Wykorzystanie bakterii produkujących biosurfaktanty w

Wykorzystanie bakterii produkujących biosurfaktanty w bioremediacji gleb
skażonych związkami ropopochodnymi
Związki ropopochodne stanowią poważne zagrożenie dla funkcjonowania wielu
ekosystemów. Obiecującą metodą bioremediacji środowisk skażonych tymi związkami jest
bioaugmentacja.
autochtonicznych
Metoda
ta
zespołów
polega
na
zwiększeniu
mikroorganizmów
poprzez
zdolności
degradacyjnych
wprowadzenie
do
gleby
wyselekcjonowanych, pojedynczych szczepów mikroorganizmów lub też ich konsorcjum.
Wprowadzane
szczepy,
obok
właściwości
degradacyjnych,
powinny
również
charakteryzować się zdolnością do produkcji związków powierzchniowo-czynnych
(biosurfaktantów). Związki te zwiększają biodostępność węglowodorów, w efekcie czego są
one łatwiej rozkładane przez mikroorganizmy.
Celem
rozprawy
doktorskiej
było
określenie
efektywności
procesu
bioaugmentacyjnego prowadzonego w glebie zanieczyszczonej związkami ropopochodnymi
z wykorzystaniem szczepów bakterii zdolnych do degradacji węglowodorów oraz produkcji
biosurfaktantów, a także ocena wpływu tych bakterii na strukturę i aktywność metaboliczną
autochtonicznych zespołów mikroorganizmów w oczyszczanej glebie. Ponadto, w celu
obniżenia kosztów produkcji biosurfaktantów przez testowane szczepy, oceniano możliwość
zastąpienia komercyjnych podłoży stosowanych do ich hodowli przez “niskokosztowe”
podłoża naturalne, w postaci ścieków i produktów ubocznych z różnych gałęzi przemysłu.
Spośród 45 szczepów bakterii rozkładających węglowodory, wyizolowanych z gleby
zanieczyszczonej związkami ropopochodnymi, do badań wybrano 4 izolaty (Bacillus sp. T-1,
T’-1, I’-1a oraz Pseudomonas sp. P-1). Szczepy te wykazywały zdolność do produkcji
biologicznych związków powierzchniowo-czynnych na podłożu przygotowanym na bazie
melasy. Ponadto, szczep P-1 wykazywał zdolność do rozkładu n-heksadekanu, surowej ropy
naftowej oraz jej frakcji destylacyjnych A5 i P3. Produkowany przez niego biosurfaktant był
mieszaniną mono- i di- ramnolipidu, z przewagą kongeneru di-ramnolipidowego. Podczas
wzrostu na podłożu melasowym szczep ten przeprowadzał również efektywną emulsyfikację
cykloheksanu, oleju silnikowego oraz n-heksadekanu. Do doświadczenia bioaugmentacyjnego
wykorzystano 2 spośród testowanych szczepów - Bacillus subtilis T’-1 oraz Pseudomonas sp.
P-1. Zastosowanie rifampicynoopornych, spontanicznych mutantów tych szczepów
umożliwiło monitorowanie ich przeżywalności w inokulowanej glebie. Eksperyment
prowadzony był w warunkach laboratoryjnych przez 91 dni w następujących układach
badawczych:
1) gleba inokulowana szczepem T’-1, 2) gleba inokulowana szczepem P-1, 3) gleba
inokulowana konsorcjum złożonym ze szczepów T’-1 oraz P-1, 4) gleba kontrolna, do której
zamiast zawiesiny bakterii wprowadzano sterylną sól fizjologiczną. Po jego zakończeniu
stwierdzono istotne statystycznie
(P<0,05)
ubytki
węglowodorów
we wszystkich
bioaugmentowanych glebach, jednakże w glebie traktowanej mieszaniną szczepów P-1+T’-1
uzyskano trzykrotnie wyższy ubytek tych związków, w porównaniu z glebami
inokulowanymi pojedynczymi szczepami. Wykazano również, że wszystkie szczepy,
introdukowane zarówno pojedynczo, jak i w postaci konsorcjum, przeżywały w glebie przez
cały okres trwania doświadczenia.
W następnym etapie badań oceniano wpływ szczepów T’-1, P-1 oraz ich konsorcjum
na mikroflorę autochtoniczną zamieszkującą oczyszczaną glebę. Wpływ tych bakterii na
zmiany w liczbie kopii genu 16S rRNA oraz genu kodującego hydroksylazy alkanowe (alkB)
badano z zastosowaniem metody łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym
(ang. real-time PCR). Wykazano, że inokulacja gleby tymi szczepami prowadziła do
statystycznie istotnego (P<0,05) zwiększenia liczby kopii genu 16S rRNA w 1 i 7 dniu
trwania doświadczenia, w porównaniu z glebą niebioaugmentowaną. W dniu 42 nie
odnotowano istotnych statystycznie (P<0,05) zmian w ilości kopii tego genu pomiędzy
badanymi glebami, natomiast po zakończonym eksperymencie statystycznie istotny (P<0,05)
wzrost kopii tego genu, w porównaniu do pozostałych układów badawczych, oszacowano
w glebie traktowanej szczepem P-1. Liczba kopii genu alkB była natomiast istotnie
statystycznie (P<0,05) większa w bioaugmentowanych glebach, w porównaniu do kontroli,
przez cały okres trwania doświadczenia. Wpływ wprowadzanych bakterii na ogólną
bioróżnorodność bakterii oraz bioróżnorodność bakterii zdolnych do rozkładu węglowodorów
alifatycznych oceniano metodą elektroforezy w gradiencie czynnika denaturującego (DGGE,
ang. denaturing gradient gel electrophoresis). Zależności pomiędzy uzyskanymi profilami
DGGE analizowano konstruując drzewa filogenetyczne metodą średnich połączeń (UPGMA,
ang. unweighted pair group with mathematical averages). Zaobserwowano, że wprowadzenie
bakterii do skażonej gleby zmieniło zarówno ogólną bioróżnorodność genetyczną zespołów
bakterii jak i bioróżnorodność genetyczną zespołów rozkładających węglowodory w tej
glebie. Zmiany w strukturze zespołów mikroorganizmów autochtonicznych zachodzące
w czasie prowadzonego doświadczenia badano metodą analizy fosfolipidowych kwasów
tłuszczowych (PLFA, ang. phospholipid fatty acid) izolowanych bezpośrednio z gleby.
Wykazano, że wprowadzenie bakterii, zarówno pojedynczych szczepów jak i ich konsorcjum,
powodowało krótkotrwałe zmiany w ilości kwasów tłuszczowych charakterystycznych dla
bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych. Najwyraźniejsze zmiany, polegające na istotnym
statystycznie (P<0,05) wzroście zawartości wszystkich analizowanych kwasów we
wszystkich bioaugmentowanych glebach obserwowano 7 dni po rozpoczęciu doświadczenia.
Po zakończonym eksperymencie w glebach traktowanych szczepami T’-1 oraz T’-1+P-1 nie
odnotowano istotnych statystycznie (P<0,05) zmian w zawartości analizowanych kwasów
w porównaniu do gleby nietraktowanej bakteriami. Natomiast w glebie bioaugmentowanej
szczepem P-1 w 91 dniu obserwowano statystycznie (P<0,05) niższy, w porównaniu do
kontroli, poziom kwasów charakterystycznych dla bakterii Gram-dodatnich. Zmiany
w bioróżnorodności metabolicznej zespołów mikroorganizmów oceniono na podstawie
analizy profili metabolizowania substratów wzrostowych przez zespoły mikroorganizmów
(CLPPs, ang. community-level physiological profiles) występujące w badanej glebie. CLPPs
wyznaczono przy użyciu płytek EcoPlates™ i systemu BIOLOG. Zaobserwowano, że na
początku doświadczenia analizowane gleby różniły się substratami, których rozkład stanowił
największy udział w ogólnej degradacji węgla. W kolejnych tygodniach doświadczenia
obserwowano wzrastające podobieństwo pomiędzy profilami metabolicznymi uzyskanymi dla
gleb traktowanych bakteriami T’-1, P-1 oraz T’-1+P-1. Po zakończonym doświadczeniu
podobne substraty były preferencyjnie metabolizowane przez mikroorganizmy występujące
w glebie poddanej procesowi bioaugmentacji. Ponadto,w bioaugmentowanych glebach
w 1 i 91 dniu doświadczenia obserwowano wyższą, w porównaniu do kontroli, aktywność
metaboliczną zespołów mikroorganizmów autochtonicznych.
Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że bioaugmentacja gleby skażonej
związkami ropopochodnymi szczepami bakterii Bacillus subtilis T’-1, Pseudomonas sp.
P-1 lub ich konsorcjum T’-1+P-1 prowadziła do zmian w genetycznej i metabolicznej
bioróżnorodności bakterii, dzięki którym efektywność procesu bioremediacji była większa.