Pobierz dokument

RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(12)
OPIS PATENTOWY
(19)
(21) Numer zgłoszenia: 348740
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej Polskiej
(54)
(22) Data zgłoszenia: 18.07.2001
PL
195437
(13) B1
(11)
(51) Int.Cl.
C12N 1/20 (2006.01)
C12N 1/06 (2006.01)
A61P 31/04 (2006.01)
Sposób przygotowania poliwalentnych preparatów fagowych
do leczenia zakażeń bakteryjnych
(73) Uprawniony z patentu:
Instytut Immunologii i Terapii Dośwadczalnej
Polskiej Akademii Nauk,Wrocław,PL
(43) Zgłoszenie ogłoszono:
27.01.2003 BUP 02/03
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
(72) Twórca(y) wynalazku:
Beata Weber-Dąbrowska,Wrocław,PL
Andrzej Górski,Wrocław,PL
Marian Mulczyk,Wrocław,PL
28.09.2007 WUP 09/07
(74) Pełnomocnik:
Rafał Witek, WTS Rzecznicy Patentowi
PL 195437 B1
(57)
6. Środek według zastrz. 5, znamienny tym, że jako multiwalentny szczep bakteriofaga specyficzny wobec bakterii należących do rodzaju Staphylococcus zawiera przynajmniej jeden szczep bakteriofaga wybrany spośród S1 (PCM F/00001), S2 (PCM F/00002), S3 (PCM F/00003), S3 (PCM
F/00003), S4 (PCM F/00004), S5 (PCM F/00006), S6 (PCM F/00006) oraz S7 (PCM F/00007), korzystnie fagi S1, S2, oraz S4 albo S5.
7. Środek według zastrz. 5, znamienny tym, że jako multiwalentny szczep bakteriofaga specyficzny wobec bakterii należących do rodzaju Pseudomonas zawiera przynajmniej jeden szczep bakteriofaga wybrany spośród P1 (PCM F/00008), P2 (PCM F/00009), P3 (PCM F/00010), P4 (PCM
F/00011), P5 (PCM F/00012), P6 (PCM F/00013), P7 (PCM F/00014), P8 (PCM F/00015), P9 (PCM
F/00016), P10 (PCM F/00017), P11 (PCM F/00018), P12 (PCM F/00019), P13 (PCM F/00020), P14
(PCM F/00021), P15 (PCM F/00022), P16 (PCM F/00023), P17 (PCM F/00024), P18 (PCM F/00025),
P19 (PCM F/00026), oraz P20 (PCM F/00027), korzystnie fagi P7, P20 i P6.
2
PL 195 437 B1
Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy multiwalentnych szczepów bakteriofagowych, sposobów ich otrzymywania
i wykorzystania w leczeniu zakażeń bakteryjnych, zwłaszcza szczepami bakterii lekoopornych.
Bakteriofagi (fagi) stanowią różnorodną grupę wirusów, których cykl życiowy związany jest wyłącznie z komórką bakteryjną. Bakteriofagi charakteryzują się litycznym lub lizogennym cyklem życiowym. Jako czynniki antybakteryjne przydatne są przede wszystkim bakteriofagi lityczne, które po zakażeniu wrażliwych nań komórek bakteryjnych namnażają się w nich, powodując ich całkowite zniszczenie (liżę), a uwalniające się nowe cząsteczki fagowe atakują i niszczą następne komórki bakteryjne. Proces ten może zachodzić zarówno in vitro jak i in vivo.
Jedną z istotnych cech bakteriofagów jest powszechnie znana wysoka swoistość ich litycznego
działania. Cecha ta jest wykorzystywana m.in. w typowaniu różnych gatunków bakterii (patrz przykładowo opisy patentowe GB 2285684, US 5824468, SU 543260, oraz międzynarodowe zgłoszenia patentowe WO 0100786, WO 0109370). Inne znane zastosowania bakteriofagów obejmują: wykorzystywanie bakteriofagów jako narzędzi w biologii molekularnej przydatnych przykładowo do ekspresji i
selekcji pożądanych białek (np. opis patentowy US 6027930), stosowanie fagów w środkach sterylizacyjnych i czyszczących ( np. opis patentowy EP 0414304, EP 0290295, GB 2253859 oraz międzynarodowe zgłoszenia patentowe WO 9808944, WO 9003122). Zmodyfikowane fagi wykorzystano do
produkcji szczepionek (np. WO 9505454). Wykorzystuje się także pewne białka pochodzenia bakteriofagowego (np. EP 0510907, US 5470573, WO 9607329). Metody izolacji bakteriofagów i otrzymywania preparatów fagowych są dobrze znane i ciągle udoskonalane (np. GB 829266, CS 192212,
RU 2109055).
Na szeroką skalę fagoterapia wykorzystywana jest już od czasu II wojny światowej w Instytucie
Mikrobiologii i Wirusologii Tbilisi (Gruzja). Stosowane są tam pule różnych preparatów fagowych w leczeniu zakażeń bakteryjnych i w profilaktyce. Dostępne dane wskazują na dużą efektywność fagoterapii. Podobne badania prowadzone są od lat w Polsce, w Laboratorium Bakteriofagowym Instytutu
Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu, gdzie fagoterapię zakażeń wywołanych lekoopornymi formami bakterii i niepoddających się antybiotykoterapii prowadzi się
od ponad 25 lat (patrz: Stefan Ślopek i wsp., Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis,
1981, 31, 293; Stefan Ślopek i wsp., Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 1983, 31,
267; Stefan Ślopek i wsp., Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 1984, 32, 317; Stefan Ślopek i wsp., Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 1985, 33, 219; Stefan Ślopek
i wsp., Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 1985, 33, 241; Stefan Ślopek i wsp.,
Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 1987, 35, 569; Beata Weber-Dąbrowska i wsp.,
Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 2000, 48, 31-37; Beata Weber-Dąbrowska
i wsp., Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 2000, 48, 547-551). W ostatnich 14 latach fagoterapią objęto 1473 pacjentów z ropnymi zakażeniami różnych tkanek i narządów wykazując
wysoką skuteczność terapii fagowej.
Całkowite ustąpienie objawów chorobowych i powrót do zdrowia zanotowano w 1289 przypadków. Należy podkreślić, że w co najmniej kilkunastu przypadkach swoista fagoterapia stanowiła jedyną możliwość likwidacji zagrażającego życiu zakażenia. Prowadzona terapia dotyczyła indywidualnych
pacjentów. Polegała ona na:
a) wyhodowaniu i identyfikacji szczepu bakteryjnego uzyskanego z materiału uzyskanego od
pacjenta
b) określeniu wrażliwości szczepu na specyficzne fagi i doborze faga wykazującego najwyższą
aktywność lityczną wobec wyhodowanego szczepu.
c) przygotowaniu lizatu faga o wysokiej liczbie cząsteczek fagowych
d) przygotowaniu sterylnego preparatu fagowego do leczenia.
Ten sposób postępowania jest dość kosztowny, praco- i czasochłonny. Niekiedy od momentu
otrzymania materiału do badań, do wydania gotowych jałowych preparatów fagowych do leczenia upływa 7-10 dni. W pewnych stanach chorobowych taki okres oczekiwania jest zbyt długi. Leczenie fagami
według dotychczas stosowanej procedury jest na szerszą skalę niewykonalne.
W ostatnich latach występuje masowe szerzenie się szczepów bakteryjnych opornych na wszystkie antybiotyki w tym również na antybiotyk ostatniej szansy wankomycynę. W rezultacie leczenie zakażeń bakteryjnych wywołanych formami lekoopornymi za pomocą antybiotyków jest bezskuteczne.
PL 195 437 B1
3
Ten stan stwarza drastyczne problemy terapeutyczne. Istnieje zatem pilna potrzeba wprowadzenia do praktyki medycznej alternatywnej metody leczenia uporczywych zakażeń bakteryjnych.
W związku z powyższym celem wynalazku jest opracowanie sposobu uzyskiwania multiwalentnego szczepu fagowego, który mógłby być wykorzystany do przygotowywania preparatów o gwarantowanej skuteczności do leczenia zakażeń bakteryjnych, bez konieczności każdorazowego indywidualnego doboru faga leczniczego.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób otrzymywania multiwalentnego szczepu bakteriofaga charakteryzujący się tym, że:
a) gromadzi się zbiór o dostatecznej liczności n różnych szczepów patogenów bakteryjnych
określonego rodzaju występujących losowo na danym obszarze, przy czym korzystnie izolowane szczepy bakteryjne są szczepami lekoopornymi,
b) gromadzi się dostateczną ilość różnych szczepów bakteriofagów specyficznych wobec przynajmniej jednego szczepu bakterii należącego do danego rodzaju,
c) określa się aktywność lityczną zgromadzonego szczepu bakteriofaga wobec każdego zgromadzonego szczepu bakteryjnego, a następnie dla szczepu bakteriofaga oblicza się wartość p, jako
stosunek liczby szczepów lizowanych przez dany fag do liczby wszystkich zgromadzonych szczepów
bakteryjnych,
d) dla uzyskanej wartości p sprawdza się czy liczność n spełnia warunek:
n≥
pq
d2
z12−α
gdzie : q = 1 - p
d jest stałą nie większą od 0,1 , korzystnie nie większą od 10% p,
Z1-α jest zmienną losową o rozkładzie normalnym zależną od przedziału ufności 1-α, który jest
nie mniejszy niż 0.95,
e) wybiera się szczep bakteriofaga spełniający kryterium określone w d) i charakteryzujący się
wartością p nie mniejszą niż 2/n, korzystnie nie mniejszą niż 0,5. Dla każdego z wyizolowanych fagów
określa się zakres jego aktywności litycznej wobec populacji szczepów bakterii chorobotwórczych
występujących na danym obszarze. W tym celu należy zgromadzić dostatecznie liczny zbiór losowo
wybranych szczepów lekoopornych bakterii. W odniesieniu do ustalonej dużej próbki bakterii o liczności n (w opisywanym przykładzie n wynosiło 845 i 880, odpowiednio dla lekoopornych szczepów
Pseudomonas i Staphylococcus izolowanych z terenu Polski) obliczamy częstość występowania sukcesu, czyli stosunek liczby szczepów lizowanych przez danego faga do liczby wszystkich szczepów
przebadanych. Tą częstość traktujemy jak prawdopodobieństwo sukcesu p. Prawdopodobieństwo
porażki q wynosi q =1 - p.
Kluczowe jest ustalenie liczności n jaką powinna mieć próbka, którą należy pobrać, aby można
było ją uznać za reprezentatywną dla populacji generalnej szczepów danego rodzaju (np. Staphylococcus, Pseudomonas).
W tym celu ustala się kryterium reprezentatywności:
(
) (
)
P v − p d = P − d v − p d = 1− α
Prawdopodobieństwo tego, że moduł różnicy między częstością z próbki v a prawdopodobieństwem sukcesu p jest mniejszy od z góry zadanej wartości d wynosi 1-α, co odpowiada poziomowi
ufności 1-α. Wartość 1-α ustala się zazwyczaj na 0,95 lub 0,98.
Natomiast liczność próbki n powinna spełniać warunek:
n≥
pq
d
2
z12−α
gdzie z1-α jest zmienną losową o rozkładzie normalnym. Dla 1-α = 0,95, z1-α =1,96, a dla 1-α =
0,98, z1-α = 2,33
W oparciu o tak ustalone kryterium oraz wartość częstości p uzyskaną dla charakteryzowanego
faga, przy założeniu rozsądnych wartości d i przedziału ufności 1-α, możliwe jest zweryfikowanie liczności n użytej do określania zakresu aktywności litycznej danego faga i stwierdzenie, czy uzyskany
4
PL 195 437 B1
dla tego n zakres aktywności litycznej, przy założonych wartościach d i 1-α, może być uznany za
prawdziwy wobec populacji generalnej szczepów bakterii danego rodzaju.
Korzystnie w etapie b) szczep bakteriofaga izoluje się z próby pochodzącej ze środowiska, poprzez sączenie przez filtry membranowe o wielkości por 0,2-0,4 µm, do uzyskanego przesączu dodaje
się podłoże odżywcze i miesza się z hodowlą bulionową bakterii określonego rodzaju, inkubuje się
w temp. około 37°C przez około 1 godzinę, pobiera się porcję zawiesiny i rozciera na płytkach z podłożem stałym, prowadzi się inkubację w około 37°C przez około od 2 do 24 godzin, izoluje się próbkę
podłoża obejmującą pojedynczą łysinkę, przenosi się ją do hodowli bulionowej bakterii określonego
rodzaju i inkubuje się do czasu rozjaśnienia się hodowli, a uzyskany lizat przesącza się przez filtry
membranowe o wielkości por 0,2-0,4 µm otrzymując preparat bakteriofagowy, przy czym korzystnie
wysiew na podłoże stałe i reizolację łysinki powtarza się 5-krotnie.
Również korzystnie w etapie c) wysiewa się na odpowiednie podłoże stałe badany szczep bakteryjny, na które nanosi się porcję preparatu bakteriofagowego uzyskanego w etapie b), inkubuje się
w temp. około 37°C przez ok. 4 godziny po czym pozostawia w temp. około 4°C przez około od 2 do
24 godzin, przy czym o aktywności litycznej szczepu bakteriofagowego świadczy pojawienie się przynajmniej pojedynczych łysinek.
Korzystnie bakteryjne szczepy patogenne należą do rodzaju Staphylococcus albo Pseudomonas.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest środek do leczenia lub zapobiegania infekcjom wywoływanym przez patogeny bakteryjne zawierający czynnik aktywny i ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik charakteryzujący się tym, że jako czynnik aktywny zawiera multiwalentny szczep bakteriofaga specyficzny wobec bakterii tego rodzaju otrzymany sposobem według wynalazku.
Korzystnie środek według wynalazku charakteryzuje się tym, że jako multiwalentny szczep bakteriofaga specyficzny wobec bakterii należących do rodzaju Staphylococcus zawiera przynajmniej
jeden szczep bakteriofaga wybrany spośród S1 (PCM F/00001), S2 (PCM F/00002), S3 (PCM
F/00003), S3 (PCM F/00003), S4 (PCM F/00004), S5 (PCM F/00006), S6 (PCM F/00006) oraz S7
(PCM F/00007), korzystnie fagi S1, S2, oraz S4 albo S5.
Korzystnie środek według wynalazku charakteryzuje się tym, że jako multiwalentny szczep bakteriofaga specyficzny wobec bakterii należących do rodzaju Pseudomonas zawiera przynajmniej jeden
szczep bakteriofaga wybrany spośród P1 (PCM F/00008), P2 (PCM F/00009), P3 (PCM F/00010), P4
(PCM F/00011), P5 (PCM F/00012), P6 (PCM F/00013), P7 (PCM F/00014), P8 (PCM F/00015), P9
(PCM F/00016), P10 (PCM F/00017), P11 (PCM F/00018), P12 (PCM F/00019), P13 (PCM F/00020),
P14 (PCM F/00021), P15 (PCM F/00022), P16 (PCM F/00023), P17 (PCM F/00024), P18 (PCM
F/00025), P19 (PCM F/00026), oraz P20 (PCM F/00027), korzystnie fagi P7, P20 i P6.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie multiwalentnego szczepu bakteriofaga
otrzymanego sposobem według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania infekcjom wywoływanym przez patogeny bakteryjne.
Korzystnie do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania infekcjom wywoływanym przez
bakterie należące do rodzaju Staphylococcus stosuje się przynajmniej jeden szczep bakteriofaga wybrany spośród S1 (PCM F/00001), S2 (PCM F/00002), S3 (PCM F/00003), S3 (PCM F/00003), S4
(PCM F/00004), S5 (PCM F/00006), S6 (PCM F/00006) oraz S7 (PCM F/00007), korzystnie fagi S1,
S2, oraz S4 albo S5.
Równie korzystnie do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania infekcjom wywoływanym
przez bakterie należące do rodzaju Pseudomonas stosuje się przynajmniej jeden szczep bakteriofaga
wybrany spośród P1 (PCM F/00008), P2 (PCM F/00009), P3 (PCM F/00010), P4 (PCM F/00011), P5
(PCM F/00012), P6 (PCM F/00013), P7 (PCM F/00014), P8 (PCM F/00015), P9 (PCM F/00016), P10
(PCM F/00017), P11 (PCM F/00018), P12 (PCM F/00019), P13 (PCM F/00020), P14 (PCM F/00021),
P15 (PCM F/00022), P16 (PCM F/00023), P17 (PCM F/00024), P18 (PCM F/00025), P19 (PCM
F/00026), oraz P20 (PCM F/00027), korzystnie fagi P7, P20 i P6.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest multiwalentny szczep bakteriofaga specyficzny wobec
bakterii należących do rodzaju Staphylococcus wybrany spośród S1 (PCM F/00001), S2 (PCM
F/00002), S3 (PCM F/00003), S3 (PCM F/00003), S4 (PCM F/00004), S5 (PCM F/00006), S6 (PCM
F/00006) oraz S7 (PCM F/00007), korzystnie spośród S1, S2, S4 oraz S5.
Przedmiotem wynalazku jest także multiwalentny szczep bakteriofaga specyficzny wobec bakterii należących do rodzaju Pseudomonas wybrany spośród P1 (PCM F/00008), P2 (PCM F/00009), P3
(PCM F/00010), P4 (PCM F/00011), P5 (PCM F/00012), P6 (PCM F/00013), P7 (PCM F/00014), P8
(PCM F/00015), P9 (PCM F/00016), P10 (PCM F/00017), P11 (PCM F/00018), P12 (PCM F/00019),
PL 195 437 B1
5
P13 (PCM F/00020), P14 (PCM F/00021), P15 (PCM F/00022), P16 (PCM F/00023), P17 (PCM
F/00024), P18 (PCM F/00025), P19 (PCM F/00026), oraz P20 (PCM F/00027), korzystnie spośród P7,
P20 oraz P6.
W badaniach wykorzystano własną kolekcję fagów aktywnych wobec gatunków bakterii będących najczęstszymi czynnikami etiologicznymi zakażeń bakteryjnych u ludzi. Opisywane przykłady
wykonania obejmują multiwalentne bakteriofagi działające litycznie na metycylinooporne szczepy
gronkowca złocistego (Staphylococcus aureus) i pałeczki ropy błękitnej (Pseudomonas aeruginosa).
Gatunki te są obecnie przyczyną ciężkich zakażeń powodujących wysoką śmiertelność.
Wprowadzenie do lecznictwa poliwalentnych preparatów fagowych zawierających fagi multiwalentne uzyskane sposobem według wynalazku to duży postęp w zwalczaniu zakażeń bakteryjnych nie
poddających się leczeniu antybiotykami. Z nową technologią wiążą się również pewne korzyści ekonomiczne. Pozwala ona znaczne zmniejszyć koszta materiałowe i skrócić czas od pobrania materiału
do badań, do chwili uzyskania preparatu fagowego do leczenia. Dzięki temu, preparat fagowy będzie
oczekiwał na pacjenta a nie pacjent na przygotowanie indywidualnego preparatu fagowego.
Szeroki zakres litycznego działania preparatów fagowych złożonych z kilku fagów multiwalentnych uzyskanych sposobem według wynalazku jest bardzo ważną cechą z punktu widzenia zastosowania ich w leczeniu zakażeń bakteryjnych. Wiadomo bowiem, że w populacji bakterii mogą pojawiać
się formy oporne na bakteriofagi z częstością około 1x10-7. W obecności dwóch fagów częstość powstawania takich mutantów wynosi 1x10-14 a przy trzech fagach tylko 1x10-21. W takim układzie problem oporności szczepów bakteryjnych na fagi prawie nie istnieje.
Na szczególne podkreślenie zasługuje duża aplikacyjność obu przykładowych preparatów złożonych z fagów multiwalentnych. Będą one mogły być powszechnie wykorzystane w praktyce medycznej i pozwolą na skuteczne zwalczanie groźnych zakażeń bakteryjnych. Możliwe jest także wykorzystywanie fagów według wynalazku w przygotowywaniu preparatów do stosowania zewnętrznego,
wykorzystywanych przykładowo do leczenia i zapobiegania zakażeniom dermatologicznym. Stwierdzono także, że doustne podawanie lizatów fagowych według wynalazku zwiększa odporność na przyszłe zakażenia bakteryjne.
W pewnych przypadkach fagoterapia będzie mogła być stosowana łącznie z antybiotykoterapią.
Poliwalentne preparaty fagowe zastosowane w leczeniu zakażeń bakteryjnych okazały się wysoce efektywne. Szczególną skuteczność obserwowano w leczeniu groźnej posocznicy (88% wyleczeń).
Figura 1 przedstawia wyniki analizy statystycznej uzyskane dla fagów S1-S7.
Figura 2 przedstawia wyniki analizy statystycznej uzyskane dla fagów P1-P20.
Dla lepszego zrozumienia istoty wynalazku została ona zilustrowana poniższymi przykładami.
Przykład 1
Izolacja bakteriofagów
Bakteriofagi Staphylococcus i Pseudomonas zostały wyizolowane ze ścieków miejskich. Ścieki
poddawano sączeniu przez filtry membranowe o wielkości por 0,2-0,4 µm zatrzymujące bakterie
a przepuszczające bakteriofagi. Do uzyskanego przesączu dodawano skoncetrowanego płynnego
podłoża odżywczego i mieszano różne rozcieńczenia przesączu z młodą hodowlą bulionową bakterii
(Staphylococcus aureus lub Pseudomonas aeruginosa). Próbki inkubowano w temp. 37°C przez 1 godzinę. Po tym czasie z każdej próbki pobierano pipetą 0,2 ml zawiesiny i rozcierano na płytkach z agarem odżywczym za pomocą bagietki szklanej. Po całonocnej inkubacji w 37°C, w przypadku obecności poszukiwanego faga na płytkach posianych odpowiednim rozcieńczeniem przesączu zawierającego młodą hodowlę bakteryjną obserwowano jednolity (mgławicowy) wzrost bakterii i oddzielnie leżące
przezroczyste małe pola tzw. łysinki, które zawierały zwykle kilka milionów cząstek fagowych. Pojedynczą łysinkę wraz z agarem wycinano za pomocą ezy izolacyjnej, przenoszono do świeżej hodowli
bulionowej bakterii a następnie inkubowano do czasu rozjaśnienia się hodowli. Po przesączeniu przez
filtry membranowe o wielkości por 0,2-0,4 µm zatrzymujące pozostałe jeszcze w lizacie bakterie w przesączu znajdował się tylko bakteriofag. Wysiewy na podłoża agrowe różnych rozcieńczeń uzyskanego
faga z odpowiednimi bakteriami i reizolacje łysinek prowadzono 5-krotnie co pozwoliło na uzyskanie
czystej linii fagowej.
Przykład 2
Oznaczanie wrażliwości szczepów Staphylococcus aureus na specyficzne dla tych drobnoustrojów bakteriofagi
Wrażliwość określano na podłożu opisanym przez Wahla. Płytki z tym podłożem wysuszone
w temp. 37 °C przez 30 min pokrywano młodą 4-godziną wstrząsaną hodowlą bulionową Staphylococcus
PL 195 437 B1
6
aureus, nadmiar zawiesiny odpipetywowano i ponownie suszono przez 30 min w temp. 37°C. Na jednej płytce podzielonej na 6 segmentów określano wrażliwość badanego szczepu na 6 różnych ale
specyficznych bakteriofagów. Na powierzchnię każdego segmentu nanoszono 1 kroplę bakteriofaga
rozcieńczonego 1/10. Płytki inkubowano w cieplarce w temp. 37°C przez ok. 4 godziny po czym pozostawiano je w lodówce do następnego dnia. W przypadku wysokiej wrażliwości szczepu na określonego faga na podłożu pokrytym jednolitym wzrostem bakterii w miejscu naniesienia faga obserwowano
łyse przezroczyste pola będące wynikiem całkowitego zniszczenia komórek bakteryjnych (lizy). Mniejsza wrażliwość szczepu manifestowała się pojawianiem się pojedynczych łysinek.
Przykład 3
Oznaczanie wrażliwości szczepów Pseudomonas aeruginosa na specyficzne dla tych drobnoustrojów bakteriofagi
Sposób określania wrażliwości był podobny do opisanego w przykładzie 2. W tym przypadku
jednak podłożem stałym był agar odżywczy z dodatkiem buforu fosforanowego a okres inkubacji płytek z naniesionym fagem wynosił 5 godzin.
Przykład 4
Wybór fagów o najszerszym spektrum działania wobec szczepów Staphylococcus i Pseudomonas - uzyskiwanie multiwalentnych szczepów fagowych
Bakteriofagi wyizolowano metodą opisaną w przykładzie 1. Określono wrażliwość 845 lekoopornych szczepów klinicznych różnych gatunków Staphylococcus izolowanych z terenu całej Polski
na fagi z kolekcji bakteriofagów specyficznych wobec Staphylococcus oraz wrażliwość 880 lekoopornych szczepów klinicznych różnych gatunków Pseudomonas na fagi z kolekcji bakteriofagów specyficznych wobec Pseudomonas.
Analiza wrażliwości obu grup szczepów na swoiste bakteriofagi pozwoliła na wyselekcjonownie
fagów o nieoczekiwanie wysokiej aktywności i szerokim spektrum działania litycznego. Fagi te przedstawiono w tabeli 1 i 2.
Tabel a 1
Fagi Staphylococcus o wysokiej aktywności litycznej zdeponowane
w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM), Wrocław, Polska
Oznaczenie faga
Polska Kolekcja Mikroorganizmów (PCM)
numer dostępu depozytu
S1
F/00001
S2
F/00002
S3
F/00003
S4
F/00004
S5
F/00005
S6
F/00006
S7
F/00007
Tabel a 2
Fagi Pseudomonas o wysokiej aktywności litycznej zdeponowane
w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM), Wrocław, Polska
Oznaczenia faga
Polska Kolekcja Mikroorganizmów (PCM)
numer dostępu depozytu
1
2
P1
F/00008
P2
F/00009
P3
F/00010
PL 195 437 B1
7
ciąg dalszy tabeli 2
1
2
P4
F/00011
P5
F/00012
P6
F/00013
P7
F/00014
P8
F/00015
P9
F/00016
P10
F/00017
P11
F/00018
P12
F/00019
P13
F/00020
P14
F/00021
P15
F/00022
P16
F/00023
P17
F/00024
P18
F/00025
P19
F/00026
P20
F/00027
Wyniki uzyskane dla fagów S1-S7 oraz P1-P20 poddano analizie statystycznej w celu określenia, czy uzyskane dla poszczególnych fagów wartości p mogą być uznane za prawdziwe dla populacji
generalnej odpowiednich rodzajów bakterii. Rezultaty tych badań przedstawiono na fig. 1 i 2. Wyliczone wartości n były w przypadku większości bakteriofagów niższe niż liczności badanych próbek
szczepów bakteryjnych, co sugeruje, że uzyskane zakresy spektrum litycznego są prawdziwe przynajmniej wobec szczepów klinicznych występujących na terenie Polski. W związku z tymi wynikami
fagi zgromadzone w tab. 1 i 2 można uznać za fagi multiwalentne według wynalazku.
Nieoczekiwanie, w przypadku fagów Staphylococcus, 3 spośród 7 najbardziej aktywnych, tj. fagi S1, S2, oraz S4 albo S5, działa litycznie na 95% badanych szczepów Staphylococcus. Również 3
spośród wybranych 21 fagów Pseudomonas tj. fagi P7, P20 i P6, działają litycznie na 87% badanych
szczepów Pseudomonas.
Przykład 5
Namnażanie fagów Staphylococcus i fagów pałeczek Gram ujemnych, otrzymywanie lizatów fagowych
Do młodej 4 godzinnej hodowli na bulionie z dodatkiem glukozy zawierającej bakterie Staphylococcus aureus (faza logarytmiczna) dodawano ok. 5% lizatu fagowego, probówki lub butle umieszczano
na wytrząsarce i inkubowano przez 3 godziny w 37°C. Po wystąpieniu przejaśnienia hodowli (lizat)
próbki były pozostawiane w chłodni do następnego dnia. Celem usunięcia pozostałych niezlizowanych
komórek bakteryjnych otrzymane lizaty sączono przez filtry membranowe o wielkości 0,2-0,4 µm.
Koncentrację żywych cząstek fagowych określano metodą dwuwarstwową Gratii. Kontrolę stanowiła
hodowla inkubowana bez dodatku lizatu fagowego.
Namnażanie fagów pałeczek Gram ujemnych (Pseudomonas). Do namnażania fagów Pseudomonas stosowano wodę peptonową. Do młodej 4 godzinnej hodowli Pseudomonas aeurginosa dodawno 5% lizatu fagowego i po umieszczeniu probówek lub butli na wytrząsarce próbki inkubowno
przez 5 godzin w 37°C. Po rozjaśnieniu się hodowli próbki pozostawiano do następnego dnia w lodówce, po czym sączono przez filtry membranowe o wielkości por jak wyżej. Liczbę żywych cząstek fagowych w lizacie określano metodą Gratii.
8
PL 195 437 B1
Bulionowe jałowe lizaty fagowe wykazują długotrwałą aktywność lityczną. Przechowywane w chłodni zachowują żywotność przez kilka a w niektórych przypadkach nawet kilkanaście lat.
Przykład 6
Przygotowywanie i stosowanie poliwalentnych preparatów fagowych
Bulionowe jałowe lizaty uzyskane sposobem opisanym w przykładzie 5 pochodzące z wybranych fagów o szerokim spektrum działania litycznego z przykładu 4, lub ich zagęszczone formy, posłużyły do przygotowywania poliwalentnych preparatów fagowych.
Przykładowy poliwalentny preparat fagów Staphylococcus stanowi mieszaninę zawierającą równe objętości lizatów fagów S1, S2, oraz S4 albo S5, lub pochodnych tych lizatów.
Przykładowy poliwalentny preparat fagów Pseudomonas stanowi mieszaninę zawierającą równe objętości lizatów fagów P7, P20 i P6, lub pochodnych tych lizatów.
Preparaty podawano doustnie 3 razy dziennie, w ilości odpowiadającej 10 ml lizatu, 30 minut
przed posiłkiem, po uprzednim zneutralizowaniu soków żołądkowych (np. przez preparatem Gell Alumini phosphorici, sodę lub wodę Vichy). W przypadku podawania bezpośrednio do rany preparaty
aplikowano 3 razy na dobę. W przypadku podawania miejscowego nie należy przemywać rany środkami odkażającymi, które mogłyby doprowadzić do inaktywacji fagów. W razie potrzeby, rany przemywano sterylną pożywką lub roztworem fizjologicznym.
W pewnych przypadkach fagoterapia może być stosowana łącznie z antybiotykoterapią.
Poliwalentne preparaty fagowe zastosowane w leczeniu zakażeń bakteryjnych okazały się wysoce efektywne. Szczególną skuteczność obserwowano w leczeniu groźnej posocznicy (88 % wyleczeń).
Zastrzeżenia patentowe
1. Sposób otrzymywania multiwalentnego szczepu bakteriofaga, znamienny tym, że:
a) gromadzi się zbiór o dostatecznej liczności n różnych szczepów patogenów bakteryjnych
określonego rodzaju występujących losowo na danym obszarze, przy czym korzystnie izolowane
szczepy bakteryjne są szczepami lekoopornymi,
b) gromadzi się dostateczną ilość różnych szczepów bakteriofagów specyficznych wobec przynajmniej jednego szczepu bakterii należącego do danego rodzaju,
c) określa się aktywność lityczną zgromadzonego szczepu bakteriofaga wobec każdego zgromadzonego szczepu bakteryjnego, a następnie dla szczepu bakteriofaga oblicza się wartość p, jako
stosunek liczby szczepów lizowanych przez dany fag do liczby wszystkich zgromadzonych szczepów
bakteryjnych,
d) dla uzyskanej wartości p sprawdza się czy liczność n spełnia warunek:
n≥
pq
d
2
z12−α
gdzie : q = 1 - p
d jest stałą nie większą od 0,1, korzystnie nie większą od 10% p,
Z1-α jest zmienną losową o rozkładzie normalnym zależną od przedziału ufności 1-α, który jest
nie mniejszy niż 0,95,
e) wybiera się szczep bakteriofaga spełniający kryterium określone w d) i charakteryzujący się
wartością p nie mniejszą niż 2/n, korzystnie nie mniejszą niż 0,5.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie b) szczep bakteriofaga izoluje się z próby pochodzącej ze środowiska, poprzez sączenie przez filtry membranowe o wielkości por 0,2-0,4 µm,
do uzyskanego przesączu dodaje się podłoże odżywcze i miesza się z hodowlą bulionową bakterii
określonego rodzaju, inkubuje się w temp. około 37°C przez około 1 godzinę, pobiera się porcję zawiesiny i rozciera na płytkach z podłożem stałym, prowadzi się inkubację w około 37°C przez około od
2 do 24 godzin, izoluje się próbkę podłoża obejmującą pojedynczą łysinkę, przenosi się ją do hodowli
bulionowej bakterii określonego rodzaju i inkubuje się do czasu rozjaśnienia się hodowli, a uzyskany
lizat przesącza się przez filtry membranowe o wielkości por 0,2-0,4 µm otrzymując preparat bakteriofagowy, przy czym korzystnie wysiew na podłoże stałe i reizolację łysinki powtarza się 5-krotnie.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że w etapie c) wysiewa się na odpowiednie
podłoże stałe badany szczep bakteryjny, na które nanosi się porcję preparatu bakteriofagowego uzyskanego w etapie b), inkubuje się w temp. około 37°C przez ok. 4 godziny po czym pozostawia w temp.
PL 195 437 B1
9
około 4°C przez około od 2 do 24 godzin, przy czym o aktywności litycznej szczepu bakteriofagowego
świadczy pojawienie się przynajmniej pojedynczych łysinek.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że bakteryjne szczepy patogenne należą do rodzaju Staphylococcus albo Pseudomonas.
5. Środek do leczenia lub zapobiegania infekcjom wywoływanym przez patogeny bakteryjne
zawierający czynnik aktywny i ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienny tym, że
jako czynnik aktywny zawiera multiwalentny szczep bakteriofaga specyficzny wobec bakterii tego rodzaju otrzymany sposobem według zastrz. 1 - 4.
6. Środek według zastrz. 5, znamienny tym, że jako multiwalentny szczep bakteriofaga specyficzny wobec bakterii należących do rodzaju Staphylococcus zawiera przynajmniej jeden szczep
bakteriofaga wybrany spośród S1 (PCM F/00001), S2 (PCM F/00002), S3 (PCM F/00003), S3 (PCM
F/00003), S4 (PCM F/00004), S5 (PCM F/00006), S6 (PCM F/00006) oraz S7 (PCM F/00007), korzystnie fagi S1, S2, oraz S4 albo S5.
7. Środek według zastrz. 5, znamienny tym, że jako multiwalentny szczep bakteriofaga specyficzny wobec bakterii należących do rodzaju Pseudomonas zawiera przynajmniej jeden szczep bakteriofaga wybrany spośród P1 (PCM F/00008), P2 (PCM F/00009), P3 (PCM F/00010), P4 (PCM
F/00011), P5 (PCM F/00012), P6 (PCM F/00013), P7 (PCM F/00014), P8 (PCM F/00015), P9 (PCM
F/00016), P10 (PCM F/00017), P11 (PCM F/00018), P12 (PCM F/00019), P13 (PCM F/00020), P14
(PCM F/00021), P15 (PCM F/00022), P16 (PCM F/00023), P17 (PCM F/00024), P18 (PCM F/00025),
P19 (PCM F/00026), oraz P20 (PCM F/00027), korzystnie fagi P7, P20 i P6.
8. Zastosowanie multiwalentnego szczepu bakteriofaga otrzymanego sposobem według
zastrz. 1 - 4 do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania infekcjom wywoływanym przez patogeny bakteryjne.
9. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że do wytwarzania leku do leczenia lub
zapobiegania infekcjom wywoływanym przez bakterie należące do rodzaju Staphylococcus stosuje się
przynajmniej jeden szczep bakteriofaga wybrany spośród S1 (PCM F/00001), S2 (PCM F/00002), S3
(PCM F/00003), S3 (PCM F/00003), S4 (PCM F/00004), S5 (PCM F/00006), S6 (PCM F/00006) oraz
S7 (PCM F/00007), korzystnie fagi S1, S2, oraz S4 albo S5.
10. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że do wytwarzania leku do leczenia lub
zapobiegania infekcjom wywoływanym przez bakterie należące do rodzaju Pseudomonas stosuje
się przynajmniej jeden szczep bakteriofaga wybrany spośród P1 (PCM F/00008), P2 (PCM F/00009),
P3 (PCM F/00010), P4 (PCM F/00011), P5 (PCM F/00012), P6 (PCM F/00013), P7 (PCM F/00014),
P8 (PCM F/00015), P9 (PCM F/00016), P10 (PCM F/00017), P11 (PCM F/00018), P12 (PCM
F/00019), P13 (PCM F/00020), P14 (PCM F/00021), P15 (PCM F/00022), P16 (PCM F/00023), P17
(PCM F/00024), P18 (PCM F/00025), P19 (PCM F/00026), oraz P20 (PCM F/00027), korzystnie fagi P7, P20 i P6.
11. Multiwalentny szczep bakteriofaga specyficzny wobec bakterii należących do rodzaju Staphylococcus wybrany spośród S1 (PCM F/00001), S2 (PCM F/00002), S3 (PCM F/00003), S3 (PCM
F/00003), S4 (PCM F/00004), S5 (PCM F/00006), S6 (PCM F/00006) oraz S7 (PCM F/00007), korzystnie spośród S1, S2, S4 oraz S5.
12. Multiwalentny szczep bakteriofaga specyficzny wobec bakterii należących do rodzaju Pseudomonas wybrany spośród P1 (PCM F/00008), P2 (PCM F/00009), P3 (PCM F/00010), P4 (PCM
F/00011), P5 (PCM F/00012), P6 (PCM F/00013), P7 (PCM F/00014), P8 (PCM F/00015), P9 (PCM
F/00016), P10 (PCM F/00017), P11 (PCM F/00018), P12 (PCM F/00019), P13 (PCM F/00020), P14
(PCM F/00021), P15 (PCM F/00022), P16 (PCM F/00023), P17 (PCM F/00024), P18 (PCM F/00025),
P19 (PCM F/00026), oraz P20 (PCM F/00027), korzystnie spośród P7, P20 oraz P6.
10
PL 195 437 B1
Rysunki
PL 195 437 B1
11
12
PL 195 437 B1
Departament Wydawnictw UP RP
Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.