wpływ niektórych czynników na aktywność enzymów

WPŁYW NIEKTÓRYCH CZYNNIKÓW NA AKTYWNOŚĆ ENZYMÓW
(wpływ pH, temperatury, aktywatorów-jony Cl- na szybkość procesu hydrolizy skrobi przez - amylazę)
Enzymy są to białka proste lub złożone, które katalizują przemiany chemiczne przebiegające w organizmach
żywych.
Enzymy jako białka są wrażliwe na działanie czynników niszczących ich strukturę (wyższa temperatura,
skrajne wartości pH, jony metali ciężkich); odznaczają się one mniejszą lub większą specyficznością
katalizowanych reakcji, wykazują specyficzność grupową (jeden enzym katalizuje pewien typ reakcji, np.
katalizę estrów) lub specyficzność absolutną, np. ureaza katalizuje wyłącznie reakcję hydrolizy mocznika.
CEL PRACY:
Celem ćwiczenia jest poznanie wpływu pH, temperatury i jonów chlorkowych na
aktywność amylazy w procesie hydrolizy skrobi.
ODCZYNNIKI:
1) Przygotowanie roztworu amylazy śliny:
 wodą ogrzaną do ok. 40C przepłukać usta. Pobrać kilkanaście cm3 wody do ust i po kilku
minutach wypluć do zlewki.
 czynność powtórzyć kilkakrotnie, aż do uzyskania wystarczającej ilości roztworu amylazy – ok.
400 cm3.
2) Roztwór amylazy po dializie (zostanie przygotowany w trakcie ćwiczenia)
3) Przygotowanie dializy:
 Do woreczka dializacyjnego wprowadzić 2/3 objętości roztworu amylazy ślinowej.
 Zlewkę napełnić wodą destylowaną i wstawić do niej woreczek tak aby poziom wody w zlewce
był co najmniej równy poziomowi roztworu amylazy w woreczku, całość postawić na mieszadle
magnetycznym i uruchomić mieszadło.
 Dializę prowadzić przez co najmniej przez 1,5 godziny co pół godziny wymieniając wodę
w zlewce.
WYKONANIE ĆWICZENIA:
I. Stopniowy rozkład skrobi przez amylazę:
1. Przygotować 2 szeregi po 10 oznaczonych probówek. Do probówek w I szeregu wlać po 1 cm 3
0,005% roztworu J w KJ, do probówek II szeregu dodać po kilka kropli 0,1 M roztworu NaOH.
Dopiero kiedy dwa szeregi są gotowe do osobnej probówki odmierzyć 5,5 cm3 świeżo
przygotowanego 1% roztworu skrobi i 5,5 cm3 roztworu amylazy śliny.
2. ZARAZ po dokładnym zmieszaniu (od tego momentu powinien być mierzony czas) pobrać do pipety
„hydrolizat” 1 cm3 mieszaniny i przenieść 0,5 cm3 do pierwszej probówki pierwszego szeregu
i 0,5 cm3 do pierwszej probówki drugiego szeregu, probówkę z hydrolizatem wstawić do łaźni wodnej
o temp. 37C
3. W krótkich odstępach czasu (co 30 sek. OD MOMENTU ZAMIESZANIA) do probówek w obu
szeregach wprowadzać próbki hydrolizatu o objętości 0,5 cm3. Obserwować przebieg reakcji barwnej
z jodem.
4. Po wprowadzeniu hydrolizatu w odstępach 30-to sekundowych do wszystkich probówek, do
probówek w II szeregu dodać 2 cm3 roztworu Fehlinga. Probówki II szeregu wstawić do wrzącej łaźni
wodnej. Zanotować spostrzeżenia. Skrobia ulega stopniowej hydrolizie tworząc produkty pośrednie:
amylo- erytro- achro- i maltodekstryny. Zanik zabarwienia z roztworem J w KJ nosi nazwę punktu
achromowego.
II. Wpływ pH:
1.
Przygotować 3 zestawy po 5 probówek. Do każdej probówki odmierzyć 1 cm3 0,005% roztworu
J w KJ.
2.
Przygotować 3 probówki. Do I probówki dodać 2 cm3 buforu uniwersalnego o pH=3,0, do II
probówki dodać 2 cm3 buforu uniwersalnego o pH=6,0, do III probówki dodać 2 cm3 buforu
uniwersalnego o pH=10,0. Do każdej z probówek odmierzyć po 2 cm3 1% roztworu skrobi i 2 cm3
roztworu amylazy śliny.
3.
Zaraz po zmieszaniu składników z I probówki pobrać 0,5 cm3
hydrolizatu i przenieść do pierwszej probówki pierwszego
szeregu (czas T=0`). Czynność powtórzyć dla pozostałych
probówek II i III, przenosząc 0,5 cm3 odpowiednio do
pierwszych próbówek szeregu drugiego i trzeciego.
4.
Probówki I, II i III w których jest hydrolizat w odpowiednim
pH wstawić do łaźni wodnej (temp. 37C)
5.
Po czasie 10 min od czasu zmieszania z I probówki pobrać
kolejne 0,5 cm3 hydrolizatu i przenieść do drugiej probówki
pierwszego szeregu (czas T=10`). Czynność powtórzyć dla
pozostałych probówek II i III, przenosząc 0,5 cm3 odpowiednio
do drugich próbówek szeregu drugiego i trzeciego.
6.
Po czasie 15, 20, 30 minut (od zmieszania) do probówek
w szeregach wprowadzić próbki hydrolizatu o obj. 0,5 cm3.
7.
W przypadku braku zabarwienia roztworu w probówkach
w szeregu trzecim wprowadzić do nich kilka kropli 0,1% HCl.
8.
Odwrotność czasu (1/t) potrzebnego do osiągnięcia punktu
achromowego jest miarą szybkości reakcji. Sporządzić wykres zależności 1/t od wartości pH w
którym doszło do osiągnięcia punktu achromowego i sformułować wniosek o zależności pomiędzy
aktywnością amylazy ślinowej, a pH środowiska reakcji.
III. Wpływ temperatury na aktywność amylazy:
1.
Przygotować 5 probówek
2.
Do I, II, III i IV wprowadzić po 3 cm3 buforu uniwersalnego o pH=6,0 oraz po 3 cm3 1% roztworu
skrobi.
3.
Do I, II i III wprowadzić po 2 cm3 0,005% roztworu J w KJ.
4.
Amylazę ślinową po 3 cm3 wprowadzić do probówek I, II, III, i V. Wszystkie probówki dokładnie
zmieszać.
5.
I probówkę umieścić w zamrażalniku lodówki (temp. 0C), II probówkę pozostawić na stole
laboratoryjnym (temp. pokojowa), III próbówkę umieścić w łaźni wodnej (temp. 37C), a IV i V
umieścić w łaźni wodnej wrzącej.
6.
Po około 2 min. pobytu w łaźni wodnej wrzącej zmieszać zawartości probówek IV i V i całość
inkubować dalej we wrzącej łaźni wodnej.
7.
Wszystkie barwne probówki obserwować, w momencie CAŁKOWITEGO odbarwienia
którejkolwiek z barwnych probówek, wszystkie probówki z każdej z temperatur umieścić w statywie,
probówkę wyciągniętą z łaźni wrzącej należy najpierw ochłodzić pod strumieniem zimnej wody,
a następnie dodać do niej 2 cm3 0,005% roztworu J w KJ.
8.
Na podstawie różnic w zabarwieniu roztworów w poszczególnych probówkach wyciągnąć
i zanotować wniosek o zależności aktywności amylazy ślinowej od temperatury.
IV. Wpływ jonów chlorkowych na aktywność amylazy:
1. Do 4 probówek wlać roztwory odczynników według poniższego wykazu, z tym, że roztwory amylazy
ślinowej, zarówno dializowany jak i niedializowany powinny być dodawane na samym końcu
i jednocześnie przez dwie osoby, żeby różnice czasu dodania enzymu pomiędzy poszczególnymi
komórkami były jak najmniejsze.
Objętość [cm3]
Odczynniki
Pr. 1
Pr. 2
Pr. 3
Pr. 4
woda
1
-
1
-
1% roztwór NaCl
-
1
-
1
1% roztwór skrobi
1
1
1
1
0,5
0,5
0,5
0,5
niedializowany roztwór amylazy
1
1
-
-
dializowany roztwór amylazy
-
-
1
1
0,005% roztwór J w KJ
2.
Wszystkie probówki wstawić do łaźni wodnej o temp. 37C i obserwować kolejność odbarwienia się
roztworów w poszczególnych probówkach. Na podstawie różnic w stężeniach Cl- w poszczególnych
probówkach i kolejności odbarwienia zanotować wniosek o wpływie jonów chlorkowych na
aktywność amylazy ślinowej.
PIŚMIENNICTWO:
1. Kłyszejko-Stefanowicz L.
2. Murray R.K.
„Ćwiczenia z biochemii”
“Biochemia Harpera”
Zagadnienia do przygotowania:
 Budowa skrobi
 Charakterystyka działania amylazy ślinowej
 Mechanizm działania czynników fizycznych i chemicznych na strukturę białek enzymatycznych i
szybkość reakcji chemicznych katalizowanych przez enzymy
 Definicje pojęć: holoenzym, apoenzym, koenzym, grupa prostetyczna, kofaktor, jednostki
aktywności enzymatycznej
 Inhibicja aktywności enzymatycznej – inhibicja odwracalna (kompetycyjna, niekompetycyjna) i
nieodwracalna.
 Mechanizm osmozy i dyfuzji oraz technika dializy, czynniki wpływające na szybkość procesów