345-FML-2003 t30_ supl1

Folia Medica Lodziensia
tom 30 suplement 1
2003
Katarzyna Winczyk
UDZIAŁ RECEPTORÓW BŁONOWYCH I JĄDROWYCH
W ONKOSTATYCZNYM DZIAŁANIU MELATONINY
NA RAKA JELITA GRUBEGO U MYSZY
PRACA HABILITACYJNA
Zakład Endokrynologii Doświadczalnej i Diagnostyki Hormonalnej
Instytut Endokrynologii, Uniwersytet Medyczny w Łodzi
2003
SPIS TREŚCI
I.
II.
III.
IV.
V.
VI.
VII.
VIII.
IX.
X.
XI.
XII.
Wprowadzenie ................................................................................................................ 3
Błonowe receptory melatoniny ........................................................................................ 5
Receptory jądrowe RZR/ROR i ich rola w działaniu melatoniny ................................... 11
Cel i załoŜenia pracy ..................................................................................................... 15
Materiały i metody ......................................................................................................... 16
Wyniki ........................................................................................................................... 20
1. Działanie melatoniny i antagonisty receptora MT1 na raka jelita grubego
Colon 38 ............................................................................................................ 20
A) Badania in vitro ............................................................................................. 20
B) Badania in vivo ............................................................................................. 20
2. Działanie melatoniny i agonisty receptora jądrowego RZR/ROR
na raka jelita grubego Colon 38 ......................................................................... 25
A) Badania in vitro ............................................................................................. 25
B) Badania in vivo ............................................................................................. 26
3. Działanie melatoniny i antagonisty receptora jądrowego RZR/ROR
na raka jelita grubego Colon 38 ......................................................................... 29
A) Badania in vivo ............................................................................................. 29
4. Badanie ekspresji receptorów błonowych MT1 i MT2 oraz receptora
jądrowego RORα1 w raku jelita grubego Colon 38 ........................................... 32
A) Ekspresja receptora MT1 .............................................................................. 32
B) Ekspresja receptora MT2 .............................................................................. 32
C) Ekspresja receptora RORα1 ........................................................................ 32
Dyskusja ........................................................................................................................ 36
Wnioski .......................................................................................................................... 44
Podsumowanie .............................................................................................................. 45
Spis publikacji własnych ................................................................................................ 46
Piśmiennictwo ............................................................................................................... 47
Streszczenie/Summary ................................................................................................. 55
Folia Medica Lodziensia, 2003, 30/S1:3-61
UDZIAŁ RECEPTORÓW BŁONOWYCH I JĄDROWYCH
W ONKOSTATYCZNYM DZIAŁANIU MELATONINY
NA RAKA JELITA GRUBEGO U MYSZY
KATARZYNA WINCZYK
STRESZCZENIE
Melatonina (MLT), główny hormon szyszynki, jest związkiem wielofunkcyjnym, wykazującym
w pracach doświadczalnych równieŜ właściwości onkostatyczne. Mechanizm hamowania wzrostu
nowotworowego przez MLT jest dość złoŜony i polega na modulacji układu dokrewnego
i immunologicznego, działaniu antyoksydacyjnym oraz bezpośrednim wpływie na komórki nowotworowe głównie poprzez obniŜenie proliferacji i jak wykazały wcześniejsze badania prowadzone
w naszym Zakładzie, takŜe poprzez nasilenie apoptozy. Na tkanki docelowe MLT działa
bezpośrednio poprzez dobrze scharakteryzowane MT1 i MT2 oraz mniej poznane MT3 receptory
błonowe. Pod względem budowy receptory MT1 i MT2 naleŜą do nowej klasy rodziny receptorów
sprzęŜonych z białkami G. Za ich pośrednictwem MLT reguluje rytmy okołodobowych i sezonowe.
Nie określono do chwili obecnej budowy receptora MT3, chociaŜ ostatnio wykazano, Ŝe ma on
strukturę podobną do enzymu reduktazy chinonowej QR2 i bierze udział w regulacji ciśnienia
śródgałkowego. W 1995 roku przedstawiono dowody genomowego działania MLT poprzez nową
klasę retinoidowych receptorów jądrowych określanych skrótem RZR/ROR. Sklonowano trzy typy
receptorów RZR/ROR: α - obwodowy, znajdujący się w wielu tkankach organizmu, β - występujący
w tkance mózgowej i γ - zlokalizowany w mięśniach szkieletowych i grasicy. Obecnie przypuszcza
się, Ŝe immunomodulacyjne i onkostatyczne właściwości MLT zaleŜą głównie od jednego
z podtypów receptorów jądrowych - receptora RZR/RORα.
Celem mojej pracy było zbadanie udziału receptorów błonowych MT1 i MT2 oraz receptorów
jądrowych RZR/ROR w onkostatycznym działaniu MLT na my-siego raka jelita grubego Colon 38.
Doświadczenia przeprowadziłam w warunkach in vitro i in vivo. W badaniach in vivo dojrzałym
myszom samcom szczepu B6D2F1 indukowałam guzy jelita grubego wstrzykując podskórnie
zawiesinę komórek nowotworowych Colon 38. Wzrost nowotworowy oceniałam posługując się
wskaźnikami proliferacji komórkowej i apoptozy oraz stosunkiem proliferacji do apoptozy
(wskaźnik P/A). Do oceny proliferacji komórkowej (wskaźnik LI) zastosowałam metodę
immunohistochemiczną
wbudowywania
bromodeoxyurudyny,
analogu
tymidyny
do
jądra
komórkowego. Wielkość apoptozy (wskaźnik AI) mierzyłam metodą TUNEL polegającą na
wizualizacji charakterystycznych dla tego procesu fragmentów DNA. W warunkach hodowli
komórkowej efekt przeciwnowotworowy określałam zmodyfikowaną metodą Mossmana polegającą
na kolorymetrycznym pomiarze aktywności metabolicznej komórek nowotworowych lub metodą
izotopową oceniającą wbudowywanie [3H]-tymidyny do jądra komórkowego. Ze względu na brak
danych dotyczących rodzajów receptorów występujących na komórkach Colon 38 zbadałam
ekspresję receptorów błonowych i jądrowych w tkance nowotworowej wykorzystując trzy techniki
molekularne: metodę łańcuchowej polimerazy z uŜyciem enzymu odwrotnej transkryptazy
(RT-PCR), metodę blotingu dla DNA (tzw. „Southern blotting") i immunoblotingu (tzw. „Western
blotting").
Badania
przeprowadziłam
według
trzech
oddzielnych
schematów.
W
pierwszych
doświadczeniu badałam udział receptorów błonowych stosując MLT i związek chemiczny
oznaczony symbolem UCM 386 (antagonista receptora MT1 i częściowy agonista receptora MT2).
W hodowli komórkowej oba związki podawane oddzielnie, znamiennie statystycznie obniŜyły
Ŝywotność komórek nowotworowych ocenioną metodą Mossmana, jednakŜe działanie MLT było
zdecydowanie silniejsze niŜ wpływ UCM 386. Ponadto UCM 386 stosowany łącznie z MLT nie
zmienił jej przeciwnowotworowego działania. W badaniu in vivo dziesięć dni po indukcji guzów
podawałam zwierzętom raz na dobę wieczorem przez sześć dni w dawce 25 mg/zwierzę MLT
i UCM 386. Zaobserwowałam, Ŝe MLT i UCM 386 stosowane oddzielnie, silnie hamowały
proliferację komórkową, nasilały apoptozę i obniŜały wskaźnik P/A. Ich łączne podawanie nie
zmieniło antyproliferacyjnego działania MLT, ale dość nieoczekiwanie wywołało addytywne
nasilenie apoptozy, a w następstwie tego silne obniŜenie wartości wskaźnika P/A. Następne
przeprowadzone przeze mnie badania miały na celu wyjaśnienie znaczenia receptorów jądrowych
w onkostatycznym działaniu hormonu szyszynki. W tym celu porównałam właściwości
przeciwnowotworowe MLT i agonisty receptora RZR/RORα - tiazolidinedionu CGP 52608.
Wykazałam, Ŝe obie substancje w warunkach 24 godzinnej hodowli komórkowej znamiennie
obniŜyły wbudowywanie [3H]-tymidyny do jąder komórek nowotworowych, a podawane przez
sześć dni zwierzętom z guzami Colon 38 w dawce 10 lub 100 mg/zwierzę w sposób porównywalny
obniŜyły proliferację, zwiększyły apoptozę i znacznie zmniejszyły wartość wskaźnika P/A
w komórkach raka jelita grubego. PowyŜsze obserwacje stworzyły podstawy do przeprowadzenia
następnego doświadczenia, w którym zbadałam czy przeciwnowotworowe właściwości MLT
ulegną zmianie po zablokowaniu receptora jądrowego. Analogicznie do poprzednich badań in vivo,
myszom szczepu B6D2F1 wstrzyknęłam podskórnie zawiesinę komórek nowotworowych
Colon 38, a w dziesięć dni po indukcji guza podawałam przez dziesięć kolejnych wieczorów w
dawce 25 mg/zwierzę MLT i antagonistę receptora RZR/RORα - tiazolidinedion CGP 55644.
Zgodnie z wcześniejszymi wynikami MLT stosowana oddzielnie silnie zahamowała proliferację
komórkową, nasiliła apoptozę i obniŜyła wartość wskaźnik P/A. Natomiast antagonista receptora
RZR/RORα podawany osobno nie zmienił znamiennie statystycznie nasilenia proliferacji
komórkowej i wskaź-nika P/A, natomiast zmniejszył apoptozę w porównaniu z grupą kontrolną.
Ponadto stwierdziłam, Ŝe CGP 55644 stosowany łącznie z MLT nie tylko osłabił jej
antyproliferacyjne właściwości, ale zniósł całkowicie proapoptotyczne działanie MLT na komórki
raka jelita grubego i zdolność obniŜania wskaźnika P/A. Uzupełnieniem moich badań była analiza
receptorów posiadanych przez komórki raka Colon 38. Wykazano za pomocą metody RT-PCR
obecność mRNA dla receptorów błonowych MT1 i MT2 i metodą „Southern blotting” potwierdzono
wyniki analizy RT-PCR oraz stosując technikę immunoblottingu wykryto ekspresję receptora
jądrowego RORa1 i MT1. Na podstawie uzyskanych wyników sformułowałam następujące wnioski:
1. Komórki raka jelita grubego Colon 38 posiadają błonowe receptory MT1 i MT2 oraz
receptory jądrowe RORα1
2. Melatonina wywiera onkostatyczne działanie na raka jelita grubego Colon 38 hamując
proliferację komórkową, nasilając apoptozę, a jej efekt jest porównywalny z działaniem
agonisty receptora RZR/RORα.
3. Antyproliferacyjne właściwości melatoniny zaleŜą od dwóch rodzajów receptorów
błonowego MT2 i jądrowego RZR/RORα.
4. Proapoptotyczne działanie melatoniny zaleŜy głównie od receptora jądrowego RZR/RORα.
Podsumowując moŜna stwierdzić, Ŝe MLT wywołuje działanie przeciw-nowotworowe za
pośrednictwem receptorów błonowych i jądrowych, przy czym w działaniu MLT na raku jelita
grubego Colon 38 rola receptorów jądrowych RZR/ROR jest dominująca.
INVOLVEMENT OF MEMBRANE AND NUCLEAR RECEPTORS
IN ONCOSTATIC ACTIVITY OF MELATONIN
ON MURINE COLONIC CANCER
KATARZYNA WINCZYK
ABSTRACT
Melatonin (MLT), the main hormone of the pineal gland, is a multifunctional chemical
compound, which has shown also oncostatic activity in experimental studies. The mechanism by
which MLT inhibits tumour growth is complex and involves endocrine and immune systems
modulation, antioxidative activity and direct influence on tumour cells via the inhibition of
proliferation. Earlier studies conducted in our laboratory demonstrated that induction of apoptosis is
also a part of this mechanism. MLT acts on target tissues directly through well-characterised
membrane MT1 and MT2 receptors and less well known MT3 receptor. MT1 and MT2 receptors
belong to a new class of G-protein coupled receptors. MLT, acting through these types of
receptors, regulates mainly the circadian and seasonal rhythms. Until now the structure of MT3 has
not been fully explained, however recently it has been demonstrated that its structure is similar to
quinone reductase QR2 and that the MT3 receptor participates in the regulation of intraocular
pressure. In 1995 evidence of genomic action of MLT via the new class of retinoid nuclear
receptors called RZR/ROR was presented. Three types of RZR/ROR receptors were cloned:
α- peripheral receptor present in many tissues of the body, β - receptor found in cerebral tissues
and γ- receptor, localised in skeletal muscles and thymus. At present the immunomodulatory and
oncostatic effects of MLT are thought to depend mainly on one of the subtypes of nuclear
receptors RZR/ROR receptor.
The aim of my study was to examine the involvement of membrane MT1 and MT2 receptors
and nuclear RZR/ROR receptors in the oncostatic activity of MLT on murine Colon 38 cancer. The
investigations were conducted both in in vitro and in vivo conditions. In experiments in vivo the
colonic tumours were induced by subcutaneous injections of a suspension of cancer cells Colon 38
in adult male B6D2F1 mice strain. Tumour growth was assessed using the index of cell
proliferation, index of apoptosis and proliferation/apoptosis ratio (index P/A). To estimate the cell
proliferation (labeling index - LI), immunohistochemical method - incorporation of bromodeoxyuridine, the analogue of thymidine, into cell nuclei was used. Apoptosis (apoptosis index - AI)
was evaluated according of the TUNEL method, which is based on the visualisation of nuclei
containing DNA fragments. In cell culture the anticancer effect was assessed using the modified
Mosmann method, which measures the metabolic activity of cancer cells, or the isotopic method,
evaluating the incorporation of [3H]-thymidine into cell nuclei. Due to lack of data on the types of
receptors present on Colon 38 cells, the expression of membrane and nuclear receptors was also
investigated. Three molecular techniques were used: the reverse transcription-polymerase chain
reaction (RT-PCR), the Southern and Western blot analysis.
The study was performed according to three distinct schemes. In the first experiment the
participation of membrane receptors was examined using MLT and a compound called UCM 386
(antagonist of MT1 receptor and partial agonist of MT2 receptor). In culture cell both substances
given separately statistically significantly decreased the viability of cancer cells, as measured by
the Mosmann method, but the effect of MLT was clearly stronger than that of UCM 386. Moreover,
UCM 386 given together with MLT did not change the anticancer effect of MLT. In in vivo study,
ten days after the induction of tumours, the animals received for six days MLT and UCM 386 at
dose of 25 mg per animal once daily in the evening. It was observed that MLT and UCM 386 given
alone strongly inhibited cellular proliferation, enhanced apoptosis and decreased P/A index. The
jointly application did not diminish the antiproliferative effect of MLT, but exerted an additive effect
on tumour apoptosis, and in consequence significantly decreased the P/A ratio. Further
experiments aimed at the explanation of the role of nuclear receptors in oncostatic activity of the
pineal gland hormone. Thus, I compared the antitumor properties of MLT and an agonist of
RZR/ROR receptor
thiazolidinedione called CGP 52608. The experiments revealed that both
substances in a 24 hour cell culture significantly inhibited [3H]-thymidine incorporation into cell
nuclei. MLT and CGP 52608 administered to the animals with tumours Colon 38 for six days
similarly decreased the cell proliferation, enhanced apoptosis and decreased P/A ratio in colonic
cancer cells. The above presented observations prompted further experiment, in which it was
examined whether the anticancer effect of MLT changes after the nuclear receptors are blocked.
Similarly to previous in vivo investigations, the mice B6D2F1 strain received subcutaneously
a suspension of Colon 38 cancer cells. Ten days after the induction of tumours, MLT and the
antagonist of RZR/ROR receptor - thiazolidinedione called CGP 55644 were administered for ten
following evenings at dose of 25 mg per animal. In accordance with earlier results, MLT given
alone inhibited cellular proliferation, enhanced apoptosis and decreased the P/A ratio. However,
the antagonist of RZR/ROR receptor administered alone did not change statistically significantly
cellular proliferation and P/A ratio, but decreased apoptosis, as compared to the control group.
CGP 55644 given together with MLT diminished its antiproliferative properties, abolished
the reduction of P/A ratio by MLT and also blocked the proapoptotic activity of MLT on cancer
Colon 38 cells.
Additionally, I performed the analysis of expression of MLT receptors on Colon 38 cancer cells.
The expression of mRNA encoding MT1 and MT2 membrane receptors was demonstrated by
RT-PCR analysis and the results of RT-PCR analysis were confirmed by Southern blot method.
Using Western blot analysis the expression of nuclear RORα1 receptor and membrane MT1
receptor was detected.
On the basis of the obtained results the following conclusions were drawn:
1. The cells of colonic cancer Colon 38 express MT1 and MT2 membrane receptors and
nuclear RORα1 receptors.
2. MLT shows an oncostatic activity towards murine Colon 38 cancer, inhibiting cellular
proliferation and increasing apoptosis. Its effect is comparable with the activity of the
agonist of nuclear RZR/RORα receptor.
3. The antiproliferative properties of MLT depend on two types of its receptors membrane
MT2 and nuclear RZR/RORα.
4. The proapoptotic activity of MLT depends mainly on the nuclear RZR/RORα receptor.
In conclusion, it can be stated that MLT exerts the anticancer effect through both membrane
and nuclear receptors, but in the oncostatic activity of MLT on murine Colon 38 cancer the role of
nuclear RZR/ROR receptors is predominant.