Charakterystyka białka ERH człowieka

Projekt "Charakterystyka białka ERH człowieka"
Dr Piotr Kozłowski
Badania dotyczą bardzo słabo poznanego białka ERH
(enhancer of rudimentary homolog) człowieka. Białko to jest
niewielkim polipeptydem (104 aa, 12.3 kDa), zawierającym dwa
potencjalne miejsca fosforylacji dla kinazy CK2 i jedno dla
kinazy MAPK. ERH występuje także u zwierząt wyższych
(mysz, żaba szponiasta) i niższych (wywilżna karłowata,
wrzecioniec powabny1), roślin kwiatowych (rzodkiewnik
pospolity), protistów (zarodziec) oraz niektórych grzybów (np.
obecny jest u drożdży rozszczepkowych, ale brak go u drożdży
piekarniczych i kropidlaka). Choć jego sekwencja
aminokwasowa jest bardzo silnie konserwowana ewolucyjnie
(np. białka ERH człowieka i żaby szponiastej są identyczne), to
ze względu na swoją unikatowość nie dostarcza ona żadnych
przesłanek co do funkcji, aktywności lub wewnątrzkomórkowej
lokalizacji ERH; konsekwentnie, unikatowa jest również jego
struktura przestrzenna. Na podstawie analizy mutantów
wywilżny (z niedoborem ERH) przypisano wstępnie temu białku
wpływ na dostępność nukleotydów pirymidynowych w komórce
(Genetics 138, 1163-70).
Z racji naszego zainteresowania regulacją metabolizmu
nukleotydów pirymidynowych przez czynniki zewnętrzne
aktywujące kinazę MAPK (Nature 403, 328-32), postanowiliśmy
poznać dokładniej rolę ERH w komórkach człowieka. W trakcie
dotychczasowych badań, polegających na przeszukaniu
proteomu człowieka za pomocą drożdżowego systemu
dwuhybrydowego w połączeniu z techniką GST pull-down i
tandemową spektrometrią mas oraz użyciu mikroskopii
konfokalnej i hybrydyzacji DNA-RNA, ustaliliśmy, że ERH jest
białkiem jądrowym, którego gen jest wyrażany we wszystkich
głównych tkankach człowieka (patrz także profil dla ERH na
stronie www.proteinatlas.org), zaś jego partnerami w komórce
są dwa, nowe, równie słabo poznane, wyrażane powszechnie
białka jądrowe: PDIP46/SKAR (polymerase delta-interacting
protein of 46 kDa / S6 kinase 1 Aly/REF-like target) i Ciz1/NP94
(p21Cip1/Waf1-interacting zinc finger protein 1 / nuclear protein of
94 kDa) (FEBS J 273, 4728-41 i FEBS J 275, 332-40). Inni
pokazali, że PDIP46/SKAR wydaje się być zaangażowany w
regulację wielkości komórki (Curr Biol 17, 1540-9 i Cell 133,
303-13), zaś Ciz1/NP94 w inicjację replikacji DNA (J Cell Sci
118, 101-12, J Cell Sci 120, 115-24 i J Cell Sci 123, 1108-15), a
także w powstawanie nowotworów (rdzeniaka i raka piersi;
Cancer Res 22, 11021-9). Ustaliliśmy także, że białko ERH
wiąże się ze swoimi partnerami w miejscach, w których mogą
one oddziaływać jeszcze z innymi białkami, odpowiednio
p21Cip1/Waf1 (inhibitorem kinaz zależnych od cyklin) i S6K1
(kinazą białka S6 rybosomu). Ponadto pokazaliśmy, że kiedy
ERH jest wyrażany razem z Ciz1/NP94, to są one rekrutowane
do miejsc inicjacji replikacji DNA (replication foci), zaś kiedy
ERH jest współwyrażane z PDIP46/SKAR, to kolokalizują się
one w skupiskach ziarnistości interchromatynowych (nuclear
speckles), będących magazynami czynników splicingowych.
Wykazaliśmy zatem związek między trzema bardzo słabo
scharakteryzowanymi białkami człowieka. Wszystkie one
wydają się brać udział w kluczowych procesach dla
funkcjonowania komórki oraz zdrowia człowieka, a które, choć
badane od wielu lat, ciągle jeszcze wymagają wyjaśnienia,
m.in. poprzez uwzględnienie pomijanych dotąd białek.
Jednocześnie, nasze odkrycie prowokuje pytanie, czy ERH
rzeczywiście działa w komórce poprzez wpływ na poziom
nukleotydów pirymidynowych, czy też raczej bierze udział w
niektórych procesach zależnych od ich dostępności (np.
replikacji DNA, wzroście komórki) i jego brak wpływa na te
procesy w inny sposób.
Obecnie dążymy do dalszego poznania roli ERH w
komórce człowieka, teraz już w kontekście jego interakcji z
obydwoma uniwersalnymi partnerami - PDIP46/SKAR i
Ciz1/NP94. Eksperymenty będą wykonywane w komórkach linii
HeLa człowieka i będą bazowały na naszych obserwacjach
zachowania się białka ERH w żywej komórce. Używając
zróżnicowanego asortymentu, w dużej mierze stworzonych
przez nas, narzędzi biologii molekularnej: mutantów ERH w
miejscach fosforylacji przez kinazy CK2 i MAPK, inhibitorów i
stymulacji kinaz CK2 i MAPK oraz konkurencyjnych białek
p21Cip1/Waf1 i S6K1, będziemy sprawdzać wewnątrzkomórkową
lokalizację ERH oraz jego zdolność do oddziaływania z
PDIP46/SKAR i Ciz1/NP94. Ponadto ustalimy, czy zmiany
poziomu białka ERH wywołane wyciszeniem za pomocą shRNA
przeciwko transkryptowi ERH oraz nadekspresją ERH z silnego
konstytutywnego promotora wywierają wpływ na procesy, z
którymi związane są PDIP46/SKAR i Ciz1/NP94, odpowiednio
regulację wielkości komórki i inicjację replikacji DNA. Badania
prowadzone będą przy wykorzystaniu mikroskopii konfokalnej,
real-time PCR i cytometrii przepływowej. Wyniki tych
eksperymentów pozwolą ustalić w jakich kombinacjach
(kompleksach) białka te występują w komórce, jak na ich skład
wpływa fosforylacja - bardzo dobrze udokumentowany
mechanizm regulacji zachowywania się białek w komórce oraz
jakie jest ich znaczenie funkcjonalne.
Równolegle prowadzimy badania z wykorzystaniem
drożdży rozszczepkowych, u których ostatnio odkryliśmy
obecność białka ERH. Mają one na celu pełną charakterystykę
tego białka, z nadzieją na wskazanie jego funkcji i procesów, w
które jest ono zaangażowane, uniwersalnych dla wszystkich
organizmów eukariotycznych, w których ono występuje, co
pomoże zrozumieć jego rolę u człowieka.
Zakład Biologii Molekularnej UW jest obecnie jedynym
laboratorium na świecie prowadzącym systematyczne badania
mające na celu ustalenie roli ERH w komórkach człowieka.
Kierownikiem projektu jest dr Piotr Kozłowski. Projekt jest
dostępny dla licencjatów i magistrantów Zakładu Biologii
Molekularnej.
1 Wrzecioniec
powabny to nazwa polska dla nicienia
Caenorhabditis elegans zaproponowana przez kierownika tego
projektu.