materiały

Ćwiczenie 15.
Wykorzystanie biotransformacji sorbitolu przez bakterie Gluconobacter oxydans ssp.
suboxydans w procesie produkcji witaminy C
Cel ćwiczenia: Charakterystyka zdolności bakterii G. oxydans do biotransformacji sorbitolu.
Materiał: hodowla Gluconobacter oxydans (PCM 2091)
Odczynniki i podłoża:
Podłoże do hodowli Gluconobacter oxydans:
trypton
10,0 g
ekstrakt drożdżowy 5,0 g
glukoza
20,0 g
K2HPO4
1,0 g
CaCO3
1,0 g
agar
20,0 g
woda
do 1000 ml
Podłoże półsyntetyczne dla G. suboxydans z dodatkiem 10% sorbitolu
ekstrakt drożdżowy 5,0 g
sorbitol
100,0 g
(NH4)2HPO4
2,0 g
KH2PO4
1,0 g
MgSO4 x 7 H2O
0,25 g
woda
do 1000 ml, pH 4,8-5,0
Odczynnika Luffa-Schoorla (syn. roztwór cytrynianu miedzi II alkaliczny)
Skład (proporcje na 1000 ml):
 roztwór siarczanu miedziowego: rozpuścić 25 g CuSO4 x 5H2O w 100 ml wody
 roztwór węglanu sodu: rozpuścić 143,8 g czystego, bezwodnego Na2CO3 w ok. 300 ml
ciepłej wody
 roztwór kwasu cytrynowego: rozpuścić 50 g czystego kwasu cytrynowego w 50 ml
wody
Starannie mieszając, wlać roztwór kwasu cytrynowego do roztworu węglanu sodowego.
Dolać roztworu siarczanu miedziowego i uzupełnić wodą do 1000 ml. Odstawić roztwór na
noc do odstania się i przefiltrować. Wartość pH roztworu powinna wynosić w przybliżeniu
9,4.
1
A. Badanie morfologii bakterii octowych:
Sporządzić preparat mikroskopowy z hodowli płynnej Gluconobacter oxydans, utrwalić w
płomieniu i wybarwić fioletem krystalicznym. Obserwować pod immersją. Wykonać rysunek:
B. Oznaczanie zawartości sorbozy w podłożu hodowlanym G. oxydans metodą
redukcyjną wg Luffa-Shoorla:
Zasada metody: Metoda opiera się na redukcji jonów Cu2+ zawartych w płynie Luffa przez
cukry redukujące obecne w badanym roztworze. W analizowanej hodowli bakteryjnej
właściwości redukujące posiada wyłącznie produkt biotransformacji, czyli D-sorboza,
natomiast substrat – D-sorbitol – ich nie wykazuje.
W środowisku alkalicznym D-sorboza redukuje CuSO4 do Cu2O. Dodanie, w
kolejnym etapie, do roztworu jodku potasu i kwasu siarkowego (VI) powoduje wydzielenie
jodowodoru, który ulega reakcji z niezredukowanym przez sacharydy CuSO4 i tworzy jodek
miedzi (I). Nadmiar jodu (z dodatku KI) odmiareczkowuje się tiosiarczanem(VI) sodu.
2 CuSO4 + 4 KI → 2 K2SO4 + Cu2I2 + I2
I2 + 2 Na2S2O3 → 2 NaI + Na2S4O6
Oznaczenie wykonuje się również dla próby ślepej (pozbawionej cukrów
redukujących), aby ustalić zużycie tiosiarczanu sodu na zmiareczkowanie jodu wydzielonego
przez całkowitą ilość miedzi zawartej w płynie Luffa (w próbie ślepej nie nastąpiła redukcja
jonów miedzi). Ilość wytworzonego produktu bioprocesu (D-sorbozy) ocenia się na podstawie
różnicy w objętości uzyskanych z dwóch miareczkowań (próby ślepej i właściwej), a
następnie z krzywej wzorcowej (rycina) odczytuje się zawartość sacharydów redukujących w
analizowanej próbce.
Materiał: 4-dniowa hodowla wytrząsana Gluconobacter oxydans (PCM 2091) na podłożu
półsyntetycznym z dodatkiem 10% sorbitolu (temp. 30°C).
Wykonanie:
1. Odmierzyć 20 ml hodowli, przenieść do litrowej kolby miarowej, uzupełnić wodą do
kreski. Dokładnie wymieszać.
2. Pobrać 25 ml do kolby, dodać 25 ml odczynnika Luffa-Schoorla, doprowadzić do wrzenia
i gotować przez 10 min.
2
3. Po ostudzeniu ostrożnie dodać 25 ml 25% H2SO4 – wydzielający się dwutlenek węgla
może spowodować wyciek mieszaniny z kolby!
4. Dodać 2 g jodku potasu i miareczkować 0,1 M roztworem tiosiarczanu sodu wobec skrobi
(1% roztwór, 1 ml). Końcowym punktem miareczkowania jest uzyskanie przez roztwór
mlecznobiałej barwy.
5. Wyniki odnieść do próby ślepej, którą stanowi czysta woda (25 ml) – z próbą ślepą
postępować analogicznie jak z badaną (punkty 2-4).
6. Obliczyć różnicę (R) (w mililitrach) pomiędzy ilością titranta zużytą do zmiareczkowania
próby ślepej, a ilością zużytą do zmiareczkowania próby badanej.
7. Określić teoretyczną i praktyczną wydajność biotransformacji sorbitolu.
Ryc. Krzywa standardowa obrazująca zależność pomiędzy ilością sorbozy w próbie (mg), a
wartością R (ml)
3
Wyniki:
Tabela. Oznaczanie zawartości fruktozy metodą Luffa-Schoorla:
objętość titranta [ml]
próba ślepa
próba badana
średnia
średnia
1.
2.
3.
różnica [ml]
zawartość sorbozy w
badanej hodowli [mg]
Wydajność teoretyczna i praktyczna bioprocesu:
Wnioski:
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
4