Ćwiczenie 6

Ćwiczenie 6
OZNACZANIE NIEORGANICZNEGO FOSFORANU
METODĄ FISKE-SUBBAROWA
Część doświadczalna obejmuje:
−
przygotowanie rozcieńczonych roztworów KH2PO4
−
wykonanie oznaczeń
−
wykreślenie krzywej kalibracyjnej i wyliczenie średniego współczynnika kierunkowego
WPROWADZENIE
Ilościowe oznaczanie fosforanów metodą Fiske-Subbarowa oparte jest na reakcji jonów ortofosforanowych (V) z molibdenianem (VI) amonu w środowisku kwaśnym. Powstającą
w wyniku reakcji sól amonową kwasu czterotrójmolibdenianofosforowego poddaje się redukcji kwasem 1-amino-2-naftolo-4-sulfonowym (eikonogen). W wyniku tej reakcji, molibdenian (VI) związany w soli kompleksowej ulega redukcji do niższych tlenków molibdenu
dając tzw. błękit molibdenowy (maksimum absorpcji przy 660nm).
PO4-3
(NH4)2MoO4
odczynnik redukujący
(eikonogen)
(NH4)3 P(Mo3O10)4
(Mo2O5 · MoO3)
błękit molibdenowy
Po wykonaniu reakcji barwnej przeprowadza się pomiar absorbancji przy długości fali λ =
660 nm. Zawartość fosforanu w badanej próbie określa się na podstawie wyznaczonej
dla wzorcowych roztworów ortofosforanu (V) zależności ich absorbancji od stężenia.
WYKONANIE
Odczynniki:
1. 50mM bufor Tris-HCl, pH 8,6
2. 10% roztwór TCA
3. 5M H2SO4
1
4. 2,5% roztwór molibdenianu (VI) amonu w 0,25 M H2SO4
5. 0,25% eikonogen (kwas 1-amino-2-naftolo-4-sulfonowy). Rozpuścić w wodzie 7,5 g
Na2S2O5 i 1 g Na2SO3 w kolbie miarowej na 100 ml, a następnie dodać 0,25 g eikonogenu. Uzupełnić wodą do 100 ml. Roztwór przechowywany w ciemnej, szczelnie zamkniętej
butelce jest trwały przez kilka tygodni.
6. 40 mM roztwór KH2PO4.
Wyznaczanie krzywej standardowej:
1. W 100 ml kolbce miarowej przygotować 40 mM roztwór wyjściowy KH2PO4 w 50 mM
buforze Tris-HCl, pH 8,6, z którego następnie należy sporządzić roztwory o stężeniu: 0,4
mM, 0,8 mM, 1,2 mM, 1,6 mM, 2,0 mM, 3,2 mM i 4,0 mM, używając do rozcieńczeń
50 mM buforu Tris-HCl, pH 8,6. Rozcieńczenia przygotować w 50 ml kolbkach miarowych.
2. Do 16 oznakowanych probówek odmierzyć po 0,9 ml 50 mM buforu Tris-HCl, pH 8,6.
Do każdej probówki dodać po 0,1 ml roztworu fosforanu o odpowiednim stężeniu (dla
każdego stężenia wykonać dwie równoległe próby). Do prób zerowych (odniesienia)
zamiast fosforanu napipetować po 0,1 ml H2O destylowanej (Uwaga! Wymienić końcówkę pipety przed pipetowaniem wody)
3. Do każdej próby dodać kolejno: 0,5 ml 10% roztworu kwasu trichlorooctowego (TCA), a
następnie po 0,4 ml mieszaniny zawierającej: 5M H2SO4, 2,5% molibdenian (VI) amonu,
wodę dest. zmieszanych w stosunku 1 :2 :1. Próby dokładnie wytrząsnąć, a następnie napipetować po 0,1 ml eikonogenu. Próby, po wytrząśnięciu, wstawić na 10 minut do łaźni
wodnej o temperaturze 300C w celu przyspieszenia reakcji powstawania błękitu molibdenowego.
4. Zmierzyć absorbancję prób wobec próby zerowej (odniesienia) przy λ = 660nm. Obliczyć wartości średnie absorbancji z dwóch powtórzeń. Wykreślić krzywą standardową,
odkładając absorbancję na osi rzędnych, a stężenie ortofosforanu w badanych próbach na
osi odciętych.
2
5. Obliczyć zawartość fosforanu w kolejnych próbach (ilość powinna być podana w µmolach). Obliczyć wartości współczynnika kierunkowego (k), a następnie średniego współczynnika kierunkowego:
k=
µmole KH2PO4 w próbie
A660nm
Zagadnienia do przygotowania:
−
roztwory (stężenia procentowe, roztwory molowe, rozcieńczenia, przeliczenia)
−
kolorymetria
Literatura:
Ćwiczenia z biochemii – pod redakcją L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN Warszawa, 2005
Obliczenia biochemiczne – Zgirski A, Gondko R, PWN Warszawa, 1998
3