Pracownia biochemii

Pracownia biochemii
Wydział Chemii UW
Ćwiczenie: Badanie i oznaczanie aktywności amylazy ślinowej
Przygotowanie roztworu śliny
Usta przepłukać wodą destylowaną, chwilę poczekać i zebrać 2 cm3 śliny do probówki
falcone 15. Zebraną ślinę rozcieńczyć 5-krotnie wodą destylowaną.
1. Stopniowy rozkład skrobi przez amylazę ślinową
Odczynniki: roztwór śliny, 1% roztwór skrobi (o temperaturze 37oC) , 0.0025% roztwór I2 w
KI
Sprzęt: 1 probówka falcone 50, 15 probówek szklanych, statyw na probówki, 3 pipetki
plastikowe, łaźnia wodna, stoper
Do probówki falcone 50 cm3 wprowadzić 1 cm3 roztworu śliny i 9 cm3 wody destylowanej.
Probówkę wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 37oC na parę minut. W tym czasie
przygotować statyw z probówkami szklanymi, do których należy dodać po 1 cm3 roztworu
jodu.
Po osiągnięciu przez roztwór śliny temperatury 37oC, wlać do niego 10 cm3 1% roztworu
skrobi inkubowanego w tej samej temperaturze, zamieszać, pobrać pipetką plastikową 1 cm3
mieszaniny i dodać do pierwszej probówki z jodem.
Mieszaninę reakcyjną (skrobia + ślina) inkubować w łaźni w temperaturze 37oC. Co 30 sek.
pobierać po 1 cm3 hydrolizatu i dodawać do kolejnej probówki z jodem. Jeśli barwa w trzech
pierwszych probówkach nie wykazuje wyraźnej zmiany, hydrolizat pobierać co minutę.
2. Określenie optymalnego pH dla aktywności amylazy
Odczynniki: roztwór śliny, 1% roztwór skrobi (o temperaturze 37oC), 0.0025% roztwór I2 w
KI, bufor cytrynianowo - fosforanowy o pH 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5
Sprzęt: 3 probówki falcone 50 cm3 , 3 x 20 probówek szklanych, 3 statywy na probówki,
3 pipetki plastikowe, łaźnia wodna, stoper
Do trzech probówek falcone 50 cm3 dodać po 1 cm3 roztworu śliny i 9 cm3 buforów o trzech
różnych wartościach pH wskazanych przez prowadzącego ćwiczenie. Probówki inkubować w
temperaturze 37oC przez parę minut (w tym czasie przygotować probówki zawierające po
1cm3 roztworu jodu) a następnie dodać do nich po 10 cm3 roztworu skrobi o tej samej
temperaturze. Włączyć stoper. Pobierać co 2 minuty kolejno po 1 cm3 hydrolizatu z
mieszanin o różnym pH i dodawać je do probówek z jodem. W przypadku braku widocznej
zmiany lub zbyt szybkiej zmiany barwy we wszystkich trzech szeregach probówek
skorygować odstęp czasu, w którym pobierany jest hydrolizat.
3. Określenie optymalnej temperatury dla aktywności amylazy
Odczynniki: roztwór śliny, 1% roztwór skrobi (o temperaturze 20oC, 37oC i 45oC), 0.0025%
roztwór I2 w KI
Sprzęt: 3 probówki falcone 50 cm3 , 3 x 20 probówek szklanych, 3 statywy na probówki, 3
pipetki plastikowe, łaźnia o temperaturze 20, 37 i 45oC, stoper
Do trzech probówek falcone 50 cm3 dodać po 1 cm3 roztworu śliny i 9 cm3 wody
destylowanej. Probówki inkubować w trzech różnych temperaturach przez parę minut (w tym
czasie przygotować probówki zawierające po 1cm3 roztworu jodu) a następnie dodać do nich
po 10 cm3 roztworu skrobi o tej samej temperaturze. Włączyć stoper. Pobierać co 1 minutę
kolejno po 1 cm3 hydrolizatu z mieszanin o różnych temperaturach i dodawać je do probówek
z jodem. W przypadku braku widocznej zmiany lub zbyt szybkiej zmiany barwy we
wszystkich trzech szeregach probówek skorygować odstęp czasu, w którym pobierany jest
hydrolizat.
4. Oznaczenie aktywności amylazy ślinowej metodą Wohlgemuta
Odczynniki: roztwór śliny, 0.1% roztwór skrobi, 0.25% roztwór I2 w KI, bufor cytrynianowo fosforanowy o pH wyznaczonym w punkcie 2
Sprzęt: 1 probówka falcone 15 cm3, 10 probówek szklanych, statyw na probówki, pipetka
szklana, łaźnia wodna o temperaturze wyznaczonej w punkcie 3
Przygotowanie roztworu śliny: usta przepłukać wodą destylowaną, chwilę poczekać i zebrać
1-2 cm3 śliny do probówki falcone 15 cm3. Zebraną ślinę rozcieńczyć 5-krotnie buforem o
odpowiednim pH..
Przygotować w statywie 10 probówek i oznakować je numerami od 1 do 10. Do probówki #1
dodać 4 cm3 przygotowanego roztworu śliny. Do pozostałych dziewięciu probówek dodać po
2 cm3 buforu. Następnie przygotować serię rozcieńczeń roztworu śliny pobierając z probówki
#1 2 cm3 roztworu i przenosząc go do probówki #2, z której, po dokładnym (ale delikatnym!)
wymieszaniu, pobieramy 2 cm3 roztworu i przenosimy do kolejnej probówki. Procedurę
powtórzyć do probówki #10, z której pobrane 2 cm3 roztworu wylewamy. Probówki
inkubować w temperaturze wyznaczonej w punkcie 3 przez parę minut a następnie dodać do
każdej z nich po 2 cm3 0.1% roztworu skrobi, wymieszać i pozostawić w tej samej
temperaturze na 30 minut. Po tym czasie do każdej probówki dodać po kropli 0.25% roztworu
jodu i obserwować zmianę barwy.
Opis ćwiczenia powinien zawierać:
1. omówienie wykonywanych eksperymentów według następującego schematu:
2.
•
zasada, na której opiera się wykonanie
•
obserwacje
•
wnioski
obliczenie aktywności amylazy. W stosowanej metodzie za jednostkę aktywności
przyjmuje się taką ilość amylazy, która w czasie 30 minut rozkłada do stadium
achrodekstryn (nie dające już zabarwienia z jodem) 1 mg skrobi. Wynik podać w cm3
0.1% roztworu skrobi rozłożonej w czasie 30 minut przez 1 cm3 śliny.