ĆWICZENIE NR 3 BADANIE MIKROBIOLOGICZNEGO UTLENIENIA

ĆWICZENIE NR 3
BADANIE MIKROBIOLOGICZNEGO UTLENIENIA AMONIAKU DO
AZOTYNÓW ZA POMOCĄ BAKTERII NITROSOMONAS sp.
Uwaga: Ze względu na laboratoryjny charakter zajęć oraz kontakt z materiałem biologicznym, studenci
zobowiązani są uŜywać fartuchów i rękawiczek jednorazowych.
Azot jest nieodzownym dla Ŝycia pierwiastkiem. Występując w atmosferze ziemskiej
w postaci dwuatomowej cząsteczki, nie moŜe być wykorzystywany przez organizmy jako
źródło azotu do produkcji białek i kwasów nukleinowych. Źródłem mogą być jedynie
mineralne sole azotu rozpuszczone w wodzie (w postaci jonów NO2¯ , NO3¯ i NH4+).
Do zbiorników wodnych związki azotu dostają się ze źródeł naturalnych (rozkład
materii organicznej, wydaliny) i antropogenicznych (dopływ ze ściekami komunalnymi
i przemysłowymi, spływ z pól nawoŜonych związkami azotu, z depozycji zanieczyszczeń
atmosferycznych). Atomy tego pierwiastka zostają wbudowane w związki chemiczne
wskutek procesów biochemicznych. Dzięki mikroorganizmom następuje rozkład azotowych
związków organicznych (mocznika, białka, kwasu moczowego) do amoniaku i jonów
amonowych (NH4+) w wyniku procesu zwanego amonifikacją.
Amonifikacja mocznika: (NH2)2CO + H2O → 2NH3 + CO2
W procesie zwanym nitryfikacją toksyczne jony amoniowe pod wpływem ściśle
chemolitotroficznych Gram ujemnych bakterii Nitrosomonas sp. ulegają utlenieniu do
znacznie mniej toksycznych azotynów według reakcji:
2NH4+ + 3O2 → 2NO2¯ + 4H+ + 2H2O
Następnie dzięki bakterii Nitrobacter sp. do azotanów według reakcji:
2NO2¯ + O2 → 2NO3¯
Azotany mogą być bezpośrednio wykorzystywane jako źródło azotu przez rośliny, mogą
gromadzić się w glebie (np. złoŜa saletry chilijskiej) lub ulegać rozkładowi przez bakterie
Własność T. Ruman i K. Lecka-Szlachta. Obiekt objęty prawem autorskim. Zakaz
modyfikowania
1
denitryfikacyjne (bakterie wykorzystujące jako ostateczny akceptor wodoru azotany, azotyny
lub podtlenek azotu z wytworzeniem tlenków azotu i azotu cząsteczkowego, uchodzącego do
atmosfery, jako produktów końcowych reakcji). Proces ten nazywa się denitryfikacją lub
oddychaniem azotanowym, który zachodzi w warunkach beztlenowych. Ogólne równanie
denitryfikacji wygląda następująco:
5(CH2O) + 4NO3¯ +4H+ → 5CO2 + 2N2 + 7H2O
Denitryfikatory są to powszechnie występujących w środowisku glebowym bakterie
chemoheterotroficznych z rodzaju Bacillus, Micrococcus, Pseudomonas, Aeromonas i Vibrio.
Oceniając stopień zanieczyszczenia wód związkami azotu naleŜy rozpatrywać ich jakościowe
i ilościowe występowanie. Obecność w wodzie powierzchniowej amoniaku, przy braku
azotynów wskazuje na świeŜe zanieczyszczenia wody ściekami gospodarczymi lub innymi
związkami organicznymi. Jednoczesne występowanie amoniaku i azotynów wskazuje na to,
Ŝe zanieczyszczenie wody nastąpiło jakiś czas temu. Natomiast brak amoniaku
i azotynów przy obecności azotanów wskazuje o dawnym zanieczyszczeniu wody
i zapoczątkowaniu procesów jej samooczyszczania.
Własność T. Ruman i K. Lecka-Szlachta. Obiekt objęty prawem autorskim. Zakaz
modyfikowania
2
1. Przygotowanie biomasy bakterii Nitrosomonas sp. i Nitrobacter sp.
Bakterie Nitrosomonas sp. i Nitrobacter sp. to płynna zawiesina preparatu BIOLEN IN 100
firmy BioArcus.
a) Przygotować poŜywkę hodowlaną zawierającą w 1000ml o pH 7.6:
•
0,306g NH4Cl,
•
0,1g Na2HPO4·12H2O;
•
0,05g MgSO4·7H2O;
•
0,015g CaCl2·2H2O;
•
1,13g NaHCO3;
•
99µg MnCl2·4H2O;
•
6,3µg ZnSO4·7H2O;
•
26,3µg NiSO4·7H2O;
•
2,81µg CoSO4·7H2O;
•
4,99µg CuSO4·5H2O
PoŜywkę zautoklawować w autoklawie automatycznym (temp. 121oC, czas ok. 45min)
b) Do kolby Erlenmayera o pojemności 250 ml wprowadzić 150ml poŜywki oraz roztwór
NH3aq tak aby jego stęŜenie w poŜywce wyniosło 15mM (wprowadzić 88 µl
stęŜonego roztworu NH3aq do 150ml poŜywki)
c)
Do kolb z poŜywką i amoniakiem dodać 20 ml preparatu BIOLEN IN 100.
Do jednej kolby z poŜywką i NH3aq nie dodawać preparatu BIOLEN (próba
kontrolna).
d) Przed inkubacją pobrać 15ml mieszaniny, próbkę odwirować, supernatant zachować do
pomiaru spektrofotometrycznego (jako próba ślepa, punkt IVa)
e) Kolby owinąć folią aluminiową i inkubować w 35oC w łaźni wodnej z wytrząsaniem.
f) Po 24, 48 i 96 godzinach inkubacji pobrać po 15ml zawiesiny hodowlanej, próbki
odwirować (10min, 5500rpm), a supernatant pozostawić do analizy
Własność T. Ruman i K. Lecka-Szlachta. Obiekt objęty prawem autorskim. Zakaz
modyfikowania
3
2. Przygotowanie krzywej wzorcowej
a) Przygotować wzorcowy roztwór azotynu sodu o stęŜeniu 100 µg/ml
b) Do probówek typu falkon o pojemności 15ml sporządzić szereg rozcieńczeń
wzorcowego roztworu NaNO2 (w dwóch powtórzeniach) wg poniŜszej tabeli:
Nr próby
1
2
3
4
5
6
7
NaNO2 (µl)
0
10
30
50
150
250
500
H2 O (ml)
12
11,99
11,97
11,95
11,85
11,75
11,5
Ilość NO2 µg/ml
0
0,5
2,5
5,0
15
25
50
c) Do otrzymanych roztworów dodać 350 µl odczynnika A, i 350µl odczynnika B,
(odczynniki Griessa) dokładnie wymieszać i po 10 minutach oznaczyć wartość
absorbancji przy długości fali przy λ = 545nm w odniesieniu do próbki nie
zawierającej amoniaku. Wykreślić krzywą wzorcową odkładając na osi X stęŜenie
jonów azotynowych w µg/ml, a na osi Y odpowiednie wartości absorbancji. Z krzywej
wzorcowej odczytać stęŜenie jonów NO2- w badanych próbach
.
3. Oznaczanie azotynów
a) Do probówek typu falkon dodać po 12ml otrzymanych supernatantów, następnie do
kaŜdej dodać 350µl odczynnika Griessa A, i 350µl odczynnika Griessa B, wymieszać i
pozostawić na 10min. Te same czynności wykonać dla próbki otrzymanej w punkcie Id,
która będzie tzw. próbą ślepą.
b) Po upływie 10 min odczytać wartość absorbancji prób badanych przy λ = 545nm
4. Opracowanie wyników
a) Wykreślić krzywą wzorcową oznaczając na osi odciętych stęŜenie jonów
azotynowych w µg/ml, na osi rzędnych odpowiadające im wartości absorbancji.
b) Na krzywą wzorcową nanieść uzyskane wyniki, odczytać stęŜenie jonów NO2¯ i
uzasadnić wyniki.
Własność T. Ruman i K. Lecka-Szlachta. Obiekt objęty prawem autorskim. Zakaz
modyfikowania
4
Odczynniki
•
Preparat BIOLEN IN100 (zawiesina bakterii Nitrosomonas sp. i Nitrobacter sp.)
•
PoŜywka hodowlana zawiera w 1000ml:
0,306g NH4Cl, 0,1g Na2HPO4·12H2O; 0,05g MgSO4·7H2O; 0,015g CaCl2·2H2O; 1,13g
NaHCO3;
99µg
MnCl2·4H2O;
6,3µg
ZnSO4·7H2O;
26,3µg
NiSO4·7H2O;
2,81µg
CoSO4·7H2O; 4,99µg CuSO4·5H2O
•
StęŜony roztwór NH3aq
•
NaNO2
•
Odczynnik Griessa:
o
Roztwór A: 0,1% sulfanilamid w H2O
o
Roztwór B: 0,1% dichlorowodorek N-1-naftyloetylenodiaminy w 5% H3PO4
Własność T. Ruman i K. Lecka-Szlachta. Obiekt objęty prawem autorskim. Zakaz
modyfikowania
5