Trójwymiarowe obrazowanie komórek metoda mikroskopii konfokalnej

Trójwymiarowe obrazowanie komórek metoda mikroskopii konfokalnej

Badanie dynamiki białek jądrowych w żywych komórkach metodą
mikroskopii konfokalnej.
Cel: Zbadanie dynamiki histonów wyznakowanych GFP w żywych i utrwalonych komórkach metodą FRAP
(Fluorescecne Recovery After Photobleaching)
Zakres Materiału: Podstawy mikroskopii konfokalnej, białka fluorescencyjne, struktura chromatyny
Literatura:
FRAP analysis of binding: proper and fitting. Brian L. Sprague and James G. McNally, Trends in Cell
Biology, Volume 15, Issue 2, 84-91, 1 February 2005
Dynamic binding of histone H1 to chromatin in living cells. Misteli T, Gunjan A, Hock R, Bustin M, Brown
DT. Nature. 2000 Dec 14;408(6814):877-81.
Tytuł referatu:
1. Rola białek histonowych w organizacji wysokorzędowych struktur chromatyny
2. Metoda FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching)
Wysokorzędowe struktury chromatyny
W jądrze interfazowym wyróżnia się dwie formy strukturalne chromatyny: heterochromatynę i
euchromatynę. Heterochromatyna stanowi tę część chromatyny w interfazie, która pozostaje w formie silnie
skondensowanej. Pod mikroskopem elektronowym jest widoczna jako ciemne regiony występujące na
peryferiach jądra. Wykazano, że heterochromatyna jest transkrypcyjnie nieaktywna, lecz może pełnić ważne
funkcje regulujące transkrypcję. Euchromatyna, ze względu na większe rozproszenie, nie jest tak dobrze
widoczna jak heterochromatyna. Euchromatyna to region jądra, w którym zachodzi transkrypcja. W obrębie
euchromatyny i heterochromatyny występują wysokorzędowe struktury chromatyny zaangażowane w regulację
transkrypcji. Struktury te decydują, czy dany gen będzie dostępny dla układu enzymatycznego
odpowiedzialnego za transkrypcję.
Wiele modeli wysokorzędowych struktur chromatyny zakłada, że są one tworzone przez włókna
układające się w regularne helisy, jednak nie znajduje to potwierdzenia w najnowszych badaniach. Wbrew
powszechnej opinii, DNA nie występuje in vivo w postaci 30 nm włókna o regularnym ułożeniu nukleosomów.
W żywych komórkach nukleosomy tworzą nieregularną trójwymiarową strukturę zygzaka, natomiast struktura
30 nm włókna jest obserwowana jedynie w wyizolowanej chromatynie, wraz ze wzrostem stężenia soli w
roztworze. Badania tej formy struktury DNA pokazały, że nukleosomy są w niej zwinięte w lewoskrętną helisę.
Nazwano ją solenoidem (Rys.1), na jeden obrót helisy przypada tu 6 nukleosomów. Układ ten może jednak
powstawać tylko w warunkach doświadczalnych. Dopiero przyjęcie modelu nieregularnego ułożenia
nukleosomów (Rys. 2), a nie solenoidu, pozwala wytłumaczyć fakt, że odcinki łącznikowe między
nukleosomami w komórce mają różną długość.
Rysunek 1. Model solenoidu.
Rysunek 2 Model włókna chromatyny z nieregularnym ułożeniem nukleosomów.
Funkcje wysokorzędowych struktur chromatyny
Należy podkreślić, że wysokorzędowe struktury chromatyny nie służą wyłącznie do ciasnego
upakowania DNA w jądrze, ale pełnią istotną rolę w regulacji ekspresji genów. Badania ludzkiego chromosomu
X pokazały, że nie ma różnicy w stopniu kondensacji chromatyny na poziomie molekularnym między
aktywnym a nieaktywnym chromosomem X. Natomiast chromosom X podlegający transkrypcji ma znacznie
większą powierzchnię, a zatem to właśnie wysokorzędowa struktura chromosomu zapewne decyduje o jego
funkcji. W jądrze interfazowym każdy chromosom zajmuje ograniczoną przestrzeń, a poszczególne terytoria
chromosomowe są od siebie oddzielone tzw. domenami wewnątrzchromosomowymi. RNA powstały w
procesie
transkrypcji
na
powierzchni
terytorium
chromosomowego
trafia
następnie
do
domen
wewnątrzchromosomowych, gdzie podlega dalszej obróbce i transportowi. Zatem wysokorzędowa struktura
chromatyny może decydować o tym, czy dany gen znajdzie się w odpowiedniej części regionu
chromosomowego i ulegnie transkrypcji.
Obecnie przyjmuje się, że wysokorzędowe struktury chromatyny są tworami bardzo dynamicznymi.
Występowanie wielu rodzajów struktur wysokorzędowych pozwala na precyzyjną kontrolę kluczowych
procesów, takich jak transkrypcja czy replikacja.
Rola histonu H1 w tworzeniu wysokorzędowych struktur chromatyny
Histon H1 jest ulokowany na zewnątrz nukleosomu, gdzie wiąże się z łącznikowym DNA i oddziałuje z
podjednostką H2A rdzenia. Jeśli odcinek DNA nawinięty na nukleosom zostanie skrócony z 160 do 140 par
zasad, to H1 zostaje uwolniony z nukleosomu. Usunięcie histonu H1 uniemożliwia powstanie
wysokorzędowych struktur chromatyny o największym stopniu upakowania, ponieważ jego ładunek
elektryczny jest niezbędny do zobojętnienia ujemnego ładunku DNA. Badania pokazały, że histon H1 jest
białkiem o dużej dynamice, istnieją też doniesienia pokazujące, że histon ten może pełnić istotną rolę w
regulacji transkrypcji genów.
Technika FRAP
W doświadczeniach tych w żywych komórkach umieszczonych na stoliku mikroskopu część jądra zostanie
naświetlona dużą dawką światła tak, aby doprowadzić do wyblaknięcia GFP związanego z histonami.
Następnie w określonych odstępach czasu będą rejestrowane obrazy tego jądra, w których będzie obserwowany
powrót fluorescencji w wyblakniętym rejonie dzięki nieustannej wymianie histonów między miejscami
wiązania z DNA. Pomiar tempa powrotu fluorescencji i jej poziomu po osiągnięciu równowagi pozwolą na
określenie dynamiki białek histonowych oraz frakcji histonów na stałe związanych z DNA.
Rys. 3. Schemat doświadczenia techniką FRAP.
Plan ćwiczeń
Celem ćwiczeń jest obserwacja struktury chromatyny w żywych komórkach przy użyciu mikroskopu
konfokalnego. W ćwiczeniu zostaną wykorzystane żywe oraz utrwalone komórki z histonami H1 i H2B
wyznakowanymi GFP.
Procedura utrwalania komórek:
Komórki przepłukać PBS 3 x 5 min (2 ml na szalkę)
Utrwalić 4% formaldehydem 15 min w temperaturze pokojowej (2 ml na szalkę)
Przepłukać 2xPBS (2 ml na szalkę)
Plan doświadczeń:
1. Obrazowanie żywych komórek z histonem H1-GFP oraz pomiar dynamiki wyznakowanego histonu
metodą FRAP
2. Obrazowanie utrwalonych komórek z histonem H1-GFP oraz pomiar dynamiki wyznakowanego histonu
metodą FRAP
3. Obrazowanie żywych komórek z histonem H2B-GFP oraz pomiar dynamiki wyznakowanego histonu
metodą FRAP
4. Obrazowanie utrwalonych komórek z histonem H2B-GFP oraz pomiar dynamiki wyznakowanego
histonu metodą FRAP
DNA w żywych i utrwalonych komórkach będzie barwione różnymi barwnikami fluorescencyjnymi, następnie
zarejestrowane zostaną obrazy tych komórek . Na ich podstawie porównane zostaną właściwości różnych
barwników i ich oddziaływanie na dynamikę histonów w żywych komórkach.
Szkło laboratoryjne:
3 zlewki 100 ml
3 probówki 10 ml
Pipety automatyczne, rękawiczki
Odczynniki:
PBS