Technologie nowej generacji do wysoko wydajnego

Technologie nowej generacji do wysoko wydajnego sekwencjonowania genomu (z ang. highthroughput next generation genome sequencing - HT NGGS), które zostały zastosowane w aparatach
GS-FLX firmy Roche Applied Science oraz 454 Life Sciences (usługi komercyjne) zrewolucjonizowały
możliwości sekwencjonowania DNA. System GS-FLX, oparty na sekwencjonowaniu poprzez syntezę
DNA (pirosekwencjonowaniu) umożliwia uzyskanie pojedynczego odczytu sekwencji o długości 200300 par zasad i wykonywad równocześnie 400.000 odczytów sekwencji, więc w typowej serii danych
uzyskuje się wysokiej jakości odczyt sekwencji na poziomie 100 mln par zasad. W proponowanym
projekcie, technologia ta będzie zastosowana do analizowania rasowo i tkankowo specyficznych
transkryptomów w genomie Bos taurus. W badaniach zaplanowano wykorzystanie trzech ras bydła:
Polski HF, Polska Czerwona i Hereford; oraz tkanek: wątroby. W chwili obecnej ogólnodostępna baza
danych sekwencji genomu Bos taurus oparta jest w głównej mierze na rasie hereford
(http://www.ensembl.org/Bos_taurus/Info/Index).
Planowany eksperyment opiera się na
wykorzystaniu łączonego mRNA (mRNA pools) wyizolowanego z próbek tkanek w oparciu o próbki
pochodzące od młodych buhajów każdej rasy, na różnych etapach rozwoju (6, 9 i 12 miesięcy).
W eksperymencie przewiduje się analizę 3 matryc transkryptomicznych cDNA (rasowo specyficzna).
Transkryptomiczne sekwencjonowanie genomu Bos taurus zostanie przeprowadzone za pomocą
systemu HT NGGS w trzech podstawowych etapach: 1) przygotowanie tkankowo i rasowo
specyficznych, bibliotek shotgun jednoniciowego DNA (sstDNA), transkryptomów Bos taurus,
2) amplifikacja klonalna w emulsji wodno-olejowej (emPCR), cząsteczek jednoniciowych shotgun
sstDNA, 3) pirosekwencjonowanie na płytce PTP (PicoTiterPlate) i zestawianie bazy krótkich
sekwencji (200-300pz) (usługi komercyjne). Rasowo specyficzna analiza transkryptomu, genomu Bos
taurus, przy użyciu systemu HT NGGS pozwoli uzyskad bazę około 400.000 ekspresyjnych sekwencji
(ESTs) wątroby dla każdej z ras (uporządkowanie ich wszlakach metabolicznych). W sumie w czasie
realizacji projektu powstanie baza obejmująca około 1.2 miliona ESTs - tkankowo i rasowo
specyficznych. Wszystkie dane dotyczące rasowo i tkankowo specyficznej transkryptomiki będą
udostępnione w ogólnodostępnej bazie danych GenBanku (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Sequin/).
Duży zestaw danych o tkankowo i rasowo specyficznych transkryptomach ESTs systematycznie
dokumentowany posłuży jako podstawa do dalszej analizy transkryptomicznej genomu Bos taurus
przy użyciu szerokiego wachlarza narzędzi bio-informatycznych. Za pomocą zaawansowanego
oprogramowania, dostarczonego z systemem GS-FLX, przeprowadzone zostanie obszerne
zestawienie de novo genomów polskiego HF i Polskiej Czerwonej obejmujące około 2 Mega pz (2000
000). . Dla rasy hereford, planuje się re-sekwencjonowanie w oparciu o istniejącą sekwencję genomu
Bos taurus i powtórne zestawienie (reasembling) 1 Mega pz. (1000 000) (Btau 4,0http://www.ensembl.org/Bos_taurus/Info/Index).
Ponadto,
uzyskane
wyniki
zostaną
przeanalizowane pod kątem zastosowania w praktyce hodowlanej. Uzyskany, tkankowo i rasowo
specyficzny duży zbiór snipów (polimorfizmów jednonukleotydowych), zostanie przekazany do
publicznej bazy danych NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_batchSearch.cgi?org=9913).
Analiza Blast-n i Blast-x, uzyskanego transkryptomu Bos taurus, będzie przeprowadzona przy użyciu
internetowych
zasobów
dotyczących
genomu
bydła
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=9913,
http://www.ensembl.org/Multi/blastview,). Ponadto, uzyskane wyniki dostarczą danych dla nowego
indeksu genowego dla bydła (http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/cgi-bin/tgi/gimain.pl?gudb=cattle)
oraz nowych adnotacji o ontologii genów (http://www.geneontology.org/GO.annotation.shtml).
Będzie to znaczący wkład do istniejącej wiedzy z zakresu genomiki funkcjonalnej dla gatunku Bos
taurus.
Główny opiekun naukowy:
dr hab. Chandra Shekhar Pareek, prof. UMK
[email protected]
Dodatkowy opiekun naukowy:
prof. dr hab. Bogusław Buszewski
[email protected]