rozpiska - Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej

rozpiska - Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej

Inżynieria genetyczna 2016/17
Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej
Ćwiczenie 8.
Oczyszczanie T-vectora
1. Do mieszaniny reakcyjnej zawierającej wektor (……. μl) dodać wody do uzyskania łącznie
100 μl (100 μl = 1 objętość), następnie dodać 1 objętość mieszaniny fenol : chloroform : alkohol
izoamylowy (50 : 49 : 1).
2. Dokładnie zamknąć probówkę i intensywnie zworteksować lub wytrząsać ręcznie (ok. 30 sek.)
aż do uzyskania mlecznobiałej zawiesiny.
3. Wirować próbkę 13.000 obr./min przez 3 min.
4. Pipetą o pojemności 100 μl ostrożnie pobrać nadsącz – górną warstwę i przenieść go do nowej
probówki.
5. Ponownie oszacować objętość i dodać 2,5 objętości zimnego etanolu 96% oraz 1/20 objętości
3M octanu sodu.
6. Wymieszać delikatnie przez odwracanie probówki i zamrażać -20ºC przez co najmniej 1 godz.
7. Próbkę wirować 13.000 obr./min przez 20 min w 4°C. DNA powinno być widoczne jako
białawy osad na dnie probówki. Ostrożnie, jednym ruchem zlać nadsącz (obserwować, czy nie
zgubiło się osadu!).
8. Osad przemyć 2 objętościami etanolu 70%, zwirować 13.000 obr./min przez 5 min. Jednym
ruchem zlać supernatant (obserwować, czy nie zgubiło się osadu!).
9. Probówki suszyć (odwrócone do góry dnem) w temp. pokojowej przez 10-15 min.
10. Rozpuścić osad w 10 μl buforu TE (Tris/EDTA) (Pełne rozpuszczenie DNA wymaga czasu,
zaleca się wykonanie pomiaru stężenia po 24h od wytrącenia DNA).
Ocena stężenia DNA metodą płytek agarozowych:
Stężenie T-vectora po oczyszczeniu wynosi: ……………………
Stężenie produktu PCR po oczyszczeniu wynosi: ……………………
Przygotowanie płytek z podłożem LB
Skład:
wyciąg drożdżowy
pepton trypton
NaCl
woda
5g
10 g
10 g
do 1000 ml
1. Odważyć odpowiednią ilość powyższych składników pamiętając, że każda z grup powinna
przygotować po 3 szalki (ok. 20 ml podłoża na płytkę).
2. Odpowiednio przygotowaną pożywkę wysterylizować w autoklawie.
Inżynieria genetyczna 2016/17
Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej
3. Po ostudzeniu wysterylizowanej pożywki (dalej musi być płynna), pracując pod komorą
laminarną, dodać do niej odpowiednią ilość roztworu ampicyliny (stężenie wyjściowe
to 50 mg/ml, końcowe powinno wynosić 50 µg/ml), wylać ją do jałowych szalek i pozostawić
do stężenia w lekko uchylonych szalkach.
4. Po zestaleniu rozprowadzić sterylną głaszczką na powierzchni każdej szalki po 40µl 2%
roztworu X-Gal oraz 100 µl 0,1 M IPTG. Zamknięte szalki pozostawić do wyschnięcia.
5. Przygotowane szalki szczelnie zawinąć w folię aluminiową i przechowywać w lodówce.
Ligacja T-vectora i insertu
Stosunek molowy insertu do wektora może wynosić 3-5:1
3
X ng insertu =
1
x
X ng wektora x Y kpz insertu
Z kpz wektora
Skład mieszaniny reakcyjnej:
stężenie początkowe
objętość
-
woda
-
T-vector
…
20 – 100 ng/reakcję
insert
…
/ reakcję
bufor ligazy T4
10 x
1x
DNA ligaza T4
5 U/µl
1 U/reakcję
woda
-
20 µl
Warunki termiczne:
22°C – 1 godz.
70°C – 5 min.
Zagadnienia:
1. Budowa wektorów plazmidowych.
2. Izolacja kwasów nukleinowych.
3. Ligacja, transformacja i analiza rekombinantów.
Literatura:
1. Turner P.C, McLennan A.G, Bates A.D, White M.R.H. Biologia molekularna. Krótkie wykłady.
Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2012.
2. Bednarek I.: Inżynieria genetyczna i terapia genowa. Zagadnienia podstawowe i aspekty praktyczne.
3. Słomski R. Analiza DNA teoria i praktyka. Wydawnictwo Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu,
Poznań 2008.
Materiały dodatkowe:
https://www.addgene.org/plasmid-protocols/dna-ligation/