tilling i fox-hunting: nowe metody analizy funkcjonalnej genów

NOWE
METODY ANALIZY FUNKCJONALNEJTOM
GENÓW
539
POSTÊPY BIOLOGII
KOMÓRKI
36 2009 NR 4 (539–554)
TILLING I FOX-HUNTING:
NOWE METODY ANALIZY FUNKCJONALNEJ GENÓW*
TILLING AND FOX-HUNTING:
NEW METHODS IN FUNCTIONAL ANALYSIS OF GENES
Krystyna RYBKA
Zak³ad Biochemii i Fizjologii Roœlin, Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roœlin
w Radzikowie
Streszczenie: TILLING (ang. Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) i FOX-hunting (ang. Fulllength cDNA Over-eXpressing gene hunting system) to nowe metody badawcze, które umo¿liwiaj¹ masow¹ i szybk¹ analizê funkcjonaln¹ genów. Przyspieszenie prac w tym obszarze nauk biologicznych jest
konieczne do systematyzowania danych uzyskiwanych w programach sekwencjonowania genomów,
genów oraz EST (ang. Expressed Sequence Tag), a tak¿e w programach badañ zmian ekspresji genów,
prowadzonych przy zastosowaniu analizy mikromacierzy DNA. Klasyczne metody badañ funkcjonalnych by³y i s¹ prowadzone drog¹ „od cechy do genu” (ang. Top-down/ Forward). Najpierw, przy stosowaniu metod mapowania jakoœciowego lub iloœciowego poszukuje siê markerów genetycznych silnie
sprzê¿onych z cech¹. Kosegreguj¹ce z cech¹ markery nanosi siê na mapy fizyczne kontigów klonów
bibliotek genomowych w celu wyboru klonu zawieraj¹cego poszukiwany gen, co sprawdzane jest w
teœcie komplementacji. Wynik pozytywny tego testu potwierdza przewidziane funkcje biologiczne badanego genu, jednak¿e brak oczekiwanych zmian fenotypowych w transformantach nie stanowi negacji
przyjêtych za³o¿eñ, ze wzglêdu na czêsto zachodz¹ce wyciszanie genów. Innym typem rozwi¹zañ w
analizie funkcjonalnej genów jest droga „od mutacji do genu” (ang. Botom-up/Reverse), zak³adaj¹ca wytwarzanie, poszukiwanie oraz analizê mutantów i to w³aœnie podejœcie jest wykorzystywane w obydwu
omawianych technikach. Technika TILLING, to po³¹czenie tradycyjnej mutagenezy chemicznej z nowoczesn¹ i czu³¹, technik¹ identyfikacji mutantów punktowych, SNP (ang. Single Nucleotide Polymorphism), opart¹ na analizie PCR. Metoda ta polega na namna¿aniu mieszaniny równych iloœci DNA
poszczególnych mutantów w reakcji PCR, a nastêpnie na trawieniu produktów endonukleaz¹ Cel1
rozpoznaj¹c¹ niesparowane zasady w podwójnej nici DNA. Wa¿nym i trudnym etapem wstêpnym jest
uzyskanie odpowiednio du¿ej i wystarczaj¹co wysyconej populacji mutantów, co zale¿y zarówno od
czynnika chemicznego, jak i od modyfikowanego genomu. Drugim krytycznym krokiem jest przygotowanie DNA matrycowego, które jest kolekcjonowane w 96-do³kowych mikrop³ytkach. Do pojedynczej
reakcji PCR przygotowuje siê mieszaniny DNA zbieraj¹c do 8 probówek DNA z poszczególnych rzêdów do³ków, a potem (do 12 probówek) DNA z do³ków kolejnych kolumn, tak ¿e materia³ z jednej
mikrop³ytki mo¿na przeanalizowaæ w 20 (8 + 12), a nie 96 reakcjach. Analizê DNA wielu p³ytek mo¿na
*Praca zrealizowana w ramach tematu IHAR/1-1-01-4-05.
540
K. RYBKA
dodatkowo usprawniaæ zbieraj¹c DNA z tych samych do³ków ró¿nych p³ytek. W celu identyfikacji
mutantów ka¿dy z produktów reakcji PCR jest poddawany denaturacji, a nastêpnie renaturacji, co
powoduje powstawanie heterodupleksów z niesparowanymi zasadami w miejscu mutacji. Trawienie
tego DNA endonukleaz¹ Cel1 specyficzn¹ do niedopasowanych zasad umo¿liwia ich identyfikacjê po
rozdziale elektroforetycznym na ¿elu sekwencyjnym. W metodzie TILLING identyfikacja mutantów
jest szybsza ni¿ klasyczna metoda identyfikacji mutantów SNP, gdy¿: i/ zamiast koszto- i czasoch³onnego sekwencjonowania wykorzystuje siê enzym restrykcyjny trawi¹cy renaturowane produkty PCR w
miejscach niedopasowanych nukleotydów i standardow¹ elektroforezê DNA; ii/ reakcja PCR prowadzona jest na skalê masow¹, na matrycy DNA bêd¹cej mieszanin¹ kilku/kilkunastu próbek. Technika
FOX-hunting, to nowa metoda nadekspresji genów roœlinnych, która umo¿liwia szybkie wyodrêbnianie
i sekwencjonowanie równolegle z analiz¹ funkcjonaln¹. Jest ona modyfikacj¹/rozwiniêciem metody transformacji rzodkiewnika wektorami binarnymi wprowadzanymi do komórek roœlinnych przez A. tumefaciens, przez zamaczanie m³odych kwiatostanów w zawiesinie biblioteki binarnej. Wektory binarne stosowane w systemie FOX-hunting zawieraj¹ pomiêdzy sekwencjami granicznymi: i/ dwa tandemowe powtórzenia wzmacniacza transkrypcji (sekwencji –490 do –90 pz poprzedzaj¹cej promotor 35S wirusa
mozaiki kalafiora CaMV); ii/ promotor 35S (sekwencja –90 do –1 pz wirusa CaMV); iii/ sekwencjê W –
5' liderowy, nieulegaj¹cy translacji odcinek RNA wirusa mozaiki tytoniu (TMV), zwiêkszaj¹cy efektywnoœæ translacji wprowadzanego genu; iv/ kasetê zawieraj¹c¹ gen, którym chcemy transformowaæ A.
thaliana w otoczeniu sekwencji starterów (GS4 i GS6) u³atwiaj¹cych jego identyfikacjê w mutancie oraz
sekwencji rozpoznawanych przez endonukleazê SfiI; v/ terminator transkrypcji genu syntazy nopaliny
(nos) z plazmidu Ti oraz vi/ gen selekcyjny odpornoœci na higromycynê. Do konstrukcji biblioteki w
wektorze binarnym wykorzystywane s¹ pojedyncze kopie ka¿dego z genów zgromadzonych w bibliotekach cDNA skonstruowanych w wektorach Lambda ZAP i Lambda FLC-1-B. Zalety systemu FOXhunting, to: i/ ma³y procent kosupresji genów wskutek stosowania pe³nej d³ugoœci klonów cDNA i
znormalizowanych bibliotek w wektorach binarnych; ii/ liczebne ograniczenie ekspresji genów metabolizmu podstawowego (ang. house-keeping genes) w znormalizowanych bibliotekach; iii/ u³atwienia w
analizie fenotypowej wynikaj¹ce z krótkiego cyklu ¿yciowego A. thaliana; iv/ doœæ ³atwa izolacja i
sekwencjonowanie genów. Wad¹ tego systemu jest ograniczenie analizy funkcjonalnej jedynie do genów
wykorzystanych do konstrukcji biblioteki w A. tumefaciens. Obydwie techniki, TILLING i FOX-hunting, pozwalaj¹ na przyspieszenie analizy genów. Programy je wykorzystuj¹ce mog¹ byæ równie¿ dodatkowym Ÿród³em zró¿nicowanego materia³u dla hodowli. System TILLING z tej racji, i¿ zosta³ opracowany do badania mutantów indukowanych chemicznie, pozwala na natychmiastowe i bezpoœrednie wprowadzanie uzyskanych materia³ów do hodowli. System FOX-hunting otwiera g³ównie perspektywy w
analizie funkcjonalnej, generuj¹c cenne mutanty, w których obserwuje siê nadekspresjê genów.
S³owa kluczowe: TILLING, FOX-hunting, analiza funkcjonalna genów, mutageneza.
Summary: TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) and FOX-hunting (Full-length
cDNA Over-eXpressing gene hunting system) are new research methods which enable quite fast functional
analysis of gens on a mass scale. Accelerating of functional analysis of gens is required in biological
sciences. It is crucial for systematization of data gathered from programs of genomes, genes, and EST
(Expressed Sequence Tag ) sequencing as well as from studies of gene expression profiles, based on DNA
microarray analysis. Classical methods of functional studies have been fulfilled using Top-Down (Forward) approach. Firstly genetic markers cosegregating or at least strongly conjugated with the trait of
interest are searched for, using quantitative or qualitative mapping methods. Subsequently those markers
are mapped physically on contigs of genomic library clones spanning the region between cosegregating
markers in order to select the clone carrying the gene to be tested by complementation. Positive result of
that test confirms biological functions of the gen, however lack of changes in transformant phenotypes do
not negate the assumptions due to frequent gene silencing. Newer breakthrough tactic in gene functional
analysis is the bottom-up approach. This procedure assumes generation of mutants followed by mutant
population screening and analysis. The TILLING technique is a combination of traditional chemical
mutagenesis with modern and sensitive method of point mutations – SNP (Single Nucleotide Polymorphism) identification. The TILLING bases on PCR amplification of template DNA which is a mixture of
equal amounts of mutants DNA, followed by digestion with endonuclease Cel1, recognizing unpaired
bases of the double-helix DNA. Crucial and difficult preliminary step of this method is generation of
NOWE METODY ANALIZY FUNKCJONALNEJ GENÓW
541
appropriate population of mutants, which depends not only on chemical mutagen but also on genome to
be modified. The second crucial step is preparation of a template DNA, which is collected in 96-well
microplates. For single PCR reaction DNAs are combined from each row of wells into 8 test-tubes and
then DNA from the columns into 12 tubes so that the material from one plate can be analyzed in 20 (12+8)
not in 96 reactions. DNA analysis from several plates can be additionally improved by collecting the
DNAs from the same wells of different plates. Finally, in order to identify mutants, each of PCR reaction
products is denatured and then renatured which induces heteroduplex formation with unpaired bases in
the point of mutation. Digestion of this DNA by Cel1 endonuclease, specific to unpaired bases, enables
their identification after the electrophoresis on sequencing gel. In the TILLING method the identification
of SNP mutants is faster than in the classical approach because: i/ the standard electrophoresis on
sequencing gels of Cel1 digested, renatured PCR products is run instead of costly and time-consuming
sequencing reaction; ii/ the PCR reaction is carried out on a mass scale due to the DNA template which is
a mixture of few/several different DNAs. The FOX-hunting is a novel gain-of-function system, which
enables the plant genes overexpression as well as genes isolation and sequencing parallelly to functional
analysis. This method is a modification of the protocol of A. thaliana transformation by floral dip in a
suspension of A. tumefaciens carrying the full-length cDNA library in binary vectors. The binary vector
used in the FOX-hunting system contains between the border sequences: i/ two tandem repeats of
sequence strengthening the transcription (5'-upstream sequence of CaMV 35S promoter –419 to –90 bp);
ii/ P35S, CaMV 35S promoter –90 to –1 bp; iii/ W – 5'-upstream sequence of TMV, which increases
translation effectiveness of inserted gen; iv/ a gene cassette flanked by sequences of PCR starters to
identify the gene in the mutant and restriction sites for SfiI endonuclease; v/ polyadenylation signal of
nopaline synthase gene from Ti plasmid; vi/ hygromycin resistance gene. To construct the library in the
binary vector, single copies of each gen gathered in cDNA libraries (in Lambda ZAP and Lambda FLC1-B vectors) are used. The advantages of FOX-hunting system: i/ low percentage of gene cosuppression
due to use of full length cDNA clones and normalized libraries in binary vectors; ii/ reduction of the
expression of housekeeping genes in normalized libraries; iii/ simplification in phenotype analysis due to
A. thaliana's short life cycle; iv/ quite easy genes isolation and sequencing. The disadvantage of FOXhunting system is limitation of functional analysis only to the genes selected to construction of the library
in A. tumefaciens. Both methods, TILLING and FOX-hunting enable more rapid functional analysis of
genes. Projects using one of that protocol can be used as an additional source of diversified material for
plant breeding. The TILLING system, developed to study of chemically induced mutants, enables immediate and direct implementation of gathered results to breeding programs. FOX-hunting system which
generates valuable mutants with gene overexpression gives the new perspectives to functional analysis.
Key words: TILLING, FOX-hunting, functional analysis of genes, mutagenesis.
1. WSTÊP
Pocz¹tek XXI wieku zosta³ nazwany epok¹ po-genomow¹ (ang. post-genomic
era) z tej przyczyny, i¿ obecnie jest poznanych ponad 180 pe³nych sekwencji
genomów pocz¹wszy od sekwencji faga FX174 w 1977 roku (5368 pz), bakterii
Haemophilus influenzae w roku 1995, muszki owocówki i rzodkiewnika w roku
2000, cz³owieka w 2001 r., ry¿u w 2002 r., a w roku 2007 pierwszego pe³nego
genomu, 6 miliardów nukleotydów, jednego cz³owieka [22]. Znajomoœæ sekwencji
genomu nie oznacza znajomoœci liczby i funkcji genów. Tak na przyk³ad, w genomie
ry¿u, najmniejszym wœród zbó¿ i przez to przyjêtym za modelowy (430 Mpz),
pierwotnie, in silico, zidentyfikowano ok. 50 000 potencjalnych sekwencji
koduj¹cych, w wiêkszoœci o nieznanych funkcjach. Po dok³adniejszych badaniach
sekwencji, w tym cDNA, liczbê tê zmniejszono do 32 tys. [28].
542
K. RYBKA
Dodatkowo od przesz³o dekady obserwujemy kompleksowe gromadzenie danych
na temat zmian ekspresji genów (g³ównie iloœciowe). W roku 1996, firma Affymetrix
wprowadzi³a na rynek pierwsz¹ komercyjn¹ mikromacierz DNA (bio-chip),
umo¿liwiaj¹c¹ kompleksowe badania zmiany ekspresji genów. Na przyk³ad: na
podstawie hybrydyzacji cDNA otrzymanych z odmian ry¿u, o zró¿nicowanej
odpornoœci na suszê, do nowej generacji mikromacierzy (syntetycznych olignukleotydów), ³¹cznie zidentyfikowano prawie 16 000 genów ró¿nicowych, wœród których
jedynie ok. 30% mia³o zdefiniowan¹ funkcjê [5]. Równie¿ za pomoc¹ opracowanej
w po³owie lat dziewiêædziesi¹tych techniki SAGE (ang. Serial Analysis of Gene
Expression) i w roku 2000 metody MPSS (ang. Massively Parallel Signature
Sequencing), które umo¿liwiaj¹ masowe sekwencjonowanie fragmentów cDNA,
generowane s¹ du¿e zbiory danych [21, 24]. By ta lawina danych mog³a zostaæ
uporz¹dkowana potrzebne jest szybkie poszerzenie wiedzy na temat funkcji genów,
a tak¿e rozwój nowych narzêdzi informatycznych do obs³ugi i analizy wieloparametrowych baz danych [25, 33, 34].
Analiza funkcjonalna genów przez wiele lat by³a prowadzona zgodnie z zasadami
genetyki klasycznej: „od cechy do genu” (ang. Top-down/Forward). Rozwój technik
biologii molekularnej umo¿liwi³ podejœcie odwrotne: „od mutacji do genu” (ang.
Botom-up/Reverse) (tab. 1).
W po³owie lat 90. analiza funkcjonalna genów nabra³a tempa w zwi¹zku z
opracowaniem w USA techniki TILLING (ang. Targeting Induced Local Lesions
IN Genomes), opartej na amplifikacji DNA ze starterami genów wybieranych przez
badacza, a pozwalaj¹cej na masow¹ i szybk¹ identyfikacjê mutacji [36]. Dodatkowo
tempo kumulacji danych na temat funkcji genów wzrasta wskutek rozwoju,
opracowanej w Japonii, metody FOX-hunting (ang. Full-length cDNA OvereXpressing gene hunting system). Metoda, opatentowana w roku 2001, a udostêpTABELA 1 . P o ró wna nie me to d a na lizy funk c jo na lne j: k la syc zne j
(a ng. TOP -DOW N /F ORW A Rd ) i mo le k ula rne j (a ng. BOT T OMU P / RE V E RS E ) [3 0 , zmo d yfik o wa no ]
TABLE 1 . C o mp a riso n o f me tho d s o f ge ne func tio na l a na lysis:
To p - d o wn vs. Bo tto m- up a p p ro a c he s [3 0 , mo d ifie d ]
A N A L I ZA F U N K C J O N A L N A
K la syc zna (a ng. To p -d o w n )
Bia ³k o F e no typ
Mo le k ula rna (a ng. Bo t t o m -u p )
Bia ³k o fe no typ
ß
Ý
ß
Ý
ß
Ý
Ma p o wa nie
Q TL/a so c ja tywne
Ge n/Ge ny
Wytwa rza nie i a na liza
b ia ³e k
Ge n/Ge ny
Tra nsfo rma c ja
I d e ntyfik a c ja
Wyb ra nymi k lo na mi DN A
ge nó w
Muta nty
Muta nty
I d e ntyfik a c ja
fe no typ ó w
Te st k o mp le me nta c ji
I d e ntyfik a c ja
fe no typ ó w
Muta ge ne za
NOWE METODY ANALIZY FUNKCJONALNEJ GENÓW
543
niona szerszemu gronu badaczy nieca³e 3 lata temu umo¿liwia szybkie wyodrêbnianie,
rozpoznawanie sekwencji koduj¹cej oraz funkcji genów roœlinnych w warunkach ich
nadekspresji [17].
Dynamiczny rozwój analizy funkcjonalnej genów sk³ania do pogl¹dowego
przedstawienia koncepcji technik TILLING i FOX-hunting na tle klasycznej metody
poszukiwania mutantów oraz fizycznych, chemicznych i molekularnych metod
generowania mutacji.
2. ANALIZA FUNKCJONALNA GENÓW
wg zasad genetyki klasycznej
Analiza funkcjonalna, zgodnie z zasadami genetyki klasycznej zak³ada poszukiwanie genu koduj¹cego okreœlone bia³ko/fenotyp. Przyk³adem takiego podejœcia jest
klonowanie pozycyjne genu, w którym najpierw poszukuje siê markerów genetycznych silnie sprzê¿onych z cech¹. W zale¿noœci od charakteru badanej cechy wykorzystywane s¹ metody mapowania jakoœciowego lub iloœciowego (QTL) albo
asocjatywnego polegaj¹cego na analizie nierównowagi sprzê¿eñ (ang. LD-Linkage
Disequilibrium). W przypadku genomu roœlinnego mapowanie prowadzone jest przy
wykorzystaniu populacji segreguj¹cych: potomstwa BC2 lub F2, linii podwojonych
haploidów (DH), linii rekombinacyjnych (RILs), jak równie¿ linii bliskoizogenicznych
(NILs), aneuploidów i linii substytucyjnych [15]. Silnie sprzê¿one markery nanoszone
s¹ na mapy fizyczne (kontigów klonów bibliotek genomowych) w celu wyboru klonu
TABELA 2 . Lo k a liza c ja ge nó w p sze nic y zid e ntyfik o wa nyc h w p ro gra ma c h k lo no wa nia
p o zyc yjne go [1 2 , zmo d yfik o wa no ]
TABLE 2 . Whe a t ge ne s lo c a lize d in p o sitio na l c lo ning p ro gra ms [1 2 , mo d ifie d ]
Ge n/Q TL
L r1
L r1 0
L r2 1
Qf h s . N d s u - 3 b s
P m 3b
Yr5
S r2
Tsn l
Lo k a li- C e c ha
za c ja
5 DL
O d p o rno œæ na rd zê liœc io w¹
1 AS
"
" rd zê liœc io w¹
1 DS
"
" rd zê liœc io w¹
3 BS
"
" fuza rio zê k ³o sa
1 AS
"
" m¹ c znia k a p ra wd ziwe go
2 BL
"
" rd zê b runa tn¹
3 BS
"
" rd zê Ÿd Ÿb ³o w¹
5 BL
O d p o rno œæ na to k synê , P t r To x
Unive rsity o f Zuric h/ B. K e lle r
Unive rsity o f Zuric h/ B. K e lle r
K a nsa s S ta te Unive rsity/ B. S . Gill
K a nsa s S ta te Unive rsity/ B. S . Gill
Unive rsity o f Zuric h/ B. K e lle r
US DA- ARS , Whe a t Ge ne tic s/ K . G C a mp b e ll
C S I RO P la nt I nd ustry, Austra lia / ES La gud a h
N o rth Da k o ta S ta te Unive rsity/ J. D. F a ris
Bo 1
F r2
V RN 1
V RN 2
V RN -B3
E P S -1
Q
7 BL
5 BL
5A
5A
7 BS
I AL
5 AL
Unive rsity o f Ad e la id e / P. La ngrid ge
Unive rsity o f C a lifo rnia , Da vis/ J. Dub c o vsk y
Unive rsity o f C a lifo rnia , Da vis/ J. Dub c o vsk y
jw.
jw.
jw.
K a nsa s S ta te Unive rsity/ B. S . Gill
G P C -B1
P h1
6 BS
1 A/5 B
O d p o rno Ͼ na jo ny b o ru
O d p o rno œæ na mró z
Ge n o d p o wie d zi na we rna liza c jê
Ge n o d p o wie d zi na we rna liza c jê
Ge n o d p o wie d zi na we rna liza c jê
Ge n d e te rminuj¹ c y te rmin k witnie nia
Ge n re gula to ro wy wa runk uj¹ c y
m. in. wyso k ¹ za wa rto œæ glute nu
Wyso k a za wa rto œæ b ia ³k a w zia rnie
K o niuga c ja c hro mo so mó w ho mo lo gic znyc h w tra k c ie me jo zy
P la c ó wk a / Lid e r ze sp o ³u
Unive rsity o f C a lifo rnia , Da vis/ J. Dub c o vsk y
Jo hn I nne s C e ntre , C o lne y, N o rwic h/ G.
Mo o re
544
K. RYBKA
zawieraj¹cego poszukiwany gen. Po zsekwencjonowaniu wytypowane fragmenty
DNA s¹ wykorzystywane do transformacji roœlin dzikich; zmiana fenotypu regenerantów potwierdza przewidziane funkcje biologiczne genu. Brak oczekiwanych zmian
fenotypowych nie stanowi negacji przyjêtych za³o¿eñ ze wzglêdu na czêste wyciszanie genów w transformantach [27]. Przyk³adem takich badañ mog¹ byæ poszukiwania genu Pi-ta2 warunkuj¹cego odpornoœæ ry¿u na Pyricularia grisea [31]. W
genomie pszenicy metod¹ klonowania pozycyjnego zidentyfikowano kilkanaœcie
genów. G³ównie s¹ to geny: odpornoœci na stresy i odpowiedzi na wernalizacjê, a
tak¿e gen regulatorowy udomowienia pszenicy z chromosomu 5AL m.in. warunkuj¹cy wysok¹ zawartoœæ glutenu w ziarnie, a tak¿e locus warunkuj¹cy koniugacjê
chromosomów homologicznych w trakcie mejozy (tab. 2).
Efektywniejszym podejœciem do analizy funkcjonalnej jest wytwarzanie, poszukiwanie
i analiza mutantów. Mutanty wprowadzono do hodowli, w latach trzydziestych XX w.,
kiedy to odkryto mo¿liwoœæ indukowania mutacji. Rozwój technik biologii molekularnej
pozwoli³ na wykorzystanie tego podejœcia do poszukiwania genów i poznawania ich funkcji
bez znajomoœci fenotypu i/lub produktów bia³kowych.
3. ANALIZA FUNKCJONALNA GENÓW
wg zasad genetyki molekularnej
3.1. Metody uzyskiwania mutantów
3.1.1. Mutageneza fizyczna
Mutageneza czynnikami fizycznymi lub chemicznymi jest najczêœciej indukowana
w nasionach. Fizyczne czynniki mutagenne to przede wszystkim promieniowanie:
gamma (Ÿród³o: izotopy promieniotwórcze), X (Ÿród³a: lampy rentgenowskie,
synchrotrony), ultrafioletowe, elektronów o wysokiej i niskiej energii kinetycznej
(Ÿród³o: akcelatory) [3]. Energia promieniowania powoduje zmiany charakteru wi¹zañ
pomiêdzy atomami w cz¹steczkach polimeru, prowadz¹c do niszczenia lub powstawania nieistniej¹cych w naturze wi¹zañ kowalencyjnych, co zak³óca prawi-d³owy
metabolizm DNA i w efekcie ostatecznym generuje mutacje. Zjawisko mutagenezy
indukowanej promieniowaniem rentgenowskim zosta³o po raz pierwszy opisane dla
genomu jêczmienia, w okresie miêdzywojennym. W latach 60. wdro¿ono
kompleksowe programy generowania zmiennoœci w kolekcjach roœlin uprawnych;
wspó³dzia³anie FAO (ang. Food & Agriculture Organization) oraz IAEA (ang.
International Atomic Energy Agency) w zakresie pokojowego wykorzystania energii
atomowej zaowocowa³o w œwiecie wieloma programami hodowlanymi. Zarejestrowano 2570 mutantów, w tym 1020 mutantów g³ównych zbó¿: ry¿u – 439, jêczmienia
– 305, pszenicy – 204 i kukurydzy – 71 [26], wytworzonych g³ównie z wykorzystaniem promieni g (30%) i w mniejszym stopniu przez promieniowanie rentgenowskie
(3%). Dwie trzecie z tych mutantów zosta³o wygenerowanych w Chinach. Do
spektakularnych osi¹gniêæ mutagenezy fizycznej nale¿y odmiana peruwiañska
NOWE METODY ANALIZY FUNKCJONALNEJ GENÓW
545
jêczmienia dobrze plonuj¹ca w Andach powy¿ej 5 000 m n.p.m. Ewenementem
przyrodniczym jest równie¿ odmiana ry¿u rosn¹cego w wodzie o wysokim zasoleniu,
uprawiana w Delcie Mekongu w po³udniowym Wietnamie [38]. W Polsce znacz¹cym
osi¹gniêciem mutagenezy promieniami g by³o uzyskanie form samokoñcz¹cych siê
bobików [1].
3.1 2. Mutageneza chemiczna
Mutageneza chemiczna (najczêœciej punktowa) zachodzi pod wp³ywem zmian
konformacyjnych jednej z par zasad w komplementarnych ³añcuchach DNA. Zwi¹zki
indukuj¹ce zmiany konformacyjne to: i/ analogi zasad, np. 5-bromouracyl lub
2-aminopuryna; ii/ zwi¹zki hydroksyluj¹ce, np. hydroksylamina; iii/ zwi¹zki alkiluj¹ce,
np. metanosulfonian etylu (EMS) lub dimetylonitrozoamina; iv/ zwi¹zki deaminuj¹ce,
np. kwas azotawy lub siarczyn sodu. Interkalacja cz¹steczek zwi¹zków aromaTABELA 3 . Re a lizo wa ne i uruc ha mia ne o b e c nie p ro je k ty a na lizy funk c jo na lne j ge nó w tra w
w o p a rc iu o muta ge ne zê c he mic zn¹ i syste m a na lityc zny TI LLI N G [3 7 , zmo d yfik o wa no ]
TABLE 3 . Existing a nd p ro p o se d p ro je c ts o f ge ne func tio na l a na lysis in gra ss sp e c ie s b a se d
o n c he mic a l muta ge ne sis a nd TI LLI N G a na lytic a l syste m [3 7 , mo d ifie d ]
Ga tune k
N a zwa p ro je k tu
Muta Ad re s stro ny inte rne to we j
ge n
JÊC ZMI EÑ
c v.
c v.
c v.
c v.
O p tic
Ba r k e
Mo re x
Lux
DI S tilling (S C RI )
GABI - TI LL
TI LLMo re
Ris ÆN a tio na l La b s,
K VL De nma rk
K UK URY- Ma ize TI LLI N G
D ZA
P ro je c t, P urd ue
C ro p Ta ilo r AB
O WI ES
Ric e TI LL (UC Da vis)
RY¯ (ssp .
j a p o n ic a ) Mishima
P S ZEN I C A
EMS
EMS
EMS
EMS
EMS
www. c ro p ta ilo r. c o m/Enge lsk /e ngind e x. htm
EMS
www. tilling. uc d a vis. e d u/ind e x. p hp /Ric e _ Tilling
EMS lub
M N U+ N a N 3
MN U
T. a e st iv u m Arc a d ia Bio sc ie nc e s EMS
T. m o n o Ro tha mste a d
EMS
coccum
Re se a rc h (RRe s)
T. d u ru m
S O RGO
P RO S O
http ://ge rmina te . sc ri. sa ri. a c . uk /b a rle y/muta nts/
www. ga b i- till. d e /p ro je c t/ip k /b a rle y. html
www. d ista ge no mic s. unib o . it/TI LLMo re /
www. p grc . ip k - ga te rsle b e n. d e /b a rle yne t/o rga nisa tio n_ k vl. p hp
http ://ge no me . p urd ue . e d u/ma ize tilling/
EMS
O P TI WHEAT
US DA, Lub b o c k , TX EMS
P urd ue TI LLI N G
EMS
P r o je c t
www. ro tha mste d . a c . uk
www. ro tha mste d . a c . uk /c p i/o p tiwhe a t/ind e xc o nte nt. html
http ://ge no me . p urd ue . e d u/
RÓ ZGO WE
www. riso e . d k /risp ub l/BI O /b io p d f/ris- r- 5 1 0 . p d f
Bra c h y p o -- Ris ÆN a tio na l La b s, N a N 3
d iu m
K VL De nma rk
Wy j a œn ie n ia sk ró t ó w : EMS – me ta no sulfo nia n me tylo wy ; MN U – N - me tylo - N - nitro mo c znik ;
N a N 3 – a zyd e k so d u
546
K. RYBKA
tycznych, takich jak: proflawina czy bromek etydyny, do helis DNA prowadzi do
zaburzeñ replikacji, naprawy lub rekombinacji DNA.
Skutecznoœæ otrzymywania mutantów o charakterze dominuj¹cym wynosi dla zbó¿
mniej ni¿ pó³ promila [18]. Przejrzyst¹ ilustracjê jej wykorzystania stanowi¹ prace zespo³u
Finkelstein, które, na podstawie badañ mutantów A. thaliana niewra¿liwych na kwas
abscyzynowy, wyjaœni³y wiele aspektów przekazywania sygna³ów zale¿nych od tego
hormonu [9]. Istotnym osi¹gniêciem naszej hodowli by³o wytworzenie form rzepaku
ozimego o podwy¿szonej zawartoœci kwasu oleinowego oraz ni¿szej zawartoœci kwasu
linolenowego w oleju nasion w porównaniu z odmianami podwójnie ulepszonymi [32].
Mutageneza chemiczna jest, od przesz³o pó³wiecza, wa¿n¹ metod¹ pozyskiwania
mutantów, a w ostatnim dziesiêcioleciu dziêki wprowadzenia techniki TILLING s¹
uruchamiane nowe, kompleksowe projekty badawcze (tab. 3).
3.1.3. Mutageneza insercyjna
Mutanty insercyjne uzyskuje siê metod¹ transformacji roœlin przez naturalnie
wystêpuj¹ce retrotranspozony i T-DNA [20, 35]. Dominuj¹c¹ form¹ uzyskiwanych
mutantów s¹ mutanty, w których wyciszenie genu (ang. knock out/loss-of-function)
zachodzi pod wp³ywem insercji w sekwencjê koduj¹c¹ [40]. Pocz¹tkowo badano
naturalnie wystêpuj¹ce mutanty insercyjne kukurydzy, gdy¿ gatunek ten ma aktywne
elementy transpozonowe [23], co po raz pierwszy opisa³a Barbara McClintok (1948),
wyró¿niona za to odkrycie Nagrod¹ Nobla. Sklonowanie transpozonów Ac i Ds
kukurydzy [7] umo¿liwi³o transformacje gatunków, których genomy nie mia³y
aktywnego systemu transpozonowego [2]. Pierwszym genem, znalezionym dziêki
transpozonowym mutantom insercyjnym w genomie roœliny u¿ytkowej, by³ gen
odpornoœci na Cladosporium fulvum, Cf-9, warunkuj¹cy odpornoœæ na brunatn¹
plamistoœæ liœci u pomidora [16]. Taka strategia analizy funkcjonalnej dominowa³a
w laboratoriach œwiata przez prawie dwie dekady, tak wiêc nic dziwnego, ¿e liczba
wytworzonych w ten sposób mutantów roœlinnych wynosi przesz³o 290 tysiêcy [11].
Czynnikiem limituj¹cym wykorzystanie tych mutantów jest, na przyk³ad, niemo¿noœæ
analizy genów wystêpuj¹cych w wielu transkrybowanych kopiach, jak równie¿
niemo¿noœæ badania genów warunkuj¹cych stadia wczesnego rozwoju roœliny, gdy¿
ich wyciszenie prowadzi zazwyczaj do powstania mutantów letalnych. Dodatkowo
mutanty te, w przeciwieñstwie do mutantów T-DNA, s¹ niestabilne, co wynika
bezpoœrednio z w³aœciwoœci transpo-zonów. Mutanty T-DNA s¹ stabilne; T-DNA
jest integrowany z genomem roœlinnym przeciêtnie jako 1,5 kopii w genomie
Arabidopsis lub ry¿u [8]. W tabeli 4 zestawiono dostêpne dla badaczy kolekcje
mutantów insercyjnych ry¿u.
Zarówno transformacja z u¿yciem transpozonów, jak i przez T-DNA, prowadzi
g³ównie do powstania mutantów recesywnych. Dlatego te¿ wybór odpowiedniego
mutanta do dalszych badañ wymaga szeregu krzy¿owañ i analizy fenotypów licznego
potomstwa; w przypadku genu Cf-9 by³o to ok. 160 000 mutantów pomidora [16].
Podnoszenie wydajnoœci transformacji przy jednoczesnym upraszczaniu systemów
regeneracji i analizy mutantów zaowocowa³o opracowaniem systemu FOX-hunting.
NOWE METODY ANALIZY FUNKCJONALNEJ GENÓW
547
W systemie tym omijany jest etap kultur in vitro, gdy¿ transformacji przez
zamaczanie m³odych kwiatostanów w roztworze Agrobacterium tumefaciens
poddawane s¹ zarodki [4]. Wektory binarne T-DNA wykorzystywane w tych
eksperymentach nios¹ pe³nej d³ugoœci cDNA genów badanego organizmu [14].
Promuje to powstawanie mutantów charakteryzuj¹cych siê nadekspresj¹ pojedynczych, okreœlonych genów (ang. gain-of-function) (ryc. 1).
Sfil (A)
GS4
EI EI
Sfil (B)
RAFL cDNA
P35S
W
NOS-T
GS6
Hyg
wektor binarny
T-DNA pBIG21 13SF
RYCINA 1. Wektor binarny pBIG2113SF wykorzystywany w metodzie FOX-hunting: LB/RB – sekwencje
graniczne T-DNA; EI – wzmacniacze transkrypcji (sekwencje –490 do –90 pz powy¿ej koñca 5' promotora
35S wirusa mozaiki kalafiora CaMV); P35S – promotor 35S (sekwencja –90 do –1 pz wirusa CaMV); W
– 5'-liderowy nieulegaj¹cy translacji odcinek RNA wirusa mozaiki tytoniu (TMV); NOS-T – terminator
transkrypcji genu syntazy nopaliny (nos) z plazmidu Ti; Hyg – gen odpornoœci na higromycynê; GS4,
GS6 – startery do reamplifikacji RAFL cDNA z mutanta; SfiI(A), SfiI(B) – miejsce restrykcyjne
endonukleazy SfiI; RAFL cDNA (RIKEN Arabidopsis Full-Length cDNA) – pe³nej d³ugoœci cDNA z
bibliotek cDNA A. thaliana skonstruowanych w RIKEN/Japonia
FIGURE 1. The binary vector pBIG2113SF used in the FOX-hunting system: LB/RB – T-DNA border
sequences; EI – two tandem repeats of sequence strengthening the transcription (5¢-upstream sequence
of CaMV 35S promoter –419 to –90 bp; P35S – P35S, CaMV 35S promoter –90 to –1 bp; W –
5'-upstream sequence of TMV, which increases translation effectiveness of inserted gen; NOS-T –
polyadenylation signal of nopaline synthase gen from Ti plasmid; Hyg – hygromycin resistance gene;
GS4, GS6 – sequences of PCR starters to GS4 and GS6 primers used to recover the cDNAs; SfiI(A),
SfiI(B) – restriction sites for SfiI endonuclease; RAFL cDNA – RIKEN Arabidopsis Full-Length cDNA
548
K. RYBKA
Rozwijana w ostatnich latach technologia RNAi jest równie¿ potê¿nym narzêdziem
analizy funkcjonalnej, jednak¿e z tego wzglêdu, ¿e bazuje na potranskrypcyjnym
wyciszaniu genów [27, 29] nie jest przedmiotem obecnego artyku³u.
3.2. Metody poszukiwania i analizy mutantów
3.2.1. Zarys metody TILLING [36]
Technika TILLING, to po³¹czenie tradycyjnej mutagenezy chemicznej z
nowoczesn¹, opart¹ o analizê PCR, technik¹ identyfikacji mutantów punktowych,
SNP (ang. Single Nucleotide Polymorphism). Wa¿nym i trudnym etapem
wstêpnym jest samo uzyskanie odpowiednio du¿ej i wystarczaj¹co wysyconej
populacji mutantów, co zale¿y zarówno od czynnika chemicznego, jak i od
modyfikowanego genomu. Drugim krytycznym krokiem jest przygotowanie DNA
matrycowego. Jednakowa iloœæ DNA z poszczególnych osobników jest kolekcjonowana w 96-do³kowych mikrop³ytkach. Do pojedynczej reakcji PCR przygotowuje
siê mieszaniny DNA zbieraj¹c do 8 probówek DNA z poszczególnych rzêdów do³ków,
a potem (do 12 probówek) DNA z do³ków kolejnych kolumn, tak ¿e materia³ z jednej
mikrop³ytki mo¿na przeanalizowaæ w 20 (8 + 12), a nie 96 reakcjach. Analizê DNA
wielu p³ytek mo¿na dodatkowo usprawniaæ zbieraj¹c DNA z tych samych do³ków
ró¿nych p³ytek. W takim uk³adzie analiza DNA 960 osobników (10 p³ytek ´ 96
do³ków) wymaga jedynie 296 reakcji PCR [(10 ´ 8) + (10 ´ 12) + 96 = 296].
W celu identyfikacji mutacji ka¿dy z produktów reakcji PCR jest poddawany
denaturacji, a nastêpnie renaturacji, co powoduje powstawanie heterodupleksów z
niesparowanymi zasadami w miejscu mutacji. Trawienie tego DNA endonukleaz¹
Cel1 specyficzn¹ do niedopasowanych zasad umo¿liwia ich identyfikacjê po rozdziale
elektroforetycznym na ¿elu sekwencyjnym (ryc. 2).
Klasyczna metoda identyfikacji mutantów SNP polega na namna¿aniu, a nastêpnie
sekwencjonowaniu wybranych genów oddzielnie dla ka¿dego osobnika badanej
populacji. W metodzie TILLING identyfikacja mutantów jest szybsza, gdy¿: i/
zamiast koszto- i czasoch³onnego sekwencjonowania wykorzystuje siê enzym
restrykcyjny trawi¹cy renaturowane produkty PCR w miejscach niedopasowanych
nukleotydów i standardow¹ elektroforezê DNA; ii/ reakcja PCR prowadzona jest
na skalê masow¹, na matrycy DNA bêd¹cej mieszanin¹ kilku/kilkunastu próbek.
Poniewa¿ ka¿de DNA wystêpuje w 3 ró¿nych mieszaninach DNA matrycowego,
wynik prawid³owo przeprowadzonej analizy dok³adnie wskazuje mutanta, co pozwala
nie tylko na jego bezpoœrednie typowanie do wykorzystania w badaniach funkcjonalnych, lecz równie¿, w przypadku roœlin, na natychmiastowe i bezwarunkowe
w³¹czenie do programów hodowlanych. Obecnie, na œwiecie, jest realizowanych 17
projektów typu TILLING dotycz¹cych genomów zbó¿ (tab. 3).
3.2.2. Zarys metody FOX- hunting [14, 17]
Koncepcjê tê opracowa³ zespó³ z RIKKEN (Japonia) i opublikowa³ pod nazw¹
FOX-hunting. Strategia zosta³a opracowana dla A. thaliana i jest modyfikacj¹ –
NOWE METODY ANALIZY FUNKCJONALNEJ GENÓW
DNA ROŒLIN
KONTROLNYCH I NIEZMUTOWANYCH
G
PCR
C
DNA MUTANTA
A
T
denaturacja
renaturacja
G
G
C
A
HOMODUPLEKSY
549
A
T
HETERODUPLEKSY
T
G
C
A
trawienie C
endonukleaz¹ Cel1 G
A
T
miejsce trawienia
T
C
rozdzia³ DNA
(elektroforeza na ¿elach denaturuj¹cych lub HPLC)
DNA roœlin kontrolnych i niezmutowanych
DNA mutantów
RYCINA 2. Ideogram techniki TILLING: Równa iloœæ DNA badanych roœlin a tak¿e DNA roœliny
kontrolnej s¹ mieszane i amplifikowane w reakcji PCR ze starterami wybranych genów. Trawienie
endonukleaz¹ Cel1 specyficzn¹ do niesparowanych zasad w helisie DNA, a nastêpnie elektroforeza w
¿elu sekwencyjnym wskazuje zmutowane DNA [10, 13, zmodyfikowano]
FIGURE 2. Ideogram of the TILLING technique. Equal amounts of mutant DNAs as well as the DNA of
the wild plant are mixed and amplified in PCR reaction with primers of particular genes. Digestion of that
DNA by Cel1 endonuclease, specific to unpaired bases of the double-helix DNA, enables mutant identification after the electrophoresis on sequencing gel [10, 13, modified]
rozwiniêciem metody transformacji rzodkiewnika wektorami binarnymi wprowadzanymi do komórek roœlinnych przez A. tumefaciens.
Istotnymi, dla skutecznoœci transformacji s¹ sekwencje wzmacniaczy i terminatorów transkrypcji wbudowane pomiêdzy sekwencje graniczne T-DNA (ang. LB/
RB left/right border). Wektory binarne stosowane w systemie FOX zawieraj¹
pomiêdzy sekwencjami granicznymi: i/ dwa tandemowe powtórzenia wzmacniacza
transkrypcji (sekwencji –490 do –90 pz poprzedzaj¹cej promotor 35S wirusa mozaiki
N ip p o nb a re
C I RAD- I N RAI RD
C N RS , Ge no p la nte
F ra n c j a
I P MB, Ac a d e mia
S inic a ; Ta j w a n
Hua zho ng Agric ultura l Unive rsity
C h in y
SIPP
C h in y
Zhe jia ng Unive rsity
C h in y
N I AS
J a p o n ia
UC Da vis
U SA
31 000
26 000
11 3 2 6 2 1 6 1 5 8
14 197
1 101
97 500
8 840
17 414
11 4 8 8
30 000 18 382
45 000 14 137
100 000 13 745
Lic zb a muta ntó w
C a ³k o wita S k la syfk . Do stê p n.
150 000 84 680 58 943
400 000
ET
T- DN A
G. An
ge ne a n@ p o ste c h. a c . k r
k r/p fg
E. Guid e rd o ni
guid e rd o ni@ c ira d . fr
Lid e r/Ad re s e - ma il
E. Guid e rd o ni
guid e rd o ni@ c ira d . fr
N . M. Up a d hya ya
na ra ya na . up a d hya ya @ c siro . a u
C . - D. Ha n
c d ha n@ no nga e . gsnu. a c . k r
R. S riniva sa n
F. F u
ship @ sib s. a c . c n
P. Wu
c lsp wu@ nia s. a ffrc . go . jp
H. Hiro c hik a
hiro hik o @ nia s. a ffrc . go . jp
V. S und a re sa n
sund a r@ uc d a vis. e d u
TRI M
Y. C . Hsing
http ://trim. sinic a . e d u. tw b o hsing@ ga te . sinic a . e d . tw
RMD
Q . Zha ng
http ://rmd . nc p gr. c n
q ifa zh@ ma il. hza u. e d u. c n
http ://urgi. ve rsa ille s.
inra . fr/O ryza Ta gLine
RI S D
http ://a n6 . p o ste c h. a c .
Ad re s www.
8 8 4 0 F S T+ http ://ship . p la ntsigna l.
11 0 0 0 linii c n/ho me . d o
N ip p o nb a re
T- DN A
1 009
1 009
http :/www. ge no mic s.
Zho nghua 11
zju. e d u. c n/ric e td na
N ip p o nb a re
To s1 7
500 000 34 844 34 844
http ://to s. nia s. a ffrc .
go . jp
N ip p o nb a re
Ac - Ds
20 000
Ds 4 7 3 5 4 6 3 0
http ://www- p lb .
GT
dSpm
9 036
uc d a vis. e d u/
S p m/d S p m
9 469
Labs/sundar
Gye o ngsa ng N a tio na l Do ngjin Bye o Ac - Ds
30 000
4 820
4 820
K RDD http ://www.
Unive rsity; K o re a P d
GT
nia b . go . k r/RDS
Te ma se k Life sc ie nc e s, N ip p o nb a re
Ac - Ds
20 000
3 500
2 000
S in g a p u r
GT
N ip p o nb a re
Ac - Ds
25 000
1 380
1 300
http ://o ryge ne sd b .
EU- O S TI D
F ra n c j a
ET
c ira d . fr
C S I RO P la nt I nd ustry N ip p o nb a re
Ac - Ds
16 000
6 11
~ 50%
http ://www. p i. c siro .
A u s t r a lia
GT/ET
ste rylnyc h
a u/fgrttp ub
Zho nghua 11
Zho nghua 1 5
N ip p o nb a re
Zho nghua 11
ET
T- DN A
ET/AT
To s1 7
T- DN A,
ET
To s1 7
T- DN A
AT
T- DN A
Do ngjin,
Hwa yo ung
P O S TEC H
K o re a P d
Ta inung 6 7
Muta ge n
Ge no typ
TABELA 4 . K o le k c je d o stê p nyc h muta ntó w inse rc yjnyc h ry¿u [1 9 , zmo d yfik o wa no ] – TABLE 4 . Ric e muta nt re so urc e s [1 9 , mo d ifie d ]
O œro d e k b a d a wc zy
550
K. RYBKA
NOWE METODY ANALIZY FUNKCJONALNEJ GENÓW
551
TABELA 5 . Realizowane i uruchamiane obecnie projekty F O X- hunting w badaniach genomów zbó¿
TABLE 5 . Existing a nd p ro p o se d F O X- hunting p ro je c ts in stud ie s o f c e re a l ge no me s
Linie F O X Ba d a ny
C e l p ra c y
Lid e r grup y
[lite ra tura ] ge no m
a d re s e - ma il
A . t h a li a n a r y¿
se le k c ja i p o szuk iwa nie ge nó w
I c hik a wa Y.
[1 4 , 1 7 ]
o d p o rno œc i, szc ze gó lnie na wyso k ¹
yo uic hi@ p sc . rik e n. jp
te mp e ra turê ; l. muta ntó w: 2 3 0 0 0
r y¿
r y¿
wyk o rzysta nie p ro mo to ra ub ik wityny;
I c hik a wa Y
[2 8 ]
uzysk a nie i a na liza fe no typ o wa muta ntó w yo uic hi@ p sc . rik e n. jp
l. muta ntó w: c a ³k o wita – 1 2 0 0 0
z p o je d ync z¹ wsta wk ¹ – 8 3 2 2
A . t h a lia n a Bru g u ie ra p o szuk iwa nie ge nó w
Ta d a Y.
[6 ]
G y m n o rh iza o d p o rno œc i na stre s za so le nia
ta d a yui@ b s. te u. a c . jp
p sze nic a
p sze nic a
p ro je k t w fa zie wstê p ne j, uzysk a no
S te b e r C .
[3 9 ]
sta b ilne muta nty, a le w ma ³e j lic zb ie
jza le @ utk . e d u
kalafiora CaMV); ii/ promotor 35S (sekwencja –90 do –1 pz wirusa CaMV);
iii/ sekwencjê W – 5'-liderowy nieulegaj¹cy translacji odcinek RNA wirusa mozaiki
tytoniu (TMV), zwiêkszaj¹cy efektywnoœæ translacji wprowadzanego genu; iv/ kasetê
zawieraj¹c¹ gen, którym chcemy transformowaæ A. thaliana w otoczeniu
sekwencji starterów (GS4 i GS6) u³atwiaj¹cych jego identyfikacjê w mutancie oraz
sekwencji rozpoznawanych przez endonukleazê SfiI; v/ terminator transkrypcji genu
syntazy nopaliny (nos) z plazmidu Ti oraz vi/ gen selekcyjny odpornoœci na
higromycynê (ryc. 2).
Do konstrukcji biblioteki w wektorze binarnym wykorzystywane s¹ pojedyncze kopie
ka¿dego z genów zgromadzonych w bibliotekach cDNA skonstruowanych w
wektorach LambdaZAP i Lambda FLC-1-B; unikalnoœæ ka¿dego klonu sprawdzana
jest przez sekwencjonowanie i odrzucanie powtarzaj¹cych siê klonów. W celu
normalizacji biblioteki autorzy techniki wykorzystali cztery geny bakteryjne wywo³uj¹ce
znane zmiany fenotypowe i sterylnoœæ roœlin. Geny te zosta³y wklonowane w miejscu
ciêcia przez enzym restrykcyjny SfiI. Mieszaninê cDNA genomowego oraz
bakteryjnego przygotowano w takim stê¿eniu, by w mutantach obserwowaæ ekspresjê
genów bakteryjnych z czêstoœci¹ 1/7500 klonów. Mieszaninê poddano trawieniu
enzymem SfiI, a nastêpnie ligacji ze zmodyfikowanym wektorem binarnym
pBIG2113N. W wektorze tym w miejscu trawienia XbaI do³¹czono adaptory SfiI,
tak by ligacja wstawki DNA nastêpowa³a w orientacji „sens”. Bakterie Echerichia
coli DH10B transformowano mieszanin¹ ligacyjn¹ przez elektroporacjê. Z uzyskanej
w ten sposób biblioteki plazmidowej wyizolowano plazmidy i transformuj¹c nimi
Agrobacterium tumefaciens przygotowano bibliotekê do projektów FOX.
O ile przygotowanie biblioteki jest kosztown¹ i czasoch³onn¹ czeœci¹ eksperymentu, o tyle sama transformacja A. thaliana nie wymaga kultur in vitro. Biblioteka
w A. tumefaciens, po namno¿eniu, jest rozcieñczana w roztworze 5% sacharozy
zawieraj¹cym œrodek powierzchniowo-czynny 0,05% Silwet L-77, w iloœci 100–200
ml do transformacji 2–3 roœlin. Kwiatostany A. thaliana s¹ zanurzane w tym
roztworze na 2–3 sekundy, z delikatnym mieszaniem, tak by pokryæ je warstw¹
552
K. RYBKA
zawiesiny A. tumefaciens. Po transformacji roœliny trzymane s¹ w kamerze o
podwy¿szonej wilgotnoœci, a nastêpnie pielêgnowane w standardowy sposób. Zebrane
nasiona zostaj¹ poddane selekcji przez kie³kowanie na agarze zawieraj¹cym higromycynê,
a po tygodniu ¿ywe siewki s¹ przenoszone do doniczek z ziemi¹. W ten sposób autorzy
techniki uzyskali ponad 15 000 p³odnych transformantów FOX, które teoretycznie powinny
reprezentowaæ 77% cDNA u¿ytych do konstrukcji biblioteki w A. tumefaciens. By
stwierdziæ skutecznoœæ transformacji przebadano 24 linie FOX. Sprawdzono obecnoœæ
genu odpornoœci na higromycynê technik¹ hybrydyzacji Southerna. Wszystkie badane
linie by³y transgeniczne, a œrednia liczba zintegrowanych wektorów w genomie
pojedynczej linii FOX wynosi³a 2,6. Œrednia d³ugoœæ wstawek DNA w populacji FOX
by³a oko³o 30% mniejsza ni¿ œrednia d³ugoœæ cDNA w bibliotece A. tumefaciens i
kszta³towa³a siê w zakresie od 0,2 do 4,6 kpz, z median¹ 1–1,4 kpz. Zaobserwowano
nieznaczn¹ liczbê transformantów o wstawkach mniejszych lub wiêkszych ni¿ wstawki
biblioteki w wektorze binarnym. Liczba transformantów o fenotypie indukowanym przez
geny bakteryjne by³a wy¿sza od wartoœci oczekiwanych. Zjawisko to autorzy techniki
FOX t³umaczyli ró¿nym tempem wzrostu bakterii z wektorami binarnymi nios¹cymi pe³nej
d³ugoœci cDNA roœlinne i bakteryjne w czasie namna¿ania biblioteki. Na œwiecie jest
obcenie realizowanych i uruchamianych kilka projektów typu FOX-hunting dotycz¹cych
genomów zbó¿ (tab. 5).
Zalety systemu FOX-hunting, to: i/ ma³y procent kosupresji genów wskutek
stosowania pe³nej d³ugoœci klonów cDNA i znormalizowanych bibliotek w wektorach
binarnych; ii/ liczebne ograniczanie ekspresji genów metabolizmu podstawowego
(ang. housekeeping genes) w znormalizowanych bibliotekach; iii/ u³atwienia w
analizie fenotypowej wynikaj¹ce z krótkiego cyklu ¿yciowego A. thaliana; iv/ doœæ
³atwa izolacja i sekwencjonowanie genów. Wad¹ tego systemu jest ograniczenie
analizy fenotypowej jedynie do genów wykorzystanych do konstrukcji biblioteki A.
tumefaciens.
4. PODSUMOWANIE
Techniki TILLING i FOX-hunting pozwalaj¹ na przyspieszenie analizy funkjonalnej
genów. Programy je wykorzystuj¹ce mog¹ byæ równie¿ dodatkowym Ÿród³em
zró¿nicowanego materia³u dla hodowli. System TILLING, z tej racji i¿ zosta³
opracowany do badania mutantów indukowanych chemicznie, pozwala na natychmiastowe i bezpoœrednie wprowadzanie uzyskanych materia³ów do hodowli. System
FOX-hunting otwiera g³ównie perspektywy w analizie funkcjonalnej genów, generuj¹c
cenne mutanty, w których obserwuje siê nadekspresjê genów.
PODZIÊKOWANIE
Pani dr hab. Annie Goc, z Uniwersytetu Miko³aja Kopernika w Toruniu, dziêkujê
serdecznie za wnikliw¹ dyskusjê i uwagi.
NOWE METODY ANALIZY FUNKCJONALNEJ GENÓW
553
LITERATURA
[1] ARSENIUK E, KRZYMUSKI J, MARTYNIAK J, OLEKSIAK T. Bobik – odmiany rejestrowane. W:
KRZYMUSKI J [red.] Historia hodowli i nasiennictwa na ziemiach polskich w XX wieku. Poznañ, IHAR
2003: 323–324.
[2] ASSAAD F. Generation of Arabidopsis transposon lines. Genome Biol 2000; 1, reports018; doi:010.1186/
gb-2000-1181-1181-reports1018.
[3] CHOPRA VL. Mutagenesis: Investigating the process and processing the outcome for crop improvement.
Cur Sci 2005; 89: 353–360.
[4] CLOUGH SJ, BENT AF. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium – mediated transformation of
Arabidopsis thaliana. Plant J 1998; 16: 735–743.
[5] DEGENKOLBE T, THI DO P, ZUTHER E, REPSILBER D, WALTHER D, HINCHA DK, KOHL KI.
Expression profiling of rice cultivars differing in their tolerance to long-term drought stress. Plant Mol
Biol 2009; 69: 133–153.
[6] EZAWA S, TADA Y. Identification of salt tolerance genes from the mangrove plant Bruguiera gymnorhiza using Agrobacterium functional screening. Plant Sci 2009; 176: 272–278.
[7] FEDOROFF N, WESSLER S, SHURE M. Isolation of the transposable maize controlling elements Ac and
Ds. Cell 1983; 35: 235-242.
[8] FELDMANN KA. T-DNA insertion mutagenesis in Arabidopsis: mutational spectrum. Plant J 1991; 1:
71–82.
[9] FINKELSTEIN R, REEVES W, ARIIZUMI T, STEBER C. Molecular Aspects of Seed Dormancy. Annu
Rev Plant Biol 2008; 59: 387–415.
[10] GAO H, HUANG J, BARANY F, CAO W. Switching base preferences of mismatch cleavage in endonuclease V: an improved method for scanning point mutations. Nucleic Acids Res 2007; 35: e2.
[11] GUIDERDONI E, AN G, YU SM, HSING YI, and WU C. T-DNA insertion mutants as a resource for rice
functional genomics. W: UPADHYAYA N [red.] Rice Functional Genomics: Challenges, Progress and
Prospects. New York, Springer. 2007: 181–221.
[12] GUPTA PK, MIR RR, MOHAN A, KUMAR J. Wheat Genomics: present status and future prospects. Int
J Plant Genomics 2008; Article ID 896451.
[13] HENIKOFF S, COMAI L. Single-nucleotide mutations for plant functional genomics. Annu Rev Plant
Biol 2003; 54: 375–401.
[14] ICHIKAWA T, NAKAZAWA M, KAWASHIMA M, IZUMI H, KURODA H, KONDOU Y, TSUHARA Y,
SUZUKI K, ISHIKAWA A, SEKI M, FUJITA M, MOTOHASHI R, NAGATA N, TAKAGI T, SHINOZAKI K, MATSUI M. The FOX hunting system: an alternative gain-of-function gene hunting technique.
Plant J 2006; 45: 974–985.
[15] IYER-PASCUZZI AS, SWEENEY MT, SARALA N, McCOUCH S. Natural variation and functional
genomics. Utilizing germplasm to identify useful alleles. W: UPADHYAYA N [red.]. Rice Functional
Genomics: Challenges, Progress and Prospects. New York, Springer 2007: 116–132.
[16] JONES DA, THOMAS CM, HAMMOND-KOSACK KE, BALINT-KURTI PJ, JONES JD. Isolation of
the tomato Cf-9 gene for resistance to Cladosporium fulvum by transposon tagging. Science 1994; 266:
789–793.
[17] KONDOU Y, HIGUCHI M, TAKAHASHI S, SAKURAI T, ICHIKAWA T i in. Systematic approaches to
using the FOX hunting system to identify useful rice genes. Plant J 2009; 57: 883–894.
[18] KOOMNEEF M, ALONSO-BLANCO C, PEETERS AJM. Genetic approaches in plant physiology. New
Phytol 1997; 137: 1–8.
[19] KRISHNAN A, GUIDERDONI E, AN G, HSING Y-C, HAN C-D, LEE MC, YU S-M, UPADHYAYA N,
RAMACHANDRAN S, ZHANG Q, SUNDARESAN V, HIROCHIKA H, LEUNG H, PEREIRA A. Mutant
resources in rice for functional genomics of the grasses. Plant Physiol 2009; 149: 165–170.
[20] KUMAR A, BENNETZEN JL. Plant retrotransposons. Annu Rev Genet 1999; 33: 479–532.
[21] LEADER DJ. Transcriptional analysis and functional genomics in wheat. J Cereal Sci 2005; 41: 149–
163.
[22] LEVY S, SUTTON G, NG PC, FEUK L, HALPERN AL, i in/ Celera Genomics/. The diploid genome
sequence of an individual human. PLoS Biology 2007; 5: e254. doi:10.1371/journal.pbio.0050254
[23] MAÆKO A. Opracowano kompletny system klasyfikacji ruchomych elementów genetycznych. Biotechnologia 2008;http://www.biotechnologia.pl/biotechnologia/9/960
554
K. RYBKA
[24] MCINTOSH S, WATSON L, BUNDOCK P, CRAWFORD A, WHITE J, CORDEIRO G, BARBARY D,
ROOKE L, HENRY R. SAGE of the developing wheat caryopsis. Plant Biotechnol J 2007; 5: 69–83.
[25] MUKHERJEE G, ABEYGUNAWARDENA N, PARKINSON H, CONTRINO S, DURNICK S i in. Plantbased microarray data at the european bioinformatics institute. Introducing AtMIAMExpress, a submission tool for Arabidopsis gene expression data to ArrayExpress. Plant Physiol 2005; 139: 632–636.
[26] MUTANT VARIETIES DATABASE 6. 05. 2009 http://www-mvd.iaea.org/MVD/default.htm
[27] NADOLSKA-ORCZYK A. Transgene expression and gene silencing in cereals. Biotechnologia 2006; 4:
168–180.
[28] NAKAMURA H, HAKATA M, AMANO K, MIYAO A, TOKI N i in. A genome-wide gain-of-function
analysis of rice genes using the FOX-hunting system. Plant Mol Biol 2007; 65: 357–371.
[29] PAPROCKA M, WO£OSZYÑSKA M. Potranskrypcyjne wyciszanie genów u roœlin. Kosmos 2004; 53:
193–200.
[30] ROSS-IBARRA J, MORRELL PL, GAUT BS. Plant domestication, a unique opportunity to identify the
genetic basis of adaptation. Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104(Suppl. 1): 8641–8648.
[31] RYBKA K, MIYAMOTO M, ANDO I, SAITO A, KAWASAKI S. High resolution mapping of the indicaderived rice blast resistance genes II. Pi-ta2 and Pi-ta and a consideration of their origin. Mol Plant
Microbe Interact 1997; 10: 517–524.
[32] SPASIBIONEK S. New mutants of winter rapeseed (Brassica napus L.) with changes in fatty acid
composition. Plant Breeding 2006; 125: 259–267.
[33] SREENIVASULU N, USADEL B, WINTER A, RADCHUK V, SCHOLZ U, STEIN N, WESCHKE W,
STRICKERT M, CLOSE TJ, STITT M, GRANER A, WOBUS U. Barley grain maturation and germination: metabolic pathway and regulatory network commonalities and differences highlighted by new
MapMan/PageMan profiling tools. Plant Physiol 2008; 146: 1738–1758.
[34] SRINIVASASAINAGENDRA V, PAGE GP, MEHTA T, COULIBALY I, LORAINE AE. CressExpress: a
tool for large-scale mining of expression data from Arabidopsis. Plant Physiol 2008; 147: 1004–1016.
[35] SZOPA J, WRÓBEL M. Transfer i regulacja ekspresji genu. Biotechnologia 2001; 1: 63–72.
[36] TILL BJ, ZERR T, COMAI L, HENIKOFF S. A protocol for TILLING and Ecotilling in plants and
animals. Nat Protocols 2006; 1: 2465–2477.
[37] WEIL CF. TILLING in Grass Species. Plant Physiol 2009; 149: 158–164.
[38] WILDER M, THANH-PHUONG N. The Status of Aquaculture in the Mekong Delta Region of Vietnam:
Sustainable Production and Combined Farming Systems. Fisheries Sci 2002; 68(Suppl. 1): 1–5.
[39] ZALE J, AGARWAL S, LOAR S, STEBER C. Evidence for stable transformation of wheat by floral dip
in Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Rep 2009; 28: 903–913.
[40] ZIEMIENOWICZ A, MERKLE T, SCHOUMACHER F, HOHN B, ROSSI L. Import of Agrobacterium
T-DNA into plant nuclei: two distinct functions of VirD2 and VirE2 proteins. Plant Cell 2001; 13: 369–
384.
Redaktor prowadz¹cy – Maria Olszewska
Otrzymano: 18.05. 2009 r.
Przyjêto: 27.07. 2009 r.
Dr Krystyna Rybka,
Zak³ad Biochemii i Fizjologii Roœlin
Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roœlin w Radzikowie
05-870 B³onie
e-mail: [email protected]