oznaczanie substancji przy pomocy wysokosprawnej chromatografii

OZNACZANIE SUBSTANCJI PRZY POMOCY WYSOKOSPRAWNEJ
CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ Z DETEKTOREM FLUORESCENCYJNYM
Wprowadzenie
Jednym z najbardziej selektywnych detektorów wykorzystywanych w
chromatografii cieczowej jest detektor fluorescencyjny (Fluorescence Detector - FLD).
Detektor ten wykorzystywany jest do oznaczania substancji fluoryzujących naturalnie lub
odpowiednich pochodnych (np. WWA, katecholaminy, niektóre leki).Zjawisko
fluorescencji zachodzi wówczas, kiedy elektron znajdujący się na wyższym poziomie
energetycznym, na skutek wzbudzenia cząsteczki (np. przez absorpcję kwantu energii)
wraca samorzutnie na poprzednio zajmowaną orbitę emitując przy tym promieniowanie.
Średni czas pomiędzy wzbudzeniem cząsteczki i emisją promieniowania wynosi od 10 -9
do 10-8 sekundy. Oznaczanie substancji z wykorzystaniem FLD polega więc na pomiarze
emitowanego przez nią światła o określonej długości fali. Naturalną zdolność do
fluorescencji wykazuje niewiele związków, z tego też względu stosuje się wzbudzanie
cząsteczek substancji światłem o długości fali, która jest przez nie absorbowana. Dzięki
temu, że związki chemiczne pochłaniają i emitują światło o określonej, charakterystycznej
dla nich długości fali, FLD może wykazywać (szczególnie dla związków
fluoryzujących)czułość nawet o trzy rzędy wielkości większą.
Przy stosowaniu FLD do analizy składu próbki należy zwrócić uwagę na zdolności
fluorescencyjne rozpuszczalnika oraz towarzyszących domieszek, a także na wpływ pH
środowiska na fluorescencję oznaczanej substancji.
Celem ćwiczenia jest zapoznanie z pracą detektora FLD.
SPRZĘT I ODCZYNNIKI
1.
Chromatograf cieczowy Agilent 1200, składający się z następujących modułów:
1
a. Kontroler układu chromatograficznego – umożliwia ustawienie żądanego składu fazy
ruchomej i prędkości przepływu, a także zaprogramowanie tabel odpowiedzialnych za
przebieg analizy (np. gradientu).
b. Pompa chromatograficzna – odpowiada za automatyczne mieszanie składników fazy
ruchomej w określonych proporcjach i bez pulsacyjne tłoczenie mieszaniny elucyjnej do
dalszych modułów układu HPLC. Odpowiedzialna jest za monitorowanie ciśnienia w
układzie. Maksymalne ciśnienie pracy pompy wynosi 400 bar.
c. Detektor DAD – pozwala na pracę w zakresie długości fal 190–950 nm. Wyposażony
jest w lampy deuterową (190–400 nm) i wolframową (400–950 nm), celkę pomiarową o
objętości 13μl i długości drogi optycznej równej 10 mm.
d. Detektor FLD – pozwala na pracę w zakresie długości fal: dla wzbudzania 200–
700nm, dla emisji 280–900 nm. Wyposażony jest w lampę ksenonową i celkę pomiarową
8 μl
e. Komputer z zainstalowaną kartą komunikacyjną i oprogramowaniem ChemStation –
służy do zbierania i przetwarzania danych.
2. Warunki chromatograficzne:
a. kolumna chromatograficzna z wypełnieniem C18,
b. pętla nastrzykowa o objętości 20 L,
c. faza ruchoma: składnik A: acetonitryl (cz. do HPLC), składnik D: woda wysokiej
czystości,
d. przepływ fazy ruchomej 1 ml/min,
e. detekcja z zakresu światła UV i z zastosowaniem fluorescencji.
3. Pipety automatyczne 20 - 200 μL, 100 - 1000 μL.
4. Wialki chromatograficzne o pojemności 2 mL.
5. Antracen – roztwór w acetonitrylu 1,0 mg/mL.
6. Acetonitryl, cz. do HPLC.
SPOSÓB WYKONANIA
1. Wyznaczanie analitycznej długości fali wzbudzania antracenu przy pomocy DAD.
Wykonać analizę chromatograficzną roztworu antracenu w warunkach analizy opisanych
w p. 2., wykorzystując do detekcji detektor z matrycą fotodiodową i wybraną długością
fali 230 nm (przy tej długości fali absorbuje większość związków organicznych). Na
podstawie widma uzyskanego dla piku antracenu odczytać długość fal/-i odpowiadającą
maksimum absorpcji.
2. Przygotowanie roztworów wzorcowych antracenu.
W wialkach chromatograficznych o pojemności 2 mL wykonać rozcieńczenia
roztworu wyjściowego antracenu tak, aby otrzymać po 1 mL roztworów w acetonitrylu o
stężeniach 100;10; 1; 0,1 i 0,01 μg/mL.
3. Ustawienie warunków chromatograficznych.
a. w oprogramowaniu ChemStation ustawić skład fazy ruchomej na składnik
A (acetonitryl) = 70%, składnik B = 0%, składnik C = 0%, składnik D (woda) = 30% oraz
2
przepływ na 1,0 mL/min. Ustawić przepływ gradientowy: 0 min 70% A i 30% D, 8 min
100% A i 0% D.
4. Wyznaczanie długości fali emisji.
W ustawieniach FLD nastawić długość fali wzbudzania odpowiadającą maksimum
absorpcji wyznaczoną w p.1. Długość fali emisji nastawić na wartość 300nm, wybrać opcję
Multi Emission i ustawić dodatkowe długości fal emisji na 350, 400 i 450 nm. Wykonać
analizę chromatograficzną roztworu antracenu o stężeniu 100μg/mL w warunkach
analizy opisanych w p. 2.
Na podstawie uzyskanych pików dla wybranych długości fali emisji wybrać długość fali
odpowiadającą maksimum emisji.
Analizę roztworu antracenu o stężeniu 100μg/mL powtórzyć wybierając węższy zakres
fal emisji.
W przypadku wyznaczenia kilku fal maksimum absorpcji w p.1 czynności z p.4 powtórzyć
dla różnych długości fal wzbudzania.
5. Wykonanie pomiarów właściwych.
Wykonać analizę roztworów wykorzystując FLD. Każdorazowo po analizie zebrać
wszystkie podstawowe parametry charakteryzujące piki uzyskane dla badanych
substancji – czasy retencji, wysokości pików, pola powierzchni pod pikami – umieszczając
zebrane wartości w tabeli.
Tabela 1. Tabela pomiarów
FLD
Numer wialki
Stężenie roztworu [µg/mL]
1
2
3
4
5
100
10
1
0,1
0,01
tR
[min]
A
h
Wysokość
szumów
[mm]
OPRACOWANIE WYNIKÓW
Na podstawie uzyskanych wyników wyznaczyć LOD (Limit of detection) i LOQ (Limit of
quantification).
3
Opracowanie: B. Krawczyk, D. Szczukocki
4