Wyznaczanie Stałej Michaelisa (KM) dla β

Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii i enzymologii realizowanych w Katedrze
Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie. Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.
Wyznaczanie Stałej Michaelisa (KM) dla β-fruktofuranozydazy z drożdży.
Równanie Michaelisa-Menten jest równaniem szybkości reakcji dla reakcji jednosubstratowej:
v0 = Vmax [S] ⁄ (KM + [S])
Równanie to wiąże ze sobą szybkość początkową i szybkość maksymalną poprzez KM.
Chociaż w równaniu nie występuje wyrażenie na stężenie enzymu, to wyrażenie to zawiera
się w Vmax. W specjalnym przypadku gdy szybkość początkowa reakcji jest równa połowie
szybkości maksymalnej v0 = ½Vmax, to po przekształceniu równania Stała Michaelisa jest
równa stężeniu substratu, w którym szybkość początkowa reakcji stanowi połowę szybkości
maksymalnej. KM wyraża się w molach /l i jest niezależna od stężenia enzymu. KM można
oznaczyć po wykonaniu serii prostych eksperymentów, w których początkową szybkość
reakcji mierzy się w różnych początkowych stężeniach substratu przy stałym stężeniu
enzymu. Równanie M-M można przekształcić w równanie liniowe (Lineweavera-Burka),
które łatwo przedstawić graficznie. Gdy 1/ v0 wykreśli się w zależności od 1/[S] to otrzyma
się linię prostą o nachyleniu KM/ Vmax. Taki podwójnie odwrotnościowy wykres pozwala
znacznie dokładniej wyznaczyć Vmax, którą tylko w przybliżeniu można odczytać z wykresu
v0 od [S]. Używając odwzorowania (L-B) można też określać typ inhibicji enzymów.
Wykonanie ćwiczenia
Przygotować 12 probówek ponumerowanych w następujący sposób: A0, A1, A2; B0, B1, B2;
C0, C1, C2; D0, D1, D2. Litery będą oznaczać stężenia sacharozy używane w reakcji
enzymatycznej A – 8 mM, B – 12, 5 mM, C – 25 mM, D – 50 mM. Cyfry będą oznaczać:
0 próby kontrolne, 1, 2 próby badane. Do probówek dodać roztwór sacharozy i bufor
octanowy według poniższej tabeli.
Stężenie
sacharozy (mM)
8,0 mM
12,5 mM
25 mM
50 mM
Probówki
A0, A1, A2
B0, B1, B2
C0, C1, C2
D0, D1, D2
200
mM
sacharoza (ml)
0,080
0,125
0,25
0,5
Bufor octanowy
pH 4,7 (ml)
0,920
0,875
0,75
0,5
Wszystkie probówki wymieszać i wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 30°C na 5 min. Po
5 minutach do probówek A1, A2; B1, B2; C1,C2; D1, D2 dodać po 1ml ogrzanego do 30°C,
odpowiednio rozcieńczonego roztworu enzymu i inkubować dalej przez 10 min. Po tym
czasie do wszystkich (także z indeksem 0) probówek dodać po 0,5 ml NaOH i po 2 ml
odczynnika Samogyi. Następnie do probówek z indeksem 0 dodać po 1 ml roztworu enzymu.
Wszystkie probówki wstawić do wrzącej łaźni wodnej i ogrzewać 20 minut. Po ochłodzeniu
dodać po 2ml odczynnika Nelsona, intensywnie zamieszać i po 10 minutach przenieść
ilościowo do kolbek stożkowych z 20 ml wody. Absorbancję mierzyć przy λ = 520 nm
względem odpowiednich kontroli: A0 dla probówek A1 i A2, B0 dla probówek B1 i B2 itd.
Na podstawie pomiaru absorbancji prób odczytać z krzywej kalibracyjnej liczbę µg cukrów
redukujących odpowiadającą zmierzonej absorbancji. Następnie obliczyć szybkość reakcji,
tzn. liczbę µmoli zhydrolizowanej sacharozy ciągu 1 minuty. Obliczona szybkość jest
szybkością początkową, ponieważ w trakcie przygotowywania ćwiczenia sprawdzono, że
szybkość reakcji przy wszystkich wybranych do doświadczenia stężeniach sacharozy jest
liniowa przynajmniej do 15 minut trwania inkubacji. Wyniki obliczeń przedstawić w tabeli:
Stężenie
substratu [S]
8,0 mM
12,5 mM
25 mM
50 mM
Odwrotność
stężenia: 1/[S]
µg cukrów µmole
redukujących sacharozy
(v0)
µmole Odwrotność
sacharozy/min szybkości 1/v0
Na podstawie wyników sporządzić wykres odkładając dla każdego stężenia na osi odciętych
odwrotność stężenia sacharozy 1/[S], a na osi rzędnych odwrotność szybkości reakcji 1/v0
przy tym stężeniu.
Na tak przygotowanym wykresie prosta przecina oś rzędnych w punkcie wyznaczającym
1/ Vmax, a oś odciętych w punkcie – 1/KM . Z wykresu odczytać wartość stałej Michaelisa KM
i maksymalną szybkości reakcji Vmax .