Analityka ogólna, dwiczenia dla studentów III OAM 2010/2011

Analityka ogólna, dwiczenia dla studentów III OAM
Wydział Farmaceutyczny UJCM, Zakład Diagnostyki Medycznej
2010/2011
ENZYMY
Enzymy komórkowe:
o Miejscem ich działania są komórki, są związane z różnymi organellami komórkowymi:
o Pojawiają się w dużych ilościach po uszkodzeniu narządów.
o Należą do nich min. ALT, AST
Enzymy sekrecyjne:
o Po uszkodzeniach komórek (np. hepatocytów) zachodzi spadek ich aktywności, ponieważ ich
ilośd zależy od syntezy na rybosomach.
o Należą do nich min. czynniki krzepnięcia krwi oraz fibrynolizy, esterazy cholinowe i lipaza
lipoproteinowa.
Enzymy ekskrecyjne
o przeszkoda w odpływie wydzielin ustrojowych, takich jak: żółd, sok trzustkowy, ciecz
sterczowa czy ślina, powoduje zastój wydzieliny i przedostanie się enzymów do krwiobiegu.
o Do tej grupy należą enzymy soku trzustkowego, żółci oraz fosfataza sterczowa
_________________________________________________
Izoenzymy
o Homologiczne enzymy w obrębie danego organizmu, które katalizują tę samą reakcję,
ale różnią się nieznacznie strukturą, wartościami Km i Vmax oraz właściwościami
regulacyjnymi.
o Izoenzymy ulegają ekspresji w różnych tkankach lub organellach w różnych stadiach
rozwojowych.
o Są kodowane przez geny zajmujące różne loci
o Izoenzymy można często odróżnid od siebie na podstawie właściwości biochemicznych, np.:
 ruchliwośd elektroforetyczna – izoenzymy dehydrogenazy mleczanowej
 Inhibicja przez L-winian: L-winian hamuje kwaśną fosfatazę sterczową, nie działając
na inne izoenzymy fosfatazy kwaśnej
1
Analityka ogólna, dwiczenia dla studentów III OAM
Wydział Farmaceutyczny UJCM, Zakład Diagnostyki Medycznej
2010/2011
OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ENZYMÓW
Typowe przyczyny zmian aktywności enzymów we krwi:
o
o
o
o
o
Zmiana przepuszczalności błony komórkowej
Rozpad komórek w wyniku patologicznych procesów
Zmiany w eliminacji/katabolizmie enzymu
Zwiększona proliferacja komórek/ indukcja enzymów
Utrudniony odpływ wydzieliny gruczołu zawierającej enzymy ekskrecyjne
o
Upośledzenie syntezy enzymu
Zasada pomiaru aktywności enzymów
A) Kofaktory oznaczanych enzymów:
Pomiar spadku/ wzrostu absorbancji pochodzący od powstającego/ zużywanego w reakcji
enzymatycznej NADH lub NADPH :
o
o
o
NADH/NAD i NADPH/NADP są kofaktorami używanymi przez wiele enzymów
Redukcja NAD do NADH i NADP do NADPH jest monitorowana przy =340 nm, ponieważ
forma utleniona nie absorbuje światła przy tej długości fali.
Jeśli oznaczany enzym nie wymaga do swej aktywności kofaktorów w postaci NADH/NAD
i NADPH/NADP, istnieje koniecznośd sprzężenia reakcji dla oznaczanego enzymu z reakcją
pomocniczą oraz/lub wskaźnikową podczas której wykorzystywany jest enzym wymagający
do prawidłowego funkcjonowania ww. kofaktorów, np.:
ALT
L-alanina + a-ketoglutaran <---------> L-glutaminian + pirogronian
reakcja wskaźnikowa:
LDH
+
pirogronian + NADH + H <--------> mleczan + NAD+
B) Analogi naturalnych substratów:
Pomiar wzrostu absorbancji pochodzący od powstającego p- nitrofenolu:
o
o
p-nitrofenol może zostad sprzęgnięty z wieloma związkami chemicznymi, tworząc sztuczny
substrat dla oznaczanego enzymu
Enzym katalizuje reakcję odszczepienia p-nitrofenolu, który tworzy żółto zabarwiony anion pnitrofenolanowy

p-nitrofenylofosforan (pNPP) – fosfatazy

p-nitrofenylo-D-maltoheptozyd (pNP-G7) - amylaza
C) Substancje, z których pod wpływem reakcji enzymatycznej powstają barwne produkty:

3,3’,5,5’-tetrametylobenzydyna (TMB)
2
Analityka ogólna, dwiczenia dla studentów III OAM
Wydział Farmaceutyczny UJCM, Zakład Diagnostyki Medycznej
2010/2011
Pomiar szybkości reakcji odbywa się w ustalonych i ściśle kontrolowanych warunkach
(pH, temperatura, stężenie substratów, aktywnośd innych enzymów biorących udział w reakcji),
w określonym przedziale czasu.
Aktywnośd enzymatyczna wyrażamy w dwóch standardowych jednostkach.
o
o
jednostka enzymatyczna (IU – international unit) jest to taka ilośd enzymu, która katalizuje
przekształcenie 1 μmola substratu w ciągu 1 minuty, w warunkach optymalnych dla danego
enzymu.
Katal (kat) jest jednostka aktywności enzymatycznej obowiązująca w układzie SI, to taka ilośd
enzymu, która w standardowych warunkach przekształca 1 mol substratu w ciągu 1 sekundy.
1 kat – 6x107 IU
1 IU = 1 μmol/min
1 kat = 1 mol/s
→ 60 mol/min → 6x107 IU
1 μkat = 60 IU
1 IU = 16,7 μkat
o
Dopuszcza się stosowanie jednostki zwyczajowej (U - unit) pod warunkiem wskazania
przelicznika obu jednostek.
Jednostki U definiuje się w sposób zaproponowany przez producenta danego testu
enzymatycznego np. oznaczanie mieloperoksydazy (enzymu katalizującego reakcję utleniania w
obecności H2O2):
 sztuczny substrat – gwajakol (forma utleniona jest barwna)
 przyrost absorbancji związany jest z przyrostem barwnego produktu
 ściśle zdefiniowane warunki reakcji: 1% gwajakol, 6mmol H2O2, pH 7.4, temperatura 37
st. C
 pomiar absorbancji dla długości fali  = 450 nm
1U = taka aktywnośd enzymu, która spowoduje przyrost absorpcji równy 1 w czasie 1 min.
3
Analityka ogólna, dwiczenia dla studentów III OAM
Wydział Farmaceutyczny UJCM, Zakład Diagnostyki Medycznej
2010/2011
STANDARYZACJA OZNACZEO ENZYMATYCZNYCH:
Cel: otrzymanie porównywalnych wyników aktywności enzymów w materiale biologicznym,
niezależnie od:
 rodzaju użytych odczynników (firmy produkującej zestawy odczynników),
 analizatora biochemicznego, na którym dane oznaczenie było przeprowadzone,
 laboratorium w którym oznaczenie było przeprowadzone
Próba standaryzacji metod enzymatycznych przez IFCC (International Federation of Clinical Chemistry
and Laboratory Medicine – Międzynarodowa Organizacja Chemii Klinicznej) zaproponowała system
referencyjny, który obejmuje:
 dobrze zdefiniowane metody referencyjne oznaczania aktywności enzymów, które
cechują się linową zależnością wyników pomiaru od stopnia rozcieoczenia materiału,
 stworzenie certyfikowanych materiałów referencyjnych,
 utworzenie sieci laboratoriów referencyjnych
4
Analityka ogólna, dwiczenia dla studentów III OAM
Wydział Farmaceutyczny UJCM, Zakład Diagnostyki Medycznej
2010/2011
ENZYMY - WYBRANE ZAGADNIENIA
1. Aminotransferazy a alkoholowe uszkodzenie wątroby
o
o
o
W większości typów schorzeo wątroby aktywnośd AlAT jest wyższa niż AspAT; wyjątek
stanowi alkoholowe zapalenie wątroby, w którym może byd wiele przyczyn podwyższenia
aktywności AspAT.
Alkohol indukuje uwalnianie mitochondrialnej AspAT z komórek bez ich widocznego
uszkodzenia.
Niedobór pirydoksyny, częsty u alkoholików, zmniejsza aktywnośd wątrobowej AlAT
2. Wskaźnik de Ritisa
Określa stosunek poziomu (aktywności) aminotransferazy asparaginianowej do poziomu
aminotransferazy alaninowej (AST/ALT).
W warunkach prawidłowych parametr ten jest nieco wyższy od 1
Wskaźnik <1 (AspAT < AlAT) sugeruje takie choroby miąższu wątroby, jak:
 przewlekłe wirusowe zapalenia wątroby,
 hemochromatoza,
 uszkodzenia polekowe i toksyczne,
 autoimmunologiczne zapalenie wątroby
Wskaźnik >1 (AspAT > AlAT) może świadczyd o:
 toksycznym uszkodzeniu wątroby (często w praktyce wskazywad to może na alkoholową
chorobę wątroby AspAT/AlAT>2)
 marskości wątroby
 pozawątrobowej przyczynie - zap. trzustki, zawał serca, uszkodzenie mięśni szkieletowych
3. Wielokrotnośd górnej granicy normy – znaczenie diagnostyczne
o
o
o
o
o
o
100x – ciężkie uszkodzenie wątroby spowodowane działaniem toksyn
W przebiegu ostrego WZW wzrost aktywności AlAT i AspAT jest co najmniej 10-krotny
powyżej górnej granicy normy, a często 20-30-krotny i wyższy
W przebiegu przewlekłego WZW wzrost aktywności AlAT i AspAT jest niższy niż 10-krotny
powyżej górnej granicy normy
W autoimmunologicznym zapaleniu wątroby aktywnośd AlAT i AspAT zwykle fluktuują
w granicach 100-1000 U/l
W marskości aktywnośd AlAT i AspAT najczęściej jest nieznacznie podwyższona (np. 1,5-5 razy
powyżej g.g.n.), ale aminotransferazy w normie nie wykluczają marskości wątroby
Przewlekłe, niewielkie podwyższenie aktywności AlAT i AspAT u pacjentów bezobjawowych
może byd spowodowane najczęściej: nadużywaniem alkoholu, stosowanymi lekami,
stłuszczeniem wątroby (niealkoholowym)
5
Analityka ogólna, dwiczenia dla studentów III OAM
Wydział Farmaceutyczny UJCM, Zakład Diagnostyki Medycznej
2010/2011
4. Diagnostyka enzymatyczna chorób wątroby – porównanie:
CHOROBY WĄTROBY
AST
ALT
AST/ALT
Ostre zapalenie
wątroby
Przewlekłe zapalenie
wątroby
Choroba alkoholowa
 10-20 x
 10-30 x
<1
N
10 x
N
7 x
N
5 x
N
3 x
N
8 x
vN
2 x
N
3 x
N
5 x
Cholestaza
wewnątrzwątrobowa
Cholestaza
zewnątrzwątrobowa
>1
>5
>1,5
<1,5
ALP
GGT
N
3 x
N
3 x
N
2 x
N
7 x
N
3 x
N
3 x
2-10 x
1-10 x
N
7 x
2-10 x
5. Przykładowe enzymy oznaczane w moczu:


Amylaza
NGAL - lipokaina związana z żelatynazą neutrofili
 Nowy wczesny marker ostrej niewydolności nerek, może byd oznaczany we krwi i w
moczu, przy czym w moczu notuje się wyższy wzrost stężenia (>100-krotny) niż w osoczu
(ok. 10-krotny).
 Ekspresja NGAL w komórkach cewek nerkowych znacznie wzrasta w związku z ich
niedokrwieniem lub uszkodzeniem przez nefrotoksyny.
 ABBOTT Architect – oznaczenie immunochemiluminescencyjne (CMIA)

N-acetylo-β-D – heksozoaminidaza
 W moczu oznaczana jest przede wszystkim izoforma a składająca się z podjednostek 
 NAG jest wczesnym markerem uszkodzenia nerek oraz markerem nasilającej się
niewydolności nerek
6