W 1884 roku duński lekarz Hans Christian Gram odkrył różnicującą

Instrukcja do ćwiczeń „Biotechnologia żywności ”
Technologia Żywności i Żywienie Człowieka
r II
Kod przedmiotu
WNOZIR/TZIZ/S1/D4tiz
s. III
Ćwiczenie 1. Izolacja DNA z drobnoustrojów gram dodatnich
prowadzący dr inż. Wojciech Sawicki
W 1884 roku duński lekarz Hans Christian Gram odkrył różnicującą metodę
barwienia, która stała się odtąd podstawą podziału bakterii na dwa typy:
Gram dodatnie (G+) – budująca ich ściany mureina (peptydoglikan, mukopeptyd)
tworzy wielowarstwową błonę. Można ją usunąć działając odpowiednim enzymem –
lizozymem.
Gram ujemne (G-) – odporne na działanie lizozymu. Ich mureina jest jednowarstwowa i
otoczona dodatkową błoną zewnętrzną zbudowaną z białek, fosfolipidów i
lipopolisacharydu (LPS) składającego się z części rdzeniowej (lipidu A) oraz
wielocukrowego łańcucha (antygenu O) nadającego bakteriom swoistość antygenową.
Izolacja DNA jest wstępnym i podstawowym etapem w wielu procedurach
stosowanych w biologii molekularnej, mającym zawsze krytyczne znaczenie dla ich
dalszego przebiegu. Podstawowym celem jest uzyskanie preparatu DNA o wysokiej
czystości i niskim stopniu degradacji.
Etap izolacji DNA:
 fizyczne zniszczenie struktury komórkowej materiału biologicznego
 liza komórek
 usunięcie zdegradowanych wcześniej elementów komórkowych (białka, lipidy,
polisacharydy polifenole, RNA).
 oddzielenie DNA od związków użytych w poprzednich działaniach(detergenty, sole,
inhibitory).
 przygotowanie wyekstrahowanego DNA do przechowywania.
Zastosowana na ćwiczeniach technika:
Technologia AX opiera się na wykorzystaniu unikalnych membran jono-wymiennych
wiążących niezwykle efektywnie ujemnie naładowane cząsteczki DNA. Membrany są
umieszczone w kolumienkach formatu probówek 15 ml. Przepływ roztworów przez
kolumienkę zachodzi pod wpływem sił grawitacji. Zastosowane membrany
jonowymienne w określonych warunkach buforowych wiążą DNA z wydajnością blisko
99,0%, podczas gdy większość zanieczyszczeń przechodzi nie wiąże się i jest w ten sposób
usuwana.
Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny
w Szczecinie
al. Piastów 17, 70-310 Szczecin
tel. Centrala +48 91 449 41 11
NIP: 852-254-50-56; REGON: 320588161
rachunek bankowy: 02 1090 1492 0000 0000 4903 0242
www.zut.edu.pl; www.wnozir.zut.edu.pl
Stosowany na ćwiczeniach zestaw do izolacji DNA:
Genomic Mini AX Bacteria
specyfikacja:
- materiał: membrana jono-wymienna,
- wielkość próbki do izolacji: 0.2 - 1.0 ml 24 godzinnej hodowli komórkowej,
- pojemność złoża: 20 μg DNA,
- roztwory do elucji DNA ze złoża: bufor o wysokiej sile jonowej,
- zastosowania: PCR
Wykonanie:
1. Zwirować 0.2 - 1 ml hodowli bakteryjnej i zawiesić w 100 μl buforu do zawieszania bakterii BS.
Dodać 10 μl lizozymu (stężenie 10 mg/ml) i inkubować 15 min w 37 °C. Następnie dodać 0.9 ml
zawiesiny lizującej LS (uwaga: zawiesinę należy wymieszać przez kilkukrotne odwracanie butelki)
oraz 20 μl roztworu Proteazy.
2. Całość wymieszać i inkubować w 50 °C przez 30 min. Probówkę należy mieszać od czasu do czasu
przez odwracanie.
3. Po inkubacji próbkę intensywnie worteksować przez 15 sek. a następnie wirować 5 min. przy 10
000 - 14 000 obr./min.
4. W trakcie wirowania przygotować kolumnę umieszczoną w probówce 15 ml i nanieść 0.8 ml
roztworu równoważącego K1. Poczekać aż roztwór wypłynie z kolumny.
5. Po wirowaniu pobrać supernatant (na dnie powinien znajdować się zwarty osad stanowiący
mieszaninę niezlizowanego materiału oraz drobinek pochodzących z mieszaniny lizującej) i nanieść
go na zrównoważoną uprzednio kolumnę. Poczekać aż lizat przejdzie przez kolumnę.
6. Płukać kolumnę przez dodanie 3 ml roztworu płuczącego K2. Poczekać aż roztwór wypłynie z
kolumny.
7. Dodać do kolumny 0.25 ml roztworu elucyjnego K3 i poczekać aż wypłynie z kolumny.
8. Przenieść kolumnę do nowej probówki 2 ml, która znajduje się w zestawie (kolumna posiada
odpowiednie żeberka pozwalające na łatwe umieszczenie w probówce) i eluować DNA przez
dodanie do kolumny 1 ml roztworu elucyjnego K3
9. Do eluatu zawierającego DNA dodać 0.8 ml mieszaniny precypitacyjnej PM. Całość wymieszać i
wirować 10 min. przy 12 000 obr./min.
10. Po odwirowaniu zlać supernatant (na dnie powinien być widoczny jasnoniebieski osad DNA) i
dodać do probówki 0.5 ml 70% etanolu. Próbkę wymieszać i wirować 3 min. przy 12 000 obr./min.
11. Po wirowaniu zlać supernatant i trzymając probówkę w pozycji odwróconej, przytknąć samą
końcówkę pipety (tips bez pipety) do dna i ścianek probówki celem kapilarnego usunięcia resztek
alkoholu. Następnie suszyć odwróconą do góry dnem probówkę przez 5 min. w temp. pok.
12. Osad zawiesić w odpowiedniej ilości jałowej wody destylowanej, buforu TE lub buforu 10 mM
TRIS pH 8.0 (niebieska barwa osadu pozwala kontrolować proces rozpuszczania DNA).
Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny
w Szczecinie
al. Piastów 17, 70-310 Szczecin
tel. Centrala +48 91 449 41 11
NIP: 852-254-50-56; REGON: 320588161
rachunek bankowy: 02 1090 1492 0000 0000 4903 0242
www.zut.edu.pl; www.wnozir.zut.edu.pl