Załącznik do Zarządzenia nr 56

Nazwa pola
Nazwa przedmiotu (w języku
polskim oraz angielskim)
Jednostka oferująca przedmiot
Liczba punktów ECTS
Sposób zaliczenia
Język wykładowy
Określenie, czy przedmiot
może być wielokrotnie
zaliczany
Skrócony opis przedmiotu
Pełny opis przedmiotu
Komentarz
Metody analityczne w chemii bioorganicznej
Analytical methods in bioorganic chemistry
CBMiM PAN
4
Egzamin na ocenę – egzamin pisemny, jedno pytanie z 1 godziny
wykładu
polski
Wymagane zaliczenie jednorazowe
W ramach wykładu zostaną zaprezentowane podstawy fizyczne
magnetycznego rezonansu jądrowego NMR i omówienie
podstawowych metod spektroskopii NMR.
Przedstawione zostaną metody krystalograficzne w analizie
strukturalnej białek i kwasów nukleinowych.
Przedstawione zostaną metody sekwencjonowania DNA.
Zostaną przedstawione chemiczne i fizykochemiczne podstawy
oddziaływań cząsteczek chromatografowanych substancji z różnego
typu wypełnieniami stosowanymi w chromatografii cieczowej.
Omówione zostaną parametry wypełnień istotne dla prawidłowego
doboru typu wypełnienia do zadania analitycznego.
Przedyskutowane zostaną parametry elementów konstrukcyjnych.
Przedstawione zostaną enzymatyczne i chemiczne metody
sekwencjonowania białek. W obrębie metod enzymatycznych
omówione zostaną schematy analiz z wykorzystaniem odpowiednich
proteaz, w tym dipeptydaz. Omówione zostaną metody chemiczne
sekwencjonowania od N-końca (metoda Edmana) oraz od C-końca
(metoda z zastosowaniem fenyloizotiocyjanianu). Omówione zostanie
zagadnienie sekwwencjonowania z użyciem metody Tandem Mass
Spectrometry. W ramach wykładu zostaną przedstawione także
metody spektralne (spektrometria UV/VIS i spektrofluorymetria)
ilościowego oznaczania oligonukleotydów i białek, badania
przemian fazowych kompleksów biopolimerów i wykrywania
oddziaływań „gospodarz-ligand).
W ramach wykładu omawiane zostaną podstawowe techniki izolacji
DNA, RNA i białek z preparatów biologicznych, a także separacji
(elektroforeza) i identyfikacji (hybrydyzacja) biomolekuł , fizyczne
podstawy elektroforezy i podstawowe techniki elektroforetyczne do
separacji biomolekuł: elektroforeza żelowa i kapilarna.
Przedstawiona będzie elektroforeza dwukierunkowa i jej
zastosowanie w badaniach proteomicznych oraz techniki
hybrydyzacyjne oraz immunoenzymatyczne (Southern, Northern i
Western), a także ich praktyczne zastosowanie w diagnostyce
medycznej, analizie mutacji genetycznych i badaniach z
wykorzystaniem białek rekombinantowych.
Słuchacze zapoznają się z metodami rejestracji widm 1H, 13C, 31P,
29Si oraz 15N. Omówione zostaną parametry jakościowe i ilościowe
dostępne w analizie widm NMR. Omawiany będzie wpływ struktury
badanych związków na obraz podstawowych widm NMR.
Zaprezentowane zostaną również podstawowe sekwencje pulsowe i
1
techniki wykorzystywane do rejestracji widm – DEPT, INEPT.
Omówione zostaną podstawowe definicje związane z krystalografią i
analizą rentgenostrukturalną, metody krystalizacji biocząsteczek,
zjawiska dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego, metody
rozwiązywania struktury(problemu fazowego) w oparciu o dane
dyfrakcyjne (metody: bezpośrednia, SIR/MIR, MR, MA),
udokładnianie modelu struktury, parametry oceny jakości
uzyskanego modelu struktury oraz znaczenie stosowania badań
krystalograficznych w rozwoju nauki.
Przedstawione zostanie sekwencjonowanie DNA metodą MaxamaGilberta, metodą Sangera z wykorzystaniem fluorescencyjnie
znakowanych trifosforanów nukleozydów, narzędzia biologii
molekularnej stosowane w sekwencjonowaniu genomów (PCR,
technologia rekombinacji genów, chromosome walking), schemat
sekwencjonowania genomów, zsekwencjonowanie ludzkiego genomu.
Nowoczesne metody sekwencjonowania DNA –
pirosekwencjonowanie, sekwencjonowanie pojedynczej cząsteczki
DNA, sekwencjonowanie z użyciem nanoporów.
Omówione zostaną metody analizy i rozdziału związków
organicznych, polimerów i biopolimerów stanowiących podstawy
współczesnej chemii, biochemii i chemii medycznej a szczegónie
podstawowe pojęcia w zakresie typów chromatografii cieczowej i
obszarów jej stosowania (chemia, farmacja, biochemia i biologia
molekularna), stosowane techniki rozdziału (na żelu krzemionkowym,
na odwrotnej fazie, złoża jonowymienne, filtracja żelowa) i
mechanizmy oddziaływań (siły Van derWaalsa, oddziaływania
hydrofobowe, jonowe) wykorzystywane w danej rodzinie metod,
charakterystyka podstawowych typów wypełnień, rodzaj grup
funkcyjnych, stopień rozwinięcia powierzchni, porowatość złoża a
wielkość separowanych cząsteczek, trwałość nośnika (żel
krzemionkowy, złoża polimerowe), charakterystyka podstawowych
typów modułów chromatografów cieczowych, pompy tłokowe i
strzykawkowe, detektory UV-VIS, IR, RI, MS, ELSD, typowe objawy
niedomagań kolumn chromatograficznych i elementów
chromatografu,a także sposoby ich unikania lub naprawy, wzrost
ciśnienia wstecznego, ubytek złoża, niewłaściwa średnica
wewnętrzna użytych kapilar połączeniowych.
Omówione zostaną metody enzymatycznego i chemicznego
określania sekwencji aminokwasów w peptydach a w szczególności:
wstępna hydroliza enzymatyczna dużych białek i izolowanie
otrzymanych peptydów, sposoby odblokowywania N-terminalnej
grupy aminowe, schematy analiz z wykorzystaniem odpowiednich
proteaz, w tym dipeptydaz, metoda chemiczna sekwencjonowania od
N-końca (metoda Edmana)i jej ograniczenia, metoda chemiczna
sekwencjonowania od C-końca i jej ograniczenia, metody ochrony
„wrażliwych” aminokwasów (Ser, Thr, Cys, Trp), metody
sekwencjonowania z użyciem techniki spektrometrii mas, metody
identyfikowania aminokwasów uwolnionych w kolejnych cyklach
degradacji (znaczniki UV i fluorescencyjne, znakowanie
2
radioizotopowe).
Część wykładu poświęcona metodom spektralnym obejmować będzie
zastosowanie spektrometrii UV/VIS i spektrofluorymetrii w
następujących zagadnieniach badawczych - określanie ilościowe
kwasów nukleinowych i białek w oparciu o charakterystyczne
współczynniki ekstynkcji, badanie stabilności termicznej struktur
wyższego rzędu (dupleksów i trypleksów oligonukleotydowych) przez
pomiar krzywych mięknięcia, zastosowanie fluorescencyjnych
„molecular beacons” w badaniach przejść fazowych kwasów
nukleinowych, zastosowanie „molecular beacons” w badaniach
oddziaływań białek z niskocząsteczkowymi ligandami.
Wykład obejmie także:
1.
fizyczne podstawy elektroforezy
2.
pojęcie ruchliwości elektroforetycznej
3.
rodzaje i funkcje nośników elektroforetycznych
4.
elektroforeza w żelu poliakryloamidowym (PAGE)
a.
elektroforezę natywną i denaturującą
b.
wykorzystanie PAGE do rozdziału biocząsteczek
c.
wyznaczanie masy cząsteczkowej białek
d.
ogniskowanie izoelektryczne
5.
elektroforezę dwukierunkową
6.
elektroforezę agarozową
7.
elektroforezę agarozową w pulsującym polu elektrycznym
8.
elektroforezę kapilarną
a.
zjawisko elektroosmozy
b.
rodzaje elektroforezy kapilarnej
9.
techniki hybrydyzacyjne i ich wykorzystanie w badaniach
nad biocząsteczkami
10.
hybrydyzację Southern w badaniach DNA
a.
delecje/insercje
b.
mutacje punktowe
c.
polimorfizmy DNA
d.
typowanie DNA
11.
hybrydyzację Northern w badaniach RNA, identyfikację i
poziom ekspresji mRNA
12.
hybrydyzacja Western w badaniach białek
a.
identyfikacja białek endogennych i rekombinantowych
b.
poziom ekspresji i fosforylacji białek
13.
izolowanie białek, DNA i RNA z komórek
a.
metoda Chomczyńskiego
b.
izolacja DNA lub RNA na złożach krzemionkowych
c.
izolacja mRNA z wykorzystaniem oligo-dT
d.
izolacja białek rekombinantowych zawierających metkę His
lub GST
Literatura
1. RM. Silverstein, FX Webster, DJ. Kiemle; Spektroskopowe metody
identyfikacji związków organicznych. PWN 2007
2. W. Zieliński, A. Rajca , Metody spektroskopowe i ich zastosowanie
do identyfikacji związków organicznych
3. H. Günter, Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego,
PWN 1983
4. FW. Wherli , T. Wirthlin, Interpretacja widm w spektroskopii 13C
NMR, PWN 1985.
5. H. Friebolin, One- and Two- Dimensional NMR Spectroscopy.
VCH 1991.
3
6.„Metody krystalografii”, Z. Kosturkiewicz, Wydawnictwo
Naukowe UAM, Poznań 2000.
„Crystallography made crystals clear. A guide for users of
macromolecular models”, G. Rhodes, Academic Press Inc., San
Diego 1993.
7. "Principles of protein X-ray crystallography", J. Drenth, SpringerVerlag, New York 1999.
8. Chemia Bioorganiczna, 9. J. Berg, J. Tymoczko, L. Stryer
PWN wyd. 5, 2005
9. Artykuły z bazy PubMed
10. Doniesienia internetowe
11.CRC Handbook of HPLC for the separation of amino acids,
peptides and proteins. W.S. Hancock ed., CRC Press, Inc., Boca
Raton., 1984
12. P. Guga, Konfigurowanie Systemów HPLC. Analityka, 1/2004,
28-34.
13. Drukowane i dostępne w internecie materiały informacyjne firm
produkujących
chromatografy
cieczowe
i
kolumny
chromatograficzne (Waters, Dionex, Agilent, Varian),
14. Hanno Steen, Matthias Mann. „The abc's (and xyz's) of peptide
sequencing.” Nature Reviews Molecular Cell Biology, 5:699-711,
2004.
15. Coon, J. J. (April 13, 2009). "Collisions or Electrons? Protein
Sequence Analysis in the 21st Century". Anal. Chem. 81 (9): 3208–
3215. doi:10.1021/ac802330b.
16.http://www.molecularbeacons.org/download/antony,jbsd01(19)49
7.pdf
http://www.auburn.edu/~santosr/protocols/OligoProtocols.pdf
http://www.ecoli.sk/files/documents/quantification.pdf
17. Chomczynski P. 1993. A reagent for the single-step simultaneous
isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.
BioTechniques, 15, 532-537.
18. Introduction to capillary electrophoresis – Beckman Coulter
handbook, www.lumexpol.com
19. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. (1982) Molecular
Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, NY.
20. Elektroforeza przykłady zastosowań - opracowanie zbiorowe pod
redakcją Bogdana Walkowiaka i Violetty Kochmańskiej
Efekty uczenia się
Słuchacz zapoznaje się z podstawami fizycznymi spektroskopii NMR i
poznaje podstawowe parametry spektralne. Poznaje podstawowe
techniki rejestracji widm 1D i 2D.
Student (doktorant) zapoznaje się z podstawowymi pojęciami
w zakresie krystalografii biocząsteczek, poznaje stosowane
techniki krystalizacji biocząsteczek, techniki pomiarowe i
metody rozwiązywania struktur, zapoznaje się z procesem
udokładniania i oceny uzyskanej struktury oraz uzyskuje
wiedzę na temat metod sekwencjonowania, zasady ich
działania i zastosowania w określonych warunkach.
Doktorant zapoznaje się z podstawowymi pojęciami w
zakresie podstawowych typów chromatografii cieczowej i
obszarów jej stosowania (chemia, farmacja, biochemia i
biologia molekularna) poznaje stosowane techniki (rozdział
na żelu krzemionkowym, na odwrotnej fazie, złoża
jonowymienne, filtracja żelowa) i mechanizmy oddziaływań
(siły Van derWaalsa, oddziaływania hydrofobowe, jonowe)
wykorzystywanych w danej rodzinie metod. Poznaje
charakterystykę podstawowych typów wypełnień,
charakterystykę podstawowych typów modułów
4
chromatografów cieczowych (pompy, detektory) . Poznaje
typowe objawy niedomagań kolumn chromatograficznych i
elementów chromatografu,a także sposoby ich unikania lub
naprawy. Doktorant zapoznaje się z podstawowymi
pojęciami w zakresie enzymatycznych i chemicznych metod
sekwencjonowania peptydów. Poznaje zagadnienia doboru
enzymów dla uzyskania peptydów, które można poddać
sekwencjonowaniu. Poznaje podstawowe metody
odblokowywania N-terminalnych grup aminowych. .Poznaje
metody chemicznego sekwencjonowania peptydów od N- i Ckońca.Poznaje metody sekwencjonowania z użyciem techniki
spektrometrii mas. Poznaje metody identyfikowania
aminokwasów uwolnionych w kolejnych cyklach degradacji.
Doktorant zapoznaje się z podstawowymi pojęciami w
zakresie zastosowania spektrometrii UV/VIS i
spektrofluorymetrii w badaniach ilościowych biopolimerów
oraz w badaniach niektórych ich przemian fazowych,
poznaje zagadnienia określania ilościowego kwasów
nukleinowych i białek w oparciu o charakterystyczne
współczynniki ekstynkcji, poznaje podstawowe metody
badania stabilności termicznej struktur wyższego rzędu,
poznaje zasady zastosowania fluorescencyjnych markerów
typu „molecular beacons”.
Metody i kryteria oceniania
Praktyki zawodowe w ramach
przedmiotu
Doktorant ma możliwość zaznajomić się z metodami izolacji
RNA, DNA i białek z preparatów komórkowych,
podstawowymi pojęciami i technikami wykorzystywanymi do
analizy biomolekuł: elektroforezą, western, southern i
northern blotingiem, obszarami zastosowań omówionych
technik, przede wszystkim w badaniach podstawowych,
diagnostyce medycznej, biotechnologii,
Ocena każdego pytania w skali 1 do 10, zaliczenie po uzyskaniu co
najmniej 60% punktów.
Nie dotyczy
5
B) Opis przedmiotu cyklu
Nazwa pola
Komentarz
Cykl dydaktyczny, w którym
Pierwszy rok studium doktoranckiego, semestr II
przedmiot jest realizowany
Forma(y) i liczba godzin zajęć Wykład, 16 godzin
oraz sposoby ich zaliczenia
Forma zaliczenia – egzamin pisemny
Imię i nazwisko koordynatora/ów
przedmiotu cyklu
Metody dydaktyczne
Literatura
Prof.dr Barbara Nawrot
Wykład interaktywny
Jak wyżej
6