward
i Timmins (1999)
rham
5’-TGCATCTTGATTTAATTTTG-3’
16S rDNA
z Lactobacillus rhamnosus
Ward
i Timmins (1999)
bak4
5’-AGGAGGTGATCCARCCGCA-3’
Greisen
i wsp. (1994)
bak11w
5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’
Goldenberger (1997)
14
cd. tabeli 2
1
PL 206 763 B1
2
3
4
eub338
5’-ACTCCTACGGGAGGCAGG-3’
Amann i wsp. (1995)
uni515
5’-ACCGCGGCTGCTGGCAC-3’
Lane (1991)
uni785
5’-GGMTTAGATACCCTGGTAFTCC-3’
Amann i wsp. (1995)
uni1088
5’-CGRRAAGTCCCGCAACGAGC-3’
Amann i wsp. (1995)
uni1392
5’-GTACACACCGCCCGTCA-3’
Lane (1991)
a
- odpowiada konserwatywnemu regionowi większości znanych bakteryjnych sekwencji 16S rDNA
Trzydzieści pięć cykli wykonane w następujących warunkach: temperatura 96°C przez 10 sekund, 50°C przez 30 sekund, 60°C przez 4 minuty. Sekwencjonowanie nukleotydów obydwu nici
z klonowanego DNA prowadzono metodą zakańczania dideoksy-łańcucha (Sanger i wsp., 1977) z
„wędrowaniem primerem” (primer walking) w zestawie BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready
Reaction Kit, wykonując analizy w analizatorze ABI PRISM ABI 310 Genetic Analyser (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Analizę sekwencji DNA, przyrównywanie sekwencji i poszukiwanie sekwencji w bazie danych prowadzono wykorzystując oprogramowanie zawarte w pakiecie Sequence
Analysis Software Package (wersja 10.0) uzyskane w ramiach licencji z Genetic Computer Group
z Uniwersytetu Wisconsin, Madison, WI, USA).
Do porównywania sekwencji z sekwencjami występującymi w bazie danych GenEMBL użyto algorytm Pearsona i Lipmana (1988) ((TastA and TfastA).
Różnicowanie Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei i Lactobacillus rhamnosus w łańcuchowej reakcji polimerazy
Amplifikację 16S rDNA przeprowadzono w sposób opisany przez Warda i Timminsa (1999)
z pewnymi modyfikacjami. Amplifikowano fragment 16S rDNA o długości 290 par zasad, stosując
primery swoiste dla gatunku (casei, para, rham) w połączeniu z primerem Y2 odpowiadającym regionowi konserwatywnemu, 16S rDNA (tabela 2). Każda m.ieszanina reakcyjna w objętości 50 μl zawierała 2,5 jednostki Taq polimerazy, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0), 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, po 1 mM zestawia dNTP, po 1 μM każdego primera i jedną kolonię odpowiedniego szczepu. Polimerazę Tag,
bufory i zestaw dNTP do reakcji PCR uzyskano z Amersham Pharmacia Biotech (Upsala, Szwecja).
Oligonukleotydy zsyntetyzowano w firmie Microsynth (Balgach, Szwajcaria). Ustawiono program, temperatury według Young'a i wsp. (1991): 300 s w 93°C 35 cykli po (45 s w 93°C, 45 s w 62°C i 120 s
w 72°C), następnie 300 s w 72°C i końcowe schłodzenie do 4°C. Produkty amplifikacji rozdzielano
w 2% żelu agarozowym.
Badanie aktywności przeciw-drobnoustrojowej na płytkach agarowych
Przygotowano płytki agarowe z dodatkiem Propionibacterium jensenii SM11 lub przeciwdrobnoustrojowego Lactobacillus albo obydwu bakterii. Kultury uprzednio hodowano oddzielnie przez
72 godziny w temperaturze 32°C we wzbogaconym filtracie z serwatki (SWP1), wirowano, przemyto
raz i zawieszono (1:1) w 0,85% NaCl po czym sporządzono rozcieńczenia seryjne w buforze do rozcieńczania (0,85% NaCl, 0,1% peptonu). Przygotowano porcje po 20 ml agaru z dodatkiem 10% każ5
6
7
8
dego rozcieńczenia, uzyskując końcowy poziom 10 , 10 , 10 i 10 cfu/ml. Agar rozlano na płytki i po
zestaleniu płytki szczepiono punktowo porcjami po około 2-5 μl hodowli bulionowych szczepów indykatorowych. Do drożdży i pleśni użyto agar YM a do bakterii użyto agar BHI. Po trzy jednakowe płytki
agarowe utrzymywano w temperaturze 6°C, 12°C i 25°C w czasie do 4 tygodni, kontrolując wzrost
organizmów indykatorowych raz na tydzień na płytkach utrzymywanych w temperaturze 6°C albo codziennie na płytkach utrzymywanych w 12°C i 25°C. Jako kontrolę nastawiono płytki agarowe bez
dodatku pałeczek mlekowych i pałeczek Propionibacterium oraz płytki agarowe z dodatkiem 1 g/litr
Ka-Sorbatu (EU-Richtlinie, nr. 95/2/EG).
Badanie aktywności przeciw grzybom na modelu żywnościowym
Ustawiono model żywnościowy na porcjach po 50 g tyndalizowanego, odtłuszczonego mleka
(Difco, Detroit, MI, USA) poddanego fermentacji z użyciem handlowej kultury jogurtowej. Badane
próbki dodatkowo szczepiono kulturą ochronną (1% 100-krotnie zatężonej kultury Propionibacterium
jensenii SM11 i 1% 100-krotnie zatężonej kultury przeciwgrzybowego Lactobacillus), otrzymując po8
ziom 10 komórek/g każdej bakterii. Kultury uprzednio dwukrotnie przemyto i zawieszono w tyndalizo-
PL 206 763 B1
15
wanym odtłuszczonym mleku. Dla uzyskania porównywalnych wyników, próbkę kontrolną mieszano
z 2% tyndalizowanego, odtłuszczonego mleka. Prowadzono fermentację przez około 5 godzin w temperaturze 42°C do czasu osiągnięcia pH 4,6. Wszystkie próbki zakażano szczepem Candida pulcherrima 1-50/13 dodanym w ilości odpowiadającej końcowemu poziomowi 102 cfu/g. Dodatkowo ustawiono próbkę kontrolną bez skażenia drożdżami. Próbki utrzymywano w temperaturze 6°C przez 7 tygodni, zliczając ilość ochronnych pałeczek Propionibacterium, pałeczek mlekowych i drożdży co tydzień.
Jednocześnie, co tydzień oznaczano wartość pH.
Hamowanie wzrostu grzybów w jogurcie przez kultury ochronne
Ilości po 200 g mleka z dodatkiem 5% śmietanki (35% tłuszczu, 2,5% białka), 2% odtłuszczonego mleka w proszku i 5% cukru utrzymywano w temperaturze 90°C przez 10 minut i następnie prowadzono fermentację handlową kulturą jogurtową. Badane próbki dodatkowo zaszczepiano kulturą
ochronną (0,1% albo 1% 100-krotnie zatężonej kultury Propionibacterium jensenii SM11 i 0,1% albo
1% 100-krotnie zatężonej kultury przeciw-grzybowego szczepu Lactobacillus) uzyskując poziom każ7
8
dej bakterii 10 albo 10 cfu/g. Kultury ochronne uprzednio dwa razy przemyto i zawieszono w tyndalizowanym odtłuszczonym mleku. Prowadzono fermentację przez około 5 godzin w temperaturze 42°C
do czasu osiągnięcia pH 4,6. Jogurt skażono mieszaniną Candida pulcherrima 1-50/13, Candida magnoliae 1-35/1, Candida parapsilosis 3-5/1 i Zygosaccharomyces bailii 1-48/1 do końcowego poziomu
102 cfu/g. Dodatkowo przygotowano próbkę kontrolną bez skażenia drożdżami. Jogurt utrzymywano
w temperaturze 6°C przez 4 tygodnie, ilość drożdży oznaczano raz w tygodniu. Jednocześnie, co tydzień oznaczano wartość pH. W dniu 1 i po 3 tygodniach przechowywania oznaczano ilość ochronnych pałeczek Propionibacterium i pałeczek mlekowych oraz po 3 tygodniach oznaczano mleczany
i octany enzymatycznie (Boehringer Mannheim, Niemcy; zestaw używany do oznaczania kwasu D/L-mlekowego: E1 112 321 / zestaw użyty do oznaczania kwasu octowego: E0 143 261).
Powiększenie skali w zastosowaniu kultury ochronnej w jogurcie
Próby powiększenia skali badań jogurtu zawierającego kultury ochronne przeprowadzono
w sposób opisany powyżej. Hamowanie rozwoju drożdży na powierzchni sera przez kultury ochronne
Przygotowano jednakowe sześciany (2,5 x 4,8 x 8 cm) po 100 g twardego sera (Gruyère).
W celu uniknięcia skażenia mikroorganizmami powierzchni sera, uprzednio ścięto z sera skórkę
o grubości 3-5 mm. Jedną partię sera namoczono z każdej strony sześcianu w kulturze zabezpieczającej (5 ml 20-krotnie zatężonej kultury Propionibacterium jensenii SM11 i 5 ml 20-krotnie zatężonej
kultury przeciw-grzybowego szczepu Lactobacillus, uzyskując poziom każdej z tych bakterii na po8
wierzchni sera równy 10 cfu/g powierzchni sera. Kultury ochronne uprzednio dwa razy przemyto
i zawieszono w 0,85% roztworze NaCl. Przygotowano dwie inne partie sera z 10-krotnym i 100-krotnym rozcieńczeniem kultur ochronnych. Na powierzchnię sześcianów we wszystkich trzech partiach
naniesiono po około 3 ml odpowiednich zatężonych kultur. Następnie sery skażono ilościami po 1 ml
(104 cfu/ml) mieszaniny Candida pulcherrima 1-50/13, Candida magnoliae 1-35/1, Candida parapsilosis 3-5/1 i Zygosaccharomyces bailii 1-48/1 do końcowego poziomu 102 cfu/g powierzchni sera. Powierzchnię sera zdefiniowano jako warstwę o grubości około 3 mm od zewnątrz sześcianu. Przygotowano próbkę kontrolną bez dodatku drożdży. Sery szczelnie pakowano w sterylne worki plastikowe
i przechowywano przez 3 tygodnie w temperaturze 6°C. W pierwszymi dniu i po 3 tygodniach przechowywania oznaczano poziom ochronnych pałeczek Propionibacterium i pałeczek mlekowych oraz
ilość drożdży. Hamowanie wzrostu Listeria przez kulturę ochronną na modelu żywności.
W celu przetestowania aktywności przeciw-bakteryjnej kultury ochronnej przeciw Listeria ustawiono dwa modele na żywności.
(1) Hamowanie Listeria innocua L17 i Listeria monocytogenes
M1 przez kulturę ochronną w śmietanie
Ilość 200 g pasteryzowanej półtłustej śmietanki (25% tłuszczu, 2,5% białka) zaszczepiono odpowiednio bakterią Listeria innocua L17 lub Listeria monocytogenes M1 do końcowego poziomu
3
10 cfu/g i podzielono na dwie porcje po 100 g w sterylnych kolbach. Jedną próbkę zaszczepiono kulturą ochronną (5% 20-krotnie zatężonej kultury Propionibacterium jensenii SM11 i 5% 20-krotnie zatężonej kultury Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20), uzyskując poziom każdej bakterii
108 cfu/g. Kultury ochronne uprzednio dwa razy przemyto i zawieszono w tyndalizowanym odtłuszczonym mleku. Dla uzyskania porównywalnych stężeń, do próbki kontrolnej dodano 10% tyndalizowanego odtłuszczonego mleka. Wszystkie próbki utrzymywano w temperaturze 6°C przez 4 tygodnie. Wartość pH i wzrost Listeria kontrolowano raz na tydzień a poziom kultury ochronnej oznaczano po 1 dniu
i po 4 tygodniach. Przygotowano drugą partię w powyższy sposób i utrzymywano ją w temperaturze
16
PL 206 763 B1
25°C przez 3 tygodnie. W tej partii podobnie, oznaczano ilość kultur ochronnych i Listeria na początku
i pod koniec okresu przechowywania.
(2) Hamowanie Listeria innocua L17 przez kultury ochronne w siekanym mięsie
Porcje po 100 g siekanego mięsa mieszano z kulturą ochronną (5% 20-krotnie zatężonej kultury
Propionibacterium jensenii SM11 i 5% 20-krotnie zatężonej kultury przeciwdrobnoustrojowego szczepu Lactobacillus), uzyskując poziom, każdej bakterii 108 cfu/g. Kultury ochronne uprzednio dwa razy
przemyto i zawieszono w 0,85% roztworze NaCl. Mięso skażono bakterią Listeria innocua L17 do
końcowego poziomu 103 cfu/g i następnie utrzymywano w temperaturze 6°C przez 8 tygodni. Dodatkowo przygotowano próbkę kontrolną nie zawierającą kultury ochronnej. Dla uzyskania porównywalnych stężeń, do tej próbki dodano 10% 0,85% NaCl. Ilość ochronnych pałeczek Propionibacterium
i pałeczek mlekowych oraz Listeria innocua L17 oznaczano raz na tydzień, wartość pH oznaczano na
końcu okresu przechowywania.
Wyniki
Aktywność Lactobacillus sp. przeciw grzybom
Przeprowadzono wstępne przesiewowe badania na aktywność przeciw drobnoustrojom na agarze MRS 1424 izolatów pochodzących z surowego mleka, sera, jogurtu, czarnych oliwek, zakwasu,
salami oraz kukurydzy i paszy kiszonej. Ogółem 82 szczepy wykazały aktywność w próbie punktowej
na agarze przeciw grzybom wymienionym, w tabeli 1. Te izolaty charakteryzowano następnie poprzez
barwienie metodą Grama, na aktywność katalazy, mikroskopowo i pod względem tworzenia zarodników. Jak przedstawiono na fig. 1, gatunki należące do grupy Lactobacillus casei wykazały głównie
aktywność przeciw grzybom z udziałem 24%. Po wstępnej identyfikacji metodą API 50 CHL sklasyfikowano te izolaty jako Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei i Lactobacillus
rhamnosus. Poza tym, wysoką aktywność hamowania testowanych grzybów wykazały gatunki Lactobacillus plantarum. Ogółem 6% przeciw-grzybowych izolatów okazało się być ziarniakami a 18% pozostało nie zidentyfikowanych przy użyciu prób fermentacji.
Identyfikacja i charakteryzacja trzech pałeczek mlekowych o wysokiej aktywności przeciw
grzybom
Trzy izolaty o wysokiej aktywności przeciw grzybom identyfikowano dalej stosując analizę sekwencji 16S rDNA. Na podstawie badania metabolizmu węglowodanów zidentyfikowano je poprzednio
jako Lactobacillus paracasei subsp. paracasei (SM20 i SM29) oraz Lactobacillus curvatus (SM63).
Analiza sekwencji 16S rDNA tych szczepów ujawniła gatunek Lactobacillus paracasei subsp. paracasei dla szczepu SM20 ze 100 procentową identycznością w 1519 nukleotydach nakładających się na
częściową sekwencję 16S rDMA Lactobacillus paracasei JCM8130 (D79212) i na częściową sekwencję 16S rDNA Lactobacillus casei D36517). W szczepie SM20 zidentyfikowano ogółem 1520 nukleotydów z 16S rDNA. 1528 nukleotydów sekwencjonowanych ze szczepu SM29 wykazało 99,9 procentową identyczność w 1520 nukleotydach nakładających się na częściową sekwencję 16S rRNA genu
Lactobacillus casei (D86517) i na częściową sekwencję 16S rDNA Lactobacillus paracasei JCM8130
(D79212). Nieoczekiwanie, 1515 nukleotydów zidentyfikowanych w genie 16S rRNA szczepu 3M63
wykazało również 99,9 procentową identyczność z 1493 nukleotydami pokrywającymi się z 16S rRNA
genu Lactobacillus casei (D86517) i z częściową sekwencją 16S rDNA Lactobacillus paracasei
JCM3130 (D79212).
Ponieważ przedstawiciele grupy casei stanowią bardzo homologiczną grupę pod względem kryteriów fenotypowych i danych dotyczących sekwencji genu 16S rRNA, Ward i Timmins (1999) opracowali proste podejście łańcuchowej reakcji polimerazy w celu zróżnicowania gatunków Lactobacillus
casei, Lactobacillus paracasei i Lactobacillus rhamnosus w oparciu o reklasyfikację dokonaną przez
Collinsa i wsp. (1939). Na fig. 2 jest przedstawiony specyficzny produkt o długości 290 bp dla szczepów SM20, SM29 i 3M63 zamplifikowany w łańcuchowej reakcji polimerazy z użyciem primera specyficznego dla Lactobacillus paracasei w połączeniu z primerem Y2. Oba te primery osiągają gen 16S
T
rRMA. Szczepy typowe Laotobacilius casei (DSM 20011 ) i Lactobacillus paracasei subsp. paracasei
T
(DSM 5622 ) również wykazały pasmo o długości 290 bp z odpowiednimi primerami. Nieoczekiwanie,
Lactobacillus rhamnosus (DSM 20021T) nie dawał specyficznego pasma po reakcji PCR z użyciem Y2
i rham. Poza tym, nie zaobserwowano żadnych produktów jeśli tę parę primerów Y2/rham użyto ze
szczepami poddawanymi identyfikacji. Tak więc, izolaty SM20, SM29 i SM63 zidentyfikowano jako
Lactobacillus paracasei subsp. paracasei. W tabeli 3 podano podsumowanie identyfikacji tych trzech
izolatów oraz ich charakterystykę.
PL 206 763 B1
17
18
PL 206 763 B1
a
- oznaczono metodą API 50 CHL
- oznaczono enzymatycznie (Boehringer Mannheim, Niemcy; zestaw użyty do oznaczania kwasu D/L-mlekowego:
E1 112 821 / zestaw użyty do oznaczania kwasu octowego: E0 148 261)
c
- analiza sekwencji 16S rDNA
b
19
PL 206 763 B1
d
- podejście w reakcji PCR zmodyfikowane według Warda i Timminsa (1999)
- długie pałeczki w łańcuchach w kulturach z bioreaktora
f
- Miescher (1999)
g
- dobry wzrost przy zawartości soli 5% i dość wzrost przy 10% NaCl
h
- dobry wzrost przy zawartości 5% NaCl i bardzo słaby wzrost przy 10% NaCl
i
- dobry wzrost przy zawartości soli 5% i słaby wzrost przy 10% NaCl
k
- dość dobry wzrost przy zawartości soli 5% i bardzo słaby wzrost przy 10% NaCl
l
- podkreślone gatunki wskazują na końcową identyfikację odpowiedniego szczepu
e
Collins i wsp. (1939) opisali inny podgatunek Lactobacillus paracasei, a mianowicie, Lactobacillus paracasei, subsp. tolerans. Biorąc pod uwagę produkcję kwasu obserwowaną przez Collinsa
i wsp. (1989), izolaty SM20, SM29 i SM63 należą do podgatunku paracasei.
Wydzielanie substancji hamujących do pożywki bulionowej
Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei
SM29, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM63, Lactobacillus plantarum SM17 i Lactobacillus
plantarum SM39 badano na zdolność wydzielania substancji hamujących do pożywki bulionowej. Tak
więc, wzrost szczepów prowadzono albo w bulionie MRS albo w pożywce SWP1. Nie wykryto aktywności
antagonistycznej w wolnych od komórek supernatantach w teście dyfuzyjnym w studzienkach. Nawet po
etapie zatężania przez ultrafiltrację (odcięcie masy cząsteczkowej 3000 Da) nie wykazało żadnej wykrywalnej aktywności (nie podano danych).
Aktywność przeciw grzybom na płytkach agarowych
Ogółem 18 bakterii pałeczek kwasu mlekowego testowano na aktywność przeciw grzybom, pojedynczo albo w kombinacji z Propionibacterium jensenii SM11 o wysokiej aktywności przeciw grzy5
8
bom. Po etapie odwirowania i przemycia, szczepy wprowadzano w stężeniach od 10 do 10 cfu/ml na
płytki z agarem YM, do którego nanoszono punktowo grzyby wymienione w tabeli 1 w odpowiednich
stężeniach od 105 do 107 cfu/ml. Płytki przechowywano w różnych partiach w temperaturze 6°C, 12°C
i 25°C. Wzrost drożdży kontrolowano odpowiednio raz na tydzień albo codziennie. Chociaż pałeczki
mlekowe a także szczep Propionibacterium mają słabą aktywność hamowania jeśli stosuje się je pojedynczo: (nie podano danych) to ich kombinacja wykazuje wysokie wartości aktywności antagonistycznej w temperaturze 6°C. Najwyższe aktywności wykryto dla następujących pałeczek mlekowych
w kombinacji z Propionibacterium jensenii SM11: Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20,
Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM29, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM63.
Słabą aktywność obserwowano przy połączeniu Lactobacillus plantarum SM17 i Lactobacillus plantarum SM39 ze szczepem SM22. Do uzyskania wysokiej aktywności hamującej była potrzebna ilość
8
8
komórek 10 cfu/ml szczepu Lactobacillus i 10 cfu/ml szczepu Propionibacterium. W tabeli 4 podano
pięć przykładów aktywności przeciw grzybom, obserwowanej w temperaturze 6°C dla stężenia
108 cfu/ml (107 cfu/ml dla Lactobacillus plantarum SM17) przeciw drożdżom, zaszczepionym punktowo
z gęstością 106 cfu/ml i przeciw zaszczepionym punktowo 3-dniowym kulturom pleśni.
T a b e l a 4. Aktywność przeciw grzybom wybranych kultur ochronnych wprowadzonych na płytki agarowe, po
przechowywaniu przez 21 dni w temperaturze 6°C albo przez 7 dni w temperaturze 12°C
Kultury ochronneb
Organizmy
a
indykatorowe
SM20/
/SM11
c
(pH 3,83)
SM29/
/SM11
(pH 3,98)
SM63/
/SM11
(pH 3,93)
SM17/
/SM11
(pH 4,53)
SM38/
/SM11
(pH 4,59)
Kontrola
(pH 5,88)
Kasorbat
d
(1 g/litr)
1
2
3
4
5
6
7
8
Candidda
magnoliae 1-35/1
+
+/-
+
++
++
++
++
Candida
parapsilosis 4-5/1
-
-
-
-
-
(+/-)
-
-
-
-
-
-
-
-
(+/-)
(+/-)
(+/-)
++
++
++
++
Przechowywanie
w 6°C przez
21 dni
Zygosaccharomyces bailii 1-48/1
Candida
silvicola 4-42/1
20
cd. tabeli 4
1
PL 206 763 B1
2
3
4
5
6
7
8
Candida valida
1-48/8
(+/-)
(+/-)
(+/-)
++
++
+
-
Candida
pulcherrima
1-50/13
(+/-)
-
(+/-)
++
++
++
++
-
-
-
++
++
++
++
(+/-)
(+/-)
(+/-)
++
++
++
++
Sporobolomyces
salmonicolor
3-46/2
-
-
-
-
-
++
-
Candida krusei
3-69/2
-
-
-
(+/-)
(+/-)
(+/-)
-
Penicillium sp.
2-21/7
-
-
-
n.d.
n.d.
++
n.d.
Penicillium sp.
2-21/12
-
-
-
n.d.
n.d.
++
n.d.
Penicillium sp.
2-52/2
-
-
-
n.d.
n.d.
++
n.d.
Penicillium sp.
3-58/3
-
-
-
n.d.
n.d.
++
n.d.
Candidda
magnoliae 1-35/1
(+/-)
+
+
+
+
++
n.d.
Candida
parapsilosis 4-5/1
-
(+/-)
-
+/-
+/-
++
n.d.
Zygosaccharomyces bailii 1-48/1
-
(+/-)
(+/-)
(+/-)
-
+/-
n.d.
Candida
silvicola 4-42/1
(+/-)
(+/-)
(+/-)
(+/-)
(+/-)
++
n.d.
Candida valida
1-48/8
-
+
+
++
+
++
n.d.
Candida
pulcherrima
1-50/13
-
++
+
++
++
++
n.d.
Candida
reukaufii 4-73/4
-
+
-
++
++
++
n.d.
Candida sp.
1-50/15
-
++
++
++
++
++
n.d.
Sporobolomyces
salmonicolor
3-46/2
-
-
-
+
+/-
++
n.d.
Candida krusei
3-69/2
+
++
++
++
++
++
n.d.
Candida
reukaufii 4-73/4
Candida sp.
1-50/15
Przechowywanie
w 12°C przez 7 dni
8
SM20 - Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20 (10 cfu/ml)
8
8
PL 206 763 B1
21
7
SM17 - Lactobacillus plantarum SM17 (10 cfu/ml)
7
SM39 - Lactobacillus plantarum SM39 (10 cfu/ml)
8
SM11 - Propionibacterium jensenii SM11 (10 cfu/ml)
n.d. - nie oznaczano
a
6
- zaszczepienie punktowe ilością 10 cfu/ml
b
- wprowadzone na płytki agarowe
c
- pH oznaczane na płytkach agarowych po przechowywaniu przez 21 dni w temperaturze 6°C
d
- stężenie według EU-Richtlinie, nr 95/2/EG
++
- silna kolonia (~ 0% hamowania)
+
- normalna kolonia (~ 25% hamowania)
+/- słaba kolonia (~ 50% hamowania)
(+/-) - bardzo słaba kolonia (~ 75% hamowania)
- brak kolonii (~ 100% hamowania)
Jest interesujące, że jeśli użyto Ka-Sorbat to obserwowano słabszą aktywność hamującą
w temperaturze 6°C niż dla kultur przeciwdrobnoustrojowych użytych w niniejszym badaniu (szczepy
SM20, SM29 albo SM63 w kombinacji ze szczepem SM11). W tabeli 4 przedstawiono ponadto, że po
przechowywaniu przez 7 dni w temperaturze 12°C obserwowano wyraźną aktywność hamującą
szczepów Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20, SM29 i SM63 a słabą aktywność szczepów Lactobacillus plantarum SM17 i SM39 w połączeniu z Propionibacterium jensenii SM11. W temperaturze 25°C obserwowano jedynie słabe aktywności hamujące, które zanikały po kilku dniach (nie
podano szczegółowych danych). Testując aktywności przeciw grzybom dwóch albo trzech pałeczek
mlekowych (Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20, SM29 i SM63) w połączeniu z Propionibacterium jensenii SM11, obserwowano wzrost hamowania (tabela 5) w porównaniu do prób, w których użyto jeden szczep Lactobacillus w połączeniu z SM11 (tabela 4). Całkowite hamowanie wzrostu
drożdży uzyskano stosując szczepy Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20, SM29 albo
SM63 w połączeniu z Propionibacterium jensenii SM11 i 1 g/litr Ka-sorbatu (tabela 5). Aktywność
przeciw-grzybowa tych szczepów bakteryjnych zwiększała się przy dodaniu tego konserwanta żywności.
22
n.d.
a
b
c
d
PL 206 763 B1
- nie oznaczano
6
- 1 g/litr, stężenie według EU-Richtlinie, nr 95/2/EG
23
PL 206 763 B1
++
+
+/(+/-)
-
- słaba kolonia (~ 50% hamowania)
- bardzo słaba kolonia (~ 75% hamowania)
Aktywność przeciwbakteryjna kultur ochronnych w próbie na płytkach agarowych
Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20, SM29 i SM63 testowano dalej na zdolność
hamowania bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, pojedynczo i w kombinacji z Propionibacterium
jensenii SM11. Po etapie odwirowania i przemycia, szczepy wprowadzano w stężeniu 108 cfu/ml na
płytki z agarem BHI, na których rosły przez dobę naniesione punktowo kultury odpowiednich bakterii.
Jedną partię płytek utrzymywano w temperaturze 6°C i wzrost bakterii kontrolowano raz na tydzień
a drugą partię inkubowano w temperaturze 25°C i hamowanie wzrostu obserwowano codziennie.
W tym doświadczeniu również, pałeczki mlekowe oraz szczep Propionibacterium miały słabą aktywność hamującą użyte osobno (nie podano danych) ale ich połączenie odznaczało się wysokimi wartościami aktywności antagonistycznej (tabela 6).
T a b e l a 6. Aktywność przeciwbakteryjna wybranych kultur ochronnych wprowadzonych na płytki agarowe,
po przechowywaniu przez 21 dni w temperaturze 6°C i 25°C.
Kultury ochronneb
Organizmy
a
indykatorowe
SM20/
/SM11
c
(pH 5,45)
SM29/
/SM11
(pH 5,48)
SM63/
/SM11
(pH 5,40)
Kontrola
(pH 6,70)
1
2
3
4
5
Listeria innocua L17
-
-
-
++
Staphylococcus aureus VF4
-
-
-
(+/-)
Escherichia coli B
-
-
-
(+/-)
Escherichia coli SG63
-
-
-
+/-
Przechowywanie w 6°C/21 dni
Serratia liquefaciens SG64
-
(+/-)
+
++
Citrobacter freundii SG84
(+/-)
(+/-)
(+/-)
++
Klebsiella pneumoniae SG89
(+/-)
(+/-)
+/-
++
Enterobacter cloacae SG95
(+/-)
(+/-)
(+/-)
+
Enterococcus faecalis DS5
-
-
-
+
Bacillus subtilis 168
-
-
-
-
Bacillus cereus DMS 31
-
-
-
-
Salmonella typhimurium ATCC 14058
-
-
-
++
Listeria monocytogenes M1
-
-
-
++
Listeria innocua L17
-
-
-
++
Staphylococcus aureus VF4
-
+/-
+/-
++
Escherichia coli B
+
(+/-)
(+/-)
++
Escherichia coli SG63
+/-
-
-
++
Serratia liquefaciens SG64
+/-
+
+/-
++
Citrobacter freundii SG84
(+/-)
+/-
(+/-)
++
Klebsiella pneumoniae SG89
(+/-)
+/-
+
++
Enterobacter cloacae SG95
(+/-)
+
+
++
Enterococcus faecalis DS5
(+/-)
(+/-)
(+/-)
++
T
Przechowywanie w 25°C/21 dni
24
PL 206 763 B1
cd. tabeli 6
2
3
4
5
Bacillus subtilis 168
1
-
-
-
++
Bacillus cereus DMS 31T
-
(+/-)
(+/-)
++
Salmonella typhimurium ATCC 14058
-
-
-
++
-
-
-
++
Listeria monocytogenes M1
8
8
8
8
a
- zaszczepienie punktowe, kultura dobowa
b
c
++
- silna kolonia (~0% hamowania)
+
+ /- - słaba kolonia (~ 50% hamowania)
Aktywność przeciw grzybom przechowywanych kultur ochronnych
W celu określenia możliwości przechowywania kultur ochronnych, przechowywano je oddzielnie
w 100-krotnym stężeniu (zawieszone w tyndalizowanym odtłuszczonym mleku) w temperaturze -80°C
przez 15 tygodni. Następnie, szczepy te wprowadzano w stężeniu 108 cfu/ml na płytki z agarem YM,
na którym uprzednio zaszczepiono punktowo drożdże wymienione w tabeli 1 w ilości od 104 do
107 cfu/ml. Płytki inkubowano w temperaturze 6°C obserwując raz w tygodniu wzrost drożdży. Jako
kontrolę przygotowano płytkę agarową z dodatkiem odpowiedniej ilości odtłuszczonego mleka. Jak
przedstawiono sumarycznie w tabeli 7, kultury ochronne Propionibacterium jensenii SM11 i szczep
Lactobacillus paracasei subsp. paracasei (SM20, SM29 i SM63) po przechowywaniu przez 15 tygodni
w temperaturze -80°C w dalszym ciągu wykazują aktywność przeciw grzybom.
T a b e l a 7. Aktywność przeciw grzybom wybranych kultur ochronnych po ich przechowywaniu przez 15 tygodni
w temperaturze -30°C, wprowadzonych na płytki agarowa
Kultury ochronneb
Organizmy
a
indykatorowe
Kontrola
SM20/
/SM11
SM29/
/SM11
SM63/
/SM11
Candida magnoliae 1-35/1
+/-
+/-
+/-
++
Candida parapsilosis 4-5/1
-
-
-
(+/-)
Zygosaccharomyces bailli 1-48/1
-
-
-
-
Candida silvicola 4-42/1
-
-
-
++
Candida valida 1-48/8
+
+
+
+
+/-
+/-
+
++
Candida reukaufii 4-73/4
-
-
-
++
Candida sp. 1-50/15
+
+
+
+
Sporobolomyces salmonicolor 3-46/2
-
-
-
+/-
-
-
-
-
Candida pulcherrima 1-50/13
Candida krusei 3-69/2
8
8
8
8
n.d. - nie oznaczano
a
6
b
++
+
25
PL 206 763 B1
+/- - słaba kolonia (~ 50% hamowania)
- brak kolonii (~100% hamowania)
Aktywność przeciw grzybom kultur ochronnych na modelu żywnościowym.
W badaniu wstępnym ustawiono model żywieniowy z różnymi kulturami ochronnymi. Szczepy
posiadające aktywność hamującą dodano do tyndalizowanego, odtłuszczonego mleka w początkowej
ilości 108 cfu/g. Były to: Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20, Lactobacillus paracasei
subsp. paracasei SM29, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM63, Lactobacillus plantarum
SM17 i Lactobacillus plantarum SM39 w kombinacji z Propionibacterium jensenii SM11. Dodatkowo
próbki zaszczepiano Candida pulcherrima 1-50/13 w ilości 102 cfu/g i następnie przechowywano
w temperaturze 6°C. Jak to jest widoczne na fig. 3, poziomy drożdży ciągle wzrastały do poziomu
107 - 108 cfu/g w próbkach zawierających szczepy Lactobacillus plantarum SM17 i SM39 i w próbce
kontrolnej, w której wartości te były najwyższe. Próbki zawierające Lactobacillus paracasei subsp.
paracasei (SM20, SM29 albo SM63) wykazywały znaczące różnice. W tych próbkach, Candida pulcherrima 1-50/13 wzrastała do poziomu 104 cfu/g i następnie poziom ten był prawie stały przez 7 tygodni. Po 4 tygodniach, w próbkach zawierających Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM63 obserwowano zwiększenie ilości drożdży. Podczas przechowywania poziom pałeczek Propionibacterium
i pałeczek mlekowych ani nie wzrastał ani nie spadał. Wartości pH próbek zawierających kultury ochronne nie wykazywały znaczących różnic w stosunku do próbki kontrolnej (nie przytoczono danych).
Aktywność przeciw grzybom w jogurcie
Ustawiono dalsze badanie z użyciem, jogurtu i kultur ochronnych zawierających Lactobacillus
paracasei subsp. paracasei, szczepy SM20, SM29 albo SM63 w kombinacji z Propionibacterium jensenii SM11. Użyto mleko wzbogacone w składniki odżywcze, co powinno korzystnie wpływać na
wzrost zakażających drożdży. Mleko to fermentowano handlową kulturą jogurtową w obecności kultury
7
8
ochronnej. Kultury ochronne stosowano w stężeniach odpowiednio 10 cfu/g albo 10 cfu/g. Po przeprowadzeniu fermentacji i schłodzeniu, próbki zaszczepiano mieszaniną Candida pulcherrima 1-50/13,
Candida magnoliae 1-35/1, Candida parapsilosis 4-5/1 i Zygosaccharomyces bailii 1-48/1 w ilości 102 cfu/g,
po czym przechowywano je w temperaturze 6°C. Jak to jest przedstawione na fig. 4, poziomy drożdży
w próbkach z kulturami ochronnymi w stężeniu 107 cfu/g oraz w próbce kontrolnej systematycznie wzrastały. Próbka kontrolna przez cały czas wykazywała najwyższe wartości skażających drożdży. W żadnej
próbce zawierającej kultury ochronne w ilości 108 cfu/g nie obserwowano podwyższenia poziomu drożdży.
Poziom drożdży utrzymywał się na stałym poziomie przez okres 4 tygodni. To samo zjawisko obserwowano przy stężeniach 1,7 x 108 cfu/g pałeczek mlekowych i 5,5 x 107 cfu/g pałeczek Propionibacterium
(tabela 11). We wszystkich próbkach poziom kultury ochronnej ani nie wzrastał ani nie spadał podczas
przechowywania. Wartości pH próbek zawierających kultury ochronne nie wykazywały znaczących różnic
w stosunku do próbki kontrolnej (nie przytoczono danych). Jak to jest przedstawione w tabeli 8, w próbkach
zawierających kultury ochronne oznaczono metodą enzymatyczną 60-70 mg/100 g octanu podczas gdy
w próbce kontrolnej nie zawierającej kultury ochronnej ilość ta wynosiła tylko 4,43 mg/100 g.
T a b e l a 8. Enzymatycznie oznaczone stężenia kwasów organicznych metabolizowanych w jogurcie zawierającym kultury ochronne.
Kultury ochronne
Kwasy organiczne
Octan
(mg/100 g)
D-mleczan
(g/100 g)
L-mleczan
(g/100 g)
Mleczany ogółem
(g/100 g)
SM20/SM11a
68,84
0,01
0,61
0,62
b
60,95
0,01
0,62
0,63
c
61,44
0,01
0,65
0,66
4,43
0,01
0,74
0,75
SM29/SM11
SM63/SM11
d
Kontrola
SM20 - Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20
SM11 - Propionibacterium jensenii SM11
a
8
7
- SM20, 1,7 x 10 cfu/g; SM11, 5,5 x 10 cfu/g
b
8
8
- SM29, 1,7 x 10 cfu/g; SM11, 2,8 x 10 cfu/g
c
8
7
- SM63, 1,6 x 10 cfu/g; SM11, 8,1 x 10 cfu/g
d
- brak kultury ochronnej
26
PL 206 763 B1
Kultura ochronna nie wpływała natomiast na zawartość D-mleczanu, L-mleczanu oraz mleczanu
całkowitego (tabela 8).
W teście sensorycznym, jogurty z kulturami ochronnymi i próbki kontrolne nie zawierające dodatkowej kultury nie wykazywały jakichkolwiek wyczuwalnych różnic po okresach przechowywania 5 i 15 dni.
Powiększenie skali w zastosowaniu kultury ochronnej w jogurcie
Próby powiększenia skali z użyciem, jogurtu dały podobne wyniki do tych, jakie otrzymano
w badaniach prowadzonych na skalę laboratoryjną.
Aktywność przeciw grzybom na powierzchni sera
W tabeli 9 przedstawiono wyniki prób hamowania mieszaniny drożdży na powierzchniach sera
traktowanych trzema różnymi kulturami ochronnymi użytymi w różnych stężeniach. Wszystkie sery
2
skażono drożdżami do końcowego poziomu na powierzchni wynoszącego 10 cfu/g. Powierzchnię
sera definiowano jako warstwę około 3 mm od brzegu sześcianu.
T a b e l a 9. Hamowanie drożdży na powierzchniach sera utrzymywanego w temperaturze 6°C
Drożdże, cfu/ga
Czas
(dni)
A
B
3,2 x 10
2
<10
2
1,0 x 10
2
<10
2
2,7 x 10
2
<10
K1
1
21
5,0 x 10
2
1,5 x 10
K2
1
21
1
21
5,5 x 10
2
3,5 x 10
3
2,2 x 10
4
1,3 x 10
1
21
6,3 x 102
3
8,0 x 10
K3
K4
C
2
2
4,1 x 102
2
<10
2
4,1 x 10
2
<10
2
1,3 x 10
2
1,9 x 10
2
A: zaszczepiono drożdżami i kulturą ochronną SM20/SM11
B: zaszczepiono drożdżami i kulturą ochronną SM29/SM11
C: zaszczepiono drożdżami i kulturą ochronną SM63/SM11
7
8
K1: stężenie kultury ochronnej: 10 - 10 cfu/g powierzchni
6
7
K2: stężenie kultury ochronnej: 10 - 10 cfu/g powierzchni
6
K1: stężenie kultury ochronnej: około 10 cfu/g powierzchni
K1: kontrola, zaszczepiono drożdżami, nie dodano kultury ochronnej
a
- mieszanina Candida pulcherrima 1-50/13, Candida magnoliae 1-35/1, Candida parapsilosis 4-5/1 i Zygosaccharomyces bailii 1-48/1
W stężeniach 108 i 107 cfu/g powierzchni, kultury ochronne zdołały całkowicie hamować rozwój
drożdży w czasie 21 dni przechowywania w temperaturze 6°C. Ilość drożdży nawet się obniżała (K1,
K2). Poziom 3,0 x 106 cfu/g powierzchni pałeczek mlekowych i 3,0 x 106 cfu/g powierzchni pałeczek
Propionibacterium wydaje się być poziomem granicznymi, przy którym osiąga się minimalne hamowanie drożdży. Próbka sera K3A zawierała niższe poziomy kultury ochronnej i z tego powodu nie było
hamowania rozwoju skażających drożdży. Poziomy kultur ochronnych na powierzchni serów mieściły
się w tym samym zakresie co ilości komórek w roztworach, w których uprzednio moczono sery (nie
przytoczono danych).
Hamowanie Listeria przez kultury ochronne na modelu żywnościowym
W tabeli 10 podsumowano hamowanie Listeria przez kultury ochronne w siekanym mięsie
i w śmietance.
T a b e l a 10. Hamowanie Listeria przez kultury ochronne na modelach żywnościowych utrzymywanych
w temperaturze 6°C i w temperaturze 25°C
Układy
żywnościowe
Czas
(dni)
1
2
Siekane mięso
(6°C)
cfu/g Listeria innocua L17
A
B
C
D
3
4
5
6
1
3,3 x 103
2,8 x 103
2,6 x 103
2,7 x 103
28
6,0 x 102
3,7 x 102
2,7 x 102
4,5 x 102
42
1,7 x 103
<102
1,5 x 102
<102
56
5,1 x 103
8,2 x 102
<102
1,5 x 102
27
PL 206 763 B1
1
2
3
4
5
cd. tabeli 10
6
Siekane mięso
0
4,1 x 103
4,9 x 103
4,0 x 103
3,7 x 103
(25°C)
2
4,5 x 104
5,5 x 103
3,0 x 103
7,5 x 103
5
6,8 x 104
5,9 x 103
3,2 x 103
5,5 x 103
1
2,7 x 103
3,2 x 103
n.d.
n.d.
14
1,3 x 10
3
3
n.d.
n.d.
1,1 x 10
3
2
n.d.
n.d.
1,0 x 10
3
Śmietanka (6°C)
21
28
Śmietanka (25°C)
1,2 x 10
1,5 x 10
2
<10
2
n.d.
2
1
2,9 x 10
2,6 x 10
2,2 x 10
21
107 - 108
<102
<102
n.d.
2
3,0 x 102
<102
Cfu/g Listeria monocytogenes M1
A
Śmietanka (6°C)
1
7
14
B
3
1,6 x 10
7
2,9 x 10
3,0 x 10
8
C
D
3
n.d.
n.d.
3
n.d.
n.d.
2
n.d.
n.d.
1,7 x 10
1,9 x 10
7,5 x 10
A: kontrola, zaszczepiono Listeria, nie dodano kultury ochronnej
B: zaszczepiono Listeria, dodano SM20/SM11 jako kulturę ochronną
C: zaszczepiono Listeria, dodano SM29/3M11 jako kulturę ochronną
D: zaszczepiono Listeria, dodano SM63/3M11 jako kulturę ochronną
n.d. - nie oznaczono
Wybrano dwa modele na żywności reprezentujące żywność o wysokiej zawartości wilgoci,
o różnej zawartości tłuszczu i białka, o pH optymalnym dla Listeria. Chociaż Listeria innocua L17 wykazała dobry wzrost po 21 dniach na agarze BHI utrzymywanym w temperaturze 6°C (tabela 6), nie
wykryto jej w modelach żywnościowych. Ilość żywych komórek tego organizmu indykatorowego spadała jednakże w obecności kultury ochronnej. Poza tym, próbki te po przechowywaniu przez 56 dni
nadal miały przyjemną czerwoną barwę mięsa, podczas gdy próbka kontrolna miała barwę zieloną do
brązowej i była wyraźnie zepsuta. Wartość pH próbki kontrolnej po 56 dniach wynosiła 6,20, podczas
gdy próbki z kulturami ochronnymi miały pH w zakresie 5,50 do 3,81. Poziom pałeczek Propionibacterium i pałeczek mlekowych pozostał niezmieniony po przechowywaniu w temperaturze 6°C przez
okres 56 dni. Drugą partię siekanego mięsa z dodatkiem lub bez dodatku kultur ochronnych przechowywano w temperaturze 25°C. Po 5 dniach przechowywania, wzrost Listeria innocua był hamowany
3
w próbkach z kulturami ochronnymi (od 3,12 do 5,9 x 10 cfu/g) podczas gdy wzrastała liczba żywych
4
komórek tego organizmu indykatorowego do 6,8 x 10 cfu/g w próbce kontrolnej. Poza tym, próbka
kontrolna uległa całkowitemu zepsuciu. W śmietance przechowywanej w temperaturze 6°C po 28
dniach obserwowano to samo zjawisko. W próbce kontrolnej, liczba bakterii Listeria innocua L17
utrzymywała się stale w tym samym zakresie jak na początku (103 cfu/g) ale w próbce z kulturą
ochronną, liczba żywych komórek tego organizmu indykatorowego spadała do poniżej 102 cfu/g.
W okresie przechowywania poziom pałeczek mlekowych i pałeczek Propionibacterium ani nie wzrastał
ani nie spadał. Wartości pH w próbkach z dodatkiem lub bez dodatku kultury ochronnej pozostawały
w tym samym zakresie. Po przechowywaniu przez 28 dni w temperaturze 6°C, pH śmietanki spadało
do 4,78 w próbce bez kultury ochronnej i do 4,60 w próbce z kulturą ochronną. W próbkach śmietanki
przechowywanych w 25°C, ilość Listeria innocua L17 spadała poniżej 102 cfu/g wobec kultur ochronnych a w próbce kontrolnej wzrastała do ilości komórek 107 - 108 cfu/g. Podobnie, wyraźnie zmieniało
się pH w tych próbkach. W próbkach z kulturami ochronnymi, pH zawierało się w zakresie 3,56 do
3,68, podczas gdy w próbce kontrolnej wynosiło przez cały czas 5,80. Po 21 dniach przechowywania
w temperaturze 25°C, ilości komórek pałeczek mlekowych i pałeczek Propionibacterium utrzymywały
się ciągle w tym samym zakresie jak na początku. Poziomy kultur ochronnych ani nie wzrastały ani nie
spadały. W próbkach zawierających Listeria monocytogenes M1 jako organizm indykatorowy obserwowano wyraźną różnicę w ilości żywych komórek tego patogenu w obecności i w nieobecności kultury ochronnej. Po przechowywaniu przez 14 dni w temperaturze 6°C, próbka bez kultury ochronnej
28
PL 206 763 B1
zawierała 3,0 x 108 cfu/g Listeria monocytogenes M1 a w próbce zawierającej kulturę ochronną ilość
komórek tego organizmu indykatorowego spadała do 7,5 x 102 cfu/g (tabela 10). Niezbędne stężenie
kultury ochronnej w żywności zapewniające wystarczające działanie przeciw-drobnoustrojowe
Dla osiągnięcia wystarczającego działania przeciw-drobnoustrojowego potrzebny jest pewien
poziom pałeczek mlekowych i pałeczek Propionibacterium. W tabelach 11 i 12 są przedstawione różne próby w ramach tego badania i odpowiednie poziomy kultury ochronnej.
PL 206 763 B1
29
30
PL 206 763 B1
Dla osiągnięcia optymalnej aktywności kultury ochronnej przeciw grzybom potrzebny jest poziom co najmniej 1,7 x 108 cfu/g albo cfu/ml pałeczek mlekowych w połączeniu z 5,5 x 107 cfu/g albo
cfu/ml pałeczek Propionibacterium (tabela 11). Na powierzchni sera, poziom 1,0 x 107 cfu/g powierzchni pałeczek mlekowych i 5,0 x,106 cfu/g powierzchni pałeczek Propionibacterium wydaje się
być minimalnym stężeniem potrzebnym do uzyskania stałego zadawalającego działania przeciw grzybom (dane nie są przytoczone). Dla uzyskania zadawalającego działania przeciwbakteryjnego, najniższym testowanym poziomem wykazującym jeszcze dobre właściwości hamujące był poziom 1,2 x 108
cfu/g albo cfu/ml pałeczek mlekowych w połączeniu z 3,0 x 108 cfu/g albo cfu/ml pałeczek Propionibacterium (tabela 12). Według przeprowadzonych doświadczeń, aktywność przeciwbakteryjna mieści
się w tym samym zakresie co aktywność przeciw grzybom.
Pomimo tego, że wynalazek został przedstawiony i opisany w jego korzystnych rozwiązaniach,
jest zrozumiałe, że nie ogranicza się on do tych rozwiązań lecz może być urzeczywistniony i wykorzystany w praktyce na różne inne sposoby objęte zakresem załączonych zastrzeżeń patentowych.
Piśmiennictwo
Al-Zoreky, M. H., J. W. Ayres i W. E. Sandine, 1991. Antimicrobial activty of MicrogardTM against
food spoilage and pathogenic microorganisms (Aktywność przeciw-drobnoustrojowa Microgardu przeciw mikroorganizmom powodującym psucie się żywności i patogennym), J. Dairy Sci., 74: 758-763.
Amann R. I., W. Ludwig, K. H. Schleifer. 1995. Phylogenetic identification and in situ detection
of individual microbial cells without cultivation (Filogenetyczna identyfikacja i detekcja in situ komórek
mikroorganizmów bez hodowli) Microbiol. Rev. 59: 143-169.
Collins M. D., B. A. Phillips i P. Zanoni, 1939. Deoxy-ribonukleic acid homology studies of Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei sp. nov. subsp. paracasei and subsp. tolerans and Lactobacillus rhamnosus sp. nov. comb. nov. (Badania homologii kwasu deoksyrybonukleinowego z Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei gat. nov. podgatunek paracasei i podgatunek tolerans oraz Lactobacillus rhaminosus sp. nov. comb. nov.) Int. J. Syst. Bacteriol, 39: 105-108.
Daeschel M. A., 1989. Antibacterial substances from lactic acid bacteria for use as food preservatives (Substancje przeciw-bakteryjne z bakterii kwasu mlekowego do stosowania jako konserwanty do żywności). Food Technol. 43: 164-167.
Daeschel M. A., 1992. Procedures to detect antimicrobial activities of microorganisms. In food
biopreservatives of microbiological origin (Procedury wykrywania aktywności mikroorganizmów.
W książce: Biokonserwanty do żywności pochodzenia mikrobiologicznego) (pod red. R. Bibek i M. A.
Daeschel). CRC Press, Inc. Boca Raton, Ann Arbor, Londyn i Tokio, 57-80.
Dasen G., J. Smutny, M. Teuber i L. Meile. 1993. Classification and identification of Propionibacteria based on ribosomal RNA genes and PCR. (Klasyfikacja i identyfikacja pałeczek Propionibacteriumi w oparciu o geny ribosomalnego RNA i reakcję PCR). System. Appl. Microbiol. 21: 251-259.
EU-Richtlinie nr. 95/2/EG des Europaischen Parlaments und des Rats vom 20. Februar 1995
uber andere Lebensmittelzusatzstoffe, farbstoffe und Sussungsmittel (Dyrektywa UE nr. 95/2/EG Parlamentu Europejskiego i Wytyczne z 20 lutego 1995 r. dotyczące innych dodatków do żywności, barwników i środków słodzących).
Federal Register. 1988. Nisin preparation: affirmation of GRAS status as a direct humian food
ingredient. (Rejestr Federalny. 1988. Preparat nisyny: potwierdzenie statusu GRAS jako bezpośredniego dodatku do żywności dla ludzi. 21 CFR Cz. 134, tom 53: 11247-11251.
Goldenberger D. 1997. Detection of bacterial pathogens in clinical specimen by broad-range
PCR amplification and direct sequencing of part of the 16S rDNA gene (Wykrywanie patogenów bakteryjnych w próbkach klinicznych metodą amplifikacji PCR o szerokim zakresie i bezpośrednie sekwencjonowanie części genu 16S rDNA) PhD thesis no. 12219, ETH, Zurich, Szwajcaria.
Greisen K., M. Loeffelholz, A. Purochit i D. Leon. 1994. PCR primers and ptobes for the 16S
rDNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid
(Primery i sondy PCR dla genu 16S rDNA większości gatunków bakterii patogennych, w tym bakterii
znajdowanych w płynie mózgowo-rdzeniowym). J. Clinic. Microbiol. 32: 335-351.
Grinstead D. A. i S. F. Barefoot. 1992. Jenseniin G., a heat-stable bacteriocin produced by
Propionibacterium jensenii P126 (Jenseniin G., termostabilna bakteriocyna wytwarzana przez Propionibacterium jensenii P126). Appl. Environ. Microbiol. 58: 213-220.
Holzapfel W.H., R.Geisen i U. Schillinger. 1995. Review Paper. Biological preservation of foods
with reference to protective cultures, bacteriocins and food-grade-enzymes (Konserwowanie biologi-
31
PL 206 763 B1
czne żywności w odniesieniu do kultur ochronnych, bakteriocyn i enzymów do żywności) Int. J. Food
Microbiol. 24: 343-362.
Jung G. 1991. Lantibiotics: a survey. In Nisin and novel lantibiotics (Lantybiotyki. Przewodnik.
Nizyna i nowe lantybiotyki) (pod red. Junga G. i H. G. Sahla). Escom Publishers, Leiden, Holandia, 1-34.
Lane D. J. 1991. Sekwencjonowanie 16S/23S rRNA. W książce: Nucleic acid techniques in bacterial systematics. (pod red. Stackebrandt E. i M. Goodfellow), John Wiley & Sons, Nowy Jork, USA
115-176.
Miescher S. 1999. Antimicrobial and autolytic systems of dairy propionibacteria (Układy przeciwbakteryjne i autolityczne pałeczek Propionibacterium z produktów mleczarskich) PhD thesis Nr. 13436.
ETH, Zurich, Szwajcaria.
Pearson P. W. R. i D. J. Lipman 1938. Improved tools for biological sequence comparison (Ulepszone narzędzia do porównania sekwencji biologicznych). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-2448.
Sanger F., S. Nicklen i A. R. Coulson 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467.
Soumalainen T. H. i A. M. Märyä-Mäkinen. 1999. Propionic acid bacteria as protective cultures
in fermented milks and breads (Bakterie kwasu propionowego jako kultury ochronne w fermentowanych mlekach i chlebie). Lait 79: 165-174.
Vogel R. F. 1996. Biotechnology of starter organisms for non-dairy lactic food fermentations
(Biotechnologia organizmów starterowych do fermentacji nie-mleczarskich produktów mlecznych)
(Mini Review). Adv. Food Sci. 13: 46-51.
Ward L. J. H. i M. J. Timinins. 1999. Differentiation of Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei and Lactobacillus rhamnosus by polymerase chain reaction (Różnicowanie Lactobacillus casei,
Lactobacillus paracasei i Lactobacillus rhamnosus w łańcuchowej reakcji polimerazy). Lett. Appl. Microbiol. 29: 90-92.
Young J. P. W., H. L. Downer i B. D. Eardly. 1991. Phylogeny of the phitotrophic rhizobium
strain BTAi1 by polymerase chain reaction-based sequencing of a 16S rRNA gene segment (Właściwości filogenetyczne fototropowego szczepu rizobium BTAi1 oznaczane przez sekwencjonowanie
segmentu genu 16S rRNA w oparciu o łańcuchową reakcję polimerazy). J. Bacteriol. 173: 2271-2277.
Zusatzstoffverordnung über die in Lebensmitteln zulässigen Zusatzstoffe, vom 26. Juni 1995.
Stand am. 22. Februar 2000. Eidgenössisches Departement des Innern: Dreifuss. EDMZ. Bern.
Zdeponowane szczepy
W dniu 20.09.2001 w Kolekcji DSMZ-Deutsche Samlung von Mikroorganismen und, Zellkulturen GmbH (DSMZ) zdeponowano następujące szczepy:
- szczep Propionibacterium jensenii SM11 zdeponowano pod numerem DSM 14513
- szczep Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20 zdeponowano pod numerem DSM
14514
- szczep Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM29 zdeponowano pod numerem DSM 14515
- Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM63 zdeponowano pod numerem DSM 15416.
PCT Oryginał (DO ZŁOŻENIA) - wydrukowany 28.10.2002 godz. 01.20.47
0-1
Formularz - PCT/RO/134 (EASY)
Dane odnoszące się do zdeponowanych mikroorganizmów lub innego materiału biologicznego (Reg. 13 bis)
0-1-1
Przygotowane przy użyciu
0-2
Zgłoszenie międzynarodowe nr
0-3
Znak Zgłaszającego lub agenta
1
Poniższe dane odnoszą się do zdeponowanych
mikroorganizmów lub innego materiału biologicznego
powołanego w opisie
1-1
Strona
57
1-2
Wiersz
7
PCT-EASY wersja 2.92
(uaktualniona 01.10.2002)
05365PC
32
PL 206 763 B1
1-3
Identyfikacja depozytu
1-3-1
Nazwa instytucji deponującej
DSMZ-Deutche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
1-3-2
Adres instytucji deponującej
Mascheroder Weg 1b, D-38124
Braunschweig, Niemcy
1-3-3
Data zdeponowania
20 Wrzesień 2001 (20.09.2001)
1-3-4
Numer akcesyjny
DSMZ 14513
1-4
Dodatkowe dane
Brak
1-5
Wyznaczenie państw, do których odnoszą się dane
Wszystkie wyznaczone państwa
1-6
Oddzielne dostarczenie danych
Te dane będą dostarczone do
Międzynarodowego Biura później
Brak
2
2-1
Strona
57
2-2
Wiersz
7
2-3
2-3-1
2-3-2
Mascheroder Weg 1b,
D-38124 Braunschweig, Niemcy
2-3-3
Data zdeponowania
20 Wrzesień 2001 (20.09.2001)
2-3-4
Numer akcesyjny
DSMZ 14514
2-4
Dodatkowe dane
Brak
2-5
2-6
Brak
3-3
3-3-1
3-3-2
3-3-3
Data zdeponowania
20 Wrzesień 2001 (20.09.2001)
3-3-4
Numer akcesyjny
DSMZ 14515
3-4
Dodatkowe dane
Brak
3-5
3-6
Brak
4
4-1
Strona
57
4-2
Wiersz
16
33
PL 206 763 B1
4-3
4-3-1
DSMZ-Deutche Sammlung
von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
4-3-2
4-3-3
Data zdeponowania
20 Wrzesień 2001 (20.09 2001)
4-3-4
Numer akcesyjny
DSMZ 15416
4-4
Dodatkowe dane
Brak
4-5
3-6
Te wskazania będą dostarczone do
Międzynarodowego Biura w późniejszym terminie
Brak
WYKAZ SEKWENCJI
<110> Eidgenössische Technische Hochschule Zürich
<120> Mieszanina bakterii, żywność karma lub lek, sposób wytwarzania żywności, sposób
przechowywania żywności karmy lub leku, zastosowanie mieszaniny bakterii i bakterie
<130> Mieszanina bakterii
<140>
<141>
<160> 11
<170> PatentIn wersja 2.1
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> Opis sekwencji nienaturalnej: Primer do reakcji PCR
<400> 1
tggctcagaa cgaacgctag gcccg
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: Primer do reakcji PCR
<400> 2
tgcactgaga ttcgacttaa
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<220>
<400> 3
caccgagatt caacatgg
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<220>
<400>
tgcatcttga tttaattttg
34
PL 206 763 B1
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<220>
<400> 5
aggaggtgat ccarccgca
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<220>
<400> 6
agtttgatcm tggctcag
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<220>
<400> 7
actcctacgg gaggcagc
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<220>
<400> 8
accgcggctg ctggcagc
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<220>
<400> 9
ggmttagata ccctggtagt cc
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<220>
<400> 10
cgttaagtcc cgcaacgagc
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<220>
<400> 11
gtacacaccg cccgtca.
PL 206 763 B1
35
Zastrzeżenia patentowe
1. Mieszanina bakterii, znamienna tym, że mieszanina ta jest kulturą nie starterową, wolną od
metabolitów i zawierającą co najmniej jedną bakterię wybraną z gatunku Propionibacterium jensenii
i co najmniej jedną bakterię wybraną z rodzaju Lactobacillus.
2. Mieszanina bakterii będąca kulturą nie starterową według zastrz. 1, znamienna tym, że wytwarza się ją sposobem zawierającym etapy:
- wprowadzenia mieszaniny bakterii zawierającej co najmniej jedną bakterię wybraną z gatunku
Propionibacterium jensenii i co najmniej jedną bakterię wybraną z rodzaju Lactobacillus, która to mieszanina jest wolna od metabolitów, do pożywki albo na powierzchnię pożywki zawartej w pierwszym
8
8
pojemniku w takiej ilości, aby uzyskać stężenie co najmniej 1 x 10 cfu/ml albo 1 x 10 cfu/g albo 1 x
7
2
10 cfu/cm każdej powyższej pierwszej i drugiej bakterii;
- wprowadzenia czynników skażających do pożywki i/lub na powierzchnię pożywki zawartej
w pierwszym pojemniku;
- wprowadzenia do pożywki i/lub naniesienie na powierzchnię pożywki zawartej w drugim pojemniku tych samych czynników skażających jakie wprowadzono do i/lub naniesiono na powierzchnię
pożywki w pierwszym pojemniku, która to pożywka jest identyczna z pożywką zawartą w pierwszym
pojemniku lecz nie zawiera mieszaniny bakterii;
- oznaczenia hamowania powyższych czynników skażających przez tę mieszaninę bakterii
przez przechowywanie pierwszego i drugiego pojemnika w odpowiedniej temperaturze w odpowiednim czasie przechowywania i porównania ilości i/lub stężenia czynników skażających w pożywce i/lub
na powierzchni pożywki zawartej w pierwszym i w drugim pojemniku, przy czym powyższa mieszanina
hamująca działa w ten sposób, że ilość i/lub stężenie czynników skażających w pożywce i/lub na powierzchni pożywki zawartej w drugim pojemniku jest wyższe od ilości i/lub stężenia w pożywce i/lub na
powierzchni pożywki zawartej w pierwszym pojemniku po przynajmniej części tego okresu przechowywania, przy czym wspomnianą mieszaninę bakterii uznaje się za posiadającą właściwości hamujące, jeśli ilość czynników skażających w pożywce i/lub na powierzchni pożywki zawartej w drugim pojemniku jest o co najmniej log 1 wyższa, korzystnie o co najmniej około log 2 wyższa, bardziej korzystnie o co najmniej około log 3 wyższa, jeszcze korzystniej o co najmniej około log 4 wyższa,
a nawet jeszcze korzystniej o co najmniej około log 5 wyższa, najkorzystniej o co najmniej około log 6
wyższa, od ilości czynników skażających na powierzchni pożywki zawartej w pierwszym pojemniku po
okresie co najmniej 3 dni, korzystnie okresie co najmniej 7 dni, bardziej korzystnie w okresie co najmniej 14 dni, jeszcze korzystniej okresie co najmniej 21 dni a najkorzystniej po okresie 25 dni.
3. Mieszanina bakterii według zastrz. 2, znamienna tym, że wspomnianą pożywkę stanowi
żywność bądź karma lub pożywka agarowa.
4. Mieszanina bakterii według zastrz. 2 albo 3, znamienna tym, że odpowiednią temperaturą
jest temperatura około 6-25°C, korzystnie, odpowiednią temperaturą jest temperatura wybrana co
najmniej z grupy około 6°C, około 12°C, około 25°C a odpowiednim czasem przechowywania jest
czas 7-28 dni, korzystnie czas przechowywania jest wybrany przynajmniej z grupy 7 dni, 14 dni,
21 dni, 28 dni.
5. Mieszanina bakterii według zastrz. 2-5, znamienna tym, że wspomnianymi czynnikami skażającymi są grzyby lub bakterie albo ich mieszaniny.
6. Mieszanina bakterii według zastrz. 1, znamienna tym, że proporcja pomiędzy wspomnianymi bakteriami w tej mieszaninie wynosi od 1:100 do 100:1, korzystnie od 1:10 do 10:1.
7. Mieszanina bakterii według zastrz. 1, znamienna tym, że bakteria z rodzaju Lactobacillus
wybrana jest z grupy obejmującej Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus
casei, Lactobacillus plantarum i ich mieszaniny.
8. Mieszanina bakterii według zastrz. 7, znamienna tym, że bakteria ta jest wybrana spośród
jednego lub kilku szczepów Lactobacillus paracasei subsp. paracasei.
9. Mieszanina bakterii według zastrz. 8, znamienna tym, że bakteria z rodzaju Lactobacillus
jest wybrana z grupy obejmującej Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM29, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM63 i ich mieszaniny.
10. Mieszanina bakterii według zastrz. 1, znamienna tym, że wspomniana bakteria Propionibacterium jensenii stanowi Propionibacterium jensenii SM11.
11. Żywność, karma lub lek, znamienne tym, że ta żywność, karma lub lek zawiera mieszaninę
bakterii jak zdefiniowano w zastrz. 1-10.
36
PL 206 763 B1
12. Żywność według zastrz. 11, znamienna tym, że ta żywność jest wybrana z grupy obejmującej produkty mleczne, korzystnie zakwaszone produkty mleczne i/lub produkty mięsne.
13. Sposób wytwarzania żywności, karmy lub leku, zwłaszcza żywności zdefiniowanej w zastrz. 11
lub 12, znamienny tym, że zawiera etapy:
- dodania mieszaniny bakterii zdefiniowanej w zastrz. 1 - 10 podczas wytwarzania żywności,
karmy lub leku w takiej ilości, aby stężenie co najmniej jednej bakterii Propionibacterium jensenii i co
najmniej jednej bakterii z rodzaju Lactobacillus w tej żywności, karmie lub leku osiągnęło dla każdej
bakterii przynajmniej 1 x 108 cfu/ml albo dla każdej bakterii przynajmniej 1 x 108 cfu/g żywności, karmy
lub leku albo dla każdej bakterii przynajmniej 1 x 107 cfu/cm2 powierzchni żywności, karmy lub leku;
- kontrolowania parametrów wytwarzania podczas procesu wytwarzania, tak, aby stężenie mieszaniny bakterii pozostawało na stałym poziomie.
14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że stężenie bakterii Propionibacterium jensenii
w tej żywności, karmie lub leku wynosi przynajmniej 1 x 109 cfu/ml albo przynajmniej 1 x 109 cfu/g
żywności, karmy lub leku albo przynajmniej 1 x 108 cfu/cm2 powierzchni żywności, karmy lub leku
a stężenie bakterii z rodzaju Lactobacillus wynosi przynajmniej 1 x 108 cfu/ml żywności, karmy lub leku
albo przynajmniej 1 x 108 cfu/g żywności, karmy lub leku albo przynajmniej 1 x 107 cfu/cm2 powierzchni żywności, karmy lub leku i vice versa.
15. Sposób według zastrz. 13 albo 14, obejmujący jeden lub większą ilość etapów fermentacji,
znamienny tym, że mieszaninę bakterii dodaje się przed tym jednym lub większą ilością etapów fermentacji i/lub pomiędzy większą ilością etapów fermentacji i/lub po jednym lub większej ilości etapów
fermentacji.
16. Sposób przechowywania żywności, karmy lub leku zdefiniowanego w zastrz. 11 albo 12 albo żywności, karmy lub leku zdefiniowanych w zastrz. 13 - 15, znamienny tym, że zawiera etap kontrolowania parametrów przechowywania podczas okresu przechowywania, tak, aby stężenie pierwszej
i drugiej bakterii pozostawało na stałym poziomie.
17. Zastosowanie mieszaniny bakterii zdefiniowanej w zastrz. 1 - 10 do hamowania rozwoju mikroorganizmów wybranych z grupy obejmującej grzyby, bakterie i ich mieszaniny, które to grzyby
i bakterie są chorobotwórcze i/lub powodują psucie, zwłaszcza żywności, karmy lub leków.
18. Bakterie wybrane z grupy obejmującej DSM14513 (Propionibacterium jensenii SM11),
DSM14514 (Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20), DSM14515 (Lactobacillus paracasei
subsp. paracasei SM29), DSM14516 (Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM63) lub ich mieszaniny.
PL 206 763 B1
Rysunki
37
38
PL 206 763 B1
PL 206 763 B1
39
40
PL 206 763 B1
Departament Wydawnictw UP RP
Cena 6,00 zł.

Dodatki funkcjonalne do żywności

Transkrypt

Podobne dokumenty

linex forte 14 kapsułek - Apteka internetowa aptekachojna.pl

Linex Forte 14kaps.

Lacidar® suplement diety. Składniki: Substancje

Informacja dla użytkowniczki. Ulotka dla pacjentki.

Compliflora femina x 10 kaps - Tanie

trilac plus forte krople – dietetyczny środek specjalnego

ProBacti dziecko jest połączeniem probiotyku i

Compliflora Femina * 10kaps. D

Osłonka Normal 8 kaps. - DobreZiółko.pl Zielarnia Internetowa