Anna Rzepecka-Stojko, Anna Kurek-G recka, Izabela Maciejewska

&ARM0RZEGL.AUK†
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
/CENAZAWARTOuCIIWŒAuCIWOuCI
ANTYOKSYDACYJNYCHFLAWONOIDÌW
WETANOLOWYCHEKSTRAKTACHPROPOLISU
4HEDETERMINATIONOFFLAVONOIDCONTENTOFETHANOLEXTRACTSOFPROPOLIS
ANDTHEANTIOXIDANTCAPACITYOFFLAVONOIDS
!NNA2ZEPECKA†3TOJKO!NNA+UREK†'ÌRECKA)ZABELA-ACIEJEWSKA†0ASZEK
-AŒGORZATA3TEC+ATARZYNA0AWŒOWSKA†'ÌRAL+AMILA'ASTOŒEK†3OŒTYSIK
+ATEDRAI:AKŒADˆYWNOuCIIˆYWIENIA7YDZIAŒ&ARMACEUTYCZNYZ/DDZIAŒEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJ
gL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH
Streszczenie
Propolis jako produkt zebrany przez pszczoły jest jednym z bogatszych źródeł flawonoidów. Biologiczna
aktywność propolisu jest ściśle związana z zawartością
tych związków. Celem pracy była ocena wpływu czasu
ekstrakcji propolisu etanolem na zawartość flawonoidów
w uzyskiwanych ekstraktach oraz ocena ich aktywności
antyoksydacyjnych. Stężenie flawonoidów w etanolowych ekstraktach propolisu oznaczono wykorzystując
zdolności tych związków do tworzenia barwnych kompleksów z AlCl3. Całkowitą zdolność antyoksydacyjną
ekstraktów w zależności od czasu prowadzenia procesu
ekstrakcji określono na podstawie reakcji redukcji barwnego kationorodnika ABTS•+ pod wpływem związków
o działaniu antyoksydacyjnym zawartych w badanych
ekstraktach. Pomiaru absorbancji dokonano przy użyciu
aparatu Spektrometru UV 2 firmy UNICAM. W oparciu
wykonane badania stwierdzono, iż największą wydajność
flawonoidów uzyskano po 5-8 godzinach ekstrakcji. Frakcje te charakteryzowały się również wysoką zdolnością
antyoksydacyjną.
Abstract
Propolis, which is collected by bees, is one of the richest
sources of flavonoids, and the biological activity of propolis is closely related to the presence of flavonoids. The
aim of our study was to evaluate the influence of the time
course of ethanol extraction of propolis on the flavonoid
content in the obtained extracts, and to assess the antioxidant capacity of flavonoids. The ability of flavonoids to
form colored complexes with aluminum chloride (AlCl3)
was used to determine the concentration of flavonoids in
ethanol extracts of propolis. The total antioxidant capacity
of extracts was determined by the reduction of the colored
ABTS.+ radical cation induced by antioxidant compounds
present in the studied extracts. The absorbance was measured with the use of Unicam UV/VIS-Spectrophotometer
UV 2. On the basis of the study results, it was concluded
that flavonoid yield was the highest when the extraction
was conducted for 5-8 hours. Those fractions were characterized by the higher antioxidant capacity.
Key words: propolis, flavonoids, antioxidant capacity
Słowa kluczowe: propolis, flawonoidy, właściwości antyoksydacyjne
Wstęp
Propolis jako produkt zebrany i częściowo przetworzony
przez pszczołę miodną jest heterogenną mieszaniną wielu
substancji takich jak: gumy, żywice, balsamy, woski, olejki
eteryczne oraz pyłek. Liczne badania potwierdzają działanie
antybakteryjne, przeciwzapalne, miejscowo znieczulające,
detoksykacyjne, immunostymulujące, regenerujące, przeciwgrzybicze, przeciwwirusowe i antyoksydacyjne propolisu [1 - 4]. Ekstrakty propolisowe są bogatym źródłem wielu
naturalnych substancji głównie pochodzenia roślinnego.
Zawierają między innymi aminokwasy, kwasy fenolowe,
estry kwasów fenolowych, flawonoidy, kwasy organiczne
i terpeny [5, 6].
Jedną z ważniejszych grup związków wchodzących
w skład propolisu są flawonoidy należące do polifenoli,
a występujące w postaci aglikonów. Flawonoidy są kluczowymi związkami decydującymi o jakości propolisu. Ich
zawartość determinuje aktywność biologiczną propolisu
[7, 8].
Wysoka aktywność antyoksydacyjna flawonoidów wynika z budowy chemicznej tej grupy związków. Właściwości przeciwutleniające odgrywają istotną rolę w profilaktyce
chorób, których przyczyną jest zaburzenie równowagi pro-i
antyoksydacyjnej organizmu [1, 9].
Działanie przeciwutleniające tych związków jest procesem złożonym i odbywa się na wielu płaszczyznach.
Przede wszystkim polega na inhibicji enzymów generu-
&ARM0RZEGL.AUK
2,0817
(+0,1482)
2,0151
(+0,3228)
1,3559
(+0,3942)
1,0684
(+0,5972)
1,4903
1,6527
1,6960
1,6938
1,7146
1,8329
1,9965
(+0,2738) (+0,3232) (+0,2253) (+0,1943) (+0,2599) (+0,1711) (+0,0544)
1,8887
(+0,1896)
0,3656
(±0,0326)
0,3493
(±0,0311)
0,3601
(±0,0115)
0,2740
0,291
0,2830
0,3018
0,3513
0,3299
0,3383
(±0,0511) (±0,0526) (±0,0381) (±0,0231) (±0,0166) (±0,0216) (±0,0234)
0,2419
(±0,0401)
0,2112
(±0,0554)
Średnia zwartość
flawonoidów
0,1025
0,1605
(+SD)
(±0,0474) (±0,0226)
[ mg/ml]
Średnie
CZA
0,6370
0,9928
(+SD)
(+0,4052) (+0,2845)
[mol/l]
Czas ekstrakcji
[godziny]
0,5
1
2
3
4
5
6
7
8
24
48
72
96
360
Tab. I. Średnie stężenie (+ SD) flawonoidów oraz średnia wartość całkowitej zdolności antyoksydacyjnej (CZA)
w badanych próbkach ekstraktów
jących reaktywne formy tlenu, na chelatowaniu jonów
metali przyczyniających się
do powstawania wolnych
rodników, jak również na
usuwaniu już wytworzonych
aktywnych form tlenu. Dzięki temu flawonoidy należą
do naturalnych przeciwutleniaczy. Duży udział flawonoidów w codziennej diecie
człowieka odgrywa istotną
rolę w profilaktyce schorzeń
spowodowanych między innymi stresem oksydacyjnym,
a istotnym problemem jest
możliwie najefektywniejsze
pozyskanie ich z propolisu
[10].
Biorąc pod uwagę powyższe właściwości flawonoidów, celem pracy była ocena
wpływu czasu ekstrakcji propolisu etanolem na zawartość
flawonoidów w uzyskiwanych ekstraktach oraz ocena
ich aktywności antyoksydacyjnych.
Materiał i metody
Materiał do badań stanowił propolis krajowy pochodzący ze zbiorów z roku
2006 z Pasieki „Barć” im.
Ks. dr Henryka Ostacha
w Kamiannej.
Ekstrakcji poddano próbki propolisu o podobnym stanie rozdrobnienia, pochodzące z tej samej porcji pobranej
z ula. Z surowca propolisowego odważono próbki
o masie 5 g. Do każdej z próbek propolisu dodano 50 g
75% wodnego roztworu etanolu. Ekstrakcję prowadzono
w temp. pokojowej przez 0.5,
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 24, 48, 72,
96 oraz 360 godzin. Podczas
ekstrakcji próbki były często
wstrząsane.
Stężenie
flawonoidów
w uzyskanych ekstraktach
(EEP) oznaczano metodą
wg Woisky i Salatino [6]. Metoda oparta jest na zdolności flawonoidów do tworzenia barwnych kompleksów
z AlCl 3. Oznaczenia wykonywano pobierając ekstrakty po
1 cm 3 (z każdej próbki) we wskazanych wyżej czasach
ekstrakcji. Następnie próbki przesączono. Z przesączu
pobierano 5 Ml, dodawano do 2 cm 3 2% etanolowego
roztworu chlorku glinu i inkubowano przez 1 godzinę
w temperaturze pokojowej. Po tym czasie mierzono
absorbancję przy długości fali L=420 nm w kuwetach
o drodze świetlnej 10 mm przy użyciu Spektrometru
UV 2 UNICAM. Próbę odnośnikową stanowił 2% alkoholowy roztwór chlorku glinu. Stężenie flawonoidów
w próbkach określano na podstawie krzywej wzorcowej
sporządzonej dla kwercetyny [6].
Oznaczenie aktywności antyoksydacyjnej otrzymanych
frakcji propolisu (EEP) przeprowadzono metodą kolorymetryczną przedstawioną przez Erle’a. Metoda polega na
redukcji barwnego kationorodnika ABTS•+ pod wpływem
związków o działaniu antyoksydacyjnym zawartych w badanych próbkach etanolowych ekstraktów propolisu EEP.
Efektem reakcji jest zanik zielononiebieskiej barwy roztworu kationorodnika ABTS•+, a stopień odbarwienia jest proporcjonalny do zawartości przeciwutleniaczy w próbce [9,
11]. W celu oznaczenia właściwości antyoksydacyjnych
ekstraktów po wskazanym czasie prowadzenia ekstrakcji
pobrano i przesączono 50 Ml ekstraktu i rozcieńczono 1cm3
75 % etanolu. Z tak przygotowanego rozcieńczenia pobrano 5 Ml dodano 2 cm3 roztworu ABTS•+ i po 10 minutach
inkubacji zmierzono absorbancję. Pomiaru absorbancji
dokonano przy długości fali L=734 nm w kuwetach o drodze świetlnej 10 mm używając Spektrometru UV 2 firmy
UNICAM.
Całkowitą zdolność antyoksydacyjną (CZA) wyrażono
stężeniem molowym Troloxu i obliczono na podstawie wzoru: CZA=Cm2R, gdzie: Cm – stężenie Troloxu odczytane dla
każdej próbki z krzywej wzorcowej; R – rozcieńczenie danej próbki.
Krzywą wzorcową sporządzono dla roztworów Troloxu
od stężenia 0,015 mmola do 2,0 mmola.
Wyniki i ich omówienie
Oznaczanie stężenia flawonoidów przeprowadzono dla
czterech próbek propolisu. W każdej z próbek po odpowiednim czasie prowadzenia procesu ekstrakcji trzykrotnie oznaczano ich stężenie. Uzyskane wyniki, jako średnią z 12 wykonanych oznaczeń, przedstawiono w tabeli I.
Obliczono również procentowy przyrost stężenia flawonoidów w kolejnych godzinach ekstrakcji w odniesieniu
do stężenia oznaczonego po 0,5 godziny, które przyjęto za
100 % (ryc. 1).
Na podstawie wykonanych oznaczeń i przeprowadzonych analiz stwierdzono, że stężenie flawonoidów we
wszystkich badanych próbkach wyraźnie wzrastało do około ósmej godziny prowadzenia procesu ekstrakcji. Wydłużenie czasu ekstrakcji powyżej 8 godzin skutkowało już tylko
nieznacznym wzrostem stężenia flawonoidów w badanych
próbkach. Niewielka tendencja wzrostowa utrzymywała
się do 72 godziny. Zatem zmiany stężenia oznaczone po
8 godzinach procesu ekstrakcji są nieistotne. Zależność tą
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
400
351,21
342,67
350
321,80
276,05
267,28
przyrost stężenia
przyrost
stê¿enia[%]
[%]
330,00
294,37
283,83
300
356,55
340,72
235,92
250
205,97
200
156,52
150
100,00
100
50
0
0,5
1
2
3
4
5
6
7
8
24
48
72
96
360
czas [godziny]
Ryc. 1. Średni procentowy przyrost stężenia flawonoidów w kolejnych godzinach ekstrakcji w odniesieniu do stężenia
oznaczonego po 0,5 godzinie przyjętego za 100%
PROCENTOWYWZROST#
CZAS;GODZINY=
Ryc. 2. Zmiany procentowe średniej wartości CZA po określonym czasie ekstrakcji w odniesieniu do CZA oznaczonej
po 0,5 godzinie ekstrakcji przyjętej za 100%
potwierdza obliczony procentowy przyrost stężenia flawonoidów w kolejnych godzinach ekstrakcji w odniesieniu do
stężenia oznaczonego po pierwszych 30 minutach (ryc. 1).
Natomiast największą dynamikę przyrostu stężenia flawonoidów w badanych ekstraktach obserwuje się do pięciu
godzin prowadzenia procesu ekstrakcji.
Potwierdzeniem tego faktu jest największa różnica
w stężeniu falwonoidów między pierwszym pomiarem wykonanym po 0,5 godzinie ekstrakcji, a kolejnymi pomiarami wykonanymi po 1, 2, 3, 4 i 5 godzinie ekstrakcji.
Wszystkie otrzymane etanolowe frakcje propolisu posiadały właściwości antyoksydacyjne określone w pracy jako
całkowita zdolność antyoksydacyjną (CZA). Wartość CZA
wzrastała systematycznie, zachowując jednak największą
dynamikę w pierwszych pięciu godzinach ekstrakcji (tab.
I, ryc. 2). Dalszy nieznaczny wzrost właściwości antyoksydacyjnych odnotowano do 48 godzin prowadzenia ekstrakcji. Wzrost właściwości antyoksydacyjnych oznaczany
w próbkach powyżej 48 godzin prowadzenia ekstrakcji jest
bardzo niewielki. Właściwości antyoksydacyjne oznaczane metodą z wykorzystaniem ABTS•+ w znacznym stopniu
korespondowały z dynamiką wzrostu stężenia flawonoidów
oznaczanego w próbkach po określonym czasie prowadzenia procesu ekstrakcji.
&ARM0RZEGL.AUK
Wnioski
Uzyskane wyniki pozwoliły na sformułowanie następujących wniosków:
1. Wydajność pozyskiwania flawonoidów z etanolowych
frakcji propolisu zależy od czasu prowadzenia ekstrakcji. W warunkach opisanego doświadczenia optymalnym
czasem ekstrakcji jest 8 godzin.
2. Podobny charakter do zmian stężenia flawonoidów
w poszczególnych frakcjach zależnych od czasu ekstrakcji, odnotowano w odniesieniu do ich aktywności
antyoksydacyjnej.
Piśmiennictwo
1. Ahn MR i wsp. Antioxidant activity and constituents
of propolis collected in various areas of Korea. J Agric
Food Chem 2004; 52: 7286-7292.
2. Gomez-Caravaca AM i wsp. Advances in the analysis
of phenolic compounds in products derived from bees. J
Pharm Biomed Anal 2006; 41: 1220-1234.
3. Kujumgiev A i wsp. Antibacterial, antifungal and antiviral activity of propolis different geografic origin. J
Ethnofarmacol 1999, 64: 253-257.
4. Lu LC, Chen YW, Chou CC. Antibacterial activity of
propolis against Staphylococcus aureus. Int J Food Microbiol 2005, 102: 213- 217.
5. Bankova V i wsp. Chemical composition of European
propolis: expected and unexpected results. Z Naturforsch
[C] 2002, 57: 530-535.
6. Woisky RG, Salatino A. Analysis of propolis: some parameters and procedures for chemical quality control. J
Apic Res 1998; 37: 99-105.
7. Kosalec I i wsp. Flavonoid analysis and antimicrobial
activity of commercially available propolis products.
Acta Pharm 2005; 55: 423-427.
8. Kosalec I i wsp. Qantitative analysis of the flavonoids in
raw propolis from northern Croatia. Acta Pharm 2004;
54: 65-72.
9. Erel O. A novel automated direct measurement method for
total antioxidant capacity using a new generation, more stable ABTS radical cation. Clin Biochem 2004; 37: 277-285.
10. Emmons C L, Petersen DM, Paul GL. Antioxidant capacity of oat (Avena sativa L.) extracts. In vitro antioxidant
activity and content of phenolic and tocol antioxidants. J
Agric Food Chem 1999; 47: 4894-4898.
11. Russo A, Longo R, Vanella A. Antioxidant activity of
propolis: role of caffeic acid phenethyl esrer and galangin. Fitoterapia 2003; 73: 21-29
Adres do korespondencji:
dr Anna Rzepecka-Stojko
Katedra i Zakład Żywności i Żywienia
Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej
Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
41-200 Sosnowiec, ul. Jedności 8,
tel. +48 32 364 11 73
e-mail:[email protected]