S. Szofer str.64 - Gospodarstwo Pasieczne Pszczeli Dar
Transkrypt
S. Szofer str.64 - Gospodarstwo Pasieczne Pszczeli Dar
Wpływ mieszaniny konserwującej ”miód – czosnek – zioła” na bakterie chorobotwórcze typowe dla mięsa drobiowego. Praca dyplomowa magisterska Sandra Szofer Promotor: Prof. dr hab. Marian Filipiak Pracę przyjęto .................................w dniu .................. podpis Promotora Kierunek: Towaroznawstwo Specjalność: Kształtowanie Jakości Produktów Spożywczych Katedra: Przyrodniczych Podstaw Jakości Poznań rok 2014 Pracę wgrano do systemu dnia .............................. Panu Profesorowi dr hab. Marianowi Filipiakowi za cenne uwagi i wskazówki serdecznie dziękuję. 2 Pani dr inż. Alinie Piotraszewskiej-Pająk za cenne uwagi, wskazówki oraz ogromną cierpliwość i wyrozumiałość serdecznie dziękuję. 3 SPIS TREŚCI WSTĘP ...................................................................................................................................... 6 CEL I ZAKRES PRACY ......................................................................................................... 7 CZĘŚĆ LITERATUROWA .................................................................................................... 8 1. Charakterystyka mikroflory mięsa drobiowego ............................................................... 8 1.1. Mikroflora saprofityczna ................................................................................................. 8 1.2. Drobnoustroje chorobotwórcze ..................................................................................... 12 Charakterystyka typowych patogenów mięsa drobiowego........................................ 12 1.2.1. 2. Trwałość mięsa drobiowego .............................................................................................. 20 2.1. Metody przedłużania trwałości mięsa drobiowego ....................................................... 20 2.2. Naturalne substancje konserwujące ............................................................................... 25 3. Surowce naturalne posiadające potencjał przeciwdrobnoustrojowy ........................... 27 3.1. Miód .............................................................................................................................. 27 3.1.1. Skład chemiczny ........................................................................................................ 27 3.1.2. Właściwości przeciwdrobnoustrojowe ...................................................................... 29 3.2. Czosnek ......................................................................................................................... 31 3.2.1. Skład chemiczny ........................................................................................................ 31 3.2.2. Właściwości przeciwdrobnoustrojowe ...................................................................... 31 3.3. Zioła .............................................................................................................................. 33 3.3.1. Tymianek .................................................................................................................. 34 3.3.1.1. Skład chemiczny .................................................................................................... 34 3.3.1.2. Właściwości przeciwdrobnoustrojowe ................................................................... 35 3.3.2. Oregano..................................................................................................................... 35 3.3.2.1. Skład chemiczny .................................................................................................... 36 3.3.2.2. Właściwości przeciwdrobnoustrojowe ................................................................... 37 3.3.3. Rozmaryn ................................................................................................................. 38 3.3.3.1. Skład chemiczny .................................................................................................... 38 3.3.3.2. Właściwości przeciwdrobnoustrojowe ................................................................... 39 CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA ............................................................................................... 41 1. Materiał badawczy ............................................................................................................. 41 1.1. Wzorcowe szczepy bakterii: .......................................................................................... 41 4 2. Stosowane podłoża mikrobiologiczne............................................................................... 42 3. Stosowana aparatura ......................................................................................................... 42 4. Metodyka ............................................................................................................................ 42 4.1. Standaryzacja inokulatów .............................................................................................. 42 4.2. Przygotowanie mieszanin konserwujących ................................................................... 43 4.3. Badanie właściwości przeciwdrobnoustrojowych ......................................................... 44 5. Wyniki i dyskusja............................................................................................................... 45 5.1. Wyniki badań mikrobiologicznych ............................................................................... 45 6. Wnioski ............................................................................................................................... 66 BIBLIOGRAFIA .................................................................................................................... 67 SPIS RYSUNKÓW ................................................................................................................. 75 SPIS TABEL ........................................................................................................................... 77 5 WSTĘP Od tysiącleci miód jest cenionym produktem spożywczym a także wykorzystywanym w medycynie naturalnej. Z zachowanych malowideł wynika, iż już 10 tysięcy lat temu człowiek zbierał miód dzikich pszczół. W starożytnym Egipcie produkcja oraz spożycie miodu były bardzo duże. Miód był również popularny w starożytnym Rzymie oraz Grecji. Znani lekarze jak: Hipokrates, Galen czy Pliniusz zalecali miód jako środek leczniczy. W medycynie arabskiej oraz indyjskiej również doceniano miód jako naturalny lek, jednocześnie używając go jako afrodyzjaku. W czasach Piastów, produkcja miodu w Polsce była szeroko rozwinięta, natomiast w okresie średniowiecza ogromnym źródłem dochodu był miód przaśny. Wywożono go nawet do krajów Europy zachodniej [Chalcarz 2004]. W ostatnich latach ponownie wzrasta zainteresowanie miodem, między innymi ze względu na modę żywieniową opierającą się na naturalnej oraz zdrowej żywności. Konsumenci coraz częściej rezygnują z żywności konserwowanej chemicznie a sięgają po takie produkty spożywcze, które mają tylko naturalne składniki w swoim składzie. Mimo znacznie wyższych cen takiej żywności, w porównaniu do żywności produkowanej z użyciem nowoczesnej technologii przetwórczej, grono jej odbiorców coraz bardziej się poszerza. Od zarania dziejów stosowane są również zioła (oregano, tymianek i rozmaryn) a także czosnek, zarówno w kuchni, jak i medycynie naturalnej. Szeroko rozwinięte w czasach starożytnych ziołolecznictwo zdaje się wracać obecnie do łask. Liczne badania prowadzone w celu scharakteryzowania różnych właściwości miodu, czosnku oraz ziół jednoznacznie dowodzą, że wszystkie te surowce wykazują działanie przeciwdrobnoustrojowe oraz wiele cech prozdrowotnych dla człowieka. Dlatego też wyniki tych badań stały się przesłanką do zastosowania wspomnianych surowców naturalnych w celu konserwacji żywności nietrwałej, jak np. mięso drobiowe, czyli do zapobiegania rozwojowi mikroflory saprofitycznej oraz patogennej dla człowieka potencjalnie rozwijającej się w produktach spożywczych. 6 CEL I ZAKRES PRACY Celem niniejszej pracy było wykorzystanie przeciwdrobnoustrojowych właściwości opracowanego wraz z dr inż. Aliną Piotraszewską-Pająk w ramach pracy inżynierskiej "Wpływ układu konserwującego ”miód – czosnek – zioła” na wzrost bakterii tlenowych bytujących na powierzchni filetów drobiowych." [Szofer 2013] układu konserwującego, składającego się wyłącznie z naturalnych surowców: 60 % roztwór miodu gryczanego z dodatkiem czosnku polskiego oraz suszonych ziół (oregano, tymianek i rozmaryn) do hamowania wzrostu bakterii patogennych, typowych dla mięsa drobiowego: Campylobacter jejuni, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, Stapchylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia enterocolitica. Ocenę skuteczności działania badanego układu konserwującego przeprowadzono na podstawie pomiaru stref zahamowanego bądź ograniczonego wzrostu drobnoustrojów wokół studzienki, zawierającej testowany inhibitor. W badaniach zastosowano klasyczną metodę studzienkową, standardowo stosowaną do określania wrażliwości bakterii patogennych na działanie różnych inhibitorów wzrostu mikroorganizmów (antybiotyków, środków dezynfekujących, konserwantów). Początek niniejszej pracy stanowi charakterystyka mięsa drobiowego. Począwszy od opisu mikroflory saprofitycznej oraz patogennej bytującej na tym mięsie, poprzez omówienie stosowanych w przemyśle spożywczym konwencjonalnych metod przedłużania jego trwałości, a kończąc na nowoczesnych możliwych zastosowaniach surowców naturalnych w celu jego utrwalenia. W kolejnych rozdziałach omówione zostały składniki opracowanego układu konserwującego (miód gryczany, czosnek polski, rozmaryn, oregano oraz tymianek). Przede wszystkim skupiono się na właściwościach przeciwdrobnoustrojowych oraz determinującym je składzie chemicznym. Pracę oparto o aktualną literaturę, uwzględniając publikacje w czasopismach naukowych, doniesieniach zamieszczonych w portalach internetowych, a także książkach, polsko- i anglojęzycznych. Powołano się również na odpowiednie, aktualnie obowiązujące, akty prawne. 7 CZĘŚĆ LITERATUROWA 1. Charakterystyka mikroflory mięsa drobiowego Mikroflora występująca na mięsie drobiowym uzależniona jest od środowiska ekosystemu, w jakim żyje drób. Występuje ona stale bądź sporadycznie i może pochodzić z wody, gleby czy kału. Jej skład oraz liczebność jest uwarunkowana różnymi czynnikami. Wśród nich są: wypoczynek i głodówka przed ubojem, warunki uboju, warunki skupu oraz transportu drobiu, zabiegi technologiczne, a także transport i przechowywanie mięsa [Stryjakowska-Sekulska 2004]. Przedstawicielami grzybów (Fungi) występującymi na mięsie drobiowym są drożdże (np. Rhodotorula sp., Saccharomyces sp., Torulopsis sp.) oraz pleśnie (np. Aspergillus sp., Mucor sp., Penicillium sp., Thamnidium sp.). Występują one jednak znacznie mniej licznie niż bakterie, które odgrywają najważniejszą rolę zarówno w bezpieczeństwie zdrowotnym konsumentów jak i trwałości mięsa drobiowego podczas jego przechowywania. Najważniejszymi bakteriami jakie można znaleźć na tuszkach drobiowych są następujące rodzaje: Achromobacter sp., Bacillus sp., Bifidobacterium sp., Campylobacter sp., Clostridium sp., Escherichia sp., Klebsiella sp., Lactobacillus sp., Listeria sp., Micrococcus sp., Pseudomonas sp., Salmonella sp., Serratia sp., Staphylococcus sp., Streptococcus sp., Yersinia sp. [Grabowski 1993]. 1.1. Mikroflora saprofityczna Poważnym zagrożeniem dla jakości oraz trwałości mięsa drobiowego niesie za sobą obecność następujących drobnoustrojów saprofitycznych: Rysunek 1 Pseudomonas fluorescens Źródło: http://www.buzzle.com/articles/pseudomonas-fluorescens.html Pseudomonas sp. (rodzina: Pseudomonadaceae) - są to pałeczki gramujemne, lekko zgięte lub proste. Są bakteriami psychrofilnymi, a do wzrostu potrzebują ściśle tlenowych warunków. Poruszają się za pomocą rzęsek, umieszczonych na końcu komórki. Bezpośrednio po obróbce bakterie te występują na mięsie 8 w niewielkiej liczbie. W czasie przechowywania mięsa w warunkach chłodniczych stają się mikroflorą dominującą. Posiadają zdolność do wzrostu w warunkach chłodniczych, a także odznaczają się silną aktywnością enzymów, głównie proteolitycznych i lipolitycznych, natomiast w mniejszym stopniu sacharolitycznych. Skażenie tymi drobnoustrojami jest najlepszym wskaźnikiem jakości mikrobiologicznej tuszek drobiowych. Najliczniej występującym na mięsie gatunkiem bakterii z tego rodzaju jest Pseudomonas fluorescens [Grabowski 1993]. Bakterie z gatunku Pseudomonas fluorescens potrafią rosnąć w niskich temperaturach od 0 do 4°C. Jednak optymalny wzrost osiągają w temperaturze 25 - 30°C. Ich wzrost jest zahamowany w temperaturze 41°C. Bakterie te wytwarzają śluz, przez co są odpowiedzialne za śluzowacenie mięsa. Są również przyczyną świecenia mięsa [Burbianka, Pliszka i Burzyńska 1983]. Rysunek 2 Bacillus subtilis Źródło: http://www.visualphotos.com/photo/1x6039971/coloured _sem_of_bacillus_subtilis_b220597.jpg Bacillus sp. (rodzina: Bacillaceae) - są to tlenowe i względnie beztlenowe gramdodatnie laseczki, które zalicza się do bakterii mezofilnych lub termofilnych, posiadające zdolność do tworzenia form przetrwalnych, tzw. endospor charakteryzujących się wielką odpornością na działanie niesprzyjających czynników środowiskowych. Laseczki te cechują się wysoką aktywnością biochemiczną, a do produktów spożywczych dostają się wraz z kurzem oraz ziemią. Występują one w przetworach owocowo-warzywnych, zbożowych, mlecznych, mięsie oraz jego przetworach. Przez hydrolizę skrobi i białek, wytwarzanie śluzu, powodowanie gorzkiego smaku, a także bardzo nieprzyjemnego zapachu przyczyniają się do psucia żywności. Najczęściej występującym na mięsie przedstawicielem tego rodzaju jest Bacillus subtilis [Stobińska i Żakowska 2000]. Bacillus subtilis jest mezofilem chociaż posiada zdolność rozwoju w wysokich temperaturach. Optymalny wzrost uzyskuje 9 w temperaturze 28 - 40°C i obojętnym pH środowiska. Bakterie te, jako laseczki tworzą układy w postaci dłuższych lub krótszych nici oraz formy otoczkowe. Występują w różnych wielkościach i są zdolne do wytwarzania ciepłoopornych przetrwalników [Libudzisz 2000]. Rysunek 3 Proteus vulgaris Źródło: http://images.fineartamerica.com/images-mediumlarge-5/proteus-vulgaris-bacteria-sem-spl.jpg Proteus sp. (rodzina: Enterobacteriaceae) - są to urzęsione (bardzo liczne rzęski oraz fimbrie wokół całej komórki), gramujemne pałeczki o wymiarach 0,5 - 1 x 1 - 3 µm. Zdarzają się również formy bardzo długie do 20 µm. Komórki występują pojedynczo lub tworzą długie łańcuszki. Bakterie te nie wytwarzają przetrwalników oraz otoczek. Rosną w warunkach tlenowych, a także względnie beztlenowych. Optymalnymi warunkami dla ich wzrostu jest pH 7,5 i temperatura 37°C. Pałeczki z rodzaju Proteus są szeroko rozpowszechnione w przyrodzie. Zalicza się je do bakterii względnie chorobotwórczych. Mogą wywoływać zatrucia pokarmowe, biegunki, zapalenie płuc i opon mózgowych oraz schorzenia dróg moczowych. Wykazują się silnymi właściwościami proteolitycznymi i uczestniczą w rozkładzie gnilnym mięsa. Najczęściej występującym na mięsie gatunkiem jest Proteus vulgaris [Mizerski, Bednarczuk i Kawalec 2008]. Rysunek 4 Lactobacillus Źródło: http://www.gastroscan.ru/ handbook/118/1906 Lactobacillus sp. (rodzina: Lactobacillaceae) - są to gramdodatnie pałeczki, które nie posiadają zdolności ruchu, ani wytwarzania przetrwalników. 10 Występują w jamie ustnej, drogach rodnych oraz błonach śluzowych przewodu pokarmowego ludzi i zwierząt, a także w mleku i na roślinach. Bakterie te są termofilami lub mezofilami i mają wysokie wymagania odżywcze [Libudzisz 2000]. Najlepiej rosną w podwyższonej temperaturze i pH 5,5 - 5,8 lub niższym. Przyczyniają się do kwaśnienia i zmiany barwy mięsa oraz wędlin. Mogą również wytwarzać substancje śluzowe z sacharozy [Stobińska i Żakowska 2000]. Rysunek 5 Enterococcus faecalis Źródło: http://www.bioquell.com/interface/assets/images/ content/Enterococcus_faecium_ faecalis_41503729_1.jpg Streptococcus (rodzina: Lactobacillaceae) - są to gramdodatnie paciorkowce kałowe zaliczane do mikroorganizmów przewodu pokarmowego. Występują w układzie dwoinek albo krótkich łańcuszków. Bakterie te nie wytwarzają przetrwalników. Ich wzrost możliwy jest w szerokim zakresie temperatur 10 45°C. Odznaczają się dużą odpornością na działanie wysokich i niskich temperatur, a także NaCl. Ich wzrost jest możliwy przy 6,5% stężeniu soli oraz pH sięgającym 9,6. Duża odporność na szereg czynników przyczynia się do stosowania tych bakterii jako wskaźnika zanieczyszczeń kałowych [Libudzisz 2000]. Najczęściej występującymi na mięsie bakteriami z tego rodzaju są Enterococcus faecalis oraz Enterococcus faecium. Bakterie te zwane są enterokokami kałowymi. Ważną cechą enterokoków jest duża odporność na wysoką temperaturę. Potrafią przeżyć ogrzewanie w temperaturze 60°C przez okres 30 minut. Rosną w szerokim zakresie temperatur od 5 - 8°C do 48 50°C. Spożycie produktów skażonych tymi drobnoustrojami może być przyczyną zatruć pokarmowych u ludzi. Toksyczność enterokoków głównie zależy od warunków ich wzrostu, a także wrażliwości poszczególnych osób [Grabowski 1993]. 11 1.2. Drobnoustroje chorobotwórcze Występowanie w surowym mięsie drobiowym bakterii patogennych jest zmienne. Najczęściej wynosi ono od 1 - 10 % w zależności od organizmu, praktyki rolniczej i czynników geograficznych. Obecność patogenów w mięsie musi być ściśle kontrolowana, zaczynając od systemu hodowli zwierząt rzeźnych, a kończąc na gotowym produkcie. Ważnym aspektem jest stosowanie Dobrej Praktyki Higienicznej (GHP), Dobrej Praktyki Produkcyjnej (GMP) oraz systemu HACCP [Sienkiewicz i Marmajewska 2013]. Zgodnie z Rozporządzeniem Komisji (WE) z 5 grudnia 2007 roku, w sprawie kryteriów mikrobiologicznych dotyczących środków spożywczych [Rozporządzenie Komisji (WE) z 5 grudnia 2007 roku], obecność bakterii chorobotwórczych z rodzaju Salmonella jest zabroniona w 25 g tkanki pobranej do badania. Obecność tego patogenu dyskwalifikuje produkt oraz wyklucza możliwość jego spożywania przez konsumentów. Z doniesień literaturowych [Sienkiewicz i Marmajewska 2013] wynika, że w 4 na 30 badanych próbek mięsa drobiowego stwierdzono obecność bakterii z rodzaju Salmonella w 25 g. W przypadku mięsa mielonego (łącznie przebadano 90 próbek z mięsa wołowego, wieprzowego i drobiowego) nie stwierdzono bakterii z rodzaju Salmonella. Ponadto liczba bakterii Escherichia coli każdorazowo była zgodna z wymaganiami Unii Europejskiej. 1.2.1. Charakterystyka typowych patogenów mięsa drobiowego Najważniejszymi i najgroźniejszymi patogenami występującymi na mięsie drobiowym są: Rysunek 6 Campylobacter jejuni Źródło: http://zoonoticecology.files.wordpress.com /2013/05/campylobacter-e1367919882392.jpg Campylobacter sp. (rodzina: Spirillaceae) - są to mikroaerofilne, gramujemne, skręcone spiralnie pałeczki o wymiarach 0,2 – 0,8 x 0,5 – 5 μm, urzęsione monotrychalnie. W przypadku niesprzyjających warunków środowiskowych (np. brak związków odżywczych) potrafią zmieniać kształt na kulisty. Bakterie te są zdolne do wzrostu w temperaturach od 30 do 47°C i pH 5 - 9. Jednak optymalny wzrost osiągają w temperaturze 40°C i pH od 6,5 do 7,5. 12 Campylobacter sp. są wrażliwe na wysuszenie, poniżej aw 0,987 nie dochodzi do namnażania tych bakterii. Są katalazododatnie, oksydazododatnie oraz nie fermentują węglowodanów. Czerpią energię z rozkładu aminokwasów. Pałeczki te bytują w jelitach zwierząt dzikich oraz hodowlanych (ptaki, bydło, owce) a także domowych (koty, psy). Mogą występować również w wodzie i osadach dennych [Libudzisz, Kowal i Żakowska 2009]. Za największą ilość przypadków kampylobakteriozy odpowiedzialne są bakterie Campylobacter jejuni, natomiast w mniejszym stopniu C. coli, C. fetus, C. hyointestinalis, C. upsaliensis oraz C. lari. Najczęściej dochodzi do skażenia tymi bakteriami spożywając drób, jaja oraz mleko nie poddane obróbce termicznej. Uważa się, iż każdy szczep zasiedlający drób jest potencjalnym źródłem infekcji u człowieka. Dawka infekcyjna dla organizmu ludzkiego wynosi ok. 400 - 800 koloni [Adedayo i Kirkpatrick 2008]. Badania przeprowadzone przez Państwowy Instytut Weterynaryjny wykazały iż 80 % tuszek kurcząt brojlerów charakteryzowało się obecnością termotolerancyjnych bakterii Campylobacter sp. na poziomie od 9,5 x 105 do 4,35 x 107 jtk/tuszkę [Kwiatek, Zasadny i Wojdat 2006]. Poziom skażenia tymi bakteriami gwałtownie wzrasta w czasie procesu skubania oraz patroszenia. Procesy te sprzyjają również przenoszeniu bakterii z jednej tuszki na drugą. Newralgicznym procesem jest oparzanie drobiu. Drobnoustroje nie zawsze zostają zniszczone nawet w temperaturach 55 - 60°C. Kocioł parzelny może stać się miejscem, w którym dochodzi do zanieczyszczeń krzyżowych. Również podział tuszek, w którym może dojść do zakażenia z głębokich warstw mięśni mikrobiologicznego punktu widzenia jest krytycznym [Szczepańska i punktem in. 2007]. Najważniejszym z czynników wirulencji Campylobacter jejuni jest tworzenie ciepłochwiejnej toksyny (CJT). Toksyna ta odznacza się znacznym podobieństwem immunologicznym do toksyny (CT) wytwarzanej przez Vibrio cholerae (przecinkowiec cholery) oraz ciepłochwiejnej toksyny Escherichia coli (I.T.). Okres wylęgania choroby wynosi od 2 do 5 dni. Początkowe stadium przypomina objawami grypę. Następnie pojawiają się biegunka (często ze śladowymi ilościami żółci lub krwi), silne bóle brzucha, nudności oraz bardzo rzadko wymioty. Zazwyczaj choroba ma przebieg łagodny i często ustępuje bez interwencji lekarskiej. W przypadku osób o osłabionej odporności 13 może dojść do groźnych objawów pozajelitowych, takich jak: zapalenie stawów, zespół hemolityczno-mocznicowy oraz posocznica. Rzadko dochodzi do śmierci zakażonej osoby. Liczba przypadków śmiertelnych wśród osób zainfekowanych bakteriami Campylobacter jejuni wynosi jeden na 1000 przypadków [Young, Davis i DiRita 2007]. Rysunek 7 Salmonella typhimurium Źródło: http://salmonellatyphi.org/salmonella_typhi_3.jpg Salmonella sp. (rodzina: Enterobacteriaceae) - są to gramujemne pałeczki o wymiarach 0,6 x 2 - 3 μm. Pałeczki te są względnymi beztlenowcami, w większości ruchliwymi (wyjątek stanowią S. gallinarum oraz S. pullorum), nie wytwarzającymi przetrwalników. Rosną w szerokim zakresie temperatur od 5,2 do 49°C, pH 4 – 9, a także w środowisku o aktywności wodnej powyżej 0,94. Bakterie te odznaczają się wrażliwością na wysoką temperaturę (nie przeżywają temp. powyżej 70°C), a zarazem są wyjątkowo odporne na wysuszenie. Latami mogą przeżywać w kurzu, suszonym kale, a także paszach i żywności. W środowisku wodnym przeżywają kilka miesięcy, natomiast w glebie nawet kilka lat. Bakterie z rodzaju Salmonella sp. są zdolne do fermentacji glukozy, nie fermentują natomiast laktozy oraz sacharozy, wytwarzają deaminazę ornityny i argininy, dekarboksylazę lizyny, siarkowodór. Naturalnym miejscem występowania tych bakterii jest przewód pokarmowy człowieka, zwierząt domowych, ptaków, owadów i gadów. Z miejsc tych przenoszą się do środowiska i powodują zanieczyszczenia gleby, wody oraz żywności. Głównym źródłem zakażeń człowieka są jaja, drób, mięso, mleko oraz przetwory mleczne. Dochodziło również do izolowania tych bakterii z ciastek, lodów, czekolady, soków, owoców, a nawet znajdowano ją w herbacie [Libudzisz, Kowal i Żakowska 2009]. U drobiu najczęściej stwierdza się obecność następujących szczepów: S. galinarum, S. pullorum, S. anatum, S. enteritidis, S. tenessee, S. typhi i S. typhimurium. Zabiegi 14 technologiczne stosowane w trakcie uboju drobiu nie niszczą oraz nie eliminują tych bakterii. W celu uniknięcia skażenia należy pamiętać o właściwej obróbce termicznej (stosowanie temp. powyżej 70°C), odpowiednim przechowywaniu mięsa (schładzanie poniżej 7°C ), a także higienicznym przygotowywaniu posiłków [Grabowski 1993]. Dawka 5 infekcyjna pałeczek Salmonella sp. dla zdrowych ludzi wynosi 10 - 107 jtk. Jednak w przypadku szczepu Salmonella typhimurium dawka ta jest znacznie niższa i wynosi 102 jtk. Salmonelloza objawia się biegunką, gorączką, bólami brzucha i mięśni, nudnościami i wymiotami. Okres inkubacji wynosi od 5 godzin do 5 dni, jednakże objawy zachorowania dostrzegalne są zazwyczaj po 12 - 48 godzinach w przypadku skażenia powyżej 105 jtk w spożytej żywności. Po przedostaniu się do organizmu człowieka, pałeczki Salmonella sp. zdolne są do kolonizacji oraz penetracji w głąb ściany jelita żywiciela. Po uwolnieniu endotoksyn zawartych w komórkach dochodzi do objawów choroby u człowieka. Przebieg zakażenia oraz jego postać kliniczna determinowane są wrażliwością osobniczą oraz wielkością skażenia. Śmiertelność dorosłych osób jest bardzo niska i wynosi 1 %, wyższa jest u dzieci poniżej 3 roku życia. Człowiek może być nosicielem pałeczek Salmonella sp. po przebytej chorobie. W przypadku skażenia bakteriami Salmonella typhi, chory może cierpieć na dur brzuszny i dur rzekomy [Libudzisz, Kowal i Żakowska 2009]. Rysunek 8 Listeria monocytogenes Źródło: http://cdn.c.photoshelter.com/img-get/ I0000fx5oYi_NAWA/s/600/600/166550.jpg Listeria sp. (rodzina: Corynebacteriaceae) - są to gramdodatnie pałeczki o wymiarach 0,5 x 2,0 μm. Mają tendencję do polimorfizmu, od form pośrednich między pałeczką a ziarniakiem, do form nitkowych i dłuższych pałeczek. Bakterie te rosną w warunkach tlenowych oraz w beztlenowych, w szerokim zakresie temperatur od 0 do 45°C, pH 4,4 - 9,4 oraz aktywności 15 wodnej powyżej 0,92 [Libudzisz, Kowal i Żakowska 2009]. Optymalną temperaturą wzrostu dla bakterii Listera sp. jest 37°C, jednakże są one zdolne do wzrostu i namnażania w warunkach chłodniczych (0 - 4°C), stąd też zalicza się je do tak zwanej mikroflory lodówkowej. Bakterie te wykazują pewną ciepłooporność (niektóre szczepy potrafią przeżyć w 80°C przez 5 minut), wysoką odporność na zasolenie (do 10 % NaCl) [Bajard i in. 1996]. Listeria sp. potrafi przeżyć w wilgotnej ziemi nawet do roku, natomiast w suchej glebie i kale do 2 lat. Pałeczki te wytwarzają nieliczne rzęski w temperaturze 20 25°C, nie wytwarzają natomiast przetrwalników oraz otoczek. Są katalazododatnie, oksydazoujemne, wykazują zdolność do fermentacji sacharydów (w tym ksylozy czy mannitolu). Do rodzaju Listeria należy siedem gatunków: L. monocytogenes, L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri, L. ivanovii oraz L. grayi. Dla człowieka gatunkami chorobotwórczymi są L monocytogenes, a także L. ivanovii. Szczepy Listeria monocytogenes są szeroko rozpowszechnione w środowisku naturalnym, występują w glebie, wodzie, trawach, gnijącej roślinności czy ściekach, Źródłem tych pałeczek są również zwierzęta: bydło, ptaki, psy, owady oraz ryby. Około 1 - 10 % ludzi jest nosicielem tych bakterii [Libudzisz, Kowal i Żakowska 2009]. Bakterie Listeria monocytogenes wywołują chorobę zwaną listeriozą. Do zakażenia dochodzi zwykle w wyniku spożycia produktów pochodzenia zwierzęcego, tj. mleka, fermentowanych surowych kiełbas, drobiu czy surowych i wędzonych ryb, a także produktów roślinnych, w tym warzyw (marchew, kalafior, sałata) i owoców [Vázquez-Boland i in. 2001]. Dawka infekcyjna tej bakterii dla zdrowej osoby wynosi od 104 do 109 jtk/g spożytej żywności [Kowalik, Łobacz i Tarczyńska 2013]. Chorobotwórczość pałeczek Listeria sp. związana jest z wytwarzaniem przez nie toksyn oraz enzymów. Bakterie te produkują hemolizynę zwaną listeriolizyną O, fosfolipazę C, lecytynazę oraz metaloproteazy. Zdrowi ludzie zwalczają zwykle infekcję bez pomocy lekarskiej, cierpiąc na zapalenie żołądka i jelit. Na listeriozę chorują zwykle osoby o obniżonej odporności immunologicznej organizmu, z chorobami nowotworowymi, kobiety w ciąży, dzieci, osoby starsze, nosiciele wirusa HIV. Okres inkubacji listeriozy wynosi od 11 dni do kilku tygodni. Coraz częściej występują jednak przypadki listeriozy o czasie inkubacji do 24 godzin 16 [Vázquez-Boland i in. 2001]. Typowymi objawami tej choroby są: zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, zapalenie węzłów chłonnych, wsierdzia, szpiku i kości oraz ogólnonarządowa bakteriemia [McGann, Wiedmann i Boor 2007]. Liczba zgonów wywołanych listeriozą jest bardzo wysoka i wynosi od 30 do nawet 50 % [Libudzisz, Kowal i Żakowska 2009]. Rysunek 9 Staphylococcus aureus Źródło: http://www.micronaut.ch/wp-content/uploads/ 2012/12/%C2%A9-Micronaut-BacteriaStaphylococcus-aureus-001b014.jpg Staphylococcus sp. (rodzina: Micrococcaceae) - do tej rodziny należą między innymi: S. intermedius, S. huicus, S. epidermidis, S. chromogenes jednak głównym przedstawicielem jest patogenny Staphylococcus aureus (gronkowiec złocisty). Są to gramdodatnie, względnie beztlenowe, nieruchliwe, nieprzetrwalnikujące ziarniaki, o średnicy komórek 0,4 - 1 µm, występujące w układach gronkowców. Rosną w zakresie temperatur od 7 do 48°C, przy pH 4 - 10 oraz aktywności wodnej obniżonej nawet do 0,83. Optymalny wzrost osiągają jednak w 37°C i pH wynoszącym 6 - 7. Ziarniaki te są katalazo i ureazododatnie, fermentują glukozę, mannitol i trehalozę. Źródłem zanieczyszczeń gronkowcem złocistym jest głównie człowiek. Szacuje się, że prawie połowa społeczeństwa to nosiciele gronkowców. Innymi źródłami skażeń są: mięsa, wędliny (głównie krojone), przetwory rybne, mleko, lody, wyroby cukiernicze z kremem czy wyroby garmażeryjne [Libudzisz, Kowal i Żakowska 2009]. Czynnikami wirulencji Staphylococcus aureus są wytwarzane enzymy, takie jak: koagulaza, fosfataza, fibrynolizyna, proteaza, hyaluronidaza, penicylinaza, lipaza, kazeinaza czy dezoksyrybonukleaza oraz enterotoksyny [Grabowski 1993]. Dawka infekcyjna Staphylococcus aureus wynosi 103 - 108 jtk [Leggett, Cornwallis i West 2012]. Zatrucie gronkowcem objawia się głównie nudnościami, wymiotami, bólami i skurczami brzucha oraz biegunką. Objawy te zwykle ustępują po 24 godzinach. Ukąszenie zainfekowanego zwierzęcia może spowodować zapalenie tkanki łącznej, 17 rumień, łagodne powiększenie węzłów i naczyń chłonnych [Murray i in. 2003]. Choroby skórne (utrata skóry, pęcherze, krosty, czyraki, liszaje, ropnie, utrata płynów, zapalenie mieszków włosowych) spowodowane są wytwarzanymi przez gronkowca toksynami (w tym TSST - 1). Bardzo rzadko zakażenie bakteriami Staphylococcus aureus może prowadzić do martwiczego zapalenia powięzi u osób z obniżoną odpornością immunologiczną [Kluytmans, van Belkum i Verbrugh 1997]. Rysunek 10 Yersinia enterocolitica Źródło:http://2.bp.blogspot.com/WL71DqEH64A/UW6wq TUZXGI/AAAAAAAAAS0/Sb01LH0CuUQ/s1600/ enterecoilitica.jpg Yersinia sp. (rodzina: Enterobacteriaceae) - do tego rodzaju bakterii należą: Y. pestis, Y. pseudotuberculosis oraz Y. enterocolitica. Yersinia enterocolitica to zdolne do ruchu, gramujemne, względnie beztlenowe, krótkie pałeczki o wymiarach 0,5 - 1 x 1 - 2,5 µm. Bakterie te są zdolne do wzrostu w szerokim zakresie temperatur (od -2 do 45°C) oraz pH (4,2 – 9). Optimum wzrostu osiągają w temperaturze 22 - 29°C i pH 7,2 - 7,4. Minimalna aktywność wodna dla tych pałeczek wynosi 0,95 [Libudzisz, Kowal i Żakowska 2009]. Bakterie te są katalazododatnie, oksydazoujemne, wytwarzają ureazę, potrafią fermentować glukozę, mannitol i sacharozę, są zdolne do dekarboksylacji ornityny jednak nie wykazują aktywności dekarboksylazy lizynowej i argininowej [Atobla i in. 2012]. Źródłami zanieczyszczeń tymi bakteriami jest gleba i woda. Szczepy chorobotwórcze dla ludzi występują u zwierząt domowych, bydła, ptactwa oraz dziko żyjących zwierząt. Choroba spowodowana bakteriami Yersinia enterocolitica zwana jest jersiniozą. Jersinioza najczęściej spowodowana jest spożyciem mięsa, przetworów melczarskich, owoców morza, ryb oraz warzyw [Libudzisz, Kowal i Żakowska 2009]. Czynnikiem wirulencji tej bakterii jest tworzona przez nią ciepłostabilna enterotoksyna Yst, ale patogenność Y. enterocolitica wynika głównie z obecności białek Yop, które odpowiadają między innymi za 18 zdolność adhezji do błony śluzowej jelita oraz unikanie mechanizmów obronnych gospodarza, przez niszczenie komórek fagocytarnych zainfekowanego organizmu [Platt-Samoraj, Bancerz-Kisiel i Szweda 2006]. Dawka infekcyjna tej bakterii wynosi 104 - 106 jtk [Sreedharan, Jones i Schneider 2012]. Okres inkubacji jersiniozy wynosi od 8 do 10 dni, a czas trwania jest zróżnicowany (5 - 21 dni). Objawami jelitowymi jersiniozy są: bóle brzucha, biegunka, wymioty oraz gorączka. W przypadku osób w wieku 20 - 30 lat może przybierać objawy charakterystyczne dla ostrego zapalenia jelita ślepego, razem z zapaleniem węzłów chłonnych krezki oraz części końcowej jelita krętego [Libudzisz, Kowal i Żakowska 2009]. Rysunek 11 Pseudomonas aeruginosa Źródło: http://pl.wikipedia.org/wiki/Pa%C5%82 eczka_ropy_b%C5%82%C4%99kitnej# mediaviewer/Plik:Pseudomonas.jpg Pseudomonas sp. (rodzina: Pseudomonadaceae) - bakterią patogenną z tego rodzaju jest Pseudomonas aeruginosa. Jest to gramujemna, nieprzetrwalnikująca, tlenowa pałeczka o wymiarach 0,5 - 0,8 x 1,5 - 3,5 µm, posiadająca umieszczoną biegunowo wić. Bakteria ta jest prototrofem, ma bardzo małe wymagania wzrostowe (potrafi wykorzystać niekonwencjonalne źródła węgla i azotu). Optimum wzrostu osiąga w 37°C, jednak potrafi rosnąć również w temperaturze 42°C. Jest także odporna na wysokie stężenia NaCl [Todar 2012]. Pseudomonas aeruginosa występuje powszechnie na terenach podmokłych, takich jak: rzeki, ścieki, jeziora, gleba ale także na powierzchni roślin i skórze zwierząt. Jest to bakteria oportunistyczna, wywołuje zakażenie tylko u osób z obniżoną odpornością [Łozowska 2013]. Pałeczki te mają wiele czynników zjadliwości. Wśród nich można wyróżnić związane z powierzchnią komórki bakteryjnej: fimbrie, rzęski, śluz, lipopolisacharydy (LPS), lektyny, a także uwalniane na zewnątrz komórki: egzotoksynę A (hamuje biosyntezę białek), egzoenzymy S, T, U oraz Y, alkaliczną proteazę, proteazę typu IV, neuraminidazę, elastazę typu A i B, fosfolipazę hemolityczną 19 i niehemolityczną oraz barwnik piocyjaninę. Każdy z wymienionych czynników wirulencji wywołuje odmienne objawy patologiczne w zależności od miejsca anatomicznego, w którym doszło do procesu zapalnego [Wolska i in. 2013]. Gastrycznymi objawami zakażenia pałeczką Pseudomonas aeruginosa mogą być: bakteriemia z następową sepsą, martwicze zapalenie jelita czy zakażenie tkanek odbytnicy. W przypadku skażenia innymi drogami może dojść do: infekcji w obrębie ucha środkowego i zewnętrznego (tzw. ucho pływaka), zakażenia układu oddechowego, zapalenia opon mózgowordzeniowych i ropień mózgu, zakażenia układu moczowego, zakażenia kości i stawów czy zakażenia gałki ocznej u pacjentów z soczewkami kontaktowymi. Leczenie skażenia tymi pałeczkami jest bardzo trudne, gdyż Pseudomonas aeruginosa jest bakterią oporną na większość antybiotyków ze względu na niską przepuszczalność jej błony zewnętrznej [Mesaros i in. 2007]. 2. Trwałość mięsa drobiowego Mięso charakteryzuje się wysoką aktywnością wodną, wysokim pH, jest bogate w białko i witaminy oraz zawiera węglowodany i składniki mineralne. Dlatego też, świeże mięso jest surowcem nietrwałym i stanowi doskonałe podłoże dla wzrostu mikroflory zarówno saprofitycznej, jak i chorobotwórczej [Danyluk i Kostecki 2014]. Rozwój mikroflory saprofitycznej działa niekorzystnie na jakość mięsa, poprzez zmiany, takie jak: świecenie, zmiany barwnikowe, oszronienie czy opleśnienie, które to prowadzą do późniejszego rozkładu gnilnego tkanki mięsnej. W przypadku mikroflory chorobotwórczej, jej obecność stanowi zagrożenie dla konsumentów i mięso takie nie powinno być dopuszczone do obrotu handlowego. Wydłużenie terminu przydatności do spożycia mięsa drobiowego wiąże się z zastosowaniem zabiegów utrwalających [Malaszewski 2006]. 2.1. Metody przedłużania trwałości mięsa drobiowego Metody przedłużania trwałości mięsa można podzielić na grupy w zależności od czynnika jakim działamy. Są to: metody fizyczne - wykorzystanie niskich oraz wysokich temperatur, metody fizykochemiczne - wędzenie oraz solenie, metody chemiczne - peklowanie. 20 W celu ograniczenia rozwoju drobnoustrojów na mięsie drobiowym, powszechnie stosuje się niskie temperatury chłodnicze (0 - 10°C), a także zamrażalnicze (-30 - 0°C). Jednak najważniejszym czynnikiem przedłużającym trwałość mięsa jest obniżenie aktywności wodnej. Następuje to w wyniku stosowania soli kuchennej, roztworów cukru oraz procesu zamrażania. Aby uzyskać pełną inaktywację mikroorganizmów bytujących na mięsie stosuje się ogrzewanie różnymi metodami oraz działanie promieniowaniem jonizującym. W przypadku wędzenia czy peklowania drobiu rezultatem są jedynie: ograniczenie rozwoju bakterii oraz pożądane cechy sensoryczne produktu. Przechowywanie tuszek drobiowych w atmosferze gazów ochronnych jest nowością wśród metod przedłużania trwałości mięsa drobiowego [Olszewski 2007]. Chłodzenie i zamrażanie Przechowywanie mięsa w warunkach drobnoustrojów psychrofilnych oraz chłodniczych uniemożliwia ogranicza rozwój dynamikę rozwoju mikroorganizmów chorobotwórczych, który jest hamowany w temperaturze 4,5°C. Opóźnione jest również wytwarzanie enzymów przez bakterie. Rysunek 12 przedstawia temperatury mające szczególne znaczenie zarówno mikrobiologiczne, jak i jakościowe dla produktów drobiarskich: Rysunek 12 Temperatury wpływające na trwałość produktów drobiarskich. Źródło: Opracowanie własne na podstawie Olszewski 2007. 21 Procesowi zamrażania można poddawać mięso, które charakteryzuje się wysoką jakością i dobrym stanem mikrobiologicznym. Proces ten jednak powoduje szereg zmian, w tym zmiany histologiczne, denaturację białek, zmiany lipidów, zmiany barwy oraz utratę masy [Olszewski 2007]. Obróbka cieplna W technologii mięsa drobiowego podstawowym procesem jest ogrzewanie. Obróbka cieplna może być wykorzystywana jako metoda utrwalania oraz przygotowania mięsa drobiowego do spożycia, a także jako cząstkowy zabieg w procesach wędzenia i suszenia. Zadaniem ogrzewania jest unieczynnienie enzymów własnych mięsa oraz doprowadzenie do stanu anabiozy lub chociażby semibiozy żywych komórek drobnoustrojów, bądź ich całkowitego zniszczenia [Olszewski 2007]. Istnieje kilka metod ogrzewania: sterylizacja (stosowane są temperatury powyżej 100°C) - zniszczeniu ulegają wszystkie formy drobnoustrojów razem z ciepłoopornymi przetrwalnikami bakterii, a także zarodnikami termofilnych grzybów pleśniowych. W praktyce można jednak spotkać w produkcie tzw. mikroflorę resztkową. Podczas sterylizacji zniszczeniu ulegają również przetrwalniki bakterii Clostridium botulinum, wytwarzające bardzo silne toksyny botulinowe. pasteryzacja (stosowane są temperatury poniżej 100°C) - podczas tego procesu w większości zniszczeniu ulegają formy wegetatywne bakterii saprofitycznych oraz wszystkie mikroorganizmy patogenne wrażliwe na działanie wysokiej temperatury. Zagrożeniem konserw pasteryzowanych jest możliwa obecność ciepłoopornych bakterii kałowych z rodzaju Enterococcus, a w szczególności E. faecium i E. faecalis [Grabowski 1993]. suszenie - zabieg prowadzony za pomocą gorącego powietrza jest najbardziej ekonomicznym sposobem. Jednakże działanie wysokiej temperatury powoduje niekorzystne zmiany: barwy, zapachu oraz smaku. Dlatego też dla mięsa stosuje się suszenie sublimacyjne. Mięso poddawane jest procesowi zamrożenia, a następnie usuwa się z niego wodę poprzez sublimację lodu. Jakość takiego mięsa jest znacznie wyższa niż suszonego gorącym powietrzem. Przeżywalność drobnoustrojów zależy przede wszystkim od szybkości procesu, a także temperatury sublimacji. Podczas rehydratacji dochodzi do namnożenia mikroorganizmów, które przeżyją proces suszenia [Olszewski 2007]. 22 Stosowanie wysokich temperatur w procesie utrwalania mięsa wiąże się z szeregiem nieodwracalnych zmian. Ogrzewanie przyczynia się do: ubytku masy, wycieków, zmniejszenia objętości mięsa, denaturacji i koagulacji jego białek oraz zmniejszenia ich rozpuszczalności. Zawarte w mięsie witaminy również ulegają stratom. W największym stopniu dotyczy to witamin z grupy B, a w szczególności tiaminy [Grabowski 1993]. Wędzenie Dym używany był od wieków do konserwowania mięsa. Proces wędzenia polega na nasyceniu produktu składnikami dymu wędzarniczego, usunięciu wilgoci, a ponadto nadaje wyrobowi pożądany zapach i smak. Może jednak dochodzić do zmian wartości żywieniowej mięsa. Fenole, kwasy organiczne, karbonyle (alkohole, aldehydy, ketony), estry i węglowodory występujące w składzie dymu wędzarniczego mają działanie bakteriostatyczne oraz bakteriobójcze. Działanie to odnosi się głównie do powierzchni mięsa, ponieważ stopień jego wniknięcia w głąb produktu jest znikomy. Najwrażliwsze na dym wędzarniczy są wegetatywne formy mikroorganizmów. Zarodniki pleśni i przetrwalniki (endospory) są znacznie odporniejsze. Dlatego proces wędzenia nie zabezpiecza całkowicie mięsa przed rozwojem Clostridium botulinum, gdyż w sprzyjających warunkach, ocalałe po procesie wędzenia, przetrwalniki mogą kiełkować i przekształcić się w wirulentne formy wegetatywne. Świeżo wędzone mięso może charakteryzować się obecnością bakterii gramdodatnich z gatunku Staphylococcus epidermidis, a także bakterii z rodzaju Micrococcus i Bacillus, natomiast nie stwierdza się występowania bakterii gramujemnych [Libudzisz, Kowal i Żakowska 2009]. Solenie i peklowanie Solenie jest najstarszą metodą utrwalania mięsa. Zabieg ten polega na obniżeniu aktywności wodnej, a więc zmniejszeniu dostępności wody dla wzrostu drobnoustrojów, który to proces prowadzi do zjawiska plazmolizy komórek drobnoustrojów. Częściowy ubytek wody jest z kolei przyczyną wzrostu ciśnienia osmotycznego wewnątrz ich komórek, a następnie pękania. Wzrost większości gramujemnych pałeczek (również chorobotwórczych), a także bakterii przetrwalnikujących z rodzaju Bacillus i Clostridium (w tym Clostridium botulinum) zostaje zahamowany w przypadku aktywności wodnej wynoszącej < 0,95. Gronkowce charakteryzują się wyższą odpornością na niską aktywność wodną. Sololubne (halofilne) bakterie mają zdolność do rozwoju przy aw = 0,75. Natomiast bakterie chorobotwórcze 23 (w tym Salmonella sp.), gnilne Pseudomonas sp. i Achromobacter sp. nie są w stanie przeżyć w środowisku, w którym stężenie soli wynosi więcej niż 6% [Dave i Ghaly 2011]. Peklowanie to proces, który opiera się głównie na działaniu azotynu. Związek ten pełni potrójną funkcje. Przede wszystkim hamuje wzrost bakterii chorobotwórczych, w tym Clostridium botulinum, stabilizuje charakterystyczny różowy kolor mięsa, nadaje pożądaną barwę i smak oraz działa przeciwutleniająco. W obecności azotynu istnieje możliwość rozwoju nielicznych bakterii, między innymi Staphylococcus aureus [Preservation by Chilling, Heating and Other Means 2002]. Zarówno solenie jak i peklowanie mają swoje wady. W wyniku solenia mięso traci dużą część wody, staje się szare i sztywniejsze. Ponadto traci cenne składniki odżywcze (rozpuszczalne w wodzie białka i fosforany). W następstwie procesu peklowania dochodzi do nieodwracalnych zmian barwy i niesie on ze sobą ryzyko wprowadzania do organizmu człowieka pewnej ilości związków kancerogennych [Dave i Ghaly 2011]. Utrwalanie radiacyjne Napromieniowanie tuszek drobiowych przyczynia się do przedłużenia ich trwałości mikrobiologicznej poprzez zredukowanie ogólnej liczby bakterii. Znacznie zmniejsza też prawdopodobieństwo przeżycia niektórych bakterii chorobotwórczych (między innymi Salmonella sp.). Dawki używane w procesie wynoszą średnio do 7 kGy. Użycie promieniowania rzędu 2 – 7 kGy powoduje zmniejszenie prawdopodobieństwa przeżycia bakterii aż o cztery cykle logarytmiczne (104) w stosunku do wartości skażenia początkowego. Mięso napromieniowane znacznie różni się od mięsa świeżego. Zmianom ulega jego barwa, smak oraz zapach. Dochodzi do strat witamin oraz zmian we frakcji tłuszczowej. Powstają związki karbonylowe oraz nadtlenki [Grabowski 1993]. Gazy ochronne Stosowanie pakowania w atmosferze ochronnej (MAP) przyczynia się do przedłużenia trwałości mięsa drobiowego. W procesie tym stosuje się naturalne gazy, między innymi: azot, dwutlenek węgla, a także mieszanki gazowe. Zaletą pakowania w atmosferze ochronnej jest opóźnianie wzrostu bakterii i pleśni, zmniejszenie utraty wody oraz masy produktów, obniżenie aktywności enzymatycznej i biochemicznej, a także utrzymanie aromatu i barwy mięsa przy jednoczesnym przedłużeniu jego okresu przechowywania. Pakowanie próżniowe 24 zmniejsza zawartość tlenu przy jednoczesnym wzroście ilości CO2, powodując zahamowanie rozwoju szkodliwych mikroorganizmów. Stężenie dwutlenku węgla powyżej 10 % przyczynia się do zahamowania wzrostu bakterii oraz pleśni (w tym typowo gnilnych Pseudomonas sp. i Achromobacter sp.). Pakowanie takie jest jednak kosztowną metodą przedłużania trwałości mięsa, wymagającą odpowiedniej linii technologicznej [Olszewski 2007]. 2.2. Naturalne substancje konserwujące Wśród konsumentów rośnie świadomość i chęć spożywania żywności o wysokiej wartości odżywczej, wolnej od chemikaliów, w tym konserwantów chemicznych, a przy tym bezpiecznej mikrobiologicznie. Dlatego też poszukuje się nowych metod przedłużania trwałości mięsa. Naturalne konserwanty można podzielić na trzy zasadnicze grupy: produkty pochodzenia roślinnego (np. zioła i przyprawy), pożądane drobnoustroje i/lub ich metabolity (np. bakterie kwasu mlekowego, bakteriocyny), składniki przeciwdrobnoustrojowe z innych produktów (np. lizozym, awidyna, konalbumina itp.) [Yadav i Singh 2004]. Najnowsze badania [Jayasena i Jo 2013] wykazują, iż olejki eteryczne pochodzące z takich roślin jak: czosnek, oregano, rozmaryn, tymianek, goździki, melisa, imbir, kolendra, majeranek, szałwia, kurkuma, koper, gałka muszkatołowa czy bazylia mogą być skutecznie stosowane w mięsie oraz produktach mięsnych jako naturalne dodatki o charakterze przeciwdrobnoustrojowym zarówno wobec patogenów (w tym Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica) jak i mikroorganizmów odpowiedzialnych za psucie mięsa (w tym Pseudomonas fluorescens, Serratia liquefaciens, Bacillus subtilis). Poszczególne olejki charakteryzują się zróżnicowanym działaniem antybakteryjnym. Olejki te można dodać bezpośrednio do produktów (częściowe ograniczenia ze względu na intensywny zapach i smak), ale również wykorzystać w tzw. inteligentnych opakowaniach. Ekstrakty z pestek winogron oraz kory sosny wykazywały lepsze działanie w opóźnianiu skażenia mikrobiologicznego bakteriami z rodzajów: Listeria, Salmonella oraz Escherichia w świeżo mielonej wołowinie niż syntetyczne przeciwutleniacze i konserwanty BHA i BHT. Ekstrakty te również opóźniały proces utleniania mięsa [Daniells 2006]. 25 Kolejnymi roślinami przebadanymi w aspekcie przedłużania trwałości były: aronia, cząber, dziki czosnek, chrzan, czerwona porzeczka oraz borówka brusznica. Badano ich właściwości przeciwdrobnoustrojowe wobec następujących bakterii: Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, i Echerichia coli. Naukowcy z Danii nadal są w trakcie testowania, w jaki sposób najlepiej dodać te rośliny do mięsa oraz badają klientów w celu sprawdzenia ich reakcji na takie dodatki do mięsa [Benson 2012]. Bakterie kwasu mlekowego oraz ich metabolity: takie jak kwas mlekowy i bakteriocyny również bada się w celu ich wykorzystania do przedłużenia trwałości mięsa. Do tej pory jedyną komercyjnie wykorzystywaną bakteriocyną jest nizyna. Przeciwgrzybicze oraz przeciwbakteryjne działanie wykazuje również polisacharyd chitosan [Zhou, Xu i Liu 2010]. W pracy magisterskiej zrealizowanej w Katedrze Przyrodniczych Podstaw Jakości Uniwersytetu Ekonomicznego w Poznaniu [Mrugalski 2011] wykazano, iż 60% roztwór miodu charakteryzuje się silnym działaniem przeciwdrobnoustrojowym wobec bakterii bytujących na filetach drobiowych. Kolejne badania przeprowadzone w tej samej Katedrze [Michalczyk 2012] dowodzą, iż dodatek zmiażdżonego chińskiego czosnku do 60% roztworu miodu nie polepsza właściwości antybakteryjnych, ale delikatnie wpływa na jego osłabienie (w mięsie zakonserwowanym miodem nastąpiła redukcja ze stanu 1,1 x 103 do 2,0 x 102 jtk/cm2, natomiast konserwacja mięsa miodem z dodatkiem czosnku przyniosła redukcje z poziomu 4,4 x 102 do 1,7 x 102 jtk/cm2). Badania te były prowadzone na mięsie wieprzowym. Badania w ramach pracy inżynierskiej [Szofer 2013] prowadzone na filetach drobiowych, wykazały, iż mieszanina konserwująca składająca się z 60% roztworu miodu gryczanego z dodatkiem czosnku (polskiego) oraz suszonych ziół (oregano, tymianek, rozmaryn) odznacza się działaniem bakteriobójczym, a także bakteriostatycznym. Świadczyła o tym redukcja ilości bakterii tlenowych bytujących na powierzchni mięsa drobiowego o jeden/dwa cykle logarytmiczne po pierwszej dobie przechowywania w lodówce (z poziomu 104 do 102 – 103 jtk/cm2). W przypadku mięsa nie poddanego konserwacji po takim samym czasie przechowywania w lodówce, poziom skażenia wzrastał mniej więcej 10 krotnie w porównaniu do skażenia początkowego, osiągając pułap 104 – 105 jtk/cm2. Efekt konserwujący takiego układu widoczny był również po 48 h przechowywania mięsa w warunkach chłodniczych. 26 3. Surowce naturalne posiadające potencjał przeciwdrobnoustrojowy 3.1. Miód Zgodnie z rozporządzeniem Rady (WE) nr 1234/2007 z dnia 22 października 2007 roku [Rozporządzenie WE z 22 października 2007] produkt spożywczy można nazywać miodem jeśli spełnia kryteria definicji brzmiącej: „miód jest naturalnie słodką substancją produkowaną przez pszczoły Apis mellifera z nektaru roślin lub wydzielin żywych części roślin, lub wydalin owadów wysysających żywe części roślin, zbieranych przez pszczoły, przerabianych przez łączenie specyficznych substancji z pszczół, składanych, odwodnionych, gromadzonych i pozostawionych w plastrach do dojrzewania.” Aktualnie to rozporządzenie jest jedynym aktem wiążącym dla pszczelarzy i jednostek zajmujących się produkcją oraz dystrybucją miodów. 3.1.1. Skład chemiczny Skład chemiczny miodów jest bardzo zróżnicowany pod względem jakościowym oraz ilościowym. Zależy on przede wszystkim od pożytku, z którego pszczoły zbierały nektar lub spadź. W różnych odmianach miodu odkryto do tej pory ponad 300 różnych składników chemicznych. Jednakże wiele z nich występuje w miodach tylko w śladowych ilościach [Piotraszewska-Pająk 2002; Kędzia i Hołderna-Kędzia 1996]. Węglowodany są głównym składnikiem miodów. Ich procentowa zawartość jest różna i wynosi od 70 - 80 % [Ellnain-Wojtaszek 1998] do 98 - 99 % [Piotraszewska-Pająk 2002]. Dominującymi cukrami w miodzie są monosacharydy: glukoza (ok. 30 %) oraz fruktoza (ok. 38 %). Stosunek tych dwóch cukrów na ogół jest wyrównany, bądź fruktoza występuje w nieznacznej przewadze [Mateo i Bosch-Reig 1997; Piotraszewska-Pająk 2002]. W miodach można znaleźć również di-, tri-, a także oligosacharydy, zwane dekstrynami miodowymi. Cukrem, który występuje w każdej odmianie miodów i należy do disacharydów, jest sacharoza. Jej zawartość w dojrzałym miodzie jest zmienna i wynosi 1 - 5 % wszystkich cukrów. W czasie przechowywania miodu zawartość sacharozy obniża się ze względu na działanie enzymów pszczelich [Piotraszewska-Pająk 2002]. Kolejnymi dwucukrami są maltoza, której zawartość może dochodzić do kilkunastu procent, oraz trehaloza [Kędzia i Hołderna-Kędzia 1996]. W śladowych ilościach (0 - 3 %) można również znaleźć w składzie chemicznym takie dwucukry jak: izomaltoza, maltuloza, nigeroza, turanoza, kojibioza, laminaribioza, gencjobioza czy neotrehaloza [Földházi 1994]. Pośród trisacharydów występują: erloza, rafinoza oraz w największych ilościach melecytoza (8 - 12 %). Wyższe 27 oligosacharydy stanowią ostatnią frakcję cukrową w miodach, a należą do nich: czterocukierstachioza oraz pięciocukier-werbaksoza [Kędzia i Hołderna-Kędzia 1996]. Kolejnym stałym składnikiem miodu jest woda. Średnia jej zawartość w miodach wynosi 17,7 % [Nagai i in. 2005]. Zgodnie z Rozporządzeniem Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi [Rozporządzenie MRiRW z 14 stycznia 2009] maksymalna zawartość wody w miodzie może wynosić 20 %, a w przypadku miodu wrzosowego 23 % ze względu na jego właściwości tiksotropowe. Przekroczenie dopuszczalnej granicy zawartości wody świadczyć może o niedojrzałości miodu lub zafałszowaniu, a tym samym o jego niższej jakości. Zawartość pierwiastków chemicznych (w tym również tzw. biopierwiastków) jest zróżnicowana. W miodach nektarowych wynosi od 0,1 - 0,3 do maksymalnie 0,6 %, natomiast w spadziowych 0,45 - 1,0 %. Łącznie w miodzie wykryto 47 pierwiastków, a wśród nich między innymi: potas, wapń, fosfor, magnez, żelazo, jod czy fluor [Gałuszka 1998]. Obecność witamin w składzie chemicznym miodu uzależniona jest od obecności pyłku kwiatowego oraz mleczka pszczelego, dlatego ich zawartość jest niewielka. Zazwyczaj w miodzie występują witaminy z grupy B (B1, B2, B6, kwas foliowy, kwas nikotynowy, kwas pantotenowy). Średnia zawartość witaminy C wynosi 22 µg/g, a w miodach gryczanych może osiągnąć nawet 120 µg/g. W niektórych miodach stwierdza się również obecność prowitaminy witaminy A, czyli β-karoten [Kędzia i Hołderna-Kędzia 1996]. W składzie chemicznym miodów można znaleźć również kwasy organiczne (w tym: glukonowy, jabłkowy, cytrynowy, winowy, szczawiowy czy mlekowy) i nieorganiczne (solny oraz fosforowy). Kwasy są jednym z wielu czynników kształtujących smak miodu. Ogólna zawartość tych związków oscyluje w granicach 0,05 – 1,2 % [Ellnain-Wojtaszek 1998]. Przeciętna zawartość związków azotowych (aminokwasy i białka) w miodzie wynosi około 0,2 %. Jest ona różna w zależności od odmiany miodu. W miodach nektarowych ich zawartość wynosi 0,015 – 0,05 %, w miodach wrzosowych oraz spadziowych 0,2 – 0,4 %, a w miodach mieszanych 0,03 – 0,2 %. W szczególnych przypadkach ich zawartość może dochodzić nawet do 2,9 % suchej masy miodu [Gałuszka 1998]. W różnych odmianach miodów rozpoznano od 11 do 21 wolnych aminokwasów. W największych ilościach występuje prolina, kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, leucyna, oraz w mniejszych ilościach: alanina, arginina, cystyna czy fenyloalanina [Prabucki 1998]. Również albuminy i globuliny, czyli białka proste, wchodzą w skład chemiczny miodu [Gałuszka 1998]. Swoistymi białkami obecnymi w składzie każdego miodu są enzymy. Pełnią one funkcję biokatalizatorów. Trafiają do miodu głównie wraz ze śliną pszczół, a także w mniejszych 28 ilościach z nektaru i pyłku. Enzymami jakie można znaleźć w miodzie są: amylazy, α- i βglukozydazy, oksydaza glukozowa, katalaza, fosfataza, lizozym oraz oksydaza kwasu askorbinowego [Doner 1991]. Szerszy opis składu chemicznego miodu znajduje się w pracy inżynierskiej pt. „Wpływ układu konserwującego ”miód – czosnek – zioła” na wzrost bakterii tlenowych bytujących na powierzchni filetów drobiowych” [Szofer 2013]. 3.1.2. Właściwości przeciwdrobnoustrojowe Jedną z najcenniejszych właściwości miodów jest działanie ich przeciwdrobnoustrojowe. Jest ono determinowane przez czynniki fizykochemiczne, a także biologiczne i chemiczne. Do tych czynników zaliczają się wysokie ciśnienie osmotyczne, kwaśny odczyn środowiska oraz obecność w składzie chemicznym, takich związków jak: oksydaza glukozowa, lizozym oraz flawonoidy i polifenole [Kędzia i Hołderna-Kędzia 1996]. Sposób działania tych czynników został przypomniany w pracy inżynierskiej pt. „Wpływ układu konserwującego ”miód – czosnek – zioła” na wzrost bakterii tlenowych bytujących na powierzchni filetów drobiowych” [Szofer 2013]. Aby miód zachował swoje antybiotyczne działanie należy pamiętać o jego właściwym przechowywaniu, a także nie ogrzewaniu powyżej 50°C. Przegrzanie miodu, czyli ogrzewanie powyżej tej temperatury, powoduje całkowitą inaktywację obecnych w miodzie związków o charakterze przeciwdrobnoustrojowym. Przechowywanie miodu przez 6 miesięcy doprowadza do osłabienia jego aktywności o około 50 %, a po 18 miesiącach następuje prawie całkowity zanik właściwości antybiotycznych [Kędzia i Hołderna-Kędzia 1996]. Szerokie spektrum działania miody wykazują wobec drobnoustrojów odpowiedzialnych za psucie żywności. Dzięki swoim właściwościom antybiotycznym hamują bądź spowalniają wzrost następujących mikroorganizmów: Aspergillus niger, Alcaligenes faecalis, Bacillus cereus, Bacillus stearothermophilus, Geotrichum candidum, Lactobacillus acidophilus, Penicillium expansum oraz Pseudomonas fluorescens [Mundo i in. 2004]. Jednak dużo ważniejsze jest działanie miodu na mikroorganizmy patogenne dla człowieka. Tabela 1 ukazuje wrażliwe na działanie miodów mikroorganizmy oraz choroby przez nie powodowane. 29 Bakterie gramdodatnie Tabela 1 Mikroorganizmy wrażliwe na działanie miodu oraz choroby przez nie powodowane. Rodzaj mikroorganizmu Choroba Bacillus anthracis wąglik Corynebacterium diphtheriae błonnica (dyfteryt) Mycobacterium tuberculosis Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae Streptococcus mutans Streptococcus pyogenes Bakterie gramujemne Listeria monocytogenes Escherichia coli gruźlica zatrucia pokarmowe, choroby skórne (ropnie czyraki itp.), zakażenia ran zapalenie ucha, zapalenie opon mózgowych, zapalenia płuc, zapalenia zatok próchnica, bakteriemia infekcje ucha, liszajec, gorączka połogowa, gorączka reumatyczna, szkarlatyna, zapalenie gardła, zakażenia ran listerioza biegunka, posocznica, zakażenia dróg moczowych Haemophilus influenzae infekcje ucha, zakażenia układu oddechowego, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, Klebsiella pneumoniae zapalenie płuc Proteus sp. posocznica, zakażenia układu moczowego bakteriemia z następową sepsą, zakażenia układu oddechowego i moczowego, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, infekcje ucha biegunka, wymioty, posocznica, dur brzuszny, infekcje ran zakażenia dróg moczowych, posocznica, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych czerwonka Pseudomonas aeruginosa Salmonella sp. (w tym S. typhi, S. typhimurium S. enterica Serratia marcescens Vibrio cholerae cholera Pierwotniaki choroba wrzodowa Trichomonas vaginalis rzęsistkowica Grzyby Shigella sp. Helicobacter pylori Candida sp. (w tym C. albicans, C. tropicalis) kandydoza (grzybica) Źródło: Opracowanie własne na podstawie Hołderna-Kędzia i Kędzia 2002, Mundo i in. 2004, Bogdanov i in. 2008, Küçük 2007. 30 3.2. Czosnek Czosnek jest jedną z najstarszych roślin uprawnych. Informacje o stosowaniu czosnku sięgają czasów neolitycznych i pochodzą z ok. 3000 lat p.n.e. Starożytni Egipcjanie używali czosnku nie tylko jako przyprawy, ale również jako zabezpieczenie przeciwko infekcyjnym chorobom przewodu pokarmowego. Podobnie miało to miejsce w krajach śródziemnomorskich oraz na Półwyspie Arabskim. Hipokrates zalecał używać czosnku jako środka moczopędnego, stymulującego czynności układu pokarmowego, pobudzającego krwawienie miesięczne u kobiet oraz w schorzeniach układu oddechowego. Galen uważał go natomiast za lek przeciwko wielu schorzeniom. Podkreślał przede wszystkim jego antytoksyczne działanie. W czasach średniowiecza zalecało się czosnek jako środek przeciwrobaczy i wzmacniający. W dzisiejszych czasach ponownie wraca się do stosowania czosnku jako naturalnego leku o szerokim spektrum działania [Lutomski 2001]. 3.2.1. Skład chemiczny Bulwa czosnku składa się głównie z wody (65 %), węglowodanów (28 %), białka (2 %), błonnika (1,5 %) oraz niewielkiej ilości tłuszczu (0,15 %). Średni ząbek surowego czosnku ma wartość energetyczną ok. 5 kcal i zawiera 12 mg potasu, ponad 5 mg wapnia, 4,59 mg fosforu, 0,94 mg witaminy C, a także niewielkie ilości witamin: A, B1, B2, B3, PP oraz innych składników mineralnych. Ponadto w czosnku zawarte są co najmniej 33 związki siarki (w tym: allina, ajoen, trisiarczek i disiarczek diallilu, garlicyna oraz skorydynina A i B), 10 różnych cukrów, peptydy, pektyny, polisacharydy, saponiny, a także enzymy. W składzie chemicznym czosnku obecne są również fitosterole oraz flawonoidy [Garlic: A Guide - The Herb Society of America]. 3.2.2. Właściwości przeciwdrobnoustrojowe Dane literaturowe [Kemper 2000] wykazują, iż czosnek ma działanie przeciwbakteryjne, przeciwgrzybiczne, przeciwpierwotniakowe oraz przeciwwirusowe. Tak silną aktywność wobec mikroorganizmów czosnek zawdzięcza obecności związków zawierających w swojej budowie siarkę. Działanie antybakteryjne czosnku przejawia się wobec bakterii gramdodatnich oraz gramujemnych. Aktywność czosnku jest bardzo szeroka i obejmuje następujące szczepy bakterii z rodzajów: Aeromonas, Bacillus, Bacteroides, Campylobacter, Citrobacter, Clostridium, Enterococcus, Escherichia, Klebsiella, Lactobacillus, Leuconostoc, Listeria, 31 Micrococcus, Proteus, Providentia, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Vibrio i Yersinia. Swoją aktywność przeciwgrzybiczą wykazuje wobec grzybów strzępkowych, zwanych potocznie pleśniami (Aspergillus sp., Candida sp., Microsporum sp.) oraz drożdży (Cryptococcus sp., Rhodotorula sp., Torulopsis sp., Trichosporon sp.). Podatne na działanie czosnku są również pierwotniaki. Wykazano, iż czosnek działa na następujące pierwotniaki: Crithidia fasciculata i Leptomonas collosoma (przenoszone przez komary, powodują trypanosomozy), Entamoeba histolytica (pełzak czerwonki, powoduje amebozy, bytuje w jelicie grubym, wątrobie, płucach oraz śledzionie), Leishmania major (patogen wewnątrzkomórkowy układu odpornościowego, powoduje leiszmaniozę), oraz Giardia lamblia (pasożyt jelitowy, powoduje giardiozę). Udowodniono także, iż czosnek jest zdolny do hamowania rozwoju wielu wirusów, w tym Influenzae B virus (wirus grypy typu B), Parainfluenzae virus typ 3 (wirus paragrypy typu 3), Herpes Simplex typ 1 i 2 (wirus opryszczki pospolitej, HSV), Cytomegalovirus (wirus cytomegalii, CMV, HCMV), Vesicularvirus (wirus zapalenia jamy ustnej) oraz Rhinovirus typ B (Rinowirus HRV-B) [Kędzia 2010]. Najsilniejsze działanie przeciwdrobnoustrojowe przypisuje się allicynie. W składzie chemicznym czosnku jest ona nieobecna. Powstaje na skutek przekształcenia alliny w biologicznie czynną formę jaką jest allicyna. Następuje to w wyniku działania enzymu zwanego allinazą. Co najmniej 10 % całkowitej zawartości białka w czosnku stanowi enzym allinaza. W wyniku zgniecenia bądź gotowania ząbków czosnku dochodzi do procesu zmiany alliny w allicynę [Ankri i Mirelman 1999]. Rysunek 13 ukazuje ten proces. Rysunek 13 Proces przekształcenia alliny w allicynę. Źródło: https://allicincenter.com/pdf/Allicin.pdf Mikroorganizmy wykazują zmienną wrażliwość na allicynę. Przykłady tego zróżnicowania przedstawiono w tabelach 2 i 3: 32 Tabela 2 Wrażliwość grzybów na allicynę. Nazwa grzyba Najmniejsze stężenie hamujące MIC (μg/mL) Candida albicans 0.3 Candida albicans (szczep kliniczny) 0.8 Candida neoformans 0.3 Candida parapsilosis 0.15 Candida tropicalis 0.3 Candida krusei 0.3 Torulopsis glabrata 0.3 Torulopsis glabrata (szczep kliniczny) 1.9 Źródło: Ankri i Mirelman 1999. Tabela 3 Wrażliwość bakterii na allicynę. Nazwa bakterii Stężenie allicyny (LD50 μg/ml) Escherichia coli 15 Escherichia coli (szczep kliniczny) 15 Staphylococcus aureus 12 Streptococcus pyogenes 3 Streptococcus β hemolyticus >100 Proteus mirabilis 15 Proteus mirabilis (szczep kliniczny) >30 Pseudomonas aeruginosa 15 Pseudomonas aeruginosa (szczep kliniczny) >100 Klebsiella pneumoniae 8 Enterococcus faecium >100 Źródło: Ankri i Mirelman 1999. 3.3. Zioła Obecnie rośliny zielarskie przeżywają swój renesans. Używamy ich nie tylko w kuchni, ale również w celach farmakologicznych. Stajemy się świadkami odżywania starych sposobów w leczeniu chorób za pomocą ziół. Szukamy również innowacyjnych zastosowań surowców zielarskich, gdyż nauka nieustannie dostarcza nam nowych informacji na temat ich przeciwdrobnoustrojowych właściwości [Lutomski 2001]. 33 3.3.1. Tymianek Tymianek pospolity (Thymus vulgaris L.) znany był i stosowany już w starożytności. W antycznym Egipcie wykorzystywano go do balsamowania zwłok ludzkich, a także jako kadzidło. Tymianku używano również do sporządzania napojów uzdrawiających, w leczeniu chorób płuc oraz jako środek przeciwkaszlowy. Obecnie stosuje się tymianek między innymi w celu łagodzenia objawów nadkwaśności, ostrych nieżytów żołądka i jelit, czy zakażeń górnych i dolnych dróg oddechowych [Kędzia i in. 2012]. 3.3.1.1. Skład chemiczny W liściach tymianku znajduje się olejek eteryczny w ilościach 0,5 – 2,5 %. Najważniejszymi składnikami tego olejku są pochodne fenolowe, takie jak tymol (18 – 80 %) oraz jego izomer karwakrol (1 – 20 %). Oprócz tego, tymianek zawiera monoterpeny, a w śród nich: α-pinen, β-pinen, p-cymen, α-terpinen, mircen, limonen, a także alkohole terpenowe, tj. borneol, octan borneolu, linalol, octan linalolu, α- terpineol i 1,8-cyneol w ilościach 0 – 19 % [Sebeşan i Cărăban 2008]. W zależności od miejsca pochodzenia tymianek różni się składem chemicznym. Informacje zawarte w tabeli 4 ukazują te różnice. Tabela 4 Różnice w składzie chemicznym tymianku w zależności od kraju pochodzenia. Zawartość [%] Składnik Maroko Turcja Brazylia Rumunia tymol 0.24 46.21 44.7 30.86 karwakrol brak danych 2.44 2.4 3.37 α-pinen 9.35 2.97 0.8 1.23 β-pinen 4.23 0.71 brak danych 0.32 p-cymen 1.19 9.91 18.6 30.53 γ -terpinen 0.55 14.08 16.5 brak danych mircen 3.21 3.45 2.4 1.63 limonen brak danych 1.23 0.8 0.62 linalol 0.14 3.99 brak danych 2.73 borneol 4.92 brak danych 0.5 3.16 1,8-cyneol 5.45 1.96 brak danych 1.24 Źródło: Opracowanie własne na podstawie Imelouane i in. 2009; Shabnum i Wagay 2011; Grigore i in. 2010; Porte i Godoy 2008. 34 3.3.1.2. Właściwości przeciwdrobnoustrojowe Olejek tymiankowy charakteryzuje się aktywnością przeciwko różnym drobnoustrojom. Wśród nich znajduje się szereg bakterii tlenowych i beztlenowych oraz grzybów. Obecnie mechanizm działania olejku nie jest jeszcze dokładnie poznany, jednakże przeprowadzone badania wykazują, iż olejek uszkadza ścianę komórkową i błonę cytoplazmatyczną komórek mikroorganizmów, a także hamuje syntezę białek. [Dobre, Gagiu i Petru 2011]. Zgodnie z danymi literaturowymi [Dorman i Deans 2000] olejek tymiankowy wykazuje działanie przeciwdrobnoustrojowe wobec następujących mikroorganizmów: Aeromonas hydrophila, Bacillus subtilis, Clostridium sporogenes, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Lactobacillus plantarum, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella pullorum, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus oraz Yersinia enterocolytica. Poszczególne składniki chemiczne olejku tymiankowego charakteryzują się różnymi właściwościami przeciwdrobnoustrojowymi. W tabeli 5 przedstawiono strefy zahamowania wzrostu wybranych bakterii przez niektóre składniki olejku tymiankowego, które uzyskano w badaniach przeprowadzonych metodą studzienkową. Tabela 5 Hamowanie wzrostu wybranych bakterii przez składniki olejku tymiankowego. Strefa zahamowania wzrostu mikroorganizmu [mm] Mikroorganizm tymol Karwakrol α-pinen β-pinen linalol α- terpineol Bacillus subtilis 39.2 39.5 brak brak 14.0 brak Clostridium sporogenes brak 20.3 5.7 7.5 20.3 8.8 Enterococcus faecalis 26.3 21.2 9.2 7.8 16.7 brak Escherichia coli 34.3 29.2 8.9 7.8 13.8 6.1 Pseudomonas aeruginosa 13.4 26.0 brak 6.5 brak 6.3 Salmonella pullorum 31.5 27.1 7.9 6.0 7.5 16.5 Staphylococcus aureus 31.6 20.2 8.3 7.4 9.0 brak Yersinia enterocolytica 27.7 22.4 6.6 5.8 9.5 brak Źródło: Opracowanie własne na podstawie Dorman i Deans 2000. 3.3.2. Oregano Oregano (Origanum vulgare) było znane i wykorzystywane już w starożytności. Egipcjanie cenili je za lecznicze, odkażające i konserwujące właściwości. Grecy uważali, iż 35 napój z oregano działa odprężająco, a także rozgrzewająco. Często stosowali je w czasie kąpieli czy masażu. W średniowieczu używano go natomiast jako środka chroniącego przed skwaśnieniem mleka. Oregano cieszy się również szeroką historią stosowania w celach leczniczych. W różnych postaciach zalecano je między innymi: na ukąszenia jadowitych zwierząt, jako lek uśmierzający bóle głowy, środek wiatropędny, uspokajający, wzmacniający nerwy oraz leczący choroby płucne czy hemoroidy. Do dzisiaj stosuje się lebiodkę jako lek żołądkowy, przeciwzapalny, moczopędny, antyseptyczny i przeciwskurczowy. Pomaga również w leczeniu zapalenia oskrzeli, zaburzeń trawienia oraz chorób dróg oddechowych [Mścisz i Czosnowska 2008]. 3.3.2.1. Skład chemiczny Liście oregano mają bardzo bogaty skład chemiczny. Lebiodka zawiera flawonoidy (w tym apigeninę, luteolinę, kempferol), kwasy fenolowe (w tym p-hydrobenzoesowy, galusowy, ferulowy, rozmarynowy), seskwiterpeny, triterpeny (kwas oleanolowy, kwas ursolowy), garbniki (ok. 8 %), gorycze, olejek eteryczny (do 1,3 %), oleożywice, taniny oraz sterole. Olejek eteryczny bogaty jest w karwakrol (60 – 75 %), octan geranylu, tymol (do 5 %), borneol, cymol, linalol, pinen oraz kariofilen [Mockutë, Bernotienë i Judþentienë 2004]. Ziele lebiodki zawiera również składniki mineralne. Są to: wapń, potas, magnez, fosfor, siarka, żelazo. Jest również bogatym źródłem składników o właściwościach antyoksydacyjnych. W 100 g oregano stwierdzono zawartość 4,2 - 23,1 mg kwasu Laskorbinowego oraz 25,5 - 51,0 mg karotenoidów [Nurzyńska-Wierdak 2012]. Istnieją bardzo duże różnice w składzie chemicznym w zależności od miejsca pochodzenia oregano. Lebiodka rosnąca dziko w Turcji charakteryzuje się dużym udziałem: kariofilenu (14,4 %), spatulenolu (11,6 %), germakremu D (8,1 %), α - terpineolu (7,5 %) oraz linalolu (2,1 %). Głównymi składnikami uprawianego na Węgrzech oregano są: p-cymen (22,3 %), tlenek kariofilenu (10,2 %), sabinen (7,9 %), γ - terpinen (5,1 %) i niewielka ilość tymolu (0,34 %). Olejek eteryczny pochodzący z polskiej uprawy oregano charakteryzował się następującym składem chemicznym: sabinen (5,46 – 35,52 %), terpinen-4-ol (0,96 – 18,48 %), β - kariofilen (0,39 – 11,85 %) i tlenek kariofilenu (0,13 – 12,79 %), cyneol (0,75–13,03 %). Tymol występuje w mniejszej ilości (0,21 – 7,35 %). Największe ilości tymolu oraz karwakrolu cechują oregano włoskiego pochodzenia [Nurzyńska - Wierdak 2012]. 36 3.3.2.2. Właściwości przeciwdrobnoustrojowe Obecność tymolu oraz karwakrolu w składzie chemicznym oregano jest głównym czynnikiem decydującym o jego właściwościach przeciwdrobnoustrojowych. Lebiodka wykazuje działanie zarówno wobec grzybów (Aspergillus sp., Candida albicans) jak i gramujemnych (Escherichia coli, Salmonella enterica, Klebsiella pneumoniae) [Mścisz i Czosnowska 2008] oraz gramdodatnich bakterii (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis) [Hać - Szymańczuk, Lipińska i Grzegrzółka 2012], a także wirusów oraz pierwotniaków (Herpes sp., Giardia sp., Eimeria sp.) [Mścisz i Czosnowska 2008]. Kolejne badania [Derwich i in. 2010] poszerzają listę mikroorganizmów, wobec których oregano wykazuje swoje przeciwdrobnoustrojowe właściwości. Tabela 6 przedstawia najmniejsze stężenie olejku z oregano hamujące rozwój badanych drobnoustrojów. Tabela 6 Wrażliwość bakterii na olejek z oregano. Nazwa mikroorganizmu Najmniejsze stężenie hamujące MIC (mg/ml) Staphylococcus aureus 0.10 Bacillus subtilis 0.15 Listeria monocytogenes 0.19 Clostridium botulinum 0.98 Clostridium perfringens 1.58 Escherichia coli 1.82 Pseudomonas aeruginosa 2.25 Salmonella typhimurium 3.12 Campylobacter jejuni 3.84 Vibrio cholerae 4.02 Źródło: Derwich i in. 2010 Oprócz działania przeciwdrobnoustrojowego oregano wykazuje również właściwości antymutagenne. Obecnie mechanizm tego działania nie jest jeszcze dokładnie poznany. Naukowcy [Ozbek i in. 2008] wnioskują, iż efekt antymutagenny może być związany z obecnością karwakrolu w olejku eterycznym, który zmniejsza wymianę chromatyd 37 siostrzanych. Z drugiej strony aktywność ta może być spowodowana właściwościami przeciwutleniającymi oregano, które zawiera w swym składzie chemicznym takie związki jak: kariofilen, spatulenol, germakrem D czy α - terpineol. 3.3.3. Rozmaryn Rozmaryn lekarski (Rosmarinus officinalis L.), podobnie jak oregano i tymianek, znane było już w starożytności. Uważano go za święte ziele, którym dekorowano trumny lub nagrobki. Zwyczaj ten praktykowano również w okresie średniowiecza i później. W Grecji studenci nosili girlandy z rozmarynu, który miał za zadanie stymulować ich pamięć i umysł. Wykorzystywano go również w bukietach ślubnych oraz dodawano do wina małżonków, co miało im pomóc w zapamiętaniu ich świętych ślubów na zawsze. W czasach średniowiecza był używany jako składnik kadzideł czy perfum. Miał za zadanie chronić domostwo przed czarną zarazą oraz zapewnić szczęście domownikom. Zioło to wykorzystywano również w celach leczniczych. Było lekarstwem na złe trawienie, migreny, choroby stawów oraz bóle mięśni [Rosemary, That's for Remembrance]. Obecnie udowodniono, iż rozmaryn stabilizuje błony biologiczne, chroni przed szkodliwym działaniem promieni jonizujących oraz UV, działa przeciwutleniająco, przeciwzapalnie, przeciwmutagennie, a także posiada właściwości przeciwbakteryjne, przeciwgrzybiczne, przeciwwirusowe oraz przeciwnowotworowe [Kowalska i Olejnik 2010]. 3.3.3.1. Skład chemiczny Zawartość składników chemicznych w rozmarynie jest bardzo bogata. Najszerzej występującymi składnikami olejku rozmarynowego są: 1,8-cyneol (17 - 50 %), pinen (15 25 %), kamfora (10 - 25 %), borneol (8 - 20 %), estry borneolu (2 - 7%), terpineol (ok. 12 %), verbenon (1 - 8 %) oraz kamfen (ok. 5 %). Rozmaryn zawiera również: p-cymen, linalol, geraniol, eugenol, karwakrol czy piperyton. Ekstrakty z rozmarynu cechują się zawartością takich składników, jak: garbniki (5 - 8 %), taniny, diterpeny (kwas karnozolowy i karnozol), pikrosalwina (do 4,6 %), rozmanol, rozmaridofenol), triterpeny (α-amyryna, βamyryna, kwas oleanolowy, kwas ursolowy, betulina), steroidy, flawonoidy oraz fitosterole (apigenina – 0,45 mg/g, luteolina – 0,26 mg/g, diosmetyna – 0,21 mg/g, hesperytyna – 0,36 mg/g). Obecne w rozmarynie substancje są labilne przez co ich ilość jest zmienna i wynika z wieku rośliny, czynników środowiskowych (wilgotność, temperatura, oświetlenie), a także uwarunkowań genetycznych [Kowalska i Olejnik 2010]. Dane zawarte w Tabeli 7 ukazują te różnice. 38 Tabela 7 Różnice w składzie chemicznym rozmarynu w zależności od kraju pochodzenia. Zawartość [%] Składnik Maroko Iran Brazylia 1,8-cyneol 5.25 23.14 19.35 kamfora 6.02 12.35 2.42 α-pinen 18.25 9.87 41.63 β-pinen 4.58 6.10 2.40 borneol 3.10 5.61 3.10 verbenon 0.24 0.11 3.86 kamfen 5.02 5.58 4.73 α - terpineol 2.89 4.30 0.68 Źródło: Opracowanie własne na podstawie Tavassoli i in. 2011; Derwich, Benziane i Chabir 2011; Atti - Santos i in. 2005. 3.3.3.2. Właściwości przeciwdrobnoustrojowe Przeciwdrobnoustrojowa aktywność rozmarynu uwarunkowana jest jego składem chemicznym. Głównymi składnikami hamującymi wzrost mikroorganizmów są α-pinen, 1,8cyneol, kamfora, borneol [Tavassoli i in. 2011]. Prowadzone badania wykazują szerokie spektrum działania przeciwdrobnoustrojowego rozmarynu. Zioło to hamuje wzrost następujących mikroorganizmów: Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli i Pseudomonas aeruginosa [Wang i in. 2012], Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Listeria grayi, Listeria innocua [Rožman i Jerŝek 2009]. Badania prowadzone przez Kowalską i Olejnik [Kowalska i Olejnik 2010] wykazały, iż silniejszym działaniem bakteriobójczym charakteryzował się olejek eteryczny niż ekstrakty wodne czy metanolowe z rozmarynu. Najwyższą aktywnością przeciwdrobnoustrojową odznaczały się heksanowe i etylooctanowe ekstrakty z rozmarynu. Wykazywały one zdolność hamowania wzrostu: Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa oraz grzybów Candida albicans i Microsporum gypseum. Olejek rozmarynowy silniej działał na bakterie gramdodatnie niż na gramujemne. Ekstrakty pozyskiwane z rozmarynu wykazują również wysoką aktywność w stosunku do bakterii Helicobacter pylori oraz wywołujących próchnicę bakterii Streptococcus mutans i Streptococcus sobrinus. Olejek eteryczny z rozmarynu zawierający: 1,8-cyneol, tymol, p-cymen, piperyton, α-pinen, limonen i terpinen wykazuje działanie 39 przeciwgrzybicze wobec Aspergillus flavus i Aspergillus parasiticus. Przy stężeniu olejku wynoszącym 450 μg/g hamowana jest zdolność syntezy aflatoksyn. 40 CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA 1. Materiał badawczy Miód gryczany – do badań wybrano trzy próby miodu gryczanego, pochodzące z różnych rejonów Polski. Miody do momentu badania przechowywano w warunkach chłodniczych, w temperaturze ok. 4°C. Tabela 8 przedstawia miejsca pochodzenia oraz zbioru pożytku przez pszczoły badanych miodów. Tabela 8 Pochodzenie prób miodów. Odmiana miodu Miejsce pochodzenia Miód gryczany (A) Miejsce zbioru Rok pożytku produkcji Krystyna Bargańska Łupawa Luzino (woj. pomorskie) 2013 Gospodarstwo Pasieczne Miód gryczany (B) Pszczeli Dar Boboszów Górny Adam Polański (woj. dolnośląskie) 2013 Międzylesie Pasieka Smolecka Miód gryczany (C) Maciej Klimowicz Smolec Długopole Zdrój (woj. dolnośląskie) 2013 Źródło: Opracowanie własne Czosnek - zakupiony w markecie spożywczym na terenie miasta Poznania Zioła (tymianek, rozmaryn, oregano) - w postaci suszu, zakupione w markecie spożywczym na terenie miasta Poznania. 1.1. Wzorcowe szczepy bakterii: Campylobacter jejuni ATTC 33291 Salmonella typhimurium ATCC 2565 Listeria monocytogenes ATCC 1911 Staphylococcus aureus ATCC 33862 Yersinia eterocolitica ATCC 9610 Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 41 2. Stosowane podłoża mikrobiologiczne PCA (Plate Count Agar) LAB-AGAR™; producent: BIOCORP Polska spółka z o.o., Brain Heart Infusion LAB-AGAR™; producent: BIOCORP Polska spółka z o.o. 3. Stosowana aparatura szafa laminarna Heraeus HS9, mini wytrząsarka typu Vortex, firmy Biomix, densytometr, firmy BIOSAN, autoklaw, firmy Varioklav, lodówka, cieplarka, płyta grzewcza, firmy Ceran, palnik gazowy, jednorazowe, jałowe płytki Petriego o średnicy 9 cm, pipeta automatyczna wraz z jałowymi tipsami o objętości 1 cm3 oraz 0,2 cm3, 4. Metodyka 4.1. Standaryzacja inokulatów Każdorazowo przed przystąpieniem do badań testowane bakterie przeszczepiano, ze skosów pochodzących z hodowli czystych kultur kolekcyjnych Katedry Przyrodniczych Podstaw Jakości UEP na świeżo przygotowane odpowiednie podłoża stałe (skosy). Następnie inkubowano je w cieplarce w temperaturze optymalnej dla ich wzrostu (37°C) w celu uzyskania hodowli 24-godzinnych. Wyhodowane w ten sposób bakterie przenoszono do probówek z roztworem soli fizjologicznej (9 cm3) za pomocą jałowej ezy. Przed przystąpieniem do pomiaru gęstości optycznej za pomocą densytometru, przygotowaną zawiesinę drobnoustrojów mieszano przy użyciu Vortexu. Gęstość wybranych do badań drobnoustrojów ustalono na poziomie 0,5 w skali McFarlanda, co odpowiada stężeniu komórek 108 jtk/cm3. Następnie za pomocą rozcieńczeń dziesiętnych ustalano kolejną gęstość inokulatu na poziomie 105 jtk/cm3. Tak przygotowane inokulaty posiewano na jałowe płytki Petriego metodą zalewową. Badanie prowadzano w trzech równoległych powtórzeniach. 42 Posiewy wykonywano w następujący sposób: każdorazowo za pomocą jałowej pipety automatycznej pobierano 1 cm3 inokulatu i wysiewano go na płytkę Petriego, następnie zalewano, odpowiednią dla danego drobnoustroju (tabela 9), upłynnioną i schłodzoną do ok. 40°C pożywką. W celu zapewnienia równomiernego wzrostu mikroorganizmów w całej objętości podłoża, zalaną płytkę Petriego mieszano delikatnie ruchem kolistym. Po zastygnięciu wycinano studzienki o średnicy 10 mm, za pomocą jałowego korkoboru. Tabela 9 Podłoża hodowlane dla badanych drobnoustrojów. Rodzaj mikroorganizmu Stosowana pożywka Campylobacter jejuni Brain Heart Infusion LAB-AGAR™ Salmonella typhimurium Brain Heart Infusion LAB-AGAR™ Listeria monocytogenes Brain Heart Infusion LAB-AGAR™ Staphylococcus aureus PCA (Plate Count Agar) LAB-AGAR™ Yersinia eterocolitica PCA (Plate Count Agar) LAB-AGAR™ Pseudomonas aeruginosa PCA (Plate Count Agar) LAB-AGAR™ Źródło: Opracowanie własne 4.2. Przygotowanie mieszanin konserwujących W celu sporządzenia mieszanin konserwujących przygotowywano: 100 cm3 60% roztworu wodnego miodu gryczanego, stanowiącego bazę całej mieszaniny, roztarty z wodą czosnek (1 g czosnku + 1 cm3 wody) oraz roztarty z wodą susz ziołowy: rozmaryn, oregano, tymianek (1,5 g suszonych ziół + 1,5 cm3 wody). Każdorazowo odważano po 1 g obranego czosnku i miażdżono go w moździerzu z przegotowaną i dobrze schłodzoną wodą, aby uzyskać miazgę czosnkową (stos. 1:1 w/w). Kolejnym etapem było naważenie każdego z ziół w ilości 0,5 g (łącznie 1,5 g suszu) i postępowanie w taki sam sposób jak w przypadku czosnku, tzn. roztarcie z 1,5 cm3 wody w celu otrzymania miazgi (stos. 1:1 w/w). Zalane wodą zioła rozcierano w moździerzu, aby uwolnić związki o działaniu przeciwdrobnoustrojowym. Wprowadzoną razem z dodatkami wodę, uwzględniano w przygotowaniu 60 % roztworu miodu. Procedura przygotowania mieszanin konserwujących została opracowana w ramach pracy inżynierskiej "Wpływ układu konserwującego ”miód – czosnek – zioła” na wzrost bakterii tlenowych bytujących na powierzchni filetów drobiowych" [Szofer 2013]. Łącznie przebadano trzy mieszaniny konserwujące, różniące się pochodzeniem geograficznym miodu. Nadano im nazwy: 43 układ I - mieszanina zawierająca miód gryczany A, układ II - mieszanina zawierająca miód gryczany B, układ III - mieszanina zawierająca miód gryczany C oraz pozostałe składniki. 4.3. Badanie właściwości przeciwdrobnoustrojowych Po przygotowaniu odpowiednich inokulatów (gęstość zawiesin: 108 i 105 jtk/cm3) wytypowanych do badania bakterii patogennych: Campylobacter jejuni, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia enterocolitica, wykonywano posiewy w sposób opisany w pkt. 4.1. Po zastygnięciu pożywek i schłodzeniu ich w lodówce (30 min) wycinano studzienki, do których następnie wlewano za pomocą jałowej pipety 100 µl odpowiedniego układu konserwującego. Na każdej płytce znajdowały się trzy studzienki: w dwóch umieszczano próbki badanych mieszanin konserwujących, a w trzeciej roztwór soli fizjologicznej jako próbę kontrolną. Tak przygotowane płytki wstawiano na 2 godziny do lodówki w celu dyfuzji układów konserwujących do podłoża. Po upływie tego czasu płytki przenoszono do cieplarki i inkubowano je przez 24 oraz 48 godzin w optymalnej dla badanych drobnoustrojów temperaturze (37°C). W przypadku bakterii Campylobacter jejuni ze wględu na jego mikroaerofilny charakter, płytki przed inkubacją zaklejano parafilmem. Po zakończeniu inkubacji dokonywano pomiaru strefy całkowitego hamowania lub ograniczenia wzrostu testowanych mikroorganizmów. W tym celu mierzono średnice wokół studzienek w mm. 44 5. Wyniki i dyskusja 5.1. Wyniki badań mikrobiologicznych Ze względu na powszechne występowanie patogennej bakterii Campylobacter jejuni na mięsie drobiowym ważne było, z punktu widzenia skuteczności działania opracowanych układów konserwujących, sprawdzenie czy będą one także hamowały wzrost tej niebezpiecznej dla zdrowia konsumenta bakterii. Tabela 10 ukazuje wyniki stopnia hamowania wzrostu szczepu wzorcowego Campylobacter jejuni przez sporządzone układy konserwujące po 24 i 48 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C, w warunkach mikroaerofilnych. Zawarte w tabeli (oraz pozostałych tabelach) dane są średnimi wynikami z trzech równoległych powtórzeń (n = 3). Tabela 10 Stopień hamowania wzrostu bakterii Campylobacter jejuni przez badane układy konserwujące. Gęstość inokulatu 105 jtk/cm3 Gęstość inokulatu 108 jtk/cm3 Strefa hamowania [mm] Strefa hamowania [mm] Układ 24 h 48 h 24 h 48 h I 24 22 19 17 II 26 23 17 15 III 24 22 14 14 Średnia 25 22 17 15 SD 1,79 2 2,12 1,79 V 7,21 % 9,10 % 12,72 % 11,74 % Legenda: Układ I - mieszanina zawierająca miód gryczany A Układ II - mieszanina zawierająca miód gryczany B Układ III - mieszanina zawierająca miód gryczany C SD - odchylenie standardowe V - współczynnik zmienności Źródło: Opracowanie własne oraz pozostałe składniki. Zgodnie z danymi zamieszczonymi w tabeli 10 widać wyraźnie, iż każdy opracowany układ spowodował zahamowanie wzrostu bakterii Campylobacter jejuni. Silniejsze hamowanie wzrostu drobnoustrojów zaobserwowano w przypadku niższego stężenia bakterii 45 wynoszącego 105 jtk/cm3, aniżeli w przypadku stężenia 108 jtk/cm3. Dawka infekcyjna dla człowieka wynosi ok. 4 – 8 x 102 jtk [Adedayo i Kirkpatrick 2008], dlatego też można wnioskować, iż zakonserwowanie mięsa proponowaną mieszaniną skutecznie zahamuje wzrost Campylobacter jejuni, a tym samym zapobiegnie ewentualnemu zakażeniu człowieka tą groźną bakterią chorobotwórczą. Efekt bakteriostatyczny utrzymywał się jeszcze po 48 godzinach inkubacji bakterii i odnotowano jedynie nieznaczny spadek siły działania opracowanych układów konserwujących (rys 14). 30 Wielkość strefy hamowania wzrostu [mm] 25 20 15 Gęstość inokulatu Y 10 Gęstość inokulatu Z 5 0 24 h 48 h Rysunek 14 Strefy hamowania wzrostu bakterii Campylobacter jejuni. Legenda: Gęstość inokulatu Y - stężenie 105 jtk/cm3 Gęstość inokulatu Z - stężenie 108 jtk/cm3 Czerwoną linią zaznaczono średnicę studzienki (ø = 10 mm) Źródło: Opracowanie własne Zdjęcia (rys 15 i 16) ukazują wzrost i strefy zahamowania bakterii Campylobacter jejuni na płytkach Petriego spowodowane działaniem trzech układów konserwujących. 46 Rysunek 15 Strefy hamowania wzrostu Campylobacter jejuni w zawiesinie o gęstości 105 jtk/cm3. Legenda: 0 - próba kontrolna; 1 - Układ I; 2 - Układ II; 3 - Układ III Źródło: Zdjęcie własne Rysunek 16 Strefy hamowania wzrostu Campylobacter jejuni w zawiesinie o gęstości 108 jtk/cm3. Legenda: 0 - próba kontrolna; 1 - Układ I; 2 - Układ II; 3 - Układ III Źródło: Zdjęcie własne Równie niebezpiecznymi oraz często występującymi na mięsie drobiowym patogenami są bakterie z rodzaju Salmonella. Wyniki działania badanych układów konserwujących na szczep wzorcowy bakterii z gatunku Salmonella typhimurium po 24 oraz 48 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C zawarto w tabelach 11 i 12. 47 Tabela 11 Stopień hamowania i ograniczenia wzrostu bakterii Salmonella typhimurium w zawiesinie o gęstości 105 jtk/cm3 przez badane układy konserwujące. Gęstość inokulatu 105 jtk/cm3 24 h 48 h Strefa Strefa Strefa Strefa hamowania ograniczonego hamowania ograniczonego [mm] wzrostu [mm] [mm] wzrostu [mm] I 22 45 22 42 II 21 39 19 33 III 21 45 21 41 Średnia 21 43 21 39 SD 1,22 3,19 1,33 4,82 V 5,74 % 7,46 % 6,49 % 12,28 % Układ Legenda: Układ I - mieszanina zawierająca miód gryczany A Układ II - mieszanina zawierająca miód gryczany B Układ III - mieszanina zawierająca miód gryczany C SD - odchylenie standardowe V - współczynnik zmienności oraz pozostałe składniki. Źródło: Opracowanie własne Tabela 12 Stopień hamowania i ograniczenia wzrostu bakterii Salmonella typhimurium w zawiesinie o gęstości 108 jtk/cm3 przez badane układy konserwujące. Gęstość inokulatu 108 jtk/cm3 24 h 48 h Strefa Strefa Strefa Strefa hamowania ograniczonego hamowania ograniczonego [mm] wzrostu [mm] [mm] wzrostu [mm] I 18 43 16 37 II 19 40 16 38 III 15 34 14 31 Średnia 17 39 15 35 SD 1,94 4,82 1,24 4,53 V 11,14 % 12,28 % 7,95 % 12,78 % Układ Legenda: Układ I - mieszanina zawierająca miód gryczany A Układ II - mieszanina zawierająca miód gryczany B Układ III - mieszanina zawierająca miód gryczany C SD - odchylenie standardowe V - współczynnik zmienności Źródło: Opracowanie własne oraz pozostałe składniki. 48 Salmonella typhimurium to jedyny szczep wśród badanych szczepów bakterii, w przypadku którego stwierdzono nie tylko strefy całkowitego zahamowania wzrostu drobnoustrojów, ale również strefy ich ograniczonego wzrostu. Każdy testowany układ konserwujący spowodował zahamowanie wzrostu tych mikroorganizmów zarówno na poziomie skażenia wynoszącego 105 jtk/cm3 jak i 108 jtk/cm3. Podobnie, jak w przypadku bakterii Campylobacter jejuni, można zaryzykować stwierdzenie, iż zakonserwowanie mięsa taką mieszaniną uchroni konsumenta przed zakażeniem bakterią patogenną, jaką jest Salmonella typhimurium, gdyż jej dawka infekcyjna wynosi 1 x 102 komórek bakterii (jtk) [Libudzisz, Kowali Żakowska 2009]. Sporządzone układy konserwujące działały zdecydowanie silniej na inokulat bakterii o gęstości 105 jtk/cm3, niż o gęstości 108 jtk/cm3. Efekt bakteriostatyczny również był obserwowany jeszcze po 48 godzinach inkubacji płytek w temp. 37oC i charakteryzował się nieznacznym osłabieniem w stosunku do odnotowanego po 24 godzinach inkubacji (rys 17 i 18). 30 Wielkość strefy hamowania wzrostu [mm] 25 20 15 Gęstość inokulatu Y 10 Gęstość inokulatu Z 5 0 24 h 48 h Rysunek 17 Strefy całkowitego hamowania wzrostu bakterii Salmonella typhimurium. Legenda: Gęstość inokulatu Y - stężenie 105 jtk/cm3 Gęstość inokulatu Z - stężenie 108 jtk/cm3 Czerwoną linią zaznaczono średnicę studzienki (ø = 10 mm) Źródło: Opracowanie własne 49 45 40 Wielkość strefy ograniczonego wzrostu [mm] 35 30 25 Gęstość inokulatu Y 20 Gęstość inokulatu Z 15 10 5 0 24 h 48 h Rysunek 18 Strefy ograniczonego wzrostu bakterii Salmonella typhimurium. Legenda: Gęstość inokulatu Y - stężenie 105 jtk/cm3 Gęstość inokulatu Z - stężenie 108 jtk/cm3 Czerwoną linią zaznaczono średnicę studzienki (ø = 10 mm) Źródło: Opracowanie własne Obraz stref hamowania i ograniczenia wzrostu bakterii Salmonella typhimurium na płytkach Petriego, spowodowane działaniem opracowanych układów konserwujących, ilustrują zdjęcia na rysunkach 19 i 20. Rysunek 19 Strefy hamowania i ograniczenia wzrostu Salmonella typhimurium w zawiesinie o gęstości 105 jtk/cm3. Legenda: 0 - próba kontrolna; 1 - Układ I; 2 - Układ II; 3 - Układ III Źródło: Zdjęcie własne 50 Rysunek 20 Strefy hamowania i ograniczenia wzrostu Salmonella typhimurium w zawiesinie o gęstości 108 jtk/cm3. Legenda: 0 - próba kontrolna; 1 - Układ I; 2 - Układ II; 3 - Układ III Źródło: Zdjęcie własne Kolejną bakterią patogenną, którą przebadano pod kątem wrażliwości na działanie czynników antybiotycznych mieszaniny konserwującej była Listeria monocytogenes. Tabela 13 ukazuje stopień hamowania wzrostu szczepu wzorcowego bakterii z tego gatunku, po 24 oraz 48 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C. Tabela 13 Stopień hamowania wzrostu bakterii Listeria monocytogenes przez badane układy konserwujące. Gęstość inokulatu 105 jtk/cm3 Gęstość inokulatu 108 jtk/cm3 Strefa hamowania [mm] Strefa hamowania [mm] Układ 24 h 48 h 24 h 48 h I 26 26 20 19 II 30 30 18 18 III 26 25 16 16 Średnia 27 27 18 18 SD 2,24 2,47 1,73 1,5 V 8,17 % 9,20 % 9,62 % 8,50 % Legenda: Układ I - mieszanina zawierająca miód gryczany A Układ II - mieszanina zawierająca miód gryczany B Układ III - mieszanina zawierająca miód gryczany C SD - odchylenie standardowe V - współczynnik zmienności Źródło: Opracowanie własne oraz pozostałe składniki. 51 Każdy testowany układ konserwujący spowodował hamowanie wzrostu bakterii Listeria monocytogenes. Dawka infekcyjna tej bakterii dla zdrowej osoby wynosi od 104 do 109 jtk/g spożytej żywności [Kowalik, Łobacz i Tarczyńska 2013], dlatego ponownie można wnioskować, iż w przypadku skażenia mięsa tą bakterią, po zakonserwowaniu go badaną mieszaniną (60% roztwór miodu gryczanego, czosnek oraz zioła: tymianek, oregano, rozmaryn), nie dojdzie do infekcji bakteryjnej u osoby spożywającej takie mięso. Badany układ konserwujący zdecydowanie słabiej działał w przypadku gęstości inokulatu 108 jtk/cm3. Średnia wielkość strefy zahamowania wzrostu w przypadku inokulatu o gęstości 105 jtk/cm3 wynosiła 27 mm, natomiast przy gęstości 108 jtk/cm3 była ona mniejsza i wynosiła 18 mm. Jak można zauważyć różnica siły działania, w zależności od wielkości skażenia, przekłada się na wielkość strefy zahamowania wzrostu tych drobnoustrojów. Im większa ilość komórek bakterii tym mniejsza strefa zahamowania wzrostu. W tym przypadku, gdzie różnica gęstości inokulatów wynosiła aż trzy cykle logarytmiczne, strefa inhibicji była mniejsza o 9 mm (rys 21). Efekt bakteriostatyczny utrzymywany był na tym samym poziomie jeszcze po 48 godzinach inkubacji drobnoustrojów z inhibitorem wzrostu. Świadczyć to może o dość dużej wrażliwości pałeczek Listeria monocytogenes na działanie czynników antybiotycznych zastosowanego układu konserwującego. 30 Wielkość strefy hamowania wzrostu [mm] 25 20 15 Gęstość inokulatu Y 10 Gęstość inokulatu Z 5 0 24 h 48 h Rysunek 21 Strefy hamowania wzrostu bakterii Listeria monocytogenes. Legenda: Gęstość inokulatu Y - stężenie 105 jtk/cm3 Gęstość inokulatu Z - stężenie 108 jtk/cm3 Czerwoną linią zaznaczono średnicę studzienki (ø = 10 mm) Źródło: Opracowanie własne 52 Obraz zahamowania wzrostu bakterii Listeria monocytogenes na płytkach Petriego spowodowanego działaniem opracowanych układów konserwujących ukazują zdjęcia na rysunkach 22 i 23. Rysunek 22 Strefy hamowania wzrostu Listeria monocytogenes w zawiesinie o gęstości 105 jtk/cm3. Legenda: 0 - próba kontrolna; 1 - Układ I; 2 - Układ II; 3 - Układ III Źródło: Zdjęcie własne Rysunek 23 Strefy hamowania wzrostu Listeria monocytogenes w zawiesinie o gęstości 108 jtk/cm3. Legenda: 0 - próba kontrolna; 1 - Układ I; 2 - Układ II; 3 - Układ III Źródło: Zdjęcie własne 53 Ze względu na powszechność zatruć pokarmowych spowodowanych toksyną gronkowca złocistego, a zwłaszcza w przypadku żywności rozmrażanej i ponownie zamrażanej, także istotne było sprawdzenie wpływu układów konserwujących na wzrost bakterii Staphylococcus aureus. W tabeli 14 przedstawiono wyniki stopnia zahamowania wzrostu szczepu wzorcowego bakterii z tego gatunku po 24 oraz 48 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C. Tabela 14 Stopień hamowania wzrostu bakterii Staphylococcus aureus przez badane układy konserwujące. Gęstość inokulatu 105 jtk/cm3 Gęstość inokulatu 108 jtk/cm3 Strefa hamowania [mm] Strefa hamowania [mm] Układ 24 h 48 h 24 h 48 h I 40 38 17 17 II 40 39 21 21 III 39 39 23 22 Średnia 40 39 20 20 SD 0,73 1,13 2,64 2,35 V 1,84 % 2,93 % 13,03 % 11,73 % Legenda: Układ I - mieszanina zawierająca miód gryczany A Układ II - mieszanina zawierająca miód gryczany B Układ III - mieszanina zawierająca miód gryczany C SD - odchylenie standardowe V - współczynnik zmienności Źródło: Opracowanie własne oraz pozostałe składniki. Zgodnie z danymi zawartymi w tabeli 14 można stwierdzić, iż opracowane układy konserwujące charakteryzowały się bardzo silnym działaniem na szczep wzorcowy bakterii Staphylococcus aureus. Wszystkie układy spowodowały zahamowanie wzrostu bakterii z tego gatunku, zarówno w przypadku gęstości inokulatu 105 jtk/cm3, a także 108 jtk/cm3. Dawka infekcyjna Staphylococcus aureus wynosi 103 - 108 komórek bakterii [Leggett, Cornwallis i West 2012], dlatego również w przypadku tego patogenu można wnioskować, iż spożycie zakonserwowanego opracowanym układem mięsa nie spowoduje infekcji w przypadku jego skażenia tą bakterią. Strefy zahamowania wzrostu po 24 godzinach inkubacji z mieszaniną 54 konserwującą kształtowały się na poziomie 40 mm (gęstość inokulatu 105 jtk/cm3) oraz 20 mm (gęstość inokulatu 108 jtk/cm3). Także po 48 godzinach inkubacji utrzymywał się efekt bakteriostatyczny. Jedynie w przypadku gęstości inokulatu 105 jtk/cm3 odnotowano nieznaczny spadek siły hamowania wzrostu drobnoustrojów o 1 mm. Rysunek 24 ukazuje porównanie stopni hamowania wzrostu bakterii Staphylococcus aureus, w zależności od gęstości zawiesiny inokulatów, w całym okresie badania. 45 40 Wielkość strefy hamowanie wzrostu [mm] 35 30 25 Gęstość inokulatu Y 20 Gęstość inokulatu Z 15 10 5 0 24 h 48 h Rysunek 24 Strefy hamowania wzrostu bakterii Staphylococcus aureus. Legenda: Gęstość inokulatu Y - stężenie 105 jtk/cm3 Gęstość inokulatu Z - stężenie 108 jtk/cm3 Czerwoną linią zaznaczono średnicę studzienki (ø = 10 mm) Źródło: Opracowanie własne Zdjęcia (rys 25 oraz 26) ukazują wielkość stref hamowania wzrostu bakterii Staphylococcus aureus w hodowli płytkowej po 24 oraz 48 godzinach inkubacji z roztworami hamującymi wzrost w temperaturze 37°C. 55 Rysunek 25 Strefy hamowania wzrostu Staphylococcus aureus w zawiesinie o gęstości 105 jtk/cm3. Legenda: 0 - próba kontrolna; 1 - Układ I; 2 - Układ II; 3 - Układ III Źródło: Zdjęcie własne Rysunek 26 Strefy hamowania wzrostu Staphylococcus aureus w zawiesinie o gęstości 108 jtk/cm3. Legenda: 0 - próba kontrolna; 1 - Układ I; 2 - Układ II; 3 - Układ III Źródło: Zdjęcie własne Groźną bakterią, zaliczaną do tak zwanych „nowych patogenów”, jest pałeczka z gatunku Yersinia enterocolitica, która wykazuje dość dużą oporność na działanie różnych czynników antybiotycznych. Tabela 15 zawiera wyniki stopnia hamowania wzrostu szczepu wzorcowego bakterii z tego gatunku po 24 i 48 godzinach inkubacji z testowanymi mieszaninami konserwującymi w temperaturze 37°C. 56 Tabela 15 Stopień hamowania wzrostu bakterii Yersinia enterocolitica przez badane układy konserwujące. Gęstość inokulatu 105 jtk/cm3 Gęstość inokulatu 108 jtk/cm3 Strefa zahamowania [mm] Strefa zahamowania [mm] Układ 24 h 48 h 24 h 48 h I 20 19 15 14 II 18 17 15 13 III 20 19 15 15 Średnia 19 18 15 14 SD 2,40 2,29 1,22 1,36 V 12,62 % 12,50 % 8,16 % 9,82 % Legenda: Układ I - mieszanina zawierająca miód gryczany A Układ II - mieszanina zawierająca miód gryczany B Układ III - mieszanina zawierająca miód gryczany C SD - odchylenie standardowe V - współczynnik zmienności Źródło: Opracowanie własne oraz pozostałe składniki. Zgodnie z danymi zawartymi w tabeli 15 widać, iż opracowane układy konserwujące hamowały wzrost bakterii Yersinia enterocolitica. Siła hamowania wzrostu tych bakterii była jednak znacznie mniejsza niż w przypadku bakterii Staphylococcus aureus, lecz wystarczająco duża aby zapobiec spożyciu potencjalnej dawki infekcyjnej, wynoszącej 104 106 jtk [Sreedharan, Jones i Schneider 2012] wraz z mięsem poddanym konserwacji opracowaną mieszaniną utrwalającą. Różnice w wielkości stref hamowaniu wzrostu pomiędzy dwiema gęstościami inokulatu nie są znaczne i wynoszą odpowiednio 4mm po każdej dobie inkubacji z inhibitorami wzrostu. Po 48 godzinach inkubacji nadal utrzymywał się jeszcze efekt bakteriostatyczny. W przypadku obu gęstości inokulatu doszło do spadku wielkości stref inhibicji o 1 mm (rys 27). 57 30 Wielkość strefy hamowania wzrostu [mm] 25 20 15 Gęstość inokulatu Y 10 Gęstość inokulatu Z 5 0 24 h 48 h Rysunek 27 Strefy hamowania wzrostu bakterii Yersinia enterocolitica. Legenda: Gęstość inokulatu Y - stężenie 105 jtk/cm3 Gęstość inokulatu Z - stężenie 108 jtk/cm3 Czerwoną linią zaznaczono średnicę studzienki (ø = 10 mm) Źródło: Opracowanie własne Poniższe zdjęcia (rys 28 i 29) ukazują strefy zahamowania wzrostu bakterii Yersinia enterocolitica w hodowli na płytkach Petriego spowodowane działaniem testowanych układów konserwujących. Rysunek 28 Stopień hamowania wzrostu Yersinia enterocolitica w zawiesinie o gęstości 105 jtk/cm3. Legenda: 0 - próba kontrolna; 1 - Układ I; 2 - Układ II; 3 - Układ III Źródło: Zdjęcie własne 58 Rysunek 29 Stopień hamowania wzrostu Yersinia enterocolitica w zawiesinie o gęstości 108 jtk/cm3. Legenda: 0 - próba kontrolna; 1 - Układ I; 2 - Układ II; 3 - Układ III Źródło: Zdjęcie własne Ostatnim z badanych patogenów była bakteria z gatunku Pseudomonas aeruginosa, potocznie zwana pałeczką ropy błękitnej. Choć naturalnym środowiskiem bytowania tej bakterii jest gleba i woda, to ze względu na infekcyjność różnego rodzaju ran może się znaleźć na dłoniach pracowników przemysłu drobiarskiego i w wyniku nie przestrzegania zasad higieny produkcji także w produkcie. Stąd ważne było sprawdzenie skuteczności działania opracowanych układów konserwujących na tę raczej oporną na działanie różnych środków antybiotycznych pałeczkę. Tabela 16 ukazuje wielkości stref zahamowania wzrostu szczepu wzorcowego Pseudomonas aeruginosa przez badane układy konserwujące po 24 i 48 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C. 59 Tabela 16 Stopień hamowania wzrostu bakterii Pseudomonas aeruginosa przez badane układy konserwujące. Gęstość inokulatu 105 jtk/cm3 Gęstość inokulatu 108 jtk/cm3 Strefa hamowania [mm] Strefa hamowania [mm] Układ 24 h 48 h 24 h 48 h I 18 18 18 18 II 20 18 16 16 III 17 16 17 16 Średnia 18 17 17 17 SD 1,13 1,01 1,24 1,12 V 6,13 % 5,81 % 7,09 % 6,71 % Legenda: Układ I - mieszanina zawierająca miód gryczany A Układ II - mieszanina zawierająca miód gryczany B Układ III - mieszanina zawierająca miód gryczany C SD - odchylenie standardowe V - współczynnik zmienności Źródło: Opracowanie własne oraz pozostałe składniki. Dane zawarte w tabeli 16 jednoznacznie wskazują, iż wszystkie opracowane układy konserwujące spowodowały zahamowanie wzrostu bakterii Pseudomonas aeruginosa. W przypadku bakterii z tego gatunku stopień hamowania wzrostu kształtował się mniej więcej na tym samym poziomie zarówno przy gęstości inokulatu wynoszącej 105 jtk/cm3, jak i przy gęstości 108 jtk/cm3. Dawka infekcyjna Pseudomonas aeruginosa wciąż nie jest określona dla organizmu ludzkiego, dlatego nie można stwierdzić, czy spożycie mięsa zakonserwowanego opracowanym układem, przyczyni się do infekcji bakteryjnej. Także w przypadku tego patogenu efekt bakteriostatyczny, wywołany przez badane układy konserwujące, utrzymywał się jeszcze po 48 godzinach inkubacji z tymi czynnikami hamującymi wzrost, a ich siła działania praktycznie nie spadła (rys 30). 60 30 Wielkość strefy hamowania wzrostu [mm] 25 20 15 Gęstość inokulatu Y 10 Gęstość inokulatu Z 5 0 24 h 48 h Rysunek 30 Strefy hamowania wzrostu bakterii Pseudomonas aeruginosa. Legenda: Gęstość inokulatu Y - stężenie 105 jtk/cm3 Gęstość inokulatu Z - stężenie 108 jtk/cm3 Czerwoną linią zaznaczono średnicę studzienki (ø = 10 mm) Źródło: Opracowanie własne Zdjęcia (rys 31 i 32) ukazują wielkości stref hamowania wzrostu bakterii Pseudomonas aeruginosa w hodowli płytkowej spowodowane przez działanie opracowanych układów konserwujących. Rysunek 31 Strefy hamowania wzrostu Pseudomonas aeruginosa w zawiesinie o gęstości 105 jtk/cm3. Legenda: 0 - próba kontrolna; 1 - Układ I; 2 - Układ II; 3 - Układ III Źródło: Zdjęcie własne 61 Rysunek 32 Strefy hamowania wzrostu Pseudomonas aeruginosa w zawiesinie o gęstości 108 jtk/cm3. Legenda: 0 - próba kontrolna; 1 - Układ I; 2 - Układ II; 3 - Układ III Źródło: Zdjęcie własne Podsumowując, opracowane układy konserwujące, przygotowane na bazie 60% roztworu miodu z dodatkiem czosnku i ziół (oregano, tymianek, rozmaryn) działały hamująco na wszystkie bakterie patogenne wytypowane do badania. Rysunki 33 i 34 obrazują różnice w stopniu hamowania wzrostu poszczególnych drobnoustrojów po 24 oraz 48 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C. Wielkość strefy hamowania wzrostu [mm] 45 40 35 30 25 20 15 10 5 24 h 48 h 0 Rysunek 33 Różnice stopnia hamowania wzrostu badanych drobnoustrojów w zawiesinie o gęstości 105 jtk/cm3. * Czerwoną linią zaznaczono średnicę studzienki (ø = 10 mm) Źródło: Opracowanie własne 62 Zgodnie z wynikami zawartymi na wykresie (rys 33) widać wyraźnie, iż najbardziej wrażliwą na opracowany układ konserwujący była bakteria patogenna Staphylococcus aureus. Drugim pod względem wrażliwości drobnoustrojem okazała się Listeria monocytogenes. Najmniejsze strefy zahamowania wzrostu stwierdzono w przypadku pałeczek Yersinia enterocolitica oraz Pseudomonas aeruginosa. W obu przypadkach zwalczanie infekcji spowodowanych tymi drobnoustrojami jest bardzo trudne. Efekt bakteriostatyczny, wynikający z działania testowanego inhibitora wzrostu, w odniesieniu do każdego badanego mikroorganizmu utrzymywał się na podobnym poziomie jeszcze po 48 godzinach inkubacji i zauważalny był tylko nieznaczny spadek siły hamowania wzrostu w stosunku do czterech mikroorganizmów. W przypadku pozostałych dwóch gatunków mikroorganizmów (S. typhimurium, L. monocytogenes) siła działania pozostawała niezmienna. Wielkość strefy hamowania wzrostu [mm] 25 20 15 10 24 h 5 48 h 0 Rysunek 34 Różnice stopnia hamowania wzrostu badanych drobnoustrojów w zawiesinie o gęstości 108 jtk/cm3. * Czerwoną linią zaznaczono średnicę studzienki (ø = 10 mm) Źródło: Opracowanie własne W przypadku gęstości inokulatów wynoszących 108 jtk/cm3 nie zauważono tak znaczących różnic w sile działania badanego układu konserwującego (rys 34). Podobnie jak w przypadku gęstości inokulatów wynoszących 105 jtk/cm3, najwrażliwszym gatunkiem bakterii był Staphylococcus aureus, a zaraz za nim Listeria monocytogenes. Najbardziej opornym patogenem na działanie układu konserwującego była Yersinia enterocolitica. W przypadku pozostałych patogenów (Campylobacter jejuni, Salmonella typhimurium oraz Pseudomonas aeruginosa) odnotowano zbliżone do siebie wielkości stref zahamowania wzrostu tych 63 bakterii. Również w tym przypadku, efekt bakteriostatyczny utrzymywał się nadal po 48 godzinach inkubacji. W odniesieniu do trzech badanych drobnoustrojów (C. jejuni, S. typhimurium, Y. enterocolitica) odnotowano jedynie lekki spadek siły jego działania (ok. 2 – 3 mm). Wszystkie dotychczas prowadzone badania na temat przeciwdrobnoustrojowych właściwości miodów, jednoznacznie wskazują na ich bakteriostatyczne działanie. Badania przeprowadzone przez amerykańskich naukowców [Mundo i in. 2004] wykazały, że siła, a także zakres działania na poszczególne rodzaje drobnoustrojów, zależne są od odmiany miodów. Według tych badań najsilniejszymi właściwościami bakteriostatycznymi charakteryzował się miód gryczany, a w następnej kolejności nowozelandzki miód manuka. Wśród badanych przez naukowców mikroorganizmów znalazły się bakterie patogenne (Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium oraz Staphylococcus aureus). Wobec każdego z tych drobnoustrojów odnotowano zahamowanie ich wzrostu [Mundo i in. 2004]. Kolejni naukowcy [Mercan i in. 2007] wykazali skuteczność działania miodów wobec takich drobnoustrojów patogennych, jak: Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus, Candida albicans, Escherichia coli oraz potwierdzili skuteczność wobec Staphylococcus aureus. Według tych badań najbardziej wrażliwym na działanie miodu szczepem bakterii był S. aureus, natomiast najmniej P. aeruginosa. W 2011 roku również słowaccy naukowcy [Melich i in. 2011] badali wpływ miodu na wzrost bakterii patogennych. Listę patogenów poszerzono o bakterie z gatunku Yersinia enterocolitica. Uzyskano podobne wyniki jak w przypadku tureckich naukowców. Najsilniejsze działanie miód wykazywał wobec bakterii Staphylococcus aureus, a najmniej podatną bakterią była Yersinia enterocolitica. Pozostałe patogeny (P. aeruginosa, L. monocytogenes, E. coli) charakteryzowały się podobną wrażliwością na działanie badanych miodów. Również w przypadku badań prowadzonych nad czosnkiem, potwierdza się jego bakteriostatyczne działanie, także wobec bakterii patogennych. Przeprowadzone przez naukowców w 2012 roku badania wykazały, iż czosnek ma działanie bakteriobójcze wobec takich patogenów, jak: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi czy Escherichia coli [Gull i in. 2012]. Badania prowadzone w ramach pracy inżynierskiej [Szofer 2013] w Katedrze Przyrodniczych Podstaw Jakości Uniwersytetu Ekonomicznego w Poznaniu stały się przesłanką do badań przeprowadzonych w niniejszej pracy. Wyniki badań, wspomnianej powyżej pracy inżynierskiej dowiodły, iż układ konserwujący złożony z 60 % roztworu 64 miodu gryczanego, czosnku oraz suszonych ziół (oregano, tymianek i rozmaryn) skutecznie hamuje rozwój niekorzystnej mikroflory saprofitycznej obecnej na mięsie drobiowym, która powoduje psucie produktu. Postanowiono zatem sprawdzić, czy ewentualna obecność niebezpiecznej dla zdrowia człowieka mikroflory patogennej, również zostanie skutecznie zahamowana. Uzyskane w niniejszej pracy wyniki badań potwierdziły dotychczasowe rezultaty badań w odniesieniu do właściwości przeciwdrobnoustrojowych miodów, czosnku oraz ziół. Opracowany układ konserwujący skutecznie hamował rozwój typowych dla mięsa drobiowego patogenów. Najsilniej działał wobec gramododatnich ziarniaków Staphylococcus aureus i gramododatnich pałeczek Listeria monocytogenes, natomiast najsłabiej wobec gramoujemnych pałeczk Pseudomonas aeruginosa oraz Yersinia enterocolitica. W przypadku gramoujemnych pałeczk Salmonella typhimurium oraz Campylobacter jejuni wykazał się podobną siłą działania hamującego ich wzrost, jednak słabszą niż St. aureus i L. monocytogenes, ale silniejszą niż Y. enterocolitica i P. aeruginosa. Skuteczność działania wykazywał zarówno przy niższym stężeniu komórek patogenów (105 jtk/cm3), jak i przy dużej gęstości zawiesiny ich komórek, wynoszącej 108 jtk/cm3. 65 6. Wnioski 1. Wszystkie opracowane wcześniej i zastosowane do badań układy konserwujące (Układ I, Układ II, Układ III) hamowały wzrost wytypowanych do badań mikroorganizmów chorobotwórczych. Różnice w sile hamowania wzrostu pomiędzy układami były niewielkie, o czym świadczą wartości odchylenia standardowego (SD) oraz współczynnika zmienności (V). Na tej podstawie można stwierdzić, iż układ konserwujący niezależnie od miejsca pochodzenia miodu gryczanego skutecznie hamuje wzrost badanych drobnoustrojów patogennych. 2. Spośród badanych szczepów bakterii najbardziej wrażliwym na działanie układów konserwujących okazał się szczep gramododatnich ziarniaków Staphylococcus aureus, natomiast najbardziej opornymi szczepy gramoujemnych pałeczek Yersinia enterocolitica oraz Pseudomonas aeruginosa. 3. W przypadku monocytogenes, bakterii z gatunków: Staphylococcus aureus, Campylobacter Yersinia jejuni, Listeria enterocolitica oraz Pseudomonas aeruginosa odnotowano tylko strefę całkowitego zahamowania ich wzrostu, natomiast w przypadku bakterii z gatunku Salmonella typhimurium zaobserwowano dwie strefy – całkowitego zahamowania oraz ograniczonego wzrostu bakterii. 4. Silniejsze działanie opracowanych układów konserwujących zaobserwowano w przypadku gęstości inokulatów wynoszących 105 jtk/cm3, niż w przypadku dużych gęstości 108 jtk/cm3. 5. Efekt bakteriostatyczny utrzymywany był jeszcze po 48 godzinach inkubacji mikroorganizmów z układami konserwującymi. Odnotowuje się jedynie nieznaczny spadek siły ich działania antybiotycznego. 6. Opracowany układ konserwujący, opierający się na 60 % roztworze miodu gryczanego, czosnku polskim i suszonych ziołach - oregano, tymianek, rozmaryn, dzięki antybiotycznemu działaniu wobec mikroflory saprofitycznej, jak i patogennej może znaleźć zastosowanie jako środek przedłużający trwałość mięsa drobiowego oraz gwarantujący jego bezpieczeństwo zdrowotne dla konsumentów. 66 BIBLIOGRAFIA LITERATURA 1. Adedayo O., Kirkpatrick B.D., 2008, Campylobacter jejuni Infections: Update on Presentation, Diagnosis, and Management, Hospital Physician, s. 9 - 15. 2. Ankri S., Mirelman D., 1999, Antimicrobial properties of allicin from garlic, Microbes and Infection, Vol. 2, s. 125 - 129. 3. Atobla K., Karou T.G., Dadie A.T., Niamke L.S., Dje K.M., 2012, Isolation and characterization of pathogenic Yersinia enterocolitica from pigs in Abidjan, Côte d'Ivoire, Journal of Applied Biosciences, Vol. 50, s. 3540 - 3548. 4. Atti-Santos A. C., Rossato M., Pauletti G. F., Rota L. D., Rech J. C., Pansera M. R., Agostini F., Serafini L. A., Moyna P., 2005, Phycico - chemical Evaluation of Rosmarinus officinalis L. Essential Oils, Brazilian Archives of Biology and Technology, Vol. 48, n.6, s. 1035 - 1039. 5. Bajard, S., Rosso, L., Fardel, G., Flandrois, J.P., 1996, The particular behaviour of Listeria monocytogenes under sub-optimal conditions, Int. J. Food Microbiol., Vol 29, s. 201 – 211. 6. Bogdanov S., Jurendic T., Sieber R., Gallmann P., 2008, Honey for Nutrition and Health: a Review, American Journal of the College of Nutrition, Vol. 27, s. 677 - 689. 7. Burbianka M., Pliszka A., Burzyńska H., 1983, Mikrobiologia żywności, PZWL Warszawa. 8. Chalcarz W., 2004, Miód w żywieniu człowieka, Postępy Fitoterapii, 2, s. 91 – 94. 9. Danyluk B., Kostecki A., 2014, Trwałość mikrobiologiczna mięsa i wyrobów mięsnych, Gospodarka Mięsna 2014/1. 10. Dave D., Ghaly A.E., 2011, Meat Spoilage Mechanisms and Preservation Techniques: A Critical Review, American Journal of Agricultural and Biological Sciences 6 (4) s. 486 – 510. 11. Derwich E., Benziane Z., Chabir R., 2011, Aromatic and Medicinal Plants of Marocco: Chemical Composition of Essential Oils of Rosmarinus officinalis and Juniperus Phoenicea, International Journal of Applied Biology and Pharmaceutical Technology, Vol. 2, Issue - 1, s. 145 - 153. 12. Derwich E., Benziane Z., Manar A., Boukir A., Taouil R., 2010, Phytochemical Analysis and in vitro Antibacterial Activity of the Essential Oil of Origanum vulgare 67 from Morocco, American - Eurasian Journal of Scientific Research, Vol. 5 (2), s. 120 - 129. 13. Dobre A. A., Gagiu V., Petru N., 2011, Antimicrobial activity of essential oils against food-borne bacteria evaluated by two preliminary methods, Romanian Biotechnological Letters, Vol. 16, No. 6, s. 119 - 125. 14. Doner L. W., 1991, The Enzymes of Honey, w: Food Enzymology (red. Fox P.F.), Elsevier Applied Science, London, New York, 2, s. 143 – 161. 15. Dorman H. J. D., Deans S. G., 2000, Antimicrobial agents from plants: antibacterial activity of plant volatile oils, Journal of Applied Microbiology, Vol. 88, s. 308 - 316. 16. Ellnain-Wojtaszek M., 1998, Produkty pszczele – cenne leki medycyny naturalne, Wydawnictwo „Sądecki Bartnik” Nowy Sącz, s. 24 - 29. 17. Földházi G, 1994, Analysis and quantitation of sugars in honey of different botanical origin using High Performance Liquid Chromatography, Acta Alimentaria, 23, s. 299 – 311. 18. Gałuszka H., 1998, Miód pszczeli. Powstanie-wartość odżywcza-zastosowanie, Wydawnictwo „Sądecki Bartnik” Nowy Sącz, s. 27 - 40. 19. Grabowski T., Technologia mięsa drobiowego, Wydawnictwo Naukowo-Techniczne, Warszawa 1993, s. 62-70, 81 – 115. 20. Grigore A., Paraschiv I., Colceru-Mihul S., Bubueanu C., Draghici E., Ichim M., 2010, Chemical composition and antioxidant activity of Thymus vulgaris L. volatile oil obtained by two different methods, Romanian Biotechnological Letters, Vol. 15, No. 4., s. 5436 – 5443. 21. Gull I., Saeed M., Shaukat H., Aslam S.M., Samra Z.Q., Athar A.M., 2012, Inhibitory effect of Allium sativum and Zingiber officinale extracts on clinically important drug resistant pathogenic bacteria, Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, s. 1 - 6. 22. Hać-Szymańczuk E., Lipińska E., Grzegrzółka O., 2012, Ocena aktywności przeciwbakteryjnej oregano (Origanum vulgare L.), Bromatologia i Chemia Toksykologiczna - XLV, Vol. 3, s. 308 - 314. 23. Hołderna-Kędzia E., Kędzia B., 2002, Miody odmianowe i ich znaczenie lecznicze, Wydawnictwo Duszpasterstwa Rolników, Włocławek, s. 9 - 12, 61 - 66. 24. Imelouane B., Amhamdi H., Wathelet J.P., Ankit M., Khedid K., El Bachiri A., 2009, Chemical Composition and Antimicrobial Activity of Essential Oil of Thyme (Thymus 68 vulgaris) from Eastern Morocco, International Journal of Agriculture & Biology, Vol. 11, No. 2, s. 205 - 208. 25. Jayasena D.D., Jo C., 2013, Essential oils as potential antimicrobial agents in meat and meat products: A review, Trends in Food Science & Technology, Vol. 34, s. 96 - 108. 26. Kędzia A., 2010, Przeciwdrobnoustrojowe działanie czosnku (Allium sativum L.), Postępy Fitoterapii, 1, s. 46 – 52. 27. Kędzia A., Dera-Tomaszewska B., Ziółkowska-Klinkosz M., Kędzia A.W., Kochańska B., Gębska A., 2012, Aktywność olejku tymiankowego (Oleum Thymi) wobec bakterii tlenowych, Postępy Fitoterapii, 2, s. 67 – 71. 28. Kędzia B., Hołderna-Kędzia E., 1996, Działanie miodu na organizm człowieka, Pszczelarstwo, 4, s. 6 - 7. 29. Kędzia B., Hołderna-Kędzia E., 1996, Produkty pszczół w medycynie, Spółdzielnia Pszczelarska „Apis”, Lublin, s. 14 - 17. 30. Kemper K.J., 2000, Garlic (Allium sativum), The Longwood Herbal Task Force and The Center for Holistic Pediatric Education and Research, s. 4. 31. Kluytmans, J., van Belkum, A., Verbrugh, H., 1997, Nasal carriage of Staphylococcus aureus: epidemiology, underlying mechanisms, and associated risks, Clinical Microbiology Reviews, Vol. 10(3), s. 505 - 520. 32. Kowalik J., Łobacz A., Tarczyńska S., 2013, Prognozowanie wzrostu liczby komórek Listeria monocytogenes w serku wiejskim, Żywność. Nauka. Technologia. Jakość., Vol. 4(89), s. 37 - 48. 33. Kowalska K., Olejnik A., 2010, Rozmaryn – roślina zielarska o potencjale terapeutycznym, Postępy Fitoterapii, 2, s. 114 – 122. 34. Küçük M., Kolayli S., Karaoğlu Ş., Ulusoy E., Baltaci C., Candan F., 2007, Biological activities and chemical composition of three honeys of different types from Anatolia, Food Chemistry, Vol. 100 (2007), s. 526 - 534. 35. Kwiatek K., Zasadny R., Wojdat E., 2006, Występowanie termotolerancyjnych drobnoustrojów z rodzaju Campylobacter na powierzchni tusz zwierząt rzeźnych, Przegląd Epidemiologiczny 2006, s. 347 - 352. 36. Leggett H.C., Cornwallis Ch.K., West S.A., 2012, Mechanisms of Pathogenesis, Infective Dose and Virulence in Human Parasites, PLoS Pathogens, Vol. 8, Issue 2, s. 1 - 20. 69 37. Libudzisz Z., 2000, Mikrobiologia techniczna, Wydawnictwo Politechniki Łódzkiej. 38. Libudzisz Z., Kowal K., Żakowska Z. (red.), 2009, Mikrobiologia techniczna. Tom 1. Mikroorganizmy i środowiska ich występowania, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, s. 323 – 345. 39. Lutomski J., 2001, Fascynacja czosnkiem – wczoraj i dziś, Postępy Fitoterapii, 2, s. 7-14 40. Lutomski J., 2001, Znaczenie ziół w terapii i dietetyce, Postępy Fitoterapii, 2-3, s. 3– 8. 41. Mateo R., Bosch-Reig F., 1997, Sugar profiles of Spanish unifloral honeys, Food Chemistry, 60, s. 33 – 41. 42. McGann, P., Wiedmann, M., Boor, K.J., 2007, The alternative sigma factor sigma B and the virulence gene regulator PrfA both regulate transcription of Listeria monocytogenes internalins, Appl. Environ. Microbiol., Vol. 73, s. 2919 - 2930. 43. Mercan N., Guvensen A., Celik A., Katircioglu, 2007, Antimicrobial activity and pollen composition of honey samples collected from different provinces in Turkey, Natural Product Research, Vol. 21, No. 3, s. 187 - 195. 44. Mesaros N., Nordmann P., Plésiat P., Roussel - Delvallez M., van Eldere J., Glupczynski Y., van Laethem Y., Jacobs F., Lebecque P., Malfroot A., Tulkens P.M., van Bambeke F., 2007, Pseudomonas aeruginosa: resistance and therapeutic options at the turn of the new millennium, Clin. Microbiol. Infect., Vol. 13, s. 560 - 578. 45. Michalczyk P., 2012, Wykorzystanie produktów pochodzenia naturalnego do przedłużania trwałości mięsa wieprzowego, praca magisterska, Uniwersytet Ekonomiczny, Poznań, [maszynopis niepublikowany]. 46. Mizerski W., Bednarczuk B., Kawalec M., 2008, Słownik bakterii ciekawych, pożytecznych, groźnych. Grupa Wydawnicza Adamantan s.c., Warszawa, s. 39, 188. 47. Mockutë D., Bernotienë G., Judþentienë A., 2004, Chemical composition of essential oils of Origanum vulgare L. growing in Lithuania, Biologija, Nr 4. s. 44 – 49. 48. Mrugalski K., 2011, Wykorzystanie właściwości antybiotycznych miodów do przedłużenia trwałości mięsa drobiowego, praca magisterska, Uniwersytet Ekonomiczny, Poznań, [maszynopis niepublikowany]. 49. Mścisz A., Czosnowska E., 2008, Oregano – fascynująca przyprawa, ale czy tylko? Możliwe zastosowania, substancje aktywne, właściwości terapeutyczne, Postępy Fitoterapii, 4, s. 233 – 239. 70 50. Mundo M.A., Padilla-Zakour O.I., Worobo R.W., 2007, Growth inhibition of foodborne pathogens and food spoilage organisms by select raw honeys, International Journal of Food Microbiology, 97, s. 1 – 8. 51. Murray, P. R., Baron, E. J., Jorgensen, J. H., Landry, M. L., Pfaller, M. A., & Yolken, R. H. (Red.), 2003, Manual of Clinical Microbiology (8th ed.), Herdon, VA, United States of America: American Society for Microbiology. 52. Nagai T., Inoue R., Kanamori N., Suzuki N., Nagashima T., 2006, Characterization of Honey from Different Floral Sources. Its Functional Properties and Effects of Honey Species on Storage of Meat, Food Chemistry, 97, s. 256 - 262. 53. Nurzyńska-Wierdak R., 2012, Lebiodka pospolita (Origanum vulgare L.) – dziko rosnąca i uprawiana roślina zielarska, Annales Universitatis Mariae CurieSkłodowska Lublin - Polonia, Vol. XXII (4), s. 1 - 11. 54. Olszewski A., 2007, Technologia przetwórstwa mięsa, Wydawnictwa NaukowoTechniczne, Warszawa, s. 161 – 182. 55. Ozbek T., Güllüce M., Şahin F., Ӧzkan H., Sevsay S., Bariş Ӧ., 2010, Investigation of the Antimutagenic Potentials of the Methanol Extract of Origanum vulgare L. subsp. vulgare in the Eastern Anatolia Region of Turkey, Turk J Biol, Vol. 32 (2008), s. 271 - 276. 56. Piotraszewska-Pająk A., 2002, Wyróżniki jakości miodów oraz ich zmiany pod wpływem warunków i czasu przechowywania, praca doktorska, Akademia Ekonomiczna, Poznań, [maszynopis niepublikowany]. 57. Platt-Samoraj A., Bancerz-Kisiel A., Szweda W., 2006, Zjadliwość Yersinia enterocolitica oraz znaczenie biotypu 1A w patogenezie jersiniozy, Medycyna Wet. Vol. 62 (10), s. 1113 - 1115. 58. Porte A., Godoy R. L. O., 2008, Chemical composition of Thymus vulgaris L. (thyme) essential oil from the Rio de Janeiro State (Brazil), Journal of the Serbian Chemical Society, Vol. 73 (3), s. 307 - 310. 59. Rožman T., Jerŝek B., 2009, Antimicrobial activity of rosemary extracts (Rosmarinus officinalis L.) against different species of Listeria, Acta agriculturae Slovenica, Vol. 93 - 1, s. 51 - 58. 60. Sebeşan M., Cărăban A., 2008, Analysis of the Essential Oils from Thyme (Thymus vulgaris L) and from Peppermint (Mentha piperita L), Chem. Bull. "POLITEHNICA" Univ. (Timişoara), Vol. 53(67), 1-2, s. 212 - 214. 71 61. Shabnum S., Wagay M. G., 2011, Essential Oil Composition of Thymus Vulgaris L. and their Uses, Journal of Research & Development, Vol. 11, s. 83 - 94. 62. Sienkiewicz J.J., 2013, Jakość mikrobiologiczna tusz zwierząt rzeźnych oraz mięsa mielonego, Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych, nr 575, s. 107 - 118. 63. Stobińska Z., Żakowska Z. (red.), 2000, Mikrobiologia i higiena w przemyśle spożywczym, Wydawnictwo Politechniki Łódzkiej. 64. Stryjakowska-Sekulska M., 2004, Materiały do ćwiczeń z mikrobiologii, wyd. 2, Wydawnictwo Akademii Ekonomicznej w Poznaniu, Poznań, s. 120 – 125. 65. Szczepańska B., Klawe J.J., Szady-Grad M., Jurgoński A., Andrzejewska M., 2007, Występowanie bakterii z rodzaju Campylobacter u drobiu w trakcie procesu ubojowego, Problemy Higieny i Epidemiologii, Vol. 88(1), s. 78 - 83. 66. Szofer S., 2013, Wpływ układu konserwującego ”miód – czosnek – zioła” na wzrost bakterii tlenowych bytujących na powierzchni filetów drobiowych, praca inżynierska, Uniwersytet Ekonomiczny, Poznań, [maszynopis niepublikowany]. 67. Tavassoli S.K., Mousavi S.M., Emam-Djomeh Z., Razavi S.H., 2011, Chemical composition and evaluation of antimicrobial properties of Rosmarinus officinalis L. essential oil, African Journal of Biotechnology, Vol. 10 (63), s. 13895 – 13899. 68. Vázquez-Boland, J.A, Kuhn, M, Berche, P., Chakraborty, T., Domínguez-Bernal, G., Goebel, W., González-Zorn, B., Wehland, J., Kreft, J., 2001, Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants, Clinical Microbiology Reviews, Vol. 14, s. 584 - 640. 69. Wang W., Li N., Luo M., Zu Y., Efferth T., 2012, Antibacterial Activity and Anticancer Activity of Rosmarinus officinalis L. Essential Oil Compared to That of Its Main Components, Molecules, Vol. 17, s. 2704 - 2713. 70. Wolska K., Kot B., Piechota M., Frankowska A., 2013, Oporność Pseudomonas aeruginosa na antybiotyki, Postępy Hig. Med. Dośw. (online), 2013; 67, s. 1300 - 1311. 71. Yadav A.S., Singh R.P., 2006, Natural preservatives in poultry meat products, Natural Product Radiance Vol. 3(4), s. 300 - 303. 72. Young K.T., Davis L.M., DiRita V., 2007, Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis, Nature Publishing Group, Vol. 5, s. 665 - 679. 73. Zhou G.H., Xu X.L., Liu Y., 2010, Preservation technologies for fresh meat A review, Meat Science, Vol. 86, s. 119 - 128. 72 AKTY PRAWNE 1. Rozporządzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 14 stycznia 2009 w sprawie metod analiz związanych z dokonywaniem oceny miodu, Dz. U. Nr 17, poz. 94. 2. Rozporządzenie Rady (WE) nr 1234/2007 z dnia 22 października 2007 o jednolitej wspólnej organizacji rynku. 3. Rozporządzenie Rady (WE) nr 1441/2007 z dnia 5 grudnia 2007 w sprawie kryteriów mikrobiologicznych dotyczących środków spożywczych. ŹRÓDŁA INTERNETOWE 1. Allicin from fresh Garlic Nature’s Original Antimicrobial, 2012, http://allicincenter.com/pdf/Allicin.pdf [dostęp: 04.04.2014]. 2. Benson J., 2012, Can berries and herbs be used to preserve meat naturally without the use of chemical additives?, http://www.naturalnews.com/035132_preservatives_meat_berries.html [dostęp: 21.04.2014]. 3. Daniells S., 2006, Plant extracts beat synthetics as meat preservatives, says study, http://www.foodnavigator.com/Science-Nutrition/Plant-extracts-beat-synthetics-asmeat-preservatives-says-study [dostęp: 21.04.2014]. 4. Garlic: A Guide - The Herb Society of America, 2006, http://www.herbsociety.org/factsheets/Garlic%20Guide.pdf [dostęp: 04.04.2014]. 5. http://2.bp.blogspot.com/WL71DqEH64A/UW6wqTUZXGI/AAAAAAAAAS0/Sb01LH0CuUQ/s1600/enterec oilitica.jpg [dostęp: 01.05.2014]. 6. http://cdn.c.photoshelter.com/img-get/I0000fx5oYi_NAWA/s/600/600/166550.jpg [dostęp: 01.05.2014]. 7. http://images.fineartamerica.com/images-medium-large-5/proteus-vulgaris-bacteriasem-spl.jpg [dostęp: 01.05.2014]. 8. http://pl.wikipedia.org/wiki/Pa%C5%82eczka_ropy_b%C5%82%C4%99kitnej#media viewer/Plik:Pseudomonas.jpg [dostęp: 01.05.2014]. 9. http://salmonellatyphi.org/salmonella_typhi_3.jpg [dostęp: 01.05.2014]. 10. http://www.bioquell.com/interface/assets/images/content/Enterococcus_faecium_faeca lis_41503729_1.jpg [dostęp: 01.05.2014]. 11. http://www.gastroscan.ru/handbook/118/1906 [dostęp: 01.05.2014]. 73 12. http://www.micronaut.ch/wp-content/uploads/2012/12/%C2%A9-Micronaut-BacteriaStaphylococcus-aureus-001b014.jpg [dostęp: 01.05.2014]. 13. http://www.visualphotos.com/photo/1x6039971/coloured_sem_of_bacillus_subtilis_b 220597.jpg [dostęp: 01.05.2014]. 14. http://zoonoticecology.files.wordpress.com/2013/05/campylobactere1367919882392.jpg [dostęp: 01.05.2014]. 15. Łozowska J., 2013, http://silesiaoptic.uni.wroc.pl/pseudomonas-aeruginosa- charakterystyka-bakterii/ [dostęp: 01.05.2014]. 16. Malaszewski J., 2006, Mikroflora mięsa i przetworów, http://wedlinydomowe.pl/mieso/wszystko-o-miesie/954-mikroflora-miesa-iprzetworow [dostęp: 08.04.2014]. 17. Preservation by Chilling, Heating and Other Means, 2002, http://www.enq.ufsc.br/disci/eqa5217/material_didatico/PoultryPP/TX609_07.pdf#pa ge=10&zoom=auto,99,434 [dostęp: 19.04.2014]. 18. Rosemary, That's for Remembrance, 2014, http://www.herbco.com/t-rosemaryarticle.aspx [dostęp: 30.03.2014]. 19. Sandhyarani N., 2007, http://www.buzzle.com/articles/pseudomonas-fluorescens.html [dostęp: 01.05.2014]. 20. Sreedharan A., Jones C., Schneider K., 2012, Foodborne Illnes: Yersiniosis, http://edis.ifas.ufl.edu/fs193 [dostęp: 02.05.2014]. 21. Todar K., 2012, http://textbookofbacteriology.net/pseudomonas.html [dostęp: 01.05.2014]. 74 SPIS RYSUNKÓW Rysunek 1 Pseudomonas fluorescens ......................................................................................... 8 Rysunek 2 Bacillus subtilis......................................................................................................... 9 Rysunek 3 Proteus vulgaris...................................................................................................... 10 Rysunek 4 Lactobacillus .......................................................................................................... 10 Rysunek 5 Enterococcus faecalis ............................................................................................. 11 Rysunek 6 Campylobacter jejuni ............................................................................................. 12 Rysunek 7 Salmonella typhimurium ......................................................................................... 14 Rysunek 8 Listeria monocytogenes .......................................................................................... 15 Rysunek 9 Staphylococcus aureus ........................................................................................... 17 Rysunek 10 Yersinia enterocolitica.......................................................................................... 18 Rysunek 11 Pseudomonas aeruginosa ..................................................................................... 19 Rysunek 12 Temperatury wpływające na trwałość produktów drobiarskich. .......................... 21 Rysunek 13 Proces przekształcenia alliny w allicynę. ............................................................. 32 Rysunek 14 Strefy hamowania wzrostu bakterii Campylobacter jejuni. ................................. 46 Rysunek 15 Strefy hamowania wzrostu Campylobacter jejuni w zawiesinie o gęstości 105 jtk/cm3......................................................................................................... 47 Rysunek 16 Strefy hamowania wzrostu Campylobacter jejuni w zawiesinie o gęstości 108 jtk/cm3........................................................................................................ 47 Rysunek 17 Strefy całkowitego hamowania wzrostu bakterii Salmonella typhimurium. ........ 49 Rysunek 18 Strefy ograniczonego wzrostu bakterii Salmonella typhimurium......................... 50 Rysunek 19 Strefy hamowania i ograniczenia wzrostu Salmonella typhimurium w zawiesinie o gęstości 105 jtk/cm3. ....................................................................................... 50 Rysunek 20 Strefy hamowania i ograniczenia wzrostu Salmonella typhimurium w zawiesinie o gęstości 108 jtk/cm3. ....................................................................................... 51 Rysunek 21 Strefy hamowania wzrostu bakterii Listeria monocytogenes. .............................. 52 Rysunek 22 Strefy hamowania wzrostu Listeria monocytogenes w zawiesinie o gęstości 105 jtk/cm3......................................................................................................... 53 Rysunek 23 Strefy hamowania wzrostu Listeria monocytogenes w zawiesinie o gęstości 108 jtk/cm3......................................................................................................... 53 Rysunek 24 Strefy hamowania wzrostu bakterii Staphylococcus aureus. ............................... 55 Rysunek 25 Strefy hamowania wzrostu Staphylococcus aureus w zawiesinie o gęstości 105 jtk/cm3......................................................................................................... 56 75 Rysunek 26 Strefy hamowania wzrostu Staphylococcus aureus w zawiesinie o gęstości 108 jtk/cm3......................................................................................................... 56 Rysunek 27 Strefy hamowania wzrostu bakterii Yersinia enterocolitica................................. 58 Rysunek 28 Stopień hamowania wzrostu Yersinia enterocolitica w zawiesinie o gęstości 105 jtk/cm3......................................................................................................... 58 Rysunek 29 Stopień hamowania wzrostu Yersinia enterocolitica w zawiesinie o gęstości 108 jtk/cm3......................................................................................................... 59 Rysunek 30 Strefy hamowania wzrostu bakterii Pseudomonas aeruginosa. ........................... 61 Rysunek 31 Strefy hamowania wzrostu Pseudomonas aeruginosa w zawiesinie o gęstości 105 jtk/cm3......................................................................................................... 61 Rysunek 32 Strefy hamowania wzrostu Pseudomonas aeruginosa w zawiesinie o gęstości 108 jtk/cm3......................................................................................................... 62 Rysunek 33 Różnice stopnia hamowania wzrostu badanych drobnoustrojów w zawiesinie o gęstości 105 jtk/cm3. ................................................................. 62 Rysunek 34 Różnice stopnia hamowania wzrostu badanych drobnoustrojów w zawiesinie o gęstości 108 jtk/cm3. ................................................................ 63 76 SPIS TABEL Tabela 1 Mikroorganizmy wrażliwe na działanie miodu oraz choroby przez nie powodowane........................................................................................................ 30 Tabela 2 Wrażliwość grzybów na allicynę. .............................................................................. 33 Tabela 3 Wrażliwość bakterii na allicynę................................................................................. 33 Tabela 4 Różnice w składzie chemicznym tymianku w zależności od kraju pochodzenia. ..... 34 Tabela 5 Hamowanie wzrostu wybranych bakterii przez składniki olejku tymiankowego. .... 35 Tabela 6 Wrażliwość bakterii na olejek z oregano. .................................................................. 37 Tabela 7 Różnice w składzie chemicznym rozmarynu w zależności od kraju pochodzenia. .. 39 Tabela 8 Pochodzenie prób miodów. ....................................................................................... 41 Tabela 9 Podłoża hodowlane dla badanych drobnoustrojów. .................................................. 43 Tabela 10 Stopień hamowania wzrostu bakterii Campylobacter jejuni przez badane układy konserwujące. ........................................................................................................ 45 Tabela 11 Stopień hamowania i ograniczenia wzrostu bakterii Salmonella typhimurium w zawiesinie o gęstości 105 jtk/cm3 przez badane układy konserwujące. ............. 48 Tabela 12 Stopień hamowania i ograniczenia wzrostu bakterii Salmonella typhimurium w zawiesinie o gęstości 108 jtk/cm3 przez badane układy konserwujące. ............. 48 Tabela 13 Stopień hamowania wzrostu bakterii Listeria monocytogenes przez badane układy konserwujące. ........................................................................................................ 51 Tabela 14 Stopień hamowania wzrostu bakterii Staphylococcus aureus przez badane układy konserwujące. ........................................................................................................ 54 Tabela 15 Stopień hamowania wzrostu bakterii Yersinia enterocolitica przez badane układy konserwujące. ........................................................................................................ 57 Tabela 16 Stopień hamowania wzrostu bakterii Pseudomonas aeruginosa przez badane układy konserwujące. ............................................................................................ 60 77