zborník - Katedra fyziologie zivocichov

Komentarze

Transkrypt

zborník - Katedra fyziologie zivocichov
SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA
UNIVERZITA V NITRE
FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA
KATEDRA FYZIOLÓGIE ŽIVOČÍCHOV
VII. CELOSLOVENSKÝ SEMINÁR
Z FYZIOLÓGIE ŽIVOČÍCHOV
23. - 24. mája 2007,
Topolčianky, Nitra - Slovenská republika
SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA
UNIVERZITA V NITRE
FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE
A POTRAVINÁRSTVA
KATEDRA FYZIOLÓGIE ŽIVOČÍCHOV
ZBORNÍK
z vedeckého seminára s medzinárodnou účasťou
VII. CELOSLOVENSKÝ SEMINÁR
Z FYZIOLÓGIE ŽIVOČÍCHOV
23.-24. mája 2007
Topolčianky, Nitra, Slovenská republika
Redakčná rada:
Ing. Adriana Kolesárová, PhD
doc. MVDr. Peter Massányi,PhD.
doc. Ing. Norbert Lukáč, PhD.
Schválil rektor Slovenskej poľnohospodárskej univerzity v Nitre dňa 7.5.2007 ako
zborník za vedeckého seminára s medzinárodnou účasťou
ISBN 978-80-8069-886-7
Vedecký výbor:
prof. Ing. Jozef Bulla, DrSc.
Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre SR
prof. MVDr.László Bárdos, Ph.D.
Szent István University, Budapest, Hungary
doc. MVDr. Viera Cigánková, PhD.
Univerzita veterinárneho lekárstva, Košice, SR
prof. MVDr., Ing. Pavel Jelínek, DrSc.
Mendělevova univerzita poľnohospodárstva a lesníctva v Brne, Česká republika
prof. Ing. Jaroslav Kováčik, Ph.D.
Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre SR
prof. MVDr. Imrich Maraček, DrSc.
Univerzita veterinárneho lekárstva, Košice, SR
prof. MVDr. Juraj Pivko, DrSc.
Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre SR
Dr. Robert Stawarz, Ph.D.
Pedagogical University, Krakow, Poland
doc. Ing. Miroslav Valent, Ph.D.
West Virginia University, Morgantown, USA
prof. dr. hab. Wladyslaw Zamachowski, Ph.D.
Pedagogical University, Krakow, Poland
prof. RNDr. Michal Zeman, DrSc.
Univerzita Komenského, Bratislava, SR
Organizačný výbor:
prof. Ing. Jaroslav Kováčik, PhD.
doc. MVDr. Peter Massányi, PhD.
Ing. Adriana Kolesárová, PhD.
doc. Ing. Norbert Lukáč, PhD.
Ing. Marcela Capcarová, PhD.
Ing. Anna Kalafová.
Ing. Jiřina Kročková
Ing. Monika Schneidgenová
Ing. Peter Čupka
Alena Balážová
Viera Bösel
Recenzenti:
prof. Ing. Jaroslav Kováčik, PhD.
prof. MVDr. Juraj Pivko, DrSc.
doc. MVDr. Peter Massányi, PhD.
Dr. Robert Stawarz, PhD.
Dr. Grzegorz Formicki, PhD.
RNDr. Janka Drábeková, PhD.
Ing. Miroslav Juráček, PhD.
VPLYV HYPODYNAMIE NA OBLIČKY JAPONSKÝCH PREPELÍC (COTURNIX
COTURNIX JAPONICA)
EFFECT OF HYPODYNAMY ON THE KIDNEYS OF JAPANESE QUAILS (COTURNIX
COTURNIX JAPONICA)
Almášiová, V., Cigánková, V., Holovská, K., Zibrín, M.
Katedra anatómie, histológie a fyziológie, Univerzita veterinárskeho lekárstva Košice
Abstract
The aim of present study was to observe the influence of simulated weightlessness on the
structure and ultrastructure of kidneys of Japanese quails reared under the conditions of
experimental long-term hypodynamy. Hypodynamy is a method to simulate weightlessness in
the earth laboratory conditions. Two days after hatching the quails were suspended in special
shirts below the ceiling of a cage so their feet did not touch the floor. They could consume
food and water ad libitum. Experimental animals were sacrificed after 7, 14, 21, 28, 35, 42,
49, 56, and 63 d of hypodynamy. Animals of the same age, hatched at the same time, and fed
the same diet were used as controls. The samples of kidney were fixed and routinely
processed for light (LM) and transmission electron microscopy (TEM). It has been found that
at short-term hypodynamy (7–21 days) there is not a more pronounced damage of the kidney
structure. Due to long-term hypodynamy (28–63 days) there are some morphological changes
in the proximal and distal tubular cells as well as in collecting ducts. However, the structure
of renal corpuscles was not damaged.
Key words: microgravity, kidney, morphology, Japanese quails
Úvod
Pokroky v kozmickom výskume a pravdepodobnosť budúcich dlhotrvajúcich pobytov
v kozme vyvolávajú záujem o ich účinky na človeka a zvieratá. Kozmické experimenty sú
náročné a drahé, preto sa častejšie využívajú modelové pokusy. Jednou z metód imitujúcich
stav beztiaže na Zemi v laboratórnych podmienkach je hypodynamia [15]. U vtákov sa
používajú špeciálne košieľky zo sieťoviny, pomocou ktorých sú zvieratá zavesené na strope
klietky tak, aby sa nemohli dotýkať podlahy, avšak aby mohli prijímať krmivo a vodu ad
libitum [7]. Veľmi vhodným aviárnym biologickým objektom na študovanie vplyvu
hypodynamie je Japonská prepelica. Je to vták s nízkou hmotnosťou tela, vysokou
produkčnou a reprodukčnou schopnosťou, krátkym individuálnym vývojom, dobrou
toleranciou na stiesnené podmienky a adaptabilitou na mikrogravitáciu [8, 17]. Zároveň má
slúžiť ako nevyhnutný heterotrofný článok v uzavretom umelom ekosystéme kozmických lodí
5
na zabezpečenie produkcie živočíšnych bielkovín pre kozmonautov a vytvoriť psychologicky
príjemnejšie prostredie pri dlhodobých pobytoch v kozme [1].
Materiál a metodika
Experimenty boli robené na Ústave biochémie a genetiky živočíchov SAV v Ivanke pri
Dunaji. Kurčatá japonských prepelíc oboch pohlaví neselektovanej línie na hypodynamiu dva
dni po vyliahnutí boli premiestnené do špeciálnych klietok a zavesené do košieľok zo
sieťoviny tak, aby sa nemohli dotýkať podlahy, avšak aby mohli prijímať krmivo a vodu ad
libitum. Prepelice toho istého veku a rovnako kŕmené slúžili ako kontrolné. Hneď po usmrtení
zvierat sme odobrali excízy z obličiek pokusných a kontrolných prepelíc na 7., 14., 21., 28.
35., 42., 49., 56. a 63. deň pokusu.
Tkanivo sme spracovali na svetelnú (SM) a transmisnú elektrónovú mikroskopiu
(TEM). Vzorky na SM sme spracovali rutinnou metódou fixáciou vo formaldehyde a zaliatím
do parafínu. Excízy na TEM sme fixovali v 3% glutaraldehyde v kakodylátovom pufri,
postfixovali 1% OsO4, odvodnili v acetóne a zaliali do Durcupanu. Ultratenké rezy
kontrastované uranylaceátom a citrátom olovnatým sme pozorovali a fotografovali TEM
Tesla BS 500. Histologické preparáty ofarbené H-E a polotenké rezy ofarbené toluidínovou
modrou sme pozorovali svetelným mikroskopom Jenamed.
Výsledky
Pri krátkodobej (7 až 21 dňovej) hypodynamii nedochádza k výraznejšiemu poškodeniu
štruktúry obličiek. Ich mikroskopický a submikroskopický obraz je v podstate rovnaký ako
u kontrolných prepelíc.
SM sme v kôrovej časti lalôčikov pozorovali početné obličkové telieska nepravidelného
tvaru a v dreni lalôčikov väčšie, menej početné okrúhle obličkové telieska. TEM sme
v kortikálnych aj medulárnych obličkových telieskach pozorovali glomeruly na povrchu
ktorých boli podocyty. Tieto bunky mali veľké oválne jadro a obsahovali pomerne málo
cytoplazmatických organel. Ich výbežky trabekuly a menšie pedikuly medzi ktorými sa
nachádzali štrbinky neboli porušené. Bazálna membrána bola tenká a súvislá. Fenestrované
krvné kapiláry, ktoré sú súčasťou filtračno-štrbinovej membrány nejavili nijaké známky
poškodenia ich štruktúry.
Kanáliky proximálneho segmentu, v ktorých prebieha tubulárna rezorpcia predstavujú
najdlhšie úseky močového kanálika. Tvorili ich bunky cylindrického tvaru, ktoré v SM mali
výrazne acidofilnú cytoplazmu a na apikálnom povrchu mali súvislý kefkovitý lem. Kanáliky
6
mali nepravidelný štrbinovitý lúmen a bočné hranice buniek boli málo zreteľné. Obsahovali
typické tyčinkovité mitochondrie, ktoré bunkám dávali jemne prúžkovaný vzhľad. V TEM
mali stredne elektróndenznú cytoplazmu a okrúhle jadro s difúzne rozptýleným chromatínom
a výrazným jadierkom sa nachádzalo v bazálnej časti bunky. V cytoplazme obsahovali
početné veľké mitochondrie pretiahleho tvaru s mitochondriovými kristami, ktoré boli
orientované kolmo na bazálnu membránu. Bazálna membrána vytvárala početné invaginácie,
ktoré zväčšujú jej povrch a sú dôležité pri zahusťovaní moču. Golgiho komplex
tvorený cisternami a váčikmi bol uložený supranukleárne. V cytoplazme sa nachádzali aj
cisterny granulovaného endoplazmatického retikula a lyzozómy. Na apikálnom povrchu
buniek bolo veľké množstvo vysokých tenkých, paralelne usporiadaných mikroklkov. Početné
pinocytárne váčiky, ktoré boli prítomné v cytoplazme svedčia o veľkej endocytóznej aktivite
týchto buniek.
Kanáliky distálneho segmentu tvorili bunky kubického tvaru. Lúmen distálnych
kanálikov bol oproti lúmenu proximálnych kanálikov väčší. V SM mali bunky distálneho
segmentu stredne acidofilnú cytoplazmu a na ich apikálnom povrchu sa nachádzali iba
ojedinelé mikroklky. Mitochondrie usporiadané do stĺpcov podmieňujú pásikovaný vzhľad
bazálnej časti týchto buniek. Hranice medzi bunkami boli zretelnejšie ako v proximálnom
kanáliku. V TEM mali bunky stredne elektróndenznú cytoplazmu, jadro okrúhleho tvaru
s difúzne rozptýleným chromatínom a výrazným jadierkom sa nachádzalo uložené v apikálnej
časti bunky. Typické boli aj dlhé tyčinkovité mitochondrie a bunková membrána, ktorá
v bazálnej časti buniek vytvárala početné hlboké invaginácie. O nižšej aktivite endocytózy
týchto buniek svedčí aj prítomnosť ojedinelých pinocytárnych vezikúl a lyzozómov.
Henleova slučka spája proximálny a distálny stočený kanálik a jej dĺžka sa líši podľa
typu nefrónu. Kôrové nefróny majú iba krátky kanálik vystlaný jednou vrstvou plochých
buniek, kým dreňové nefróny majú dlhú Henleovu slučku pokračujúcu smerom do drene
lalôčika a vracajúcu sa opäť do kôry lalôčika. Preto sa nazýva častejšie medulárnou slučkou a
je zložená z tenkého a hrubého segmentu. Intermediárne nefróny majú medulárnu slučku
krátku. Bunky tenkého segmentu boli dlaždicovitého tvaru a mali okrúhle alebo oválne
centrálne uložené jadro. Na apikálnej časti buniek sa nachádzali ojedinelé krátke nepravidelné
mikroklky. V cytoplazme boli roztrúsené malé mitochondrie, granulované endoplazmatické
retikulum a voľné ribozómy. Bazálna membrána netvorila interdigitáciíe a prstovité výbežky.
Bunky hrubého segmentu mali podobnú štruktúru, len boli tvorené vyššími bunkami.
7
Distálny kanálik ústi do zberacích kanálikov ktoré prebiehajú medzi jednotlivými
lalôčikami, vytvárajú medulárny konus a ústia do močovodu. V SM boli bunky zberacích
kanálikov svetloružovo sfarbené, výrazne ohraničené a kupolovite vyčnievali do lúmenu.
V TEM sme pozorovali, že stenu zberacích kanálikov tvorili dva typy buniek, svetlé a tmavé.
Svetlé viacpočetné bunky kubického tvaru mali pomerne veľké centrálne uložené jadro
a v cytoplazme obsahovali málo cytoplazmatických organel. Pomerne malé mitochondrie boli
orientované rôznym smerom a bazálna membrána nevytvárala záhyby. Na apikálnom povrchu
sa nachádzali len ojedinelé malé mikroklky. Tmavé ojedinelé bunky obsahovali viac
mitochondrií a vezikúl a na povrchu mali vyššie mikroklky.
V obličkách prepelíc pri dlhodobej (28 až 63 dňovej) hypodynamii sme SM
nepozorovali výraznejšie morfologické zmeny. Avšak TEM sme zistili nasledovné zmeny: V
proximálnych kanálikoch sa nachádzali dva typy buniek. Svetlé bunky s elektrónlucentnou
cytoplazmou a tmavé bunky s elektróndenznou cytoplazmou. Svetlé bunky mali okrúhle jadro
s difúzne rozptýleným chromatínom a v cytoplazme obsahovali početné mitochondrie
oválneho tvaru s mitochondriovými kristami. V niektorých bunkách sa nachádzali mierne
dilatované mitochondrie a početné svetlé vakuoly s obsahom vločkovitého materiálu. Na
apikálnom povrchu boli mikroklky bez výraznejších známok poškodenia. Tmavé bunky mali
elektróndenznú cytoplazmu a obsahovali dlhé tyčinkovité mitochondrie s tenkými kristami
a menšie vakuoly. Mali výrazne tmavé scvrknuté jadro. Mikroklky na apikálnom povrchu
týchto buniek boli tmavé so zastretou štruktúrou. Niektoré mikroklky vytvárali závitnicové
štruktúry. V obličkách pokusných zvierat na 63. deň hypodynamie niektoré proximálne
kanáliky obsahovali len tmavé bunky. U pokusných prepelíc sa v cytoplazme apikálnej časti
buniek distálneho kanálika nachádzal vločkovitý materiál. Na 42. až 63. deň hypodynamie
sme v cytoplazme zberacích kanálikov pozorovali veľké svetlé vakuoly, ostatné organely
nejavili známky poškodenia.
Diskusia
Renálne funkcie, ako metabolizmus vody a solí sú v podmienkach mikrogravitácie
extrémne zaťažené, pretože telové tekutiny lokalizované v nižších oblastiach tela sa presúvajú
smerom ku hlave a do hrudnej oblasti „blood shift“[14, 15]. Je zvláštne, že počas skorých fáz
simulovaných experimentov napríklad u „bed rest“ a „water immersion“ bola zaznamenaná
zvýšená diuréza [2, 15, 18], ale v priebehu reálnych letov do kozmu bola diuréza naopak
znížená [6, 12, 13, 14]. Vysvetlením môže byť skutočnosť, že na organizmus pri kozmickom
lete významne vplýva stres a ten aktiváciou sympatika zapríčiní zvýšenie hladín
8
glukokortikoidov a katecholamínov, ktoré sekundárne cestou konstrikcie obličkových ciev
znížia diurézu [6].
Kostra a svalstvo, ktoré zabezpečujú podpornú funkciu organizmu, reagujú na
mikrogravitáciu atrofiou svalstva končatín a osteoporózou [21, 22]. U ľudí, ktorí absolvovali
pobyt v kozme, sa v dôsledku zvýšenej rezorbcie kostného tkaniva zistilo aj riziko tvorby
močových kameňov. K ich tvorbe významne prispieva saturácia moča soľami Ca
(hyperkalciúria), pokles obsahu citrátov v moči, redukcia objemu a zmena pH moča [19, 20].
Pri dlhodobých kozmických letoch ako aj pri dlhotrvajúcich modelových pokusoch nastávajú
zmeny vodno- elektrolytovej rovnováhy, exkrécia Na a diuréza klesá, naopak exkrécia Ca
a produkcia ADH a hormónov zahrnutých v RAAS (renín-angiotenzín-aldosterón-systém)
stúpa [12].
Viacerí autori zistili morfologické zmeny v dôsledku mikrogravitácie v kozme a
hypodynamie na Zemi aj v obličkách potkanov. Počas kozmického letu sa ich obličky, ale aj
pľúca, srdce a nadobličky značne zväčšili [10, 11]. Už po 1 hodine po zavesení potkanov za
chvost došlo medzi proximálnymi kanálikmi k rozšíreniu intersticiálnych priestorov [16].
Štruktúru a ultraštruktúru obličiek dospelých japonských prepelíc, ktoré boli 7 dní
v kozme študovali Cigánková a kol. a Kočišová a kol. [3, 9]. Prepelice rovnakého veku
odchované v laboratóriu slúžili ako kontrola. Autori zistili, že krátkodobá mikrogravitácia
nemá nepriaznivý dôsledok na štruktúru, ani funkciu obličiek [3, 9].
Cigánková a kol. [4, 5] zistili morfologické zmeny aj v nadobličkách japonských
prepelíc, ktoré sa vyliahli na orbitálnej stanici MIR. Zmeny mali podobný charakter aký je
známy pri strese. Svedčí to o tom, že už aj krátkodobý pobyt v kozme má nepriaznivý vplyv
na organizmus kurčiat japonských prepelíc. Zistené zmeny sú autormi považované za
reverzibilné [6, 15]. Mikrogravitácia v kozme a hypodynamia na Zemi zapríčinila zvýšenie
koncentácie katecholamínov a kortikosteroidov v krvnej plazme japonských prepelíc, naopak
koncentrácia estradiolu v krvnej plazme prudko klesla [6, 8].
Záver
Z našich pozorovaní môžeme usúdiť, že krátkodobá (7 až 21 dňová) hypodynamia
nespôsobuje v obličkách japonských prepelíc výraznejšie morfologické zmeny. Vplyvom
dlhodobej (28 až 63 dňovej) hypodynamie vznikajú morfologické zmeny v bunkách
proximálnych a distálnych kanálikov ako aj v bunkách zberacích kanálikov. Štruktúra
obličkových teliesok nebola poškodená. Zmeny pokladáme za reverzibilné a pripisujeme ich
9
skôr regulačnému pôsobeniu obličiek v rámci adaptácie na hypodynamiu ako poruchám
funkcie nefrónov. Pokusy dokázali, že japonské prepelice žijúce v nepriaznivých
podmienkach hypodynamie rástli, vyvíjali sa a dosiahli produkčný vek.
Práca bola finančne podporená Grantovou agentúrou VEGA 1/3495/06
Literatúra
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
Boďa K.: Kozmická biológia. Gravitačná fyziológia. Vydavateľstvo SAV, Košice, 1984, s. 9-22.
Baisch F.J.: Head down tilt combined with breathing assistance by the „Iron lung“. A new simulation
model for cardiovascular deconditioning, skin and kidney function in weightlessness. J. Gravit. Physiol.
2002, 9,1, 67-68.
Cigánková V., Kočišová J., Boďa K., Tomajková E., Dadasheva O. A.: Morphological changes in tissue
of the testes and kidneys in Japanese quail exposed to microgravity. Acta Vet., Brno, 1993, 62, 69-71.
Cigánková V., Lenhardt Ľ., Zibrín M., Kočišová J., Tomajková E., Komorová T., Sabo V., Boďa K.,
Dadasheva O.A., Guryeva T.S.: Histological changes in the adrenal glands of newly hatched Japanese
quail chicks during a short stay on the orbital station Mir. Folia Veter., 2001, 45, 1, Suppl., 36-40.
Cigánková V., Zibrín M., Kočišová J., Tomajková E., Sabo V., Boďa K., Dadasheva, O.A., Guryeva,
T.S.: Morphological changes in the adrenals of Japanese quail chickens hatched out in microgravity.
Aviakosm. Ekolog. Med., 2002, 36, 5, 29-32.
Christensen N.J., Drummer C., Norsk P.: Renal and sympathorenal responses in space. Am. J. Kidney
Dis. 2001, 38, 3, 679-683.
Juráni M.., Výboh P., Lamošová D., Barošková Ž., Somogyiová E., Boďa K., Gažo M.: The effect of a
90- day hypodynamy on the neurohumoral system, egg laying and metabolism of proteins in Japanese
quail. Physiologist 1983, 26, 6, 145-148.
Juráni M., Boďa K., Výboh P., Zeman M., Lamošová D., Somogyová E., Košťál Ľ., Baumgartner J.:
An endocrine response to short-term hypodynamy in Japanese quail selected for resistance to
hypodynamy. Physiologist, 1991, 34, 129-131.
Kočišová J., Cigánková V., Marcaník J., Boďa K., Tomajková E., Dadasheva O.A., Sabo V.:
Ultrastructural and histochemical changes in tissues of Japanese quails exposed to 7- days microgravity.
In: Current Trends in Cosmic Biology and Medicine, (Eds.) Boďa, Baranov, Slovak Academy of
Science, Ivanka pri Dunaji, 1991, pp.201-208.
Miyake M., Yamasaki M., Hazama A., Nielsen S., Shimizu T.: Effect of microgravity on organ
development of the neonatal rat. Biol. Sci. Space 2004, 18, 3, 126-127.
Miyake M., Yamasaki M., Hazama A., Nielsen S., Shimizu T.: Effect of microgravity on organ
development of the neonatal rat. Biol. Sci. Space 2004, 18, 3, 126-127.
Morukov B.V., Noskov V.B., Larina I.M., Natochin I.V.: The water-salt balance and renal function in
space flights and in model experiments. Ross. Fiziol. Zh. Sechenova 2003, 89, 3, 356-367.
Norsk P., Christensen N.J., Bie P., Gabrielsen A., Heer M., Drummer C.: Unexpected renal responses in
space 2000, Lancet. 356, 1577-1578.
Norsk P.: Cardiovascular and fluid volume control in humans in space. 2005, Curr. Pharm. Biotechnol.,
6, 4, 325-330.
Planel H.: Space and Life. An Introduction to Space Biology and Medicine. Gravity and Weightlessness
CRC Press, Boca Raton-London-New York-Washington, D.C., 2004, p. 27-34.
Pettis C.R., Drake M., Witten M.L., Truitt J., Braun E., Lindberg K., McNeil G., Hall J.N.: Early renal
changes in 45 degrees HDT rats. Acta Astronaut. 2002, 50, 6, 393-398.
Škrobánek P., Hrbatá M., Baranovská M., Juráni M.: Growth of Japanese quail chicks in simulated
weightlessness. Acta Vet. (Brno), 2004, 73, 157-164.
Wang T.J., Wade C. E : Renal function of rats in response to 37 days of HDT. J. Gravit. Physiol. 2001,
8, 2, 85-89.
Whitson P.A., Pietrzyk R.A., Morukov B.V., Sams C.F.: The risk of renal stone formation during and
after long duration space flight. Nephron 2001, 89, 3, 264-270.
Zerwekh J.E.: Nutrition and renal stone disease in space. Nutrition 2002, 18, 10, 857-863.
Zibrín M., Cigánková V., Kočišová J., Tomajková E., Komorová T., Lenhardt Ľ., Sabo V., Boďa K.,
Dadasheva O.A., Guryeva T.A.: The structure of some tissues and organs of Japanese quail hatched on
the orbital space station “Mir”. Folia Vet., 2001, 45, Suppl., 17-22.
Zibrín M., Boďa K., Cigánková V., Kočišová J., Tomajková E., Komorová T., Sabo V., Pivko J.: Long
– term experimental hypodynamy affects the structure of spongy bone and osteoclasts in Japanese quail.
Acta Vet. (Brno), 2003, 72, 143-149.
10
Viera Almášiová, MVDr., Univerzita veterinárskeho lekárstva, Ústav histológie a embryológie,
Komenského 73, 041 81 Košice,
e-mail: [email protected]
THE EFFECT OF INCLUDING FABA BEAN IN THE DIET AND HEN’S AGE ON
EGGS ALBUMIN QUALITY
AL-Sardary Sardar Y. T. - Abas. Kamaran Abduljalil
Animal Department, Agricultural College, Salahaddin University- Iraq
Abstract
The aim of this experiment was to study the influence of field beans (FB) and also birds’
age on some albumin parameters of commercial layers. Seven different experimental diets
(Raw Faba Beans “RFB” 10%, 20% and 30% compared with Roasted Faba Beans “RoFB”
10%, 20% and 30%) and both groups compared with commercial layers’ diet labeled control
(C). The experiment was performed in a seven group laying test with 3 replicates, with a total
number of 630 birds aged 43 weeks. The control group and six trial groups were enclosed in 3
floor caged batteries. To test the effect of the birds’ age on the albumin quality, 28 days
during the experiment period (P) were observed. For the feeding we used a feed mixture of
wheat, barley, soybean meal, RFB or RoFB, vegetable fat with an addition of minerals,
vitamins and enzymes. The influence of the diet and ages on Haugh Unit (HU), Albumin
Index (AI) and Albumin Percentage (AP) were studied. HU increased significantly with
including RFB and RoFB in the diet compared with C. And the values were increased linear
with increasing RoFB levels. AI also increased generally, and the values were significant at
the level of 10% and 20% for both RFB and RoFB groups compared with C. But was
insignificant at the level of 30% for both RFB and RoFB groups. HU decreased with the
increasing of the bird’s age but AI and AP increased significantly by advanced ages of the
bird.
Key words: vicia faba, Layers, Haugh Unit, Albumin Index, Albumin Percentage.
Introduction
The use of legumes as sources of protein for the animal feed industry is expected to
increase further in the near future. Rising incomes in the Asian region are increasing the
demand for meat products, and hence the requirement for animal feeds. There have been
changes in public perception and some unfortunate developments, such as the consequences
of ‘mad cow’ disease (i.e. bovine spongiform encephalopathy or BSE) in UK. This has
resulted in many poultry feed industries either choosing to, or being banned from, using
11
animal by-products as a source of protein (Farrell, 1997). Single source of plant protein is not
comfortable to provide the exact amino acids required for all animals. It is, therefore,
preferable to include a range of protein sources in diet formulations, each complementing the
other (Hanburya, 2000).
The feeding value of the egg and marketing interest depending on the inner egg quality,
which are the physical characteristics like Haugh Unit, Albumin index and Yolk index (Card
and Nesheim,1971).
Eggs inner composition affected by the food, birds’ age, strain, seasons and storage
(Panda,1998).
Prochaska et al (1996) observed a significant increase in albumin weight by increasing
lysine content of layers diet. Silversides and Scott (2001) pointed out that the diet dos not
affected the HU values. But Mateos and Puchal (1982) found that including faba bean in the
diet increased significantly (p ≤ 0.05) the HU value. In addition the HU value increased with
increasing of faba bean content in layers diet. Mateos and Puchal (1982) and Robblee et al
(1977) pointed out significant results by consuming diets containing 10%, 20% and 30% of
RFB, and HU increased progressively. Also Campbll et al (1980) found an increase in HU in
groups consumed diet with 25.5% RFB compared with control. And Mateos and Puchal
(1982) observed a significant increase in HU in groups consumed diets containing 55% RFB.
But in other experiment Mateos and Puchal (1982) observed that diets containing 4%, 8%
and12% RFB has not affected HU value.
In general HU value will decrease by increasing birds age ( Austic and Nesheim,1990:
Solomn,1997: Lapao et al, 1999: Tharrington, 1999). While AI value increase with advanced
ages of the bird.
Silversides (1994) demonstrated that total albumin content in the egg increase with the
advanced ages of the bird But not significant (Lee and Garlich, 1992: Hussein et al,1993).
And the AP decreased significantly (Anderson et al, 1978: Fletcher et al, 1981and 1983: Haq
et al,1996: Silversides and Scott, 2001). While Rossi and Pompei (1995) and Al-haweizy
(2002) observed a significant increase in AP with increasing birds age.
Materials and methods
The experiment was carried out within the Erbil poultry project, and the laboratory
analysis in the nutrition laboratory of the Agriculture College of the University of Salahaddin.
The study comprised the determination of the effects of using 10%, 20% and 30% of RFB and
the same levels of RoFB compared with the control group, and the effect of the birds age,
12
with commercial Hy-Line®W98 layers, on Haugh Unit (HU), Albumin index (AI) and
Albumin Percentage (AP) were studied.
630 hens aged 43 weeks were used. The birds were housed in automatic controlled
housings in 3 floor caged batteries (45×40×45 cm) for each cage. And they were distributed
randomly into seven groups, each group comprised 90 birds distributed in 18 cages (3
replications × 6 cages × 5 birds) where feed with different feed mixtures as illustrated in
(table 1). The experiment period was 140 days.
Diets were fed to birds ad libitum, and at the end of the week remaining diets were
collected and weighed to determine the daily feed consumption for each replication. The daily
light period was 17 hours with light density 10 lux. Heating temperature was (126°c – 130oc)
for the toasting of the fb seeds.
Chemical analyses of the seeds were carried out according to a.o.a.c. 1975. Moisture
was 7.08%, crude protein was 23.5%, crude fat was 1.0%, crude fiber was 7.72%, and ash
was 3.7%.
Statistical analyses were carried out by a factorial experiment conducted in c.r.d, with
the model equation yijk = µ + ti + pj + eijk. Analyzed results and compared means by the
duncan multiple range test (duncan, 1955), on a probability level of 5%.
Results and discussion
Significant lower value of HU observed in the control group compared to the other
groups (table 2). This is could be attributed to the contribution of FB content in the other
groups diet. Due to the effect of contribution of FB proteins, which are rich in lysine amino
acid ( Prochska et al,1996), and contribute in the structure of the Ovomucin protein, which is
responsible on the frim of the albumin (Tossant and Latshow,1999). In the other hand HU
value decreased with increasing RFB level in the diet and the opposed with RoFB. This is
could be attribute to the effect of the heat treatment, which may be reduce ANFs effects, thus
lead to the best utilization of lysine amino acid by the intestine mucosal, and due to the
protein degradation. Insignificant depression observed with the increasing of birds ages
during the first four periods. And values were significantly higher than P5 (table 3). This is
could be attributed to the depression of feed efficiency during the last periods of birds age
(Davidson, 1973: Klieste,1976: Scott et al,1982).These results confirm the results obtained by
(Canningham et al, 1960: Izat,1985: Silversides and Scott,2001).
AI values were higher in all treatments compared to the control (table 1). But T3 and T6
were insignificantly higher than the control. And also the values in T1, T2 and T3 are higher
13
insignificantly than T4, T5 and T6. this is attributed to the improving in the utilization of the
protein included in the diet due to the low level of ANFs in these diets, but with increasing the
content of the FB the AI value will decrease. A relative increase of AI was observed with the
increase of bird’s age. These results conformable to (Canningham et al,1960: Izat, 1985:
Lapao et al, 1999: AL-Haweizy, 2002).
AP values in the treatments containing RFB or RoFB were higher than control, and tend
to be higher in which treatments contained RoFB in the diet. This is attributed to the
improving of utilization of protein content of the diet. AP increased significantly with
advanced ages of the bird. This is attributed to the increase of eggs weight (Ahn et al,1997), in
addition decreasing of egg yolk (Rose, 1997). Values in P3, P4 and P5 were significantly
higher than P1 and P2. This is attributed to the increase of androgen and progesterone
hormones with the increase of birds age, which affecting the secretion of the albumin in to the
oviduct.
Conclusions
There is possibility to including the Faba Bean seed as raw or toasted at 10 % level in layers
diet to obtain higher quality of table eggs for consumption, and also obtain a safely products
by feeding hens, diets without animal protein sources.
The age of the hen doesn’t affect the eggs albumin quality in generally and tend to be better
by advanced ages of the bird particularly during our experiment period.
Table 2
The effect of the treatments on Haugh Unit, Albumin Index and Albumin Percentage.
Treatments
Albumin characters
Haugh Unit
Albumin Index
percentage
Control
78.87±0.82c
41.9±1.7cd
63.28±0.29cd
T1
83.16±0.61a
48.2±1.5a
63.17±0.23cd
T2
83.26±0.71a
49.28±1.5a
64.38±0.22a
T3
81.73±091ab
45.43±1.8bcd
63.32±0.23cd
T4
81.08±0.90b
46.6±1.7ab
63.95±0.22ab
T5
83.43±0.91a
45.4±1.8ac
63.58±0.29bc
T6
83.67±0.87a
45.1±1.9ad
63.51±0.25bd
14
Table 3
The effect of bird’s age on Haugh Unit, Albumin Index and Albumin Percentage.
Periods in weeks
Albumin Characteristics
Haugh unit
Albumin index
a
38.28±1.1
percentage
d
61.96±0.21c
P1 (43-46)
83.57±0.72
P2 (47-50)
82.15±0.73ac
51.2±1.4a
62.96±0.27b
P3 (51-54)
82.93±0.71ab
46.0±1.5bc
64.11±0.41a
P4 (55-58)
81.53±0.66ad
46.7±1.2ac
64.52±0.12a
P5 (59-62)
80.67±0.70bcd
47.7±1.5ab
64.35±0.13a
Numbers with small letters means, differences are significant ( P ≤ 0.05).
Table 1
Compositions %, and calculated chemical analyses of the diets.
Treatments
Feed staffs %
T1
T2
T3
T4
T5
T6
Cont.
Broad bean %
10
20
30
10
20
30
0.0
SBM 44%*
10.985
6.618
2.252
10.985
6.618
2.252
15.347
Wheat
11.833
20.636
29.444
11.833
20.636
29.444
3.260
Barley
55.240
40.714
26.188
55.240
40.714
26.188
69.518
Vegetable Fat
0.800
0.800
0.800
0.800
0.800
0.800
0.800
Methionine
0.138
0.171
0.203
0.138
0.171
0.203
0.106
Lysine
0.122
0.127
0.132
0.122
0.127
0.132
0.117
Limestone
9.291
9.278
9.265
9.291
9.278
9.265
9.303
Di Cali Pho**
1.017
1.055
1.094
1.017
1.055
1.094
0.979
Salt
0.375
0.375
0.374
0.375
0.375
0.374
0.376
[Cx-Layer]***
0.025
0.025
0.025
0.025
0.025
0.025
0.025
Avienzyme****
0.080
0.080
0.080
0.080
0.080
0.080
0.080
Choline Chloride
0.044
0.069
0.093
0.044
0.069
0.093
0.039
Minerals*****
0.050
0.050
0.050
0.050
0.050
0.050
0.050
Calculated Chemical analyses of diets
MJ, ME/Kg Diet
10.76
10.76
10.76
10.76
10.76
10.76
10.76
Crud Protein %
15.19
15.19
15.19
15.19
15.19
15.19
15.19
15
Crud Fiber%
5.503
5.308
5.144
5.503
5.308
5.144
5.608
Calcium %
3.700
3.700
3.700
3.700
3.700
3.700
3.700
Phosphorus%
0.350
0.350
0.350
0.350
0.350
0.350
0.350
Lysine5
0.800
0.800
0.800
0.800
0.800
0.800
0.800
Methionine+Cystin% 0.58
0.580
0.580
0.580
0.580
0.58
0.580
Sodium
0.170
0.170
0.170
0.170
0.170
0.170
0.170
ME / CP
0.708
0.708
0.708
0.708
0.708
0.708
0.708
*Soy bean meal
** Di Calcium Phosphate
***Vitamin Complex, K3, E, Biotin, Pantothenic acid, Niacin, Folic acid, B12, B6, B2, B1, D3, A
**** Xylanase, β-Glucanase
***** Mineral Complex, Cu, Fe, I, Mn, Si
VPLYV EXPERIMENTÁLNEHO PODANIA NIKLU NA KVALITU BIELKA A
HMOTNOSŤ KONZUMNÝCH VAJEC
EFFECT OF EXPERIMENTAL ADMINISTRATION OF NICKEL ON EGG ALBUMEN
QUALITY AND EGG WEIGHT OF MARKET EGGS
Arpášová, H., Massányi, P., Capcarová, M., Kolesárová, A., Kalafová, A.
Slovenská poľnohospodárska univerzita
Abstrakt
The experiment was implemented on the efficient Isabrown laying hens producing brown
shell eggs. We used 53 weeks old hens. The hens were fed by the standard feed mixture
HYD – 10. Animals accepted fodder ad libitum. Hens (n=20) were divided into four groups
(K, E1, E2, E3). Experimental hens (5 in each group) received nickel (NiCl2) per os in
drinking water for 28 days. In control group K hens taked drinking water without additions,
in experimental groups was supplement in the drinking water nickel (NiCl2) in different
concentrations. In experimental group E1 in concentration 0.02g.l-1, in experimental group E2
in concentration 0.2g.l-1 and in experimental group E3 in concentration 2g.l-1. In all groups
laying hens accepted drinking water ad libitum. The experiment lasted 28 days. The following
efficiency indexes were monitored, namely egg weight, albumen weight, index of albumen,
percentage and the Haugh units of the albumen. The greatest differences during experiment
were achieved between control group C
and experimental group E3 with the highest
concentration 2 g.l-1 NiCl2. Different in values in the other groups with low concentrations
NiCl2 weren´t so bold in comparison with control group. The egg weight was in order groups:
16
62.27; 59.11; 64.90; 50.97g. Statistically significant differences were achieved among the
following combinations of the groups: very high significant difference (P≤0.001) between
control group and experimental group E3,
between
experimental groups E3 and E2
respectively E3 and E1; high significant difference (P≤0.01) between experimental groups E1
and E2. Different between control group and experimental group E3, between experimental
groups E3 and E2 respectively E3 and E1 were statistically very high significant (P≤0.001)
for albumen weight. Statistically high significant difference (P≤0.01) was observed between
experimental groups E2 and E1 and significant difference (P≤0.05) was observed between
control group and experimental group E2. Different between control group and experimental
group E2 respectively experimental groups E3 and E2 were statistically significant (P≤0.05)
for percentage albumen from egg weight. By evaluation of Index albumen and Haugh units
were found no significant differences between control and experimental groups (P>0.05).
Úvod
Stopové prvky ako kadmium, olovo, chróm, nikel, ortuť, arzén majú na živý
organizmus toxický efekt a sú často považované za kontaminanty (He et al. 2005).
Nikel je toxický prvok, zlúčeniny dvojmocného niklu sú karcinogénne ako pre ľudí
tak aj pre zvieratá. (Prokeš et al. 2005). Nikel sa zúčastňuje pri tvorbe krvi a ovplyvňuje
hladinu inzulínu v krvi. Najviac ho obsahuje pečeň a perie, je považovaný za slabý
karcinogén. Je známe, že môže určitým spôsobom ovplyvniť DNA (Matkar et al. 2006).
Výsledky práce Martinez, Diaz (1996) ukázali, že doplnok vysokých dávok Ni a Mn
signifikantne zvyšujú obsah hemoglobínu v krvi a tiež pH. Jeho toxická dávka je pomerne
vysoká a prejavuje sa nechutenstvom, znížením úžitkovosti a vyššou mortalitou. Toxicita
niklu vyvoláva veľký záujem kvôli rozšírenému výskytu Ni v prostredí. Možným vysvetlením
ako Ni spôsobuje poškodenie a smrť buniek, je peroxidácia lipidov a tvorba reaktívnych
foriem kyslíka. V experimentoch sa už po 1 hodine od aplikácie Ni ľudským lymfocytom
zistila zvýšená tvorba hydroxylových radikálov, čo hrá úlohu pri oxidatívnom poškodení
ľudských lymfocytov akútnym účinkom niklu (Chang-Yu Chen et al. 2003). Potrava s nízkym
obsahom niklu, menej ako 0,1 mg.kg-1 sušiny, vedie k symptómom deficiencie. Na nikel sa
môže vytvoriť alergia, vonkajšie vystavovanie sa zliatinám niklu môže spôsobiť zápaly kože
– dermatitídy. Experiment so štyrmi druhmi zvierat ukázal, že vystavovanie sa niklu vedie
k poruchám v metabolizme horčíka a predovšetkým zinku (Anke et al. 1995). Výsledky
experimentu autorov Kpomblekou et al. (2002), ktorí skúmali vzorky podstielky brojlerových
kurčiat ukázali širokú variabilitu koncentrácie minerálií, pri nikle bol rozsah 0,2-25,1 mg.kg-1.
Wilson et al. (2001) skúmali vo svojich pokusoch efekt niklu v dávkach 0; 25; 50; 75; 100 a
17
150 mg.kg-1 na pevnosť kostí a úžitkové parametre kohútov broilerového typu ustajnených na
hlbokej podstielke a v klietkach.
Štandardná kŕmna zmes v tomto experimente bola
obohatená o 25 mg niklu na kg krmiva. Nikel nemal významný efekt na živú hmotnosť
brojlerových kurčiat v klietkach ani na podstielke, neovplyvnil ani pevnosť holennej kosti
u kurčiat, podobne merateľná hustota kostí nebola niklom ovplyvnená. Fakayode et al. (2003)
analyzovali obsah ťažkých kovov vo vajciach sliepok. Autori našli silné pozitívne korelácie
medzi hladinami kovov v krmive a vo vajciach, priemerné koncentrácie niklu vo vajciach
boli 0,03 mg.kg-1. Meluzzi et al. (1996) sledovali transfér ťažkých kovov (Cr, Ni, Pb) do
vajca, ťažké kovy boli podávané sliepkam perorálne, krmivom obohateným troma
rozdielnymi dávkami, nižšou, zhodnou a vyššou ako je prípustná hranica pre každý kov. Pre
nikel boli dávky 100, 300 a 500 ppm ako NiSO4. Koncentrácie niklu boli v širokom rozpätí,
od 71 do 964 ppb pre bielok, 196 – 259 ppb pre žĺtok a 115 – 345 ppb pre škrupinu. Hladina
niklu vo vajciach sa zvyšovala predlžovaním pokusu z 30 na 75 dní. Podiel olova
transferovaného do jedlých častí vajca bol v porovnaní s niklom vyšší. Znáška a kvalita vajec
boli ťažkými kovmi signifikantne negatívne ovplyvnené.
Materiál a metodika
Do experimentu bolo zaradených 20 nosníc znáškového hybrida Isabrown vo veku 53
týždňov. Pokusné nosnice boli ustajnené v konvenčnej trojetážovej klietkovej batérii, kŕmené
boli ad libitum, kompletnou kŕmnou zmesou pre chov nosníc na produkciu konzumných vajec
HYD – 10. Sliepky boli rozdelené do 4 skupín, do všetkých skupín boli vybraté sliepky
s približne rovnakou živou hmotnosťou. V kontrolnej skupine zvieratá prijímali pitnú vodu
bez akýchkoľvek prídavkov, v pokusných skupinách bol do pitnej vody pridaný nikel vo
forme NiCl2 v rôznych koncentráciách. V pokusnej skupine P1 v koncentrácii 0,02 g.l-1,
v pokusnej skupine P2 v koncentrácii 0,2 g.l-1 a v pokusnej skupine P3 v koncentrácii 2 g.l-1.
Vo všetkých skupinách prijímali sliepky pitnú vodu ad libitum. Sledované ukazovatele :
hmotnosť vajec, hmotnosť bielka, percentuálny podiel bielka, index bielka, Haughove
jednotky bielka. V závere pokusu bola uskutočnená kompletná analýza vajec, analyzovali
sme po 15 vajec z každej skupiny. V skupine P1 s najvyššou koncentráciou niklu bol počet
vajec nižší, nakoľko vplyvom vysokej dávky sa u väčšiny sliepok v skupine znáška zastavila,
prípadne znášali neštandardné vajcia. Rozdiely medzi jednotlivými ukazovateľmi v rámci
pozorovaných skupín sme testovali jednofaktorovou analýzou variancie jednostupňového
triedenia. Výsledky jednofaktorovej analýzy variancie boli doplnené Scheffeho testom. Pokus
trval 28 dní.
18
Výsledky a diskusia
Zmeny hmotnosti vajec sú uvedené v tabuľke 1 a obr. 1. Hmotnosť vajec
v jednotlivých skupinách sa v priebehu pokusu najvýraznejšie menila v tretej pokusnej
skupine P3, v ktorej bol zaznamenaný najvýraznejší pokles hmotností. V kontrolnej skupine
K bola hmotnosť 62,27 g, v tretej pokusnej skupine P3 s koncentráciou niklu 2 g.l-1 bol
výrazný pokles v porovnaní s kontrolnou skupinou aj s ďalšími pokusnými skupinami,
hmotnosť analyzovaných vajec dosiahla len
50,97 g, v pokusnej skupine P2 bola
zaznamenaná hmotnosť 64,90 g a v pokusnej skupine P1 bola hmotnosť vajec 59,11 g. Tieto
výsledky sa zhodujú s výsledkami autorského kolektívu Meluzzi et al. (1996), ktorí podobne
zaznamenali štatisticky významne negatívne ovplyvnenie znášky, hmotnosti vajec aj ich
kvality ťažkými kovmi. Pri štatistickom vyhodnotení boli zaevidované veľmi vysoko
významné rozdiely (P≤0,001) medzi skupinami K : P3; P3 : P2; P3 : P1 a vysoko významné
rozdiely (P≤0,01) medzi skupinami P1 : P2.
Najnižšia hmotnosť bielka (tab. 2, obr. 2) bola v tretej pokusnej skupine P3, čo súvisí
s najvýraznejším poklesom hmotnosti celých vyprodukovaných vajec v tejto skupine
spôsobeným najvyššou koncentráciou niklu v tejto skupine (2,0 g.l-1). Rozdiely hmotností
bielkov vajec v ostatných skupinách s nižšími koncentráciami NiCl2 neboli tak výrazné
v porovnaní s kontrolnou skupinou. Pri štatistickom vyhodnotení boli zaevidované veľmi
vysoko významné rozdiely (P≤0,001) medzi skupinami K : P3; P3 : P2; P3 : P1, vysoko
významné rozdiely (P≤0,01) medzi skupinami P2 : P1 a významné rozdiely (P≤0,05) medzi
skupinami P2 : K.
V percentuálnom podiele bielka (tab. 2, obr. 3) boli výsledky v poradí skupín: 61,81;
63,15; 64,67; 61,63 %. Ako vyplýva z obrázku a z tabuľkových hodnôt, v percentuálnom
podiele bielka z hmotnosti celého vajca boli hodnoty v pokusnej skupine P3 s najvyššou
koncentráciou niklu takmer zhodné s kontrolnou skupinou, vyšší percentuálny podiel bielka
z hmotnosti celého vajca bol v skupinách P2 (64,67 %) a P1 (63,15%) čomu zodpovedá aj
vyhodnotenie štatistickej významnosti rozdielov, ktoré boli významné ((P≤0,05) len medzi
skupinami P2 : K a P2 : P3.
V indexe bielka (tab. 2, obr. 4) boli hodnoty veľmi vyrovnané (86,94; 85,50; 86,78;
84,67), medzi všetkými kombináciami skupín bol rozdiel štatisticky nevýznamný (P>0,05).
Podobne v Haughových jednotkách (83,61; 82,02; 81,23; 80,19 HJ) bola najvyššia
hodnota v kontrolnej skupine, v ostatných skupinách sa hodnota znižovala so zvyšujúcou sa
19
koncentráciou NiCl2 v skupine. Rozdiel medzi skupinami bo štatisticky nevýznamný (P>0,05)
(tab.2, obr. 5).
Tabuľka 1 - Zmeny hmotnosti vajec (g) počas experimentu
SKUPINA
UKAZOVATEĽ
Hmotnosť
vajca
(g)
K
P1(0,02 g.l-1)
P2 (0,2 g.l-1)
P3 (2 g.l-1)
x
62,26
59,11
64,90
50,97*
SD
4,85
2,45
3,94
3,03
CV
7,79
4,14
6,07
5,95
min
55,5
54,0
56,8
47,5
max
70,8
64,1
73,1
56,5
Hmotnosť vajca: *P≤0,01 (P1 – P2); P≤0,001 (P3 – K, P1, P2)
Obrázok 1 – Dynamika zmien hmotnosti vajec
hmotnosť vaj ec (g)
80
60
40
20
0
K
P1
P2
P3
Obrázok 2 – Dynamika zmien hmotnosti bielka
hmotnosť bielka (g)
50
40
30
20
10
0
K
P1
P2
P3
20
Tabuľka 2 - Zmeny ukazovateľov kvality bielka počas experimentu
Skupina
Ukazovateľ
K
P1 (0,02 g.l-1)
P2 (0,2 g.l-1)
P3 (2 g.l-1)
x
38,47
37,34
42,05*
31,43*
SD
2,87
2,08
4,31
2,33
CV
7,46
5,58
10,24
7,41
min
35,0
34,2
34,9
29,2
max
43,7
42,2
50,4
35,7
Hmotnosť bielka (g)
Percentuálny podiel bielka (%)
x
61,81
63,15
64,67*
61,63*
SD
1,36
1,58
3,45
1,68
CV
2,20
2,51
5,34
2,73
min
59,46
59,59
59,56
58,75
max
64,58
65,83
72,78
63,58
x
86,94
85,50
86,78
84,67
SD
12,84
22,40
22,41
27,48
CV
14,77
26,20
25,83
32,45
min
64,86
55,55
55,53
47,06
max
106,87
128,57
130,95
136,36
Index bielka
Haughove jednotky (HJ)
x
83,61
82,02
81,23
80,19
SD
5,05
10,15
9,43
10,83
CV
6,04
12,37
11,60
13,50
min
73,06
69,36
65,79
64,17
max
90,24
95,27
93,28
97,53
Hmotnosť bielka: *P≤0,05 (P2 – K); P≤0,01 (P2 – P1); P≤0,001 (P3 – K, P1, P2)
Percentuálny podiel bielka: *P≤0,05 (P2 – K, P3)
Obrázok 3 – Dynamika zmien percentuálneho podielu bielka
per centuálny podiel
bielka (%)
65
64
63
62
61
60
K
P1
P2
P3
21
Obrázok 4 – Dynamika zmien indexu bielka
index bielka
87
86
85
84
83
K
P1
P2
P3
Haughove jednotky (HJ)
Obrázok 5 – Dynamika zmien Haughových jednotiek bielka
84
83
82
81
80
79
78
K
P1
P2
P3
Záver
V priebehu experimentu bol sledovaný vplyv prídavku niklu (NiCl2) v rôznych
koncentráciách (0,02 g.l-1, 0,2 g.l-1 a 2 g.l-1) na zmeny hmotnosti vajec a ukazovateľov kvality
bielka sliepok hnedo vaječného znáškového hybrida Isabrown. Najvýraznejšie rozdiely
v priebehu pokusu boli zaznamenané u hmotnosti vajec ale aj u ukazovateľov kvality bielka
medzi kontrolnou skupinou K a pokusnou skupinou P3 s najvyššou koncentráciou niklu
(2 g.l-1). Rozdiely v hodnotách v ostatných skupinách s nižšími koncentráciami NiCl2 neboli
tak výrazné v porovnaní s kontrolnou skupinou. V indexe bielka a v Haughových jednotkách
boli hodnoty v skupine s vysokou koncentráciou niklu nižšie, avšak rozdiel medzi všetkými
kombináciami skupín bol štatisticky nevýznamný (P>0,05).
22
Literatúra
ANKE, M. – ANGELOW, L. – GLEI, M. – MULLER, M. – ILLING, H. 1995. The biologial importance of
nickel in the food-chain. In Fresenius Journal of Analytical Chemistry. vol. 352, 1995, num. 92 - 96
FAKAYODE, S. O. – OLU – OWOLABI, I. B. 2003. Trace metal content and estimated daily human intake
from chicken eggs in Ibadan, In Archives of Enviremantal Health, vol. 58, 2003, num. 4, p. 245 – 251
HE, Z. L. – YANG, X. E. – STOFFELLA, P. J. 2005. Trace elements in agroecosystems and impacts on the
environment In Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. vol 19, 2005, num. 2 – 3, p. 125 - 140
CHANG-YU CHEN - YI-FEN WANG - YU-HWAN LIN - SHU-FANG YEN 2003. Nickel-induced oxidative
stress and effect of antioxidants in human lymphocytes. In Arch. Toxicol., 77, 2003, 123-130.
KPOMBLEKOU, A. K. – ANKUMAH, R.O. – AJWA, H.A. 2002. Trace and nontrace element contents of
broiler litter. In Communications in Soil Science and Plant Analysis 33, 2002, (11-12): 1799-1811.
MARTINEZ, D. A. – DIAZ, G. J. 1996. In Effect of graded levels of dietary nickel and manganese on blood
haemoglobin content and pulmonary hypertension in broiler chickens. In Avian Patology, vol. 25, 1996, num. 3,
p. 537 - 549
MATKAR, J. J. – WRISCHNIK, L. A. – JONES, P. R. – HELTMAN – BLUMBERG, V. 2006. Two closely
related nickel complexes have different effects on DNA damage and cell variability. In Biochem Biophys, Res
Commun, roč. 343, 2006 č. 3, s. 754 - 761
MELUZZI, A. – SIMONCINI, F. – SIRRI, F. – VANDI, L. – GIORDANI, G. 1996. Feeding hens diets
supplemented with heavy metals (chromium, nickel and lead). In Archiv fúr Geglugelkunde, vol. 60, 1996, num.
3, p. 119 - 125
PROKEŠ, J. et al. Základy toxikologie. Praha : Galen, 2005. ISBN 80 – 7262 – 301 -X. 247 s.
WILSON, J. H. – WILSON, E, J. - RUSZLER, P. L 2001. Dietary nickel improves bale broiler (Gallus
domesticus) bone strength. In Biological Trace Element Research, vol. 83, 2001, num. 3, p. 239 - 249
DISTRIBÚCIA NIKLU V ORGANIZME POTKANA PO EXPERIMENTÁLNOM
PODÁVANÍ
DISTRIBUTION OF NICKEL IN THE ORGANISM OF RATS AFTER AN
EXPERIMENTAL ADMINISTRATION
Bábiková, L.1, Toman, R.1, Golian, J.2, Massányi, P.3, Hluchý, S.1, Lukáč, N.3, Šiška, B.2
1Katedra veterinárskych disciplín, Fakulta agrobiológie a potravinových zdrojov, SPU Nitra
2Katedra hygieny a bezpečnosti potravín, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, SPU Nitra
3Katedra fyziológie živočíchov, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, SPU Nitra
Abstract
The aim of this study was to evaluate the distribution of nickel chloride in the organism of rats
after an experimental administration. The rats were given nickel chloride in a different
concentrations. The first part of the study (group A and group P) was carried out on male rats
(n=10) which were injected (i.p.) with nickel chloride at a single dose of 25 mg.kg-1 and 35
mg.kg-1 b.wt., respectively, and killed 48 hours after the nickel administration. In the second
part of research (group B) 10 rats males were orally dosed with 100 mg.l-1 in drinking water
during three months. Ten males served as the control group (K) without the nickel
administration. The samples of kidney, muscle (m. quadriceps femoris), liver and testis were
taken for the nickel analysis. The highest concentration of nickel was detected in the kidney
23
after an intraperitoneal administration of 35 mg.kg-1 of nickel chloride. The difference
between the group P and the control one was significant (p < 0.001). The nickel level in the
kidney were significantly higher in group A when compared to the group B (2.48 ± 0.83
mg.kg-1 and 0.24 ± 0.14 mg.kg-1, respectively). The differences in liver nickel concentration in
all experimental groups were insignificant. The analysis of nickel concentration in the muscle
tissue showed the significant decrease from 1.18 ± 0.79 mg.kg-1 in group K to 0.20 ± 0.12
mg.kg-1 in group B. In the testis, the nickel concentration was highest in group P (0.61 ± 0.19
mg.kg-1) in comparison to the control (K) and experimental group B (0.22 ± 0.19 mg.kg-1 and
0.22 ± 0.17 mg.kg-1, respectively). These differences were statistically significant (p < 0.05).
These findings indicate that the acute administration of nickel chloride causes the highest
increase in the level of the metal in kidney.
Úvod
Nikel (Ni) je biogénny, esenciálny prvok, ktorý pri vyšších koncentráciách vyvoláva vznik
kontaktnej alergickej dermatitídy (Menne, 1994). Nikel je látkou, ktorá sa síce vstrebáva vo
veľmi malom množstve, ale aj z tohto množstva sa asi 70 % vylúči močom. Má významnú
úlohu v biologickom systéme, ako je enzýmová aktivita, hormonálna kontrola a tiež
v RNA, DNA a v proteínovej štruktúre, ako aj v ich funkciách. Pandey a Srivastava (2000)
uvádzajú, že hypersenzitivita niklu spôsobuje astmu, zápal spojiviek a ďalšie zápalové
reakcie. Medzi symptómy vyvolané akútnym pôsobením niklu patrí nedostatočnosť
adrenalínu, hyperglykémia, toxicita pečene a taktiež sa môže vyvinúť poškodenie obličiek.
Diwan et al. (1992) poukazujú na schopnosť prenikania Ni placentou a na následné poruchy
v obličkách vyvíjajúceho sa plodu. Kakela et al. (1999) uvádzajú, že v semenníkoch potkanov
dochádza po perorálnom podávaní Ni k zmenšeniu semenotvorných kanálikov a k zníženiu
počtu spermatogónií.
Cieľom
našej
práce
bolo
zistiť
akumuláciu
niklu
v jednotlivých
orgánoch
po
experimentálnom podaní rôznych dávok niklu.
Materiál a metodika
V pokuse sme použili samcov laboratórnych potkanov línie Wistar, ktorých sme rozdelili do 1
kontrolnej skupiny (bez podania niklu) a 3 pokusných skupín. Do každej skupiny bolo
zaradených 10 pokusných zvierat. Pokusné skupiny sme rozdelili na 1 skupinu s dlhodobým
perorálnym podávaním (B) a 2 skupiny s jednorazovým podaním niklu (A, P). V dlhodobom
pokuse (skupina B) sme podávali chlorid nikelnatý v dávke 100 mg.l-1 v pitnej vode počas
24
troch mesiacov. Pokusným zvieratám v skupine A a P sme aplikovali nikel vo forme NiCl2
v jednorazovej intraperitoneálnej dávke 25 mg.kg-1 ž.h. (skupina A) a 35 mg.kg-1 ž.h. (skupina
P). Zvieratá boli individuálne umiestené v plastových nádobách s neobmedzeným prístupom k
vode a ku krmivu. Počas každého experimentu boli v pokusnom zariadení (SK PC 50004)
dodržiavané základné nároky na životné podmienky (teplota 20 – 22 °C, vlhkosť 55 ± 10 %,
12 hodinový svetelný režim). Po 48 hodinách (skupina A a P) a 90 dňoch (skupina B)
experimentu sme zvieratá bezbolestne usmrtili a odobrali sme vzorky obličiek, pečene,
semenníka a svalu (m. quadriceps femoris) na stanovenie obsahu niklu. Podobne sme
postupovali aj u kontrolnej skupiny.
Obsah niklu v tkanivách sa stanovil použitím elektrotermálneho atómového absorbčného
spektrofotometra Varian SpectrAA 20 BQ,GTA 96 (EL s.r.o., Spišská Nová Ves). Pre získané
údaje sme vypočítali základné štatisticko-variačné hodnoty a rozdiely medzi skupinami sme
otestovali Scheffeho testom.
Výsledky
Výsledky analýz vzoriek obličiek, pečene, semenníka a svalu sú zhrnuté v tabuľkách 1 až 4.
Analýzou vzoriek tkanív sme zistili, že najväčšie množstvo niklu sa nachádzalo v obličke.
Priemerný obsah niklu v obličke bol 9,71 mg.kg-1 v skupine P, ktorej bola podaná jednorázová
dávka 35 mg.kg-1. Tento rozdiel porovnaní s kontrolnou skupinou bol vysoko štatisticky
preukazný P < 0,001. Taktiež porovnanie obsahu Ni v obličke v skupine A a P navzájom
a porovnanie medzi skupinou P a skupinou B ukázalo štatisticky preukazné rozdiely. V
skupine A s jednorázovým podaním niklu 25 mg.kg-1 sme v porovnaní s kontrolnou skupinou
samcov potkanov zaznamenali štatisticky preukazný nárast koncentrácie niklu o 2,31 mg.kg-1
oproti kontrole.
Obsah niklu v obličke potkana laboratórneho (mg.kg-1)
Tabuľka 1
Skupina
x±s
Preukaznosť rozdielov
K
0,17 ± 0,12
A
2,48 ± 0,83
A:K*
B
0,24 ± 0,14
-
P
9,71 ± 4,45
P:A***, P:B***, P:K***
*P < 0,05, ***P < 0,001, -P > 0,05
25
Ako vidno z tabuľky 2, analýzou vzoriek svaloviny sme zistili, že kumulácia niklu vo
všetkých pokusných skupinách bola nižšia ako v kontrolnej skupine. Významný pokles
hladiny niklu sme zaznamenali v dlhodobom pokuse na 0,20 mg.kg-1 oproti kontrolným 1,18
mg.kg-1. Tento pokles bol štatisticky preukazný (P < 0,01). Pokles o 0,89 mg.kg-1 niklu oproti
kontrole bol v akútnej skupine P. V porovnaní s kontrolnou skupinou bol tento rozdiel
štatisticky preukazný. Porovnanie experimentálnych skupín neukázalo žiadnu štatistickú
preukaznosť.
Obsah niklu vo svale potkana laboratórneho (mg.kg-1)
Tabuľka 2
Skupina
x±s
Preukaznosť rozdielov
K
1,18 ± 0,79
K:P*, K:B**
A
0,83 ± 0,42
-
B
0,20 ± 0,12
-
P
0,29 ± 0,09
-
*P < 0,05, **P < 0,01, -P > 0,05
Najnižšie množstvo niklu sme zaznamenali v pečeni (tabuľka 3). Nepatrné zvýšenie množstva
niklu bolo v skupine P (0,54 mg.kg-1), čo oproti kontrole činilo rozdiel 0,04 mg.kg-1. Avšak
tento rozdiel nebol štatisticky preukazný. V ostatných skupinách bola koncentrácia niklu
nižšia oproti kontrole.
Obsah niklu v pečeni potkana laboratórneho (mg.kg-1)
Tabuľka 3
Skupina
x±s
Preukaznosť rozdielov
K
0,50 ± 0,34
A
0,29 ± 0,16
-
B
0,30 ± 0,21
-
P
0,54 ± 0,20
-
-
P > 0,05
Obsah niklu v semenníku je udané v tabuľke 4. Pri porovnaní rozdielov medzi skupinami sme
zistili, že podanie jednorázovej dávky 35 mg.kg-1 ž.h. spôsobilo štatisticky preukazný nárast
26
obsahu Ni v sememenníkoh (P < 0,05). Rozdiel v priemerných hodnotách medzi skupinou P
a kontrolnou skupinou bol 0,39 mg.kg-1. Rozdiel medzi skupinou P a B bol taktiež štatisticky
preukazný. Zvýšená hladina niklu ale bola pozorovaná v akútnej skupine P v porovnaní v
chronickom experimente.
Obsah niklu v semenníku potkana laboratórneho (mg.kg-1)
Tabuľka 4
Skupina
x±s
Preukaznosť rozdielov
K
0,22 ± 0,19
A
0,38 ± 0,25
-
B
0,22 ± 0,17
-
P
0,61 ± 0,19
P:B*, P:K*
*P < 0,05, -P> 0,05
Diskusia
Mimoriadne senzitívne na koncentrácie cudzorodých látok z parenchymatóznych orgánov sú
predovšetkým pečeň, oblička a pohlavné žľazy, ktoré už pri nízkej dávke vykazujú
štrukturálne zmeny alebo funkčné poruchy (Jančová et al., 1999).
V obličkách pokusných samcov, ktorým sme podali intraperitoneálne nikel (25 mg.kg-1 a 35
mg.kg-1), sme zistili štatisticky preukazný nárast hladiny niklu o 2,31 mg.kg-1 (pri dávke 25
mg.kg-1) a o 9,54 mg.kg-1 (35 mg.kg-1). Ishimatsu et al. (1995) poukazujú na fakt, že po 24
hodinách sa vstrebáva 10 – 34 % z jednorazovej dávky zlúčenín niklu podaných perorálnym
spôsobom. Najvyššie koncentrácie zaznamenali v obličke, pľúcach a najnižšie hodnoty
v pečeni. Autori uvádzajú, že v obličkách sa nachádza 80 – 90 % z celkového množstva niklu,
ktoré sa v organizme akumulovalo. Autori ďalej uvádzajú, že transfer a distribúcia zlúčenín
niklu aplikovaných perorálnym spôsobom veľmi úzko súvisí s rozpustnosťou zlúčenín niklu,
ktorá klesá v nasledovnom poradí: [Ni(NO3)2 > NiCl2 > NiSO4] >> [NiS > Ni3S2] > NiO.
V závere svojej práce konštatujú, že rozpustnosť zlúčenín niklu je najdôležitejším faktorom,
od ktorého závisí škodlivý účinok niklu na živočíšny organizmus.
Počas dlhodobého pokusu sme zaznamenali nižšie hodnoty niklu v obličke. Naše výsledky
nekorešpondujú s výsledkami, ktoré uvádza Severa et al. (1995). Počas aplikácie sulfátu niklu
perorálnym spôsobom zistili najvyššie koncentrácie niklu v pečeni. U samcov hladiny niklu
klesali v poradí pečeň > oblička > krv (sérum, plazma) > sérum > plazma > semenníky.
U samíc poradie tvorilo: pečeň > oblička = krv = sérum = plazma > moč > vaječníky. V
našom experimente sme zaznamenali v akútnom pokuse iba nepatrné zvýšenie hladiny niklu
27
v pečeni po podaní dávky 35 mg.kg-1 ž.h. Avšak tento rozdiel nebol štatisticky preukazný.
V ostatných skupinách bola koncentrácia niklu nižšia oproti kontrole. Na druhej strane sú
naše výsledky totožné s výsledkami autorov, ktorí po aplikácii 0,1 % roztoku NiS (223,5 mg
Ni.l-1) uvádzajú najvyššie hodnoty v obličke, nižšie v semenníkoch, v pľúcach = v mozgu, v
slezine a najnižšie hodnoty udávajú v pečeni Obone et al. (1999).
Svalové tkanivo je neodmysliteľnou súčasťou ľudskej výživy. Z tohto hľadiska je dôležité
sledovať obsah xenobiotík vo svaloch. Na druhej strane však svalovina nepredstavuje veľké
riziko z hľadiska ovplyvnenia zdravia konzumentov, pretože sa nevyznačuje vysokou
schopnosťou bioakumulácie kovov (Gašparík et al., 2003; Sharma et al., 1982; Massadeh a Al
– Safi, 2005). V našom experimente sme zaznamenali významný pokles hladiny niklu
v dlhodobom pokuse na 0,20 mg.kg-1 oproti kontrolným 1,18 mg.kg-1. Tento pokles bol
štatisticky preukazný (P < 0,01). Rovnako aj dávka niklu 35 mg.kg-1 spôsobila pokles
koncentrácie vo svalovine pokusných zvierat v porovnaní s kontrolnými, ktorý bol taktiež
štatisticky preukazný. Toman et al. (2000) porovnávali hladiny kovov vo vybraných svalov
oviec, kde zaznamenali, že najvyššia hladina niklu bola v stehnovom svale 0,470 mg.kg-1, vo
veľkom bedrovci, poloblanitom a trojhlavom ramennom svale sa hodnoty niklu pohybovali
v rozmedzí 0,410 – 0,460 mg.kg-1. Svobodová et al. (2002) sledovali obsah Cd, Pb, Cr, Ni a
Cu vo svalovine kapra. Namerané hodnoty sa pohybovali pod povolenou hranicou
hygienického limitu, ktorú udáva tamojšia legislatíva okrem niklu. Obsah niklu bol nad 0,5
mg.kg-1.
Severa et al. (1995) a Obone et al. (1999) poukazujú na to, že semenníky patria medzi orgány
v ktorých nedochádza k vysokej kumulácii niklu. Na rozdiel od týchto tvrdení Sunderman et
al. (1985) vo svojom experimente zaznamenali v semenníkoch vyššiu kumuláciu niklu ako
v pečeni. Nami dosiahnuté výsledky sú v súlade s tvrdeniami týchto autorov, pretože akútne
pôsobenie niklu vyvolalo zvýšenú kumuláciu tohto kovu v semenníku, pričom jeho hladina sa
pohybovala od 0,22 – 0,61 mg.kg-1 v závislosti od dávky a spôsobu podania.
Záver
Na základe uvedených výsledkov získaných metódou atómovej absorpčnej spektrofotometrie,
možno konštatovať, že najvýraznejšie zmeny v hladine niklu v sledovaných orgánov
spôsobila dávka 35 mg Ni2+.kg-1 podaných intraperitoneálne, pričom k najvyššej akumulácii
dochádzalo v obličkách, menej vo svalovine, v semenníkoch a najmenšia kumulácia bola
zaznamenaná v pečeni experimentálnyích zvierat.
28
Literatúra
DIWAN, B.A. – KASPRZAK, K.S. – RICE, J.M. 1992. Transplacental carcinogenic effect of nickel(II) acetate
in the renal cortex, renal pelvis and adenohypophysis in F344/NCr rats. In: Carcinogenesis, roč. 13, 1992, s.
1351 – 1357.
GAŠPARÍK, J. - MASSÁNYI, P. - SLAMEČKA, J. - FABIŠ, M. - JURČÍK, R. 2003. Concentration of selected
metals in liver, kidney and muscle of the red deer (Cervus elaphus). In: Risk factors of food chain III.
Proceeding Book of III - rd International Scientific Conference. [CD - ROM]. Nitra : SPU, 2003, s. 27-29. ISBN
80-8069-282-3.
ISHIMATSU, S. – KAWAMOTO, T. – MATSUNO, K. – KODAMA, Y. 1995. Distribution of various nickel
compounds in rat organs after oral administration. In: Biol Trace Elem Res, roč. 49, 1995, s 43 – 52.
JANČOVÁ , A. – LIGAČ, S. – MASSÁNYI, P. – UHRÍN, V. 1999. Morphological analysis of testes and
epididymides in Apodemus sylvaticus and Apodemus flavicollis (M u r i d a e), In: Slovenský Veterinárny
časopis, roč. 24, 1999, s. 152 – 156.
KAKELA, R. - KAKELA, A. - HYVARINEN, H. 1999. Effects of nickel chloride on reproduction of the rat and
possible antagonistic role of selenium. In: Comp. Biochem. Physiol., roč. 123, 1999, s. 27 - 37.
MASSADEH, A. M. - Al-SAFI, S. 2005. Analysis of cadmium and lead: their immunosppressive effects and
distribution in various organs of mice. In: Biol. Trace. Elem. Res., roč. 108, 2005, s. 279-286.
MENNE. T. 1994: Quantitative aspects of nickel dermatitis: Sensitization and eliciting threshold concentrations, In: Sci.
Total Environ., roč. 148, 1994, s. 275-281.
OBONE,E. – CHAKRABARTI, S.K. – BAI, C. – MALICK, M.A. – LAMONTAGNE, L. – SUBRAMANIAN,
K.S. 1999. Toxicity and bioaccumulation of nickel sulfate in Sprague- Dawley rats following 13 weeks of
subchronic exposure. In: J. Toxicol. Environ. Health. A. roč. 57. 1999. s. 379-401.
PANDEY,R. – SRIVASTAVA,S.P. 2000. Spermatotoxic effects of nickel in mice. In: Bull. Environ. Cintám. Toxicol.,
roč. 64, 2000, s. 161- 167.
SEVERA. J, - VYSKOČIL, A. - FIALA, Z. - ČÍŽKOVÁ, M.1995. Distribution of nickel in body fluids and
organs of rats chronically exposed to nickel sulphate. In: Hum Exp Toxicol. roč.14. 1995.s.955-998.
SHARMA, R. P. - STREET, J. C. - SHUPE, J. L. - BOUCIER, D. R. 1982. Accumulation and depletion of
cadmium and lead in tissues and milk of lactating cows fed small amounts of these metals. In. J. Dairy. Sci., roč.
65, 1982, s. 972-979.
SUNDERMAN FW. JR. – MARZOUK, A. – CRISOSTOMO, MC. – WEATHERBY, DR. 1985. Electrothermal
atomic absorption spectrophotometry of nickel in tissue homogenates. In: Ann. Clin. Lab. Sci., roč. 15, 1985, str.
299 – 307.
SVOBODOVÁ, Z. – ZLABEK, V. – CELECHOVSKA,O. – RANDAK, T.- MACHOVA, J. – KOLÁROVÁ, J.
– JANOUSKOVA, D. 2002. Content of metals in tissues of marketable common carp and in bottom sediments
of selected ponds of South and West Bohemia. In: Czech Journal Anim Scien, roč. 47, 2002, str. 339 – 350.
TOMAN, R. – MASSÁNYI, P. – TATARUCH, F. – SLAMEČKA, J. – JURČÍK, R. – SALAGOVÁ, Z. – NAĎ,
P. – ČUBOŇ, J. 2000. Ťažké kovy v organizme suchozemských živočíchov. In: Rizikové faktory potravového
reťazca človeka, Nitra: GARMOND, 2000, s. 43 – 51. ISBN 80 – 7137 – 796 – 1.
Práca bola finančne podporená grantom VEGA MS SR 1/2417/05 a 1/3475/06.
Lenka Bábiková Ing., Katedra veterinárskych disciplín, Fakulta agrobiológie a potravinových
zdrojov, SPU Nitra, e- mail: [email protected]
ÚLOHA TRANSKRIPČNÉHO FAKTORA P53 A HORMÓNU GHRELÍN
V KONTROLE FUNKCIÍ OVARIÁLNYCH BUNIEK OŠÍPANÝCH
THE ROLE OF TRANSCRIPTION FACTOR p53 AND HORMONE GHRELIN IN
CONTROL OF PORCINE OVARIAN CELL FUCTIONS
Benčo, A., 1 Sirotkin, A. V.1,2
Konstantin the Philosophe University, Department of Zoology and Antropology, Tr. A. Hlinku 1, 949 01, Nitra,
Slovakia
2 Slovak Agricultural Research Centre, Research Institute of Animal Production, Department of Genetics and
Reproduction, Hlohovská 2, 949 92 Nitra, Slovakia
1
29
Abstract
The aim of our in vitro experiments was to examine (1) the role of transcription factor p53 in
control of apoptosis, proliferation and secretory activity of porcine ovarian cells, (2) the role
of ghrelin in control of these processes in porcine ovarian cells, (3) the role of p53 in
mediating ghrelin effects on porcine ovary.
Transfection of porcine cells with cDNA construct for transcription factor p53 decreased
ASK-1, Bax, PGF and increased PCNA, OT and PGE2.
We have study (1) effect of additions of hormone ghrelin on occurrence of apoptosis
(expression ASK-1, Bax) proliferation
(expression of PCNA) and release of hormones
(prostaglandin F, oxytocin and prostaglandin E2) in cultured porcine ovarian granulosa cells,
(2) effects of transfection of porcine ovarian granulosa cells with cDNA construct on these
processes. It was observed, that ghrelin inhibits expression of ASK-1, Bax did not affect
expression of PCNA, increased prostaglandin F, oxytocin and PGE2 release by porcine cells.
Moreover, transfection of porcine cells with p53 cDNA construct reversed effect of ghrelin on
ASK-1 from inhibitory to stimulatory, did not affect influence of ghrelin on Bax, convert
ghrelin PCNA from zero effect to inhibitory, did not affect ghrelin on prostaglandin F, turn
ghrelin oxytocine from stimulatory to inhibitory in porcine ovaries.
The obtained results suggests that p53 is regulator of apoptosis, proliferation and secretion,
hormone ghrelin is involved in control of porcine ovarian functions, it can be inhibitor of
apoptosis, and stimulator of hormone secretion. The opposite effects of ghrelin on normal
cells and cells with overexpression of p53 indicates that these transcription factor could be
potencial mediator of ghrelin action on the porcine ovary.
Úvod
Moderné biotechnológie vyžadujú nové regulátory, ktoré sú efektívnejšie, účinnejšie a majú
menšie vedľajšie účinky ako farmakologické preparáty. Nové trendy smerujú k regulácií
ovariálnych fukcií vplyvom hormonálnych regulátorov a vnútrobunkových mediátoroch ich
účinku. Mimobunkové a vnútrobunkové signálne dráhy regulujúce fenomény
proliferácie a sekrécie v
ovariálnych
apoptózy,
bunkách ošípaných a ľudí sú ešte veľmi slabo
preskúmané.
Vplyvy p53 na apoptózu a proliferáciu sú v ováriách čiastočne preskúmané. Máme poznatky
o tom, že transkripčný faktor p53 môže stimulovať apoptózu v makrofágoch (Matas et al.,
2004), inhibuje proliferáciu v leiomyómových bunkách u ľudí (Hsieh et al., 2004) a reguluje
sekréciu IGF (Grimberg et al., 2006). Úplne neznáme sú vplyvy p53 na sekréciu PGE, OT a
30
PGF v ováriách ošípaných.
Súčasné poznatky naznačujú, že hormón ghrelín reguluje reprodukciu u zvierat aj u ľudí na
úrovni hypotalamo-hypofyzárneho systému a gonád. (Mazzochi a kol. 2004) uvádza, že
ghrelín zvyšuje bazálnu sekréciu GH u ošípaných (Estienne a kol. 2005) a stimuluje expresiu
hypotalamickej AMP- aktivovanej proteín kinázy. (Lee a kol. 2005).
Ghrelín v ovariálnych bunkách králikov stimuluje proliferáciu (Pivko a kol. 2003) a znižuje
výskyt apoptózy v granulóznych bunkách ľudí a kurčiat (Sirotkin a kol. 2006).
Úloha niektorých hormónov napríklad žalúdočného hormónu ghrelínu, proteínkináz a
traskripčných faktorov v regulácií ovariálnych funkcií nie je celkom známa a absolútne
neznáme je, či hormón ghrelín účinkuje cez transripčný faktor (p53).
Na rozdiel od účinku ghrelínu na ovariálne bunky človeka a vtákov, v ovariálnych bunkách
ošípaných nie je dostatočne preskúmaný vplyv ghrelínu na apoptózu, proliferáciu, expresiu
vybraných kináz, transkripčných faktorov a neznáme sú jeho vplyvy na sekréciu vybraných
hormónov. Intracelulárne mediátory účinku ghrelínu na ovariálne bunky nie sú tiež dobre
preskúmané.
Materiál a metodika
Ovariálne granulózne bunky z vaječníkov ošípaných plemena biela ušľachtilá boli získané
z bitúnku Dunajská Streda. Ošípané vo veku 200-220 dní boli na konci puberty pričom
jedince boli v necyklujúcej fáze. Po aspirácii folikulárne granulózne bunky z folikulov boli
rozsuspendované v roztoku Ham’s F–12 (Bio Whittaker,Vervies,Belgium), odstredené (10
min./x 200g) a kultivované v médiu DMEM/F-12 (Bio Whittaker) doplneného 15%-ným
bovinným fetálnym sérom-FCS (FCS; Gibco, Paisley, Škótsko)
a 1% antibiotikom -
antimykotikom (Gibco BRL,Grand Island, USA). Suspenzia buniek bola následne
rozpipetovaná do kultivačných komôrok- chamber-slides (Nange Nunc International,
Naperville,USA) po 200 ml a kultivovaná do vytvorenia monovrstvy cca 5-7 dní pri 5% CO2 ,
pri 38°C. Po vytvorení monovrstvy bola kontrolná skupina granulóznych buniek podrobená
transfekcií za použitia transfekčného reagentu Roti Fect (Karlsruhe, Carl Roth, Nemecko)
génovou konštrukciou pre EGFP (Clontech, Palo Alto, Canada) , druhá skupina buniek bola
transfekovaná génovými konštrukciami pre EGFP + p53 (veľkosť inzertu 55 kb, klonovacie
miesto
5΄-
HpaI,
klonovacie
miesto
3΄-
XhoI,
typ
vektora-Mammalian
expression,Lentiviral,RNAi,Cre/Lox) . K obidvom skupinám buniek sme pridávali hormón
ghrelín (Peptides International, Louiseville, USA) v dávkach 0 (kontrolná skupina), 1, 10, 100
31
ng / ml . Po pridaní prídavkov sme bunky kultivovali 2 dni. Po kultivácii sme bunky
zafixovali v 4 % paraformaldehyde pre imunocytochemickú analýzu.
Prítomnosť ASK-1, Bax a PCNA v bunkách sme analyzovali imunocytochemickou metódou
podľa Osborna a Isenberga (1994). Použili sme primárne protilátky proti ASK-1, Bax a
PCNA (Santa Cruz Inc.,Santa Cruz,USA). Vizualizáciu naviazanej protilátky sme uskutočnili
pomocou sekundárnej protilátky- monoklonálna protilátka myší IgG1 označenej peroxidázou
(BD
Biosciences
Pharmingen,USA).
Peroxidáza
pri
reakcií
s
DAB
substrátom
(Behringer,MannheimGmbH,SRN) dala hnedé zafarbenie v mieste lokalizácie skúmaného
antigénu. Percentá zafarbených buniek boli spočítané pod svetelným mikroskopom a
vyhodnotené. Hormóny prostaglandín F, oxytocín a prostaglandín E2
secernované
granulóznymi bunkami boli analyzované vlastnými RIA systémami Prof. J. Kotwicom
(Institute of Animal Reproduction and Food Research, Olsztyn-Kortowo, Poľsko). PCNA
akumulácia bola analyzovaná metódou Western blotting. Preukaznosť rozdielov medzi
skupinami zistené pomocou imunocytochémie a RIA sme vyhodnotili Student t testom
použitím štatistického softwaru Sigma Plot 9.0 (Systat Software, GmbH, Erkhart, Nemecko).
Výsledky
U ošípaných sme hodnotili metódou imunocytochémia ASK-1, Bax a PCNA a metódou RIA
sme hodnotili uvolňovanie PGE, OT a PGE2.
Granulózne bunky získané z ovárií ošípaných obsahovali skúmané markery ASK-1, Bax,
PCNA a granulózne bunky vyprodukovali určité množstvá hormónov prostaglandínu F,
oxytocínu a prostaglandínu E2.
Imunocytochémia ukázala, že hormón ghrelín znižoval % granulóznych buniek obsahujúcich
proapoptotickú kinázu ASK-1, (Obr.3), % buniek obsahujúcich proapoptotický peptid Bax
(Obr.4) a neovplyvňoval % buniek obsahujúcich proliferačný jadrový antigén PCNA (Obr.5),
naopak Western blotting ukázal zvyšovanie akumulácie PCNA v bunkách po pridaní ghrelínu
(Obr.6). RIA ukázala, že tento hormón zvyšoval sekréciu prostaglandínu F, oxytocínu a
prostaglandínu E2. (Obr.7, 8, 9).
Overexpresia transkripčného faktora p53 znižovala expresiu apoptotických peptidov ASK-1
(Obr.3), Bax (Obr.4), stimulovala expresiu PCNA (Obr.5), inhibovala sekréciu PGF (Obr.7),
stimulovala vylučovanie OT (Obr.8) a PGE2 (Obr.9). Uspešnosť transfekcie buniek cDNA
pre markerový EGFP a p53 dokazujú obrázky (Obr. 1,2) získané metódou imunocytochémia.
Overexpresia p53 modifikovala inhibičný vplyv ghrelínu na stimulačný pre ASK-1 (Obr.3)
nemenila účinok ghrelínu pre Bax (Obr.4), menila nulový efekt ghrelínu na inhibičný
32
vzhľadom na PCNA (Obr.5), menila stimulačný účinok ghrelínu pre OT na inhibičný (Obr.8)
a nemenila účinok ghrelínu na PGF (Obr.7) a na PGE2 (Obr.9).
Obr.1. Expresia zeleno fluoreskujúceho
Obr.2. Expresia transkripčného faktora
proteínu EGFP v granulóznych bunkách
p53 v granulóznych bunkách ošípaných
ošípaných
Obr.3. Vplyv ghrelínu na expresiu
Obr.4. Vplyv ghrelínu na expresiu
ASK-1 v kultivovaných granulóznych
Bax v kultivovaných granulóznych
bunkách ošípaných bez (kontrola) a po
bunkách ošípaných bez (kontrola) a po
c DNA transfekcií génovou konštrukciou
transfekcií c DNA génovou konštrukciou
pre p53 (imunocytochémia)
pre p53 (imunocytochémia)
*
100
overexpresia p53
*
% buniek obsahujúcich Bax
% buniek obsahujúcich ASK-1
100
80
*
60
kontrola
40
*
20
0
0
1
10
100
80
60
*
*
40
overexpresia p53
*
*
*
20
0
0
1
10
∗-
*
kontrola
100
pridaná dávka ghrelínu -ng /ml média
signifikantné rozdiely v porovnaní s kontrolou
(bez
pridaná dávka ghrelínu -ng /ml média
∗ - Pozri Obr.3
prídavkov) (p<0,05).
Hodnoty ukazujú priemer
± smerodajnú
odchýlku
Hodnoty 1, 10, 100 ng/ml boli porovnávané
s kontrolou 0 ng/ml
Obr.5. Vplyv ghrelínu na expresiu
Obr.6 Expresia proliferačného jadrového
PCNA v kultivovaných granulóznych
antigénu PCNA po pridaní ghrelínu
bunkách ošípaných bez (kontrola) a po
bez transfekcie p53 (vľavo) a po transfekcií
transfekcií c DNA génovou konštrukciou
cDNA génovou konštrukciou pre p53 (vpravo)
pre p53 (imunocytochémia)
(Western blotting)
33
% buniek obsahujúcich PCNA
100
overexpresia p53
*
80
*
60
40
*
20
0
1
10
100
0
1
10
100
0
kontrola
0
1
10
Pridaná dávka ghrelínu (ng/ml média)
100
Pridaná dávka ghrelínu (ng/ml
média)
pridaná dávka ghrelínu -ng /ml média
+ transfekcia s p53
∗ - Pozri Obr.3
Obr.7. Vplyv ghrelínu na sekréciu
Obr.8. Vplyv ghrelínu na sekréciu
PGF v kultivovaných granulóznych
OT v kultivovaných granulóznych
bunkách ošípaných bez (kontrola) a po
bunkách ošípaných bez (kontrola) a po
transfekcií c DNA génovou konštrukciou
transfekcií c DNA génovou konštrukciou
pre p53 (RIA)
220
200
180
6
*
160
140
*
120
kontrola
100
*
*
*
80
60
20
overexpresia p53
*
40
Vylučovanie OT (ng / 10 buniek/deň)
6
Vylučovanie PGF (ng / 10 buniek/deň)
pre p53 (RIA)
140
120
overexpresia p53
100
*
*
kontrola
80
*
60
40
20
*
*
*
0
1
10
100
pridaná dávka ghrelínu -ng /ml média
0
1
10
100
pridaná dávka ghrelínu -ng /ml média
∗ - Pozri Obr.3
∗ - Pozri Obr.3
Obr.9. Vplyv ghrelínu na sekréciu
PGE2 v kultivovaných granulóznych
bunkách ošípaných bez (kontrola) a po
transfekcií c DNA génovou konštrukciou
6
Vylučovanie PGE2 (ng / 10 buniek/deň)
pre p53 (RIA)
350
overexpresia p53
*
300
*
250
*
200
*
∗ - Pozri Obr.3
150
100
kontrola
50
0
1
10
100
pridaná dávka ghrelínu -ng /ml média
34
Diskusia
Ako prví sme zistili, že transfekcia s p53 znižovala expresiu ASK-1 a Bax. Medzi Bax a p53
existuje korelácia v stimulovaní apoptózy v granulóznych bunkách ľudí, čo opisujú (Choi a
kol. 2004). Transfekcia s p53 zvyšovala expresiu PCNA, znižovala vylučovanie PGF, a
naopak zvyšovala vylučovanie PGE2 a OT u ošípaných. Tieto pozorovania demonštrujú, že
transkripčný faktor p53 je zainteresovaný v inhibícií apoptózy, stimulácií proliferácie a
uvolňovaní hormónov ovariálnymi bunkami.
Počas výskumov sme zistili, že ghrelín znižuje % buniek obsahujúcich ASK-1 a Bax, v
granulóznych bunkách vaječníkov ošípaných a tým pravdepodobne znižuje ich apoptózu.
Nezhodujeme sa s pozorovaniami Sirotkina a kol. (2006), ktorí pozorovali stimulačný vplyv
ghrelínu na apoptózu u kurčiat. Zistili sme, že ghrelín neovplyvňuje proliferáciu
v granulóznych bunkách ošípaných. Naše výsledky sa nezhodujú s pozorovaniami Pivka a
kol. (2003), ktorý opisuje stimulačný vplyv ghrelínu na proliferáciu ovariálnych buniek
králikov. Rozdiely vo výsledkoch budú pravdepodobne spôsobené druhovou špecifitou a
rozdielnymi vplyvmi ghrelínu na rôzne živočíšne druhy.
Ghrelín mal v našom prípade stimulačný účinok na hormóny ovárií – oxytocín, prostaglandín
F, a PGE2.
Originálne sú údaje o schopnosti transfekcie s p53 modifikovať efekty hormónu ghrelínu
v ováriách ošípaných na vybrané markery.
Výsledky nášho výskumu svedčia o schopnosti regulácie apoptózy, proliferácie a sekrécie
transkripčným faktorom p53. Modifikačné efekty p53 voči peptidovému hormónu ghrelínu po
transfekcií s p53, svedčia o tom, že p53 môže byť potencionálnym sprostredkovateľom
účinku ghrelínu na ováriá ošípaných. Hormón ghrelín môže regulovať ovariálnu apoptózu a
sekréciu u ošípaných.
Pravdepodobne sme prví, ktorí sme zistili účinok ghrelínu
na
proapoptotickú kinázu - ASK-1 u uvedeného živočíšneho druhu.
Záver
(1)
p53 môže byť zapojený do regulácie
sekrécie)
ovariálnych funkcií (proliferácie, apoptózy,
(2) Hormón ghrelín je zapojený do regulácie ovariálnych funkcií (apoptózy a sekrécie) u
ošípaných
(3) p53 môže byť sprostredkovateľom účinku ghrelínu na ováriá u ošípaných
(4) Nie je vylúčené, že ASK-1 kináza môže byť sprostredkovateľom účinku ghrelínu na
ovariálne funkcie ošípaných
35
Liteeratúra
ESTIENNE, M.J.- BARB, C.R. (2005): The control of adenohypophysial hormone secretion by amino acids and
peptides in swine., Domest Anim Endocrinol. 29(1), 34-42
GRIMBERG, A.- COLEMAN, C.M.-SHI, Z.-BURNS, T.F.-MACLACHAN, T.K.-WANG, W.-EL-REIRY,
W.S. (2006): Insulin-like growth factor binding protein-2 is a novel mediator of p53 inhibition of insulin-like
growth factor signaling. Cancer Biol Ther. 5(10), 1408-14
HSIEH, Y.Y.-CHANG, C.C.-HSU, C.W.-LIN, C.S. (2004): Gene transfection with p53 and p21 inhibit cell
proliferation, collagen type I, leukemia inhibitory factor, and tumor necrosis factor-alpha expression in
leiomyoma cells. Fertil Steril. 81(6), 1665-70
CHOI, D.-HWANG, S.- LEE, E.-YOON, S.-YOON, B.K.-BEE, D. (2004) Expression of mitochondriadependent apoptosis genes (p53, Bax, and Bcl-2) in rat granulosa cells during follicular development, 11(5), 3117
LEE, W.J.- KOH, E.H.- WON, J.C.- KIM, M.S.-PARK, J.Y.- LEE, K.U. (2005): Obesity: the role of
hypothalamic AMP-activated protein kinase in body weight regulation. Int J Biochem Cell Biol. 37(11),2254-9.
MATAS, D.-MILYAVSKY, M.-SHATS, I.-NISSIM, L.-GOLDFINGER, N.-ROTTER, V.: (2004) p53 is
regulator of macrophage differentiation. Cell Death Differ. 11(4), 458-67.
MAZZOCHI, G.- NERI, G.- RUCINSKI, M.- REBUFFAT, P.- SPINAZZI, R.- MALENDOWICZ, L.K.NUSSDORFER G.G. (2004): Ghrelin enhances the growth of cultured human adrenal zona glomerulosa cells by
exerting MAPK-mediated proliferogenic and antiapoptotic effects. Peptides, 25(8),1269-77.
OSBORN, M.- ISENBERG, S.: (1994) Immunocytochemistry of frozen and paraffin tissue sections. Cell
Biology.A Laboratory Handbook. New York: Academic Press, vol. 2 367 s.
PIVKO, J. (2003) :Regulation and evaluation of ovarian funktion and embryogenesis in normal and transgenic
animals in vitro and in vivo.Journal of Pharm Animal science., 26(6), 20-21
SIROTKIN, A.V.-GROSSMANN, R.-MARIA-PEON, M.T.-ROA, J.-TENA-SEMPERE, M.-KLEIN, S.
(2006): Novel expression and funktional role of ghrelin in chicken ovary. 26;257-258, 15-25
Kontaktná adresa:
RNDr. Andrej Benčo, Katedra zoológie a antropológie, FPV UKF v Nitre, Nábrežie mládeže
91, 949 01 Nitra, e-mail:[email protected]
h.doc., RNDr. Alexander V. Sirotkin, PhD., DrSc., SCPV, VÚŽV Nitra, Hlohovská 2, 949 92
Nitra, e-mail: [email protected]
VPLYV PROBIOTIKA BONVITAL NA ÚŽITKOVÉ PARAMETRE VÝKRMOVÝCH
OŠÍPANÝCH
THE EFFECT OF THE PROBIOTIC BONVITAL ON PRODUCTION PARAMETERS IN
FATTENING PIGS
Bindas, Ľ., Vajda, V., Maskaľová, I.
Katedra výživy, dietetiky a chovu zvierat, UVL Košice
Abstract
Results of the feeding experiment conducted on 94 fattening pigs, based on supplementation
of their diet with probiotic preparation Bonvital at a dose of 4.4 x 105 CFU/kg mixed feed
(3.27- 5.68 x 105 CFU/kg) during 103 – day fattening period up to the slaughter grade,
confirmed positive influence of this preparation on growth intensity, feed conversion and
significantly higher slaughter weight. The fattening pigs in experimental group reached
slaughter weight of 108.6± 10,3 kg while those in the control group weighed 101.9± 11,3 kg,
the difference 6.7kg (P<0.01). The experimental group reaching mean weight gain 707.8
36
g/day and control group 639.8 g/day, the difference 68 g,i.e.10,6%. The feed consumption per
kilogram weight was in the experimental group 3.39 kg compared to the control 3.75 kg.The
feed consuption per kg weight gain in the control group was higher by 0.36 kg, which
amounts to 11,6%.
Keywords :fattening pigs; probiotic; nutrition; growth intensity; conversion of feed
Úvod a literárny prehľad
V poslednom období mimoriadne narastá záujem o využívanie prípravkov na báze
prirodzených komponentov, pozitívne ovplyvňujúcich produkčné zdravie zvierat bez
negatívneho účinku na zdravie konzumenta a životné prostredie. Uvedené podmienky veľmi
dobré spĺňajú probiotika. Salminen a kol.,(1998) definuje probiotika ako živé mikrobiálne
kŕmne prídavky, ktoré sú prospešné pre zdravie.
Podľa Ouwehanda a kol. (2002) by
v definícii nemalo byť slovo živý lebo pozitívny vplyv na zdravie majú tiež inaktivované
bunky mikroorganizmov alebo len časť bunečných štruktúr hlavne baktérii a kvasiniek.
Probiotika pomáhajú udržiavať rovnováhu ekosystému tráviaceho traktu, majú inhibičný
účinok voči patogénom, optimalizačný vplyv na tráviace procesy, imunostimulačný efekt,
antitumorovú a anticholesterolovú aktivitu. Bomba (2005). Inhibičný efekt probiotík voči
patogénnom môže byť sprostredkovaný kompetíciou o receptory na črevnej sliznici,
kompetíciou o živiny, produkciou antibakteriálnych látok a stimuláciou imunity Freter (1992)
Zvýšenie intenzity rastu a zlepšenie konverzie krmiva u odstavčiat po zaradení do kŕmnej
dávky probiotika Lactiferm (Enterococcus faecium M 74 ) zaznamenali Herzig a kol. (2003).
Významné sú tiež poznatky pôsobenia probiotika u starších ošípaných. Marcin a kol. (1999)
v pokuse so 60 výkrmovými ošípanými ( s počiatočnou priemernou hmotnosťou 22, 98 kg)
počas celého výkrmového obdobia sledovali vplyv probiotického kmeňa Enterococcus facium
( 5. 109 baktérií v g preparátu), ktorý bol aplikovaný v množstve 150 g. t-1 krmiva, na
intenzitu rastu a konverziu krmiva. Zaradenie probiotického kmeňa Enterococcus facium pri
mierne vyššej intenzite rastu počas celého výkrmu sa prezentovalo o 8% nižšou spotrebou
krmiva na kg prírastku. Pozitívne účinky probiotika na úžitkové parametre u výkrmových
ošípaných pozorovali Hong a kol. (2002). Zaradenie probiotického komplexu ( Pichia
anomala ST, Galactomyces geotrichum SR 59, Thiobacillus sp.) do kŕmnej dávky výkrmovým
ošípaným signifikantne zvýšilo stráviteľnosť sušiny a dusíka, priemerné denné prírastky
a znížilo exkréciu dusíka. V našom experimente sme sa zamerali na sledovanie vplyvu
37
probiotika Bonvital s aktívnou zložkou Enterococcus faecium DSM 7134 v kŕmnej dávke
výkrmových ošípaných na zdravotný stav, rastovú intenzitu , príjem a konverziu krmiva.
Materiál a metodika
Do experimentu bolo zaradených 96 prasiat v dobrom zdravotnom stave. Prasatá boli
rozdelené do dvoch skupín. V pokusnej skupine 48 prasiat v 4 ustajňovacích boxoch po 12
kusov o priemernej počiatočnej hmotnosti 35,7 kg ± 3,1. V kontrolnej skupine 48 prasiat v 4
ustajňovacích boxoch po 12 kusov o priemernej počiatočnej hmotnosti 36,0 kg ± 2,6 bolo
umiestnené v inej hale s rovnakou technológiou.
Použité krmivá a kŕmenie : Kontrolná skupina: 30 hmotnostných dielov bielkovinový
koncentrát, 70 hmotnostných dielov šrotovaná kukurica, 248 hmotnostných dielov voda,
kŕmenie tekutým krmivom s obsahom sušiny 22,8 %, ad libitum. Pokusná skupina:– kŕmna
dávka a kŕmenie rovnaké ako v kontrolnej skupine, ale do diéty zamiešaný Bonvital v dávke
100g/t kŕmnej zmesi, koncentrácia Enterococcus fecium DSM 7134 1 x 10
10
CFU/ g
produktu, 1,32 x 105 CFU/ kg krmiva, kŕmenie ad libitum. Denná dávka bola podľa rastu
v týždňových intervaloch upravovaná. Spotreba krmív bola podľa skupín v halách evidovaná.
Odber vzoriek a vyšetrenia: Z kŕmnych zmesí boli odobraté priemerné vzorky. Analytické
metódy: stanovenie sušiny, dusíkatých látok, hrubého tuku, vlákniny, popola, škrobu podľa
príslušných ustanovení Výnosu MP SR zo 7. októbra 1997, číslo 1497/4 –100 „O úradnom
odbere vzoriek a laboratórnom skúšaní a hodnotení krmív“. Stanovenie aminokyselín po
kyslej hydrolýze, sírnych aminokyselín po oxidácii
na automatickom analyzátore
aminokyselín.
Ustajnenie : na roštovej podlahe z plastov bez podstielky. Ustajňovacie priestory boli
temperované na teplotu 270 C s poklesom na 200 C ku koncu experimentu.
Váženie zvierat : na začiatku experimentu a v mesačných intervaloch do ukončenia kŕmneho
pokusu, spolu štyri individuálne váženia.
Zdravotný stav: bol sledovaný denne ošetrovateľským personálom a veterinárnym lekárom.
Štatistické vyhodnotenie : Studentov t- test.
Výsledky a diskusia:
Výsledky vyšetrenia použitých krmív vo výžive výkrmových ošípaných sú v tabuľke 1. Pri
hodnotení použitých kŕmnych dávok v experimente sme zistili minimálne nutričné rozdiely
medzi pokusnými skupinami. Kŕmne dávky analyticky stanovenou koncentráciu
živín
a energie odpovedali požiadavkám pre výkrmové ošípané.
38
Tabuľka 1. Výsledky nutričnej analýzy kŕmnych dávok pre výkrmové ošípané
Ukazovatele
Kontrolná
Pokusná
766,6
766,1
142,8
143,9
29,1
29,8
34,3
33,7
49,8
51,4
510,6
507,3
9,22
8,96
Metionín + cystín, g. kg
5,42
5,5
Metabolizovateľná energia MJ. kg-1
11,5
11,5
-1
Sušina, g. kg.
N – látky, g. kg-1
-1
Vláknina, g. kg
-1
Hrubý tuk, g. kg
-1
Popol, g. kg
-1
BNLV, g. kg
Lyzín, g. kg-1
-1
Výsledky vplyvu probiotického prípravku Bonvital na intenzitu rastu vo výkrme ošípaných
sú v tabuľke 2
Tabuľka 2 Vplyv probiotického prípravku Bonvital na rastové parametre výkrmových
ošípaných
Ukazovatele Kontrolná skupina
počet
Pokusná skupina
Øhmotnosť Ø denné
kg
prírastky g
počet
Øhmotnosť Ø denné
kg
prírastky g
0 deň
48
36,0±2,6
-
48
35,7±3,1
-
30. deň
48
56,2±7,7
651,6
47
58,8±7,3
745,2
60.deň
47
75,9±8,3
681,1
47
79,5±8,3
713,8
103. deň
47
101,9±11,3 604,1
47
108,6±10,4 676,2
prírastok
65,9
639,8
72,9
707,8
Pri hodnotení rastovej intenzity rýchlejší rast bol pozorovaný v pokusnej skupine, čo možno
dokumentovať vyššími priemernými prírastkami vo všetkých sledovaných fázach.
Najvýraznejší vplyv probiotického prípravku Bonvital na intenzitu rastu sme pozorovali
v prvom mesiaci výkrmu. Pokusná skupina
v tejto fáze výkrmu dosahovala priemernú
hmotnosť 58,8±7,3 kg a kontrolná skupina 56,2±7,7 kg, rozdiel bol 2,6 kg resp.4,6%.
Priemerný denný prírastok za sledované obdobie bol v skupine výkrmových ošípaných
s prídavkom Bonvital 745,2 g/deň a kontrolná skupina 651,6 g/deň, rozdiel bol 93,6 g resp.
14,4%. Tendencia rýchlejšieho rastu pokračovala aj v druhej fáze výkrmu 31 – 60 dní, pri
priemernej hmotnosti v pokusnej 79,5±8,2 oproti 75,9±8,2 kg v kontrolnej skupine, rozdiel
narástol oproti prvej fáze na 3,6 kg so štatistickou významnosťou P<0,05. Pokusná skupina
výkrmových ošípaných v tejto fáze dosiahla priemerný denný prírastok 713,8g/deň
39
a kontrolná 681,1g/deň rozdiel 32,7g resp.4,7%. Rozdiel v intenzite rastu medzi pokusnou
a kontrolnou
skupinou
výkrmových
ošípaných
sa
vo
finálnej
fáze
v porovnaní
s predchádzajúcou ešte zvýšil. V tretej fáze 61 – 103 dní výkrmu priemerný prírastok
v pokusne skupine bol 676,2g/deň oproti kontrolnej 604,1g, rozdiel 72,1 g resp.12 %, takmer
dosahoval výšku najvýraznejšieho rozdielu v prvej fáze výkrmu. Vyššiu priemernú finálnu
hmotnosť 108,6±10,3 kg, pri vyrovnanej počiatočnej hmotnosti, dosiahli počas 103 dňového
výkrmového obdobia ošípané ktorých diéty boli obohatené probiotickým prípravkom Bonvital
v porovnaní s kontrolnou skupinou 101,9 kg, rozdiel 6,7 kg resp.6,6%, štatisticky vysoko
významnou preukaznosťou P<0,01. Za celé sledované výkrmové obdobie ošípané pokusnej
skupiny vytvorili priemerný celkový prírastok 72,9 kg a v kontrolnej 65,9 kg, rozdiel 7 kg
resp.10,6%.
Výsledky vplyvu probiotického prípravku Bonvital v prvej fáze výkrmu ošípaných na
priemerný denný príjem krmiva, konverziu krmiva, dusíkatých látok a metabolizovateľnej
energie na úrovni kŕmnych boxov sú uvedené v tabuľke 3
Tabuľka 3 Vplyv probiotického prípravku Bonvital na príjem krmiva, konverziu
krmiva, N – látok a energie v prvom mesiaci výkrmu ošípaných
Ukazovatele
Kontrolná skupina
Pokusná skupina
n - 48
n - 47
Ø denný príjem krmiva v kg
1,79
1,79
Konverzia krmiva, kg/kg
2,75
2,40
Konverzia N – látok g/kg
395,73
342,7
Konverzia ME
31,63
27,6
MJ/kg
Pri hodnotení úspešnosti rastu je dôležitá spotreba krmiva na kg prírastku, konverzia
dusíkatých látok a energie. Najvýraznejší rozdiel v prospech pokusnej skupiny bol v prvom
mesiaci výkrmu, čo je v zhode aj najvyšším rozdielom v intenzite rastu medzi skupinami.
Výkrmové ošípané v hodnotenom období potrebovali na vytvorenie kg prírastku 2,40 kg
krmiva, kontrolná skupina 2,75 kg, rozdiel 0,35 kg, resp. 12,7%. Spotreba dusíkatých látok na
kg prírastku v pokusnej skupine bola 342,7g v kontrolnej 395,73g, rozdiel 53,03g resp.
13,4%. Podobná je tendencia pri hodnotení konverzie energie, pokusná skupina 27,6,
kontrolná 31,63 MJ ME/kg, rozdiel 4,03 MJ, resp.12,7%.
40
Tabuľka 4 Vplyv probiotického prípravku Bonvital na príjem krmiva, konverziu
krmiva, N – látok a energie v druhom mesiaci výkrmu ošípaných
Ukazovatele
Kontrolná skupina
Pokusná skupina
n - 47
n - 47
Ø denný príjem krmiva v kg
2,47
2,47
Konverzia krmiva, kg/kg
3,63
3,46
Konverzia N – látok g/kg
518,36
497,89
Konverzia ME
41,75
39,79
MJ/kg
Lepšie využitie krmiva na tvorbu prírastku, i keď s menším rozdielom sme pozorovali aj
v druhom mesiaci výkrmu ošípaných. Zaradenie probiotika do diéty ošípaných znížilo
spotrebu krmiva /kg prírastku na 3,46 kg v porovnaní s kontrolnou skupinou 3,63 kg, rozdiel
0,17 kg, resp.4,7%. Transformácia dusíkatých látok
krmiva na priemerný prírastok
hmotnosti v pokusnej skupine ošípaných bola 497,89g/kg a v kontrolnej 518,36g/kg, rozdiel
20,47g resp. 4%. Spotreba energie v pokusnej skupine 39,79MJ ME/kg, v kontrolnej o 1,96
MJ viac 41,75 MJ ME/kg, rozdiel 4,7%.
Tabuľka 5 Vplyv probiotického prípravku Bonvital na príjem krmiva, konverziu
krmiva, N – látok a energie vo finálnej fáze výkrmu ošípaných
Ukazovatele
Kontrolná skupina
Pokusná skupina
n - 47
n - 47
Ø denný príjem krmiva v kg
2,79
2,79
Konverzia krmiva, kg/kg
4,62
4,13
Konverzia N – látok g/kg
659,74
594,31
Konverzia ME
53,13
47,50
MJ/kg
Vysoký rozdiel v intenzite rastu výkrmových ošípaných vo finálnej fáze je v zhode
s výrazným rozdielom medzi skupinami tiež v konverzii krmiva. Pokusná skupina ošípaných
potrebovala na tvorbu kg prírastku 4,13 kg, kontrolná 4,62 kg , rozdiel 0,49kg, resp. 10,6%.
Podobná situácia je pri hodnotení konverzie dusíkatých látok, pokusná skupina 594,31g/kg,
kontrolná o 65,43g viac t.j. 659,74g/kg, rozdiel 10%. Aj spotreba energie na tvorbu prírastku
bola vyššia v kontrolnej skupine 53,15MJ/kg a v pokusnej o 5,63MJ menej t.j. 47,50MJ/kg,
rozdiel 10,6%.
41
Tabuľka 6 Vplyv probiotického prípravku Bonvital na príjem krmiva, konverziu
krmiva, N – látok a energie za celé obdobie výkrmu ošípaných
Ukazovatele
Kontrolná skupina
Pokusná skupina
n - 47
n - 47
Ø denný príjem krmiva v kg
2,39
2,39
Konverzia krmiva, kg/kg
3,75
3,39
Konverzia N – látok g/kg
535,5
487,8
Konverzia ME
43,13
38,99
MJ/kg
Vyššia konverzia krmiva v pokusnej skupine s prídavkom Bonvital bola aj za celé obdobie
výkrmu ošípaných, keď priemerná spotreba krmiva na kg prírastku bola 3,39 kg
a v kontrolnej skupine o 0,36 kg na kilogram prírastku vyššia 3,75kg, rozdiel v percentách
9,6%. Podobný účinok probiotika v kŕmnej dávke výkrmových ošípaných bol zaznamenaný aj
pri hodnotení využitia
dusíkatých látok a energie na tvorbu prírastku, pokusná skupina
dusíkaté látky 487,8g/kg a kontrolná 535,5g/kg, rozdiel 47,7 g resp.8,9%, spotreba energie
pokusná skupina 38,99 MJ ME/kg a kontrolná 43,13 MJ ME/kg, rozdiel 4,14 MJ, resp. 9,6%.
Záver
Pri fortifikácii kompletných kŕmnych zmesí pre výkrmové ošípané probiotickým prípravkom
Bonvital sme zistili:
•
vyššiu finálnu hmotnosť výkrmových ošípaných s prídavkom Bonvital o 6,7 kg,
priemerná hmotnosť pokusnej skupiny 108,6kg, kontrolnej 101,9 kg, P<0,01
•
priemerný prírastok za 103dňové obdobie pri pokusnej skupine 707,8 g/deň a pri
kontrolnej 639,8 g/deň, rozdiel 10,6%
•
najvýraznejší vplyv prípravku Bonvital u odstavčiat v prvom mesiaci experimentu,
pokusná skupina
dosiahla priemerný denný prírastok 745,2g/deň a kontrolná
651,6g/deň, rozdiel bol 93,6 g resp. 14,4%.
•
lepšiu konverziu krmiva počas celého výkrmového obdobia, v pokusnej skupine,
spotreba krmiva na kilogram prírastku bola 3,39kg a v kontrolnej 3,75kg, rozdiel
0,36kg, resp.9,6%
•
podobný účinok probiotika v kŕmnej dávke výkrmových ošípaných bol zaznamenaný
aj pri hodnotení využitia dusíkatých látok a energie na tvorbu prírastku, pokusná
skupina dusíkaté látky 487,8g/kg a kontrolná 535,5g/kg, rozdiel 47,7 g resp.8,9%,
42
spotreba energie pokusná skupina 38,99 MJ ME/kg a kontrolná 43,13 MJ ME/kg,
rozdiel 4,14 MJ, resp. 9,6%.
Literatúra
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
BOMBA, A., KAŠTEĽ, R., GANCARČÍKOVÁ, S., NEMCOVÁ, R., HERICH, R., ČÍŽEK, M. 1996 :
The effect of lactobacilli inoculation on organic acid levels in the mucosal film and the small intestine
contents in gnotobiotic pigs. Berl. Munch.Tierztl. Wschr., 109, pp. 428 – 430
BOMBA, A. 2005 : Gnotobiotické zvieratá v probiotickom výskume. Doktorská dizertačná práca, UVL
Košice, pp.92
FRETER,R.1992: Factors affecting the microecology o the gut.Probiotics, The Scientific Basis,
Chapman and Hall, London, pp.111 – 114
HERZIG, I., GOPFERT, E., PISARIKOVA, B., STRAKOVA, E. 2003 : Testing of growth promoting
and protective activity of the probiotic Lactiferm in weaned piglets. Acta Veterinaria Brno, 72, 3, pp.
331 - 338
HONG, J. W., KIM, I. H., KWON, O. S., KIM, J. H., MIN, B. J., LEE, W. B. 2002 : Effects of dietary
probiotics supplementation on growth performance and fecal gas emission in nursing and finishing pigs.
J. Anim. Sci. and Technol., 44, 3, pp. 305 - 314
MARCIN, A., VALIGA, J., MOLNÁROVÁ, I., IVANKO, Š. 1999 : Vplyv Enterococcus faecium M –
74 na produkčné, ekonomické a zdravotné ukazovatele u výkrmových ošípaných. Zborník z vedeckej
konferencie “Zdravie a choroby zvierat”, diel: “Výživa a zdravie zvierat”, Košice, 8. – 9. September
1999, pp. 135 - 139
OUWEHAND, A., SALMINE, S. 2000 : Probiotics, are they save for everybody? Proceedings : The
Prospects of probiotics in prevention and therapy of diseases of young. Hight Tatras, Slovak republic,
11 – 14 October 2000, pp. 25 - 27
SALMINEN, S., OUWEHAND,A.C., ISOLAURI, E. 1998: Clinical aplication of probiotic bacteria.
Int.Daiory J. 8, pp.563 - 572
Práca bola realizovaná za podpory firmy Lactosan Starterkulturen GmbH & Co KG, Rakúsko
Kontaktná adresa:
MVDr. Ľubor Bindas, PhD., Prof.MVDr.V.Vajda, PhD., MVDr.I.Maskaľová
Univerzita veterinárskeho lekárstva, Komenského 73, 041 81 Košice
VYUŽITIE GENOMIKY VO VÝSKUME FYZIOLOGICKÉHO POZADIA
EKONOMICKY VÝZNAMNÝCH VLASTNOSTÍ HOSPODÁRSKYCH ZVIERAT
THE USE OF GENOMICS IN THE RESEARCH OF PHYSIOLOGICAL BACKGROUND
OF ECONOMICALLY IMPORTANT FARM ANIMALS TRAITS
Bulla, J.
Katedra fyziológie živočíchov, Fakulta biotechnológie a potravinárstva SPU v Nitre
Abstract
Genomics in livestock has been concentrating on the construction of genome maps and their
use for the mapping of monogenic and quantitative trait loci. Most traits of economic
importance in farm animals are complex in that they are polygenic and influenced by nongenetic environmental factors. Large single gene effects can be detected as segregating QTLs
(quantitative trait loci) with genetic markers. In recent years, subsequent positional cloning
43
efforts have led to the elucidation of the causal mutation for several genetic diseases,
metabolic variation but also monogenic factors affecting muscle mass, meat quality and
ovulation rate in different livestock species. In several cases, unexpected or previously
unknown genes have been detected. Physiological evidence is however very preliminary
especially for the elucidation of pleiotropic effect and for quantitative traits. Experiments
studying metabolic control of production characteristics can be designed to capitalize on the
existence of genes and its functional variants.
Key words: genomics, physiology, livestock, traits
44
45
46
47
VPLYV HYPODYNAMIE NA ŠTRUKTÚRU A FUNKCIU ENTEROCYTOV
DUODENA JAPONSKÝCH PREPELÍC
EFFECT OF HYPODYNAMY ON STRUCTURE AND FUNCTION OF DUODENAL
ENTEROCYTES OF JAPANESE QUAILS
Cigánková, V., Almášiová, V., Holovská, K., Lenhardt Ľ., Škrobánek P*., Zibrín, M.
Department of Anatomy, Histology and Physiology University of Veterinary Medicine, Košice
*Institute of Animal Biochemistry and Genetics, SAS, Ivanka pri Dunaji
Abstract
The effect of hypodynamy on the structure, ultrastructure, and enzymatic activity of the
duodenal enterocytes of Japanese quail (Coturnix coturnix japonica) was studied. On the
second day after hatching, 42 chicks were placed in individual slings suspended by a flexible
metal device in such a manner that their legs could not touch the floor. Feed and water was
provided ad libitum. Experimental animals were killed at 5, 7, 14, 21, 28, 35, and 42 d of age.
The birds of control group were kept under standard conditions on the floor. The samples of
the duodenum were routinely processed for light microscopy (LM) and transmission electron
microscopy (TEM), and alkaline phosphatase (AP) activity was determined. Morphological
changes in enterocytes of chicks reared under hypodynamy from day 2 after hatching were
observed on days 5 and 7 of age. LM showed that the apical ends of intestinal villi contained
clumps of necrotizing enterocytes which were more numerous compared to the control. TEM
revealed loss of microvilli and changes in both the nucleus and cytoplasm in these cells.
Besides considerable damage to mitochondria, they exhibited also typical vesiculation of
cytoplasm and damaged intercellular junctions. From day 14 to 42 of age morphological
changes were less pronounced. On day 7 of age, the activity of AP in the microvilli of
duodenal enterocytes of experimental chicks was increased in comparison with the control
(P<0.001). On day 14 of the experiment, AP in the investigated structures showed only
a slight increase (P<0.05) and on day 21 was also slightly increased (P<0.01). On days 28, 35,
and 42 of age, no significant differences in the activity of AP were observed. Hypodynamy
acted as a stress factor on Japanese quail, which was stronger at the beginning of the
experiment. Animals gradually adapted to the respective conditions. Our results show that
Japanese quail chicks are capable of feed consumption and feed conversion under conditions
of hypodynamy.
Key words: microgravity, histology, enterocytes, Japanese quail
48
Introduction
Japanese quail (Coturnix coturnix japonica) is a useful type of bird which is considered
prospective for the space programme and, at the same time, is a very suitable object for model
experiments (Boďa, 1997). Evolutionary processes responsible for shaping of bodies of
terrestrial animals were affected by earth gravitation. Both the skeleton and muscle systems,
responsible for body support, had adjusted to the gravitation forces. These systems respond to
microgravity by atrophy of the muscles of limbs, osteoporosis, and reproductive disorders
(Cigánková et al. 1993, 2001a, 2001b, 2005; Kočišová et al. 2002; Škrobánek et al. 2005;
Zibrín et al. 2003, 2005). Hypodynamy is a method which simulates microgravity in space.
Overall, hypodynamy has a negative effect on organism of Japanese quails. It induces changes
in their behaviour and causes marked decrease in their body weight (Škrobánek et al. 2003).
Škrobánek et al. (2004) observed the influence of long-term hypodynamy on body weight,
consumption of feed and growth of limbs of Japanese quail chicks. The authors observed that
56-d hypodynamy caused a 14-34% decrease in body weight compared to the control,
decrease in consumption of feed, and shortening the exposed limbs. Already short-term
hypodynamy caused stress resulting in adrenal hypertrophy but in case of long lasting
hypodynamy, gradual adaptation to the related stress was observed (Cigánková et al 2005).
The aim of the present study was to observe the influence of simulated weightlessness
on the structure and enzymatic activity of duodenal enterocytes of Japanese quail chicks kept
under hypodynamy conditions.
Material and Methods
The experiment was carried out at the Institute of Animal Biochemistry and Genetics of
SAS in Ivanka pri Dunaji. Forty-two female, newly hatched Japanese quail chicks were used
in the study. On the second day after hatching, chicks of the experimental group were exposed
to hypodynamy. Hypodynamy is a simulation of weightlessness where birds are placed in
individual slings suspended by a flexible metal device in such a manner that their legs cannot
touch the floor. However, chicks may move about freely by moving their wings. At the same
time, the chicks of control group were placed in rearing box. The birds of experimental and
control groups were kept in the respective conditions until 42 d of age in a windowless
poultry room with controlled ventilation. The lighting in the rearing room was left on
continuously. A commercial starter mash HYD-13 and water were available ad libitum. The
feed was granular and contained 260 g/kg protein and 11.5 MJ metabolizing energy/kg.
Immediately after killing on days 5, 7, 14, 21, 28, 35, and 42 of age, parts of the duodenum of
49
experimental chicks were removed in parallel with those of control. Each group consisted of 6
birds.
Samples of the duodenum were processed for light microscopy (LM), transmission
electron microscopy (TEM), and determination of alkaline phosphatase (AP) activity.
Samples of the duodenum for LM were processed routinely. They were fixed in 4% neutral
formaldehyde, embedded in paraffin, and the sections were stained with haematoxylin-eosin.
Excisions for TEM were fixed by immersion in 3% glutaraldehyde, postfixed in 1%
OsO4, dehydrated in acetone and propylene oxide, and embedded in Durcupan ACM. The
ultrathin sections were examined in the electron microscope Tesla BS 500.
The samples of the duodenum were frozen in liquid nitrogen vapours. AP activity was
demonstrated using a modified simultaneous azo–coupling method. The enzyme activity was
analysed cytophotometrically with a Vickers M 85a microdensitometer. Statistical evaluation
of the results was carried out by one way analysis of variance (ANOVA). The significance of
differences between the control and experimental animals was determined by Tukey test.
Results LM and TEM observations
In lm examination, experimental chicks, aged 5 days, showed morphological changes in
the apical ends of duodenal villi. Enterocytes and goblet cells showed signs of necrotization.
These cells occurred in groups by 2-5 and had darker cytoplasm. Using an electron
microscope, the changes were found in the nuclei and cytoplasm of the enterocytes. Their
cytoplasm was electrodense and nuclei were pycnotic with dilated perinuclear space. Also
cisternae of smooth and rough endoplasmic reticulum were markedly dilated and
mitochondrial outer membrane and cristae were damaged. Vesiculation of cytoplasm was
observed. Microvilli were damaged and their number was significantly reduced. The
intercellular junctions were disturbed and the damaged enterocytes and goblet cells sloughed
off. The enterocytes, which lined the remaining surface of intestinal villi, showed signs of
slight damage. Their cytoplasm was vacuolized. Control chicks of the same age showed less
frequent necrotization of cells of intestinal epithelium in comparison with experimental birds.
The apical ends of intestinal villi in control chicks contained only sporadic necrotizing
enterocytes and goblet cells. Structure of the enterocytes was not damaged and their
submicroscopic structure indicated normal absorption.
On day 7, the structure of duodenal epithelium in experimental chicks was similar to
that observed on day 5 of age. Some enterocytes showed signs of damage and were
50
necrotized. Loss of microvilli was observed on the apical surface of necrotizing cells. The
cytoplasm contained numerous vesicles and damaged mitochondria.
On day 14 of age, the number of necrotizing cells in the apical zone of intestinal villi in
experimental chicks was lower. Vacuoles in the cytoplasm of necrotizing enterocytes
coalesced and were filled with flocculated matter. Loss of microvilli on the apical surface of
enterocytes was observed.
On days 21–42 of age, the microscopic and submicroscopic structure of the duodenal
epithelium in experimental animals was normal. No significant morphological differences in
comparison with the control were observed. Enterocytes appeared as tall, slender, and
columnar cells which set on the basement membrane. On their free apical surface, there were
tall finger-like extensions of cell membrane – microvilli that formed a brush border.
Enterocytes had markedly polarized cytoplasm. Numerous longitudinal mitochondria,
cisternae of rough and smooth endoplasmic reticulum, free ribosomes, lysosomes, and
microtubules were found electronmicroscopically in the enterocyte cytoplasm. Golgi complex
was usually located supranuclearly. The basal part of enterocytes contained only a few
cellular organelles. The lateral walls of enterocytes were connected by zonula occludens,
zonula adhaerens, macula adhaerens, nexus, and interdigitations. Microvilli on the free apical
surface of enterocytes formed long slender finger-like extensions, which were surrounded by
a compact plasmalemma. Their inside was formed by homogenous cytoplasm with
microfilaments arranged into fascicles. The free surface of microvilli was covered with
delicate fibrous caruncles embedded into small glycoprotein layer which formed glycocalyx.
A narrow margin of the cytoplasm close under the base of microvilli did not contain almost
any organelles, except for microfilaments. Goblet cells were monocellular glands, which were
individually scattered between enterocytes and produced mucus. In the narrowed basal part,
they surrounded nucleus and cytoplasm with sporadic mitochondria, cisternae of endoplasmic
reticulum, and Golgi complex. Their apical part was filled with mucus droplets which fused
and covered with mucus the intestinal mucosa. The intestinal epithelium contained also
interspersed endocrinal cells and sporadic lymphocytes.
Histochemical analysis. On day 7, we observed that the activity of AP in the microvillous
zone of duodenal enterocytes of experimental chicks was increased in comparison with the
control (P<0.001). On day 14, in the experimental group, AP in the investigated structures
showed only a slight increase (P<0.05) and on day 21 was also slightly increased (P<0.01).
On days 28, 35, and 42 of age no significant differences in the activity of AP were observed.
51
Discussion
The microscopic and submicroscopic structure of the enterocytes of the small intestine
of Japanese quails, hatched on the orbital station MIR, was studied (Cigánková et al 2001a).
After their return to the earth, the animals were 4-5 d old. In some enterocytes of the
dudodenum and jejunum significant morphological changes were found. In the LM, the
damaged enterocytes appeared as dark cells. TEM studies confirmed the finding of these
“dead” cells. In the same animals, an increased activity of alkaline phosphatase, localized in
microvilli, was found in all intestinal villi in both observed parts of the small intestine. These
morphological and histochemical findings suggested that it was due to decreased feed intake.
In conclusion, it may be accepted that morphological changes in enterocytes did not arise due
to the direct effects of microgravity but due to reduced feed intake and they were considered
reversible.
Our investigations revealed that the most pronounced morphological changes in
enterocytes of experimental Japanese quails were observed on days 5 and 7 of age.
Observations under a light microscope showed that clumps of necrotizing enterocytes were
present on apical ends of intestinal villi and they were more pronounced in comparison with
the control. TEM allowed us to observe loss of microvilli and marked changes in the nuclei
and cytoplasm of the necrotising cells. However, also the ultrastructure of the remaining
enterocytes indicated that the stress related to suspending the chickens by means of special
jackets resulted in a decreased feed intake shortly after such handling. On day 14 to 42 of age,
the findings in enterocytes of the duodenum and jejunum of experimental chicks differed less
from those in the control chicks and the morphological picture was disturbed only slightly. By
histochemical analysis on day 7 of age, we detected only slightly increased activity of alkaline
phosphatase in duodenal enterocytes of experimental quails in comparison with the control.
This indicated an adaptation of the enzyme localized in the small intestine in the microvilli as
a response to the limited feed intake for its better utilization. Results of our observations agree
with the findings in the small intestine epithelium in Japanese quail hatched in a spacecraft
(Cigánková et al 2001a). The Japanese quail chicks hatched at the orbital station MIR,
similarly to those exposed to hypodynamy, were subjected to intensive stress. This is
supported by the structure of the adrenals of quail exposed to spacecraft conditions
(Cigánková et al 2001b) and those exposed to long-term hypodynamy (Cigánková et al 2005).
We presume that the increased number of necrotizing enterocytes in Japanese quail
observed at the beginning of the experiment was the consequence of insufficient feed intake.
52
Lower intake of feed and hypodynamy-induced atrophy of muscles resulted in decreased body
weight of quail chicks.
Acknowledgments: This work was supported by the Grant Agency for Science of
Slovak Republic VEGA 1/ 3495/ 06.
References
1.
2.
Boďa K.: Cosmic biology and veterinary medicine. Slov Vet J 1997, 22, 125-126.
Cigánková V., Kočišová J., Boďa K., Tomajková E., Dadasheva O.A.: Morphological changes in tissue of
the testes and kidneys in Japanese quail exposed to microgravity. Acta Vet (Brno) 1993, 62, Suppl.6, 69-71.
3. Cigánková V., Zibrín M., Kočišová J., Sabo V., Boďa K., Dadasheva O.A., Gurieva T.S.: Histological
changes in the adrenal glands of newly hatched Japanese quail chicks during a short stay on the orbital
station MIR. Folia Vet 2001 b, 45, 36-40.
4. Cigánková V., Lenhardt Ľ., Zibrín M., Kočišová J., Tomajková E., Komorová T., Sabo V., Boďa K.,
Dadasheva O.A., Gurieva T.S.: Morphological changes in the small intestine of Japanese quail chicks
hatched under the conditions of microgravity. Folia Vet 2001 a, 45, 27-31.
5. Cigánková V., Zibrín M., Boďa K., Holovská K.: Effect of long-term experimental hypodynamy on the
adrenal glands of Japanese quails: An ultrastructural study. Bull Vet Inst Pulawy 2005, 49, 449-453.
6. Kočišová J., Cigánková V., Zibrín M., Tomajková E., Sabo V., Boďa K., Dadasheva O.A., Gurieva T.S.:
Morphological study of gastrocnemius muscle in Japanese quail chicks hatched out in space flight.
Aviakosm Ekolog Med 2002, 36, 6-9.
7. Škrobánek P., Hrančová M.: Adaptability of Japanese quail chicks to conditions of simulated
weightlessness. Acta Vet (Brno) 2003, 2, 347-351.
8. Škrobánek P., Hrbatá M., Baranovská M., Juráni M.: Growth of Japanese quail chicks in simulated
weightlessness. Acta Vet Brno 2004, 73, 157-164.
9. Škrobánek P., Baranovská M., Juráni M., Šárniková B.: Influence of simulated microgravity on leg bone
development in Japanese quail chicks. Acta Vet (Brno) 2005, 74, 475-481.
10. Zibrín M., Boďa K., Cigánková V., Kočišová J., Komorová T., Tomajková E., Sabo V., Pivko J.: Long-term
experimental hypodynamy affects the structure of spongy bone and osteoclasts in Japanese quail. Acta Vet
(Brno) 2003, 72, 143-149.
11. Zibrín M., Cigánková V., Kočišová J., Tomajková E., Komorová T., Boďa K., Weismann P., Dadasheva
O.A., Gurieva T.S.: Effect of short-term space flight on structure of liver, lungs, bone and bone marrow of
Japanese quail hatched on orbital station Mir. Acta Vet (Brno), 2005, 74, 167-174
Viera Cigánková, Doc. MVDr.,Univerzita veterinárskeho lekárstva, Ústav histológie
a embryológie, Komenského 73, 041 81 Košice, e-mail: [email protected]
KVANTITATÍVNE HODNOTENIE OBLIČIEK APODEMUS FLAVICOLIS
Z EKOSYSTÉMOV V NOVÁKOCH
QUANTITATIVE ANALYSIS OF KIDNEYS OF APODEMUS FLAVICOLIS FROM
ECOSYSTEMS IN NOVAKY
1
Drábeková, J., 2Jančová, A., 3Massányi, P., 3Lukáč, N.
1Katedra
matematiky, Fakulta ekonomiky a manažmentu, SPU Nitra
zoológie a antropológie, Fakulta prírodných vied, UKF Nitra
3Katedra fyziológie živočíchov, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, SPU Nitra
2Katedra
Abstract
This work presents histological analysis of kidney tissue. We evaluated microscopical kidney
structures of species Apodemus flavicolis (Muridae, Rodentia). Samples for histological
53
preparations were taken from adult individuals, which were in a very good physical condition
and sexual active. They come from ecosystems that are situated close to thermal power station
Novaky. For quantitative analysis morphometrical image analyzer softwer (Micro Image ver.
4.0) was used according to micromorphological criteria. The diameter of renal corpuscle,
glomeruli, Bowman’s capsule, tubules as well as height of tubular epithelium, surface of
tubules and lumen, perimeter of tubules and lumen were evaluated. The differences between
male and female in quantitative analysis were statistical significant (P<0.05).
Úvod
Početné populácie drobných zemných cicavcov sú významnými zložkami takmer všetkých
pevninských ekosystémov. Považujú sa za vhodných bioindikátorov antropogénneho
zaťaženia
krajiny
pretože
pomocou
nich
môžeme
odhaliť
a monitorovať
rôzne
ekotoxikologické poruchy. Ich vhodnosť dokazuje skutočnosť, že škodliviny na ne pôsobia
podobne ako na človeka a domáce zvieratá, ale chorobné príznaky sú pri týchto živočíchoch
veľmi skoro a ľahko pozorovateľné. Apodemus flavicolis z čeľade Muridae (Rodentia) je
fylogeneticky mladým organizmom a z toho vyplývajú aj jeho možné citlivé reakcie na rôzne
druhy noxií v životnom prostredí. V článku sa zaoberáme mikroskopickou stavbou obličiek,
ktoré patria medzi mimoriadne senzitívne orgány na kumuláciu cudzorodých látok
a ovplyvnenie ich štruktúry môže mať za následok renálne dysfunkcie až zlyhanie základných
procesov fyziológie močovej sústavy.
Materiál a metodika
Obličky z ktorých boli odobraté vzorky na histologické analýzy pochádzajú z adultných,
sexuálne aktívnych jedincov Apodemus flavicolis, ktoré boli vo veľmi dobrej telesnej
kondícii. Boli získané z ekosystémov v blízkosti tepelnej elektrárne v Novákoch pomocou
štandardných teriologických metód a postupov. Vzorky z obličiek sa fixovali v 10% formole,
následne sa odvodnili vzostupným radom alkoholov (70%, 80%, 96%, 100%), presýtili
benzénom a zaliali do parafínu. Zaliate bločky sa následne narezali na sánkovom mikroskope
a rezy hrubé 10 µm boli farbené hematoxylínom a eozínom (Vacek, 1974).
Z preparátov sa zhotovili mikrofotografie (Olympus, Provis Ax, Japan) a tie sme na základe
mikromorfologických kritérií kvantitatívne zhodnotili (Weibel et al., 1966). Pri týchto
analýzach bol využitý softwér Micro Image ver. 4.0. Zisťovali sme priemer glomerulov,
Bowmanovho púzdra, priemer obličkového telieska, priemer tubulov, výšku epitelu tubulov,
plochu tubulov, obvod tubulov, plochu lumenu tubulov, obvod lumenu tubulov. Zo získaných
54
hodnôt sme vypočítali základné variačno-štatistické ukazovatele (aritmetický priemer x ,
x , minimum xmin , maximum x max , smerodajnú odchýlku ± s , variačný koeficient vk )
medián ~
využitím PC programu Excel. Korelačné koeficienty a štatistickú preukaznosť výsledkov sme
zisťovali pomocou analýzy rozptylu a programu SAS 9.1.
Výsledky a diskusia
Na zhotovených mikrofotografiách sme pozorovali základnú stavebnú a funkčnú jednotku
obličky, nefrón (nephonum), a intrarenálne vývodné močové cesty. Obličkové telieska
(corpusculum renis) boli zložené z Bowmanovho puzdra (capsula glomerula) a klbka
navzájom anastomozujúcich kapilár (glomerulum). Ďalšia časť nefrónu, močový kanálik
(tubulus renis) bol tvorený jednou vrstvou epitelových buniek.
V rámci kvantitatívneho morfometrického hodnotenia sme pomocou softwéru zisťovali
priemer jednotlivých častí obličkového telieska. Hodnotili sme 11 meraní obličkového
telieska u samíc a 12 meraní obličkového telieska u samcov druhu Apodemus flavicolis. Údaje
sú zaznamenané v tabuľke 1. Vzhľadom na fakt, že obličkové telieska nemali guľovitý tvar,
pri meraní priemeru jednotlivých častí obličkového telieska udávame v tabuľke 1 menší aj
väčší priemer eliptického tvaru glomerula, Bowmanovho puzdra aj celého obličkového
telieska.
Tabuľka 1: Základné matematicko-štatistické údaje (µm) jednotlivých častí obličkového
telieska u oboch pohlaví sledovaného druhu Apodemus flavicolis .
Glom 1
Glom 2
BowP 1
BowP 2
ObT 1
ObT 2
34.39
33.7
41.75
44
3.99
3.9
5.15
5.2
41.71
42.6
49.32
51.8
25
27.6
3.1
3.6
31.8
34.7
41.3
5.46
48.4
6.50
4.8
0.63
6.8
0.87
52.1
6.92
57.2
7.34
15.89
15.56
15.71
16.97
16.60
14.88
41.01
42.95
48.73
50.2
5.79
5.4
8.3
8.1
52.43
53.55
60.42
62.35
28
32.4
3.7
4.2
38.5
44.1
49.4
6.08
62.1
8.43
8.5
1.35
14.4
2.61
64.8
7.67
73.3
8.37
14.83
17.30
23.24
31.39
14.63
13.85
samice
x
~
x
xmin
x max
±s
vk
samce
x
~
x
xmin
x max
±s
vk
Glom 1 – menší priemer glomerula, Glom 2 – väčší priemer glomerula, BowP 1 – menší priemer Bowmanovho
puzdra, BowP 2 – väčší priemer Bowmanovho puzdra, ObT 1 – menší priemer obličkového telieska, ObT 2 – väčší
priemer obličkového telieska
55
Hodnoty priemeru glomerula sa u samíc pohybovali v rozmedzí 34,39 µm až 41,75 µm a
u samcov v rozmedzí 41,01 µm až 48,73 µm. Jančová et al. (1999, 2001) udáva oveľa väčšie
priemery glomerulov obličiek u druhu Apodemus sylvaticus. Ich namerané hodnoty sa
pohybovali od 63,365 µm až 73,370 µm. Druh Apodemus flavicolis vykazoval pri ich
meraniach väčšiu variabilitu a priemer glomerulov bol v rozpätí 46,690 µm až 80,04 µm. Ich
skúmané druhy pochádzali z lesných a močiarnych ekosystémov v Mochovciach. Lukáč et al.
(2004, 2006) pozorovali vplyv experimentálneho podania olova na štruktúru obličiek
laboratórnych myší. Uvádzajú, že kontrolná skupina myší mala priemer glomerulov 50,58 ±
9,45 µm. V experimentálnych skupinách sa priemer glomerulov pohyboval v intervale
od 51,80 µm až 53,73 µm. My sme takéto väčšie hodnoty namerali len pri niektorých
samcoch druhu Apodemus flavicolis (tabuľka 1). Najväčší priemer obličkového telieska sme
namerali 73,30 µm, čo je porovnateľná hodnota s údajmi, ktoré zistil Lukáč et al. (2004,
2006). Avšak všetky ostatné hodnoty sú menšie ako údaje popisované v prácach spomínaných
autorov. Vplyv olova na štruktúru obličiek potkanov skúmali tiež Massányi et al. (2006). Vo
svojej práci uvádzajú, že po experimentálnom podaní olova sa štatisticky preukazne zvýšil
priemer obličkového telieska, glomerula aj Bowmanovho puzdra. Všetky ich zistené údaje
majú vyššie hodnoty ako tie ktoré sme namerali. Lukáč et al. (2006) skúmali tiež vplyv ortuti
na štruktúru obličiek potkanov a zistili signifikantne nižšie hodnoty priemerov obličkového
telieska aj glomerula v experimentálnej skupine. Udávajú však až dvojnásobne vyššie
hodnoty morfometrických meraní ako sú nami zistené hodnoty.
Pri kvantitatívnom analyzovaní obličiek sme hodnotili aj močové kanáliky. Zamerali sme sa
prevažne na ich proximálny segment. Merali sme 100 kanálikov u samíc a 100 kanálikov
u samcov druhu Apodemus flavicolis. Údaje sú zaznamenané v tabuľke 2. Vzhľadom na
oválny tvar kanálikov v tabuľke 2 udávame menší aj väčší priemer kanálikov. Keďže sme
pozorovali rôznu výšku epitelu v rámci jedného kanálika udávame v tabuľke tiež menšiu aj
väčšiu výšku epitelu.
Hodnoty priemeru močových kanálikov sa u samíc pohybovala v rozmedzí od 22,55 µm až
31,75 µm a u samcov od 30,06 µm až 46,57 µm. Tieto hodnoty sú nižšie ako hodnoty, ktoré
namerali Lukáč et al. (2004, 2006) u laboratórnych myší (61,34 µm až 61,78 µm) či
v kontrolnej alebo experimentálnej skupine. Taktiež morfometrické merania močových
kanálikov potkanov, ktoré robili Lukáč et al. (2006) resp. Massányi et al. (2006) dosahujú
vyššie hodnoty. S prácami spomínaných autorov by sa dala porovnávať len výška epitelu
tubulov u samcov (tabuľka 2), ktorá dosahuje nimi zistené hodnoty.
56
Tabuľka 2: Základné matematicko-štatistické údaje (µm) sledovaných častí obličkového
kanálika u oboch pohlaví druhu Apodemus flavicolis.
PT1
PT2
VE1
VE2
plochaT
obvodT
plochaL
obvodL
x
~
x
22.55
31.75
8.44
9.68
563.87
85.54
60.17
29.22
22.2
31.1
8.35
9.6
535.7
83.15
41.8
27.4
xmin
15.6
19.7
4.4
4.6
285.3
60
7.07
11.4
x max
32.4
53.1
13.5
14.2
1172.3
140.3
271.1
66.7
±s
3.66
7.08
1.57
1.67
186.60
15.25
54.14
11.59
vk
16.22
22.31
18.62
17.23
33.09
17.83
89.99
39.65
x
~
x
30.06
46.57
10.3
11.85
1114.02
120.81
191.06
51.77
29.8
43.7
10.15
11.6
1056.5
115.6
154.15
47.7
xmin
17.6
28.1
6.1
6.9
530.1
83.5
11.5
17.8
x max
38.9
83.8
18.8
22.4
2223.2
194.2
687.6
137.9
±s
3.98
11.85
1.86
2.21
376.74
22.76
145.14
19.95
vk
13.23
25.44
18.09
18.66
33.82
18.84
75.96
38.53
samice
samce
PT 1 – menší priemer tubulov, PT 2 – väčší priemer tubulov, VE 1 – menšia výška epitelu, VE 2 – väčšia výška
epitelu, plochaT – plocha tubulov, obvodT – obvod tubulov, plochaL – plocha lumenu, obvodL – obvod lumenu
Vzhľadom na porovnateľné vyššie hodnoty, ktoré nám vychádzali u samcov (tabuľka 1,
tabuľka 2), sme tieto údaje podrobili analýze rozptylu, testom mnohonásobného porovnania
(Duncanov, Scheffeho), a zistili sme že rozdiely medzi pohlavím sú na hladine α = 0,05
štatisticky preukazné. Táto štatistická významnosť bola potvrdená pri všetkých skúmaných
údajoch. Strednú závislosť medzi získanými morfometrickými hodnotami a pohlavím nám
potvrdili aj štatisticky signifikantné korelačné koeficienty (Pearsonov, Spearmanov). Sú to
však prvotné výsledky a na sformulovanie záverov treba v morfometrickej analýze obličiek
drobných zemných cicavcov pochádzajúcich z oblastí s rôznym emisným zaťažením naďalej
pokračovať.
Práca je podporovaná projektmi VEGA 1/2364/05, VEGA 1/2417/05, CGA UKF VI/2/2006,
APVV-0299-06.
57
Literatúra
Jančová, A., Ligač, S., Massányi, P., Uhrín, V., 1999. Morfologická analýza semenníkov a prisemenníkov
ryšavky Apodemus sylvaticus a Apodemus flavicolis (Muridae). Slovenský veterinársky časopis, 24, 3: 152-156.
Jančová, A., Massányi, P., Uhrín, V., 2001. Morfometrická analýza obličiek Apodemus sylvaticus a Apodemus
flavicolis. Zborník „Nové poznatky v morfológii“, 39. kongres Slovenskej anatomickej spoločnosti
s medzinárodnou účasťou, Martin, 78-79.
Lukáč, N., Massányi, P., Toman, R., Sládečka, A., 2004. Štrukturálne zmeny obličiek myší po experimentálnom
podaní olova. Zborník z konferencie „Rizikové faktory potravového reťazca IV“, SPU, Nitra, 155-159.
Lukáč, N., Massányi, P., Toman, R., Trandžík, J., Capcarová, M. Stawarz, R., Cigánková, V., Jakabová, D.,
Kožáková, I., Forgács, Z., Somosy, Z., 2006. Prejavy toxicity olova a ortuti. In: Kováčik, J., et al.: Biologické
aspekty zvyšovania kvality surovín a potravín živočíšneho pôvodu. Vedecká monografia, SPU, Nitra, 145-155.
Massányi, P., Lukáč, N., Makarevich, A.V., Chrenek, P., Forgacs, Z., Zakrewski, M., Stawarz, R., Toman, R.,
Lazor, P., Flesarova, S., 2006. Lead-induced alterations in rat kidneys and testes in vivo. Journal of Enviromental
Science and Health Part A 41, 1-6.
Vacek, Z., 1974. Histológia a histologická technika. Martin, Osveta, s.388.
Weibel, E.R., Kistler, G.S., Scherle, W.F., 1966. Practical stereological methods for morphometric cytology. J.
Cell Biol., 30, 23-38.
Kontaktná adresa:
RNDr. Janka Drábeková, PhD.,Katedra matematiky FEM SPU, Tr.A.Hlinku 2, 949 76 Nitra,
email: [email protected]
RNDr. Alena Jančová, PhD., Katedra zoológie a antropológie FPV UKF, Nábrežie mládeže
91, 949 01 Nitra, email: [email protected]
EFFECT OF GRADED LEVELS OF MYCOTOXIN ON CLINICAL PLASMA
CHARACTERISTICS IN CHICKS
Faixová , Z.1, Faix, Š.2
1University of Veterinary Medicine in Košice, Košice, Slovak Republic
2Institute of Animal Physiology Slovak Academy of Sciences, Košice, Slovak Republic
Abstract
An experiment was conducted to investigate the effect of different doses of deoxynivalenol
(DON) on plasma indices of broiler chickens. Forty- two, 1-d old male broiler chicks were fed
1 of 3 diets containing DON for 42 d. The diets included (1) control (0.2 ppm DON); (2) low
level of DON (1 ppm DON) and high level of DON (3 ppm DON). The administration of 1
ppm DON to the diet altered total protein, triglycerides, free glycerol and potassium levels.
Dietary inclusion of 3 ppm DON resulted in altered calcium, potassium, total protein,
triglycerides, free glycerol levels and AST activity. No biochemical parameter, however,
responded to increased DON concentration in the diet. The feeding of DON-containing diets
did not significantly alter plasma chloride, cholesterol and albumin levels or AST, ALP and
LDH activities. It was concluded that both levels of DON in the diets tested significantly
affected protein and lipid metabolism in broiler chicks.
Key words: chicken, deoxynivalenol, mycotoxin, plasma indices
58
In this study we were interested in deoxynivalenol (DON, vomitoxin), a trichothecene toxin
which occurs regularly throughout the world, with possible high contamination levels in
cereal grain from various countries.
Many studies describe the adverse effects of DON on animal and human health. Indeed, in
domestic or laboratory animals, large doses of DON caused feed refusal, decreased weight
gain, vomiting, gastrointestinal and dermal irritation and immunological alterations. Lower
doses of DON have been shown to provoke elevation of serum IgA level and are also known
to affect cell-mediated and humoral immunity in several animal species.
The sensitivity to DON varies considerably between species. Trichothecenes are wellknown inhibitors of protein synthesis. They also cause apoptosis both in vitro and in vivo in
various organs.
Trichothecenes are also shown to interfere with the metabolism of membrane phospholipids
and to increase liver lipid peroxides in vivo (9).
In addition, some trichothecenes are shown to alter the activity of serotonin in the central
nervous system, which is known to be involved in the regulation of food intake.
The aim of this study was to determine the effect of different doses of DON on biochemical
variables of growing broiler chickens.
Material and Methods
Forty-two, 1-d-old male broiler chicks were randomly distributed into 3 groups of 14 chicks
in each one. The diets were formulated to meet all nutritional specifications of starter, grower,
and finisher broiler chickens. The three diets included control (0.2 ppm DON) and
experimental (1 and 3 ppm DON). Chicks were fed the diets from the day of hatch to 42 d of
age. Dietary contents of DON were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry.
All experimental procedures with animals were in accordance with European Guidelines
for care and use of animal for research purpose and they were approved by a local ethic
committee.
The results are expressed as mean ± S.E.M. Statistical significance was evaluated by ANOVA
test.
Results and discussion
In this experiment, diet containing 1 and 3 ppm of DON were given to growing broiler
chickens for 6 wk. The deoxynivalenol treatment in both doses significantly decreased plasma
level of total protein of chicks.
59
Our results are consistent with those of Kubena et al. (8) and Bergsjø et al. (2) Later
Mikami et al. (1) examined the toxicity of DON to porcine hepatocytes. Authors reported that
DON reduced albumin secretion from hepatocytes into the medium due to the loss of
hepatocytes by apoptosis and also due to the inhibition of protein synthesis.
DON has also been reported to reduce serum albumin level in growing piglets fed a diets
containing 8.6 mg/kg mycotoxin for 36 days (3).
The toxicity of DON in both concentrations tested was expressed through decreased plasma
triglycerides and free glycerol in broiler chickens. These findings are in agreement with the
previous reports of Kubena et al. (7). On the other hand, Accensi et al. (1) reported that DON
in low concentrations (0, 280, 560 or 840 µg/kg of feed) did no alter the performance of
weanling piglets on potassium, chloride, calcium, cholesterol, triglycerides, alkaline
phosphatase, aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase and lactate dehydrogenase.
DON has also been reported to increase liver triglycerides and total liver lipid in White
Lerghorn hens fed a diet containing 0.25 or 0.70 ppm DON for 86 or 135 days (5).
Dietary inclusion of 3 ppm DON resulted in increased plasma alanine aminotransferase,
indication liver damage.
DON has also been reported to increase activities of AST, LDH and gamma GTP in broiler
chicks fed DON at 15 mg/kg, indicating possible tissue damage and leakage of the enzymes
into the blood (6).
In the present study, plasma calcium increased in birds fed diet containing 3 ppm DON.
Plasma calcium, however, was not affected by 1 ppm DON diet.
Previous data of Bergsjø et al. (2) reported a significant decrease in serum calcium and
phosphorus in growing pigs fed a diet containing 3.5 mg/kg DON. DON has also been
reported to induce weak hypocalcaemia in rats fed 1 mg/kg DON for 6 months, suggesting
that calcium metabolism disorders during chronic action of mycotoxin could be partially
associated with secondary vitamin D deficiency (11).
Recently Gouze et al. (5) reported that electrolytes in plasma appeared to be insensitive to a
4-week exposure to low DON in mice. The discrepancy between these results and our data
could be due to a number of factors, including sensitivity to DON between species, DON
concentration, DON source, animal genetics, sex and nutritional status, contamination of feed
by other mycotoxin.
Our results showed that no biochemical parameter responded to increased DON
concentration in the diets.
60
Table 1 Effect of dietary inclusion of deoxynivalenol on clinical plasma characteristics in
growing broiler chickens
Item
Control
0.2 ppm DON
1 ppm DON
3 ppm DON
Chloride (mmol/l)
104.3 ± 4.88
104.50 ± 3.88
114.40 ± 4.36
Calcium (mmol/l)
2.17 ± 0.07a
1.86 ± 0.19b
3.36 ± 0.34ab
Magnesium (mmol/l)
0.86 ± 0.05bc
1.50 ± 0.08ab
0.34 ± 0.01ac
Potassium (mmol/l)
12.01 ± 1.04ab
5.87 ± 0.22a
4.56 ± 0.58b
Alkaline phosphatase (µkat/l)
8.06 ± 0.81
10.05 ± 0.05
10.72 ± 0.12
aminotransferase 0.25 ± 0.02b
0.22 ± 0.03a
0.47 ± 0.00ab
aminotransferase 2.01 ± 0.16
2.15 ± 0.14
2.12 ± 0.09
dehydrogenase 2.99 ± 0.12
3.02 ± 0.38
2.88 ± 0.43
Alanine
(µkat/l)
Aspartate
(µkat/l)
Lactate
(µkat/l)
Total protein (g/l)
39.11 ± 1.52ab
27.04 ± 1.74a
27.59 ± 1.92b
Albumin (g/l)
16.12 ± 0.46
15.60 ± 0.09
15.21 ± 0.32
Cholesterol (mmol/l)
4.08 ± 0.19
3.54 ± 0.19
3.80 ± 0.34
Triglycerides (mmol/l)
1.02 ± 0.06ab
0.36 ± 0.04a
0.34 ± 0.02b
Free glycerol (mmol/l)
0.91 ± 0.06ab
0.27 ± 0.04a
0.23 ± 0.02b
Values are mean ± S.E.M., n = 14. Significant differences within a row are indicated by using
the same superscript letter, P<0.01.
Conclusion
These data demonstrate that both doses of DON in the diets (1 and 3 ppm) significantly
affected protein and lipid metabolism in broiler chicks. Moreover, under field conditions with
additional stress factors, the toxicity of DON could be altered to adversely affect the health
and performance of poultry.
Acknowledgments
This work was partially supported by the grants VEGA No 1/2443/5 and APVT 51004804.
61
References
1. Accensi F., Pinton P., Gallu P., Abella-Bourges N., Guelfi J.F., Grosjean F., Oswald I.P.: Ingestion of low
doses of deoxynivalenol does not affect hematological, biochemical, or immune responses of piglets. J Anim Sci
2006, 84, 1935-1942.
2. Bergsjø B., Langseth W., Nafstad I., Jansen J.H., Larsen H.J.S.: The effects of naturally deoxynivalenolcontaminated oats on the clinical conditions, blood parameters, performance and carcass composition of growing
pigs. Vet Res Commun 1993, 17, 283-294.
3. Doll S, Dänicke S., Valenta H., Flachowsky G.: In vitro studies on the evaluation of mycotoxin detoxifying
agents for their efficacy on deoxynivalenol and zearalenone. Arch Anim Nutr 2004, 58, 311-324.
4. Farnworth E.R., Hamilton R.M., Thompson B.K., Trenholm H.L.: Liver lipid levels in White Leghorn hens
fed diets that contained wheat contaminated by deoxynivalenol (vomitoxin). Poult Sci 1983, 62, 832-836.
5. Gouze M.E., Laffitte J., Rouimi P., Loiseau N., Oswald I.P. et al.: Effect of various doses of deoxynivalenol
on liver xenobiotic metabolizing enzymes in mice. Food Chem Toxicol 2006, 44, 476-483.
6. Kubena L.F., Edrington T.S., Harvey R.B., Buckley S.A., Phillips T.D. et al.: Individual and combined effects
of fuminissin B1 present in Fusarium moniliforme culture material and T-2 toxin or deoxynivalenol on broiler
chicks. Pult Sci 1997, 76, 1230-1247.
7. Kubena L.F., Harvey R.B., Corrier D.E., Huff W.E., Phillips T.D.: Effect of feeding deoxynivalenol (DON,
vomitoxin) contaminated wheat to female White Leghorn chickens from day old through egg production. Poult
Sci 1987, 67, 253-260.
8. Kubena L.F., Huff W.F., Harvey R.B., Corrier D.E., Phillips T.D. et al: Influence of ochratoxin A and
deoxynivalenol on growing broiler chicks. Poult Sci 1988, 67, 253-260.
9. Mezes M., Barta M., Nagy G.: Comparative investigation on the effect of T-2 mycotoxin on lipid peroxidation
and antioxidant status in different poultry species. Res Vet Sci 1999, 66, 19-23.
10. Mikami O., Yamamoto S., Yamanaka N., Nakajima Y.: Porcine hepatocytes apoptosis and reduction of
albumin secretion induced by deoxynivalenol. Toxicol 2004, 15, 241-249.
11. Sergeev I.N., Piliia N.M., Kuzmina E.E., Avreneva L.I., Kravchenko L.V., Spirichev V.B., Tuteľian V.A.:
Calcium and vitamin D metabolism and enzymes of xenobiotic metabolism during chronic action of mycotoxins.
Vopr Pitan 1990, 5, 25-30.
LEPTÍN AKO REGULÁTOR FUNKCIÍ BOVINNÝCH VAJCOVODOV IN VITRO
LEPTIN AS A REGULATOR OF BOVINE OVIDUCTAL FUNCTIONS IN VITRO
Fazekašová, J. 1, 2, Makarevič, A.V.1, Sirotkin, A. V. 1, Bulla, J. 1, 2
1 Slovenské
2
centrum poľnohospodárskeho výskumu , Nitra
Katedra fyziológie živočíchov, FBP SPU Nitra
Abstract
The aim of this study was to examine effects of hormone leptin on apoptosis and
proliferation and secretory activity of cultured fragments of bovine oviducts, as well as
compare it with effects of well-known mitogen – insulin-like growth factor I (IGF-I). Effects
of leptin on the expression of pro-apoptotic peptides (Bax, caspase-3), anti-apoptotic peptide
(Bcl 2) and proliferation peptide (PCNA) were analyzed using Western-blotting, and the
release of IGF-I by cultured oviductal fragments was measured using radioimmunoassay
(RIA).
Leptin stimulated IGF-I release at all doses added. Leptin when given at low dose
(1ng/ml) leptin, like to IGF-I, stimulated the expression of anti-apoptotic peptide Bcl2. Leptin
at higher (10, 100 ng/ml) concentrations decreased PCNA- content and stimulated the
62
expression of pro-apoptotic peptides – Bax and caspase-3. IGF-I has an opposite effect on
these substances. The mainly opposite effects of leptin and IGF-I on apoptosis and
proliferation assume an existence of feedback interrelationships between these substances. It
is not excluded, that leptin and IGF-I are antagonists in control of oviductal functions. This
finding suggests different biological roles of leptin and IGF-I in the oviduct.
Key words: oviduct, proliferation, apoptosis, leptin, IGF-I
Úvod
Vajcovod je dôležitým orgánom reprodukčnej sústavy, v ktorom sa uskutočňujú
procesy kapacitácie spermií, oplodnenia oocytu a delenia embrya. Vhodné prostredie pre tieto
procesy vytvára tekutina vajcovodu, ktorej zložky pochádzajú z cirkulačného systému,
a taktiež sú syntetizované bunkami vajcovodu. Epitel vajcovodu obsahuje sekrečné žľazové
a riasinkové bunky (kinocílie), ktoré sú zapojené v transporte oocytov, spermií a raných
embryí, pokiaľ čo sekrečné produkty sú významné pre vytvorenie optimálneho prostredia
(Leese a kol., 2001). Bunky vajcovodu produkujú množstvo rozličných látok, ktoré majú
vplyv na kontrakciu, proliferáciu, apoptózu a vývoj embrya (Yeung a kol., 2002), ďalej
produkujú endokrinné/parakrinné signálne látky vrátane ovariálnych steroidov (Wollenhaupt
a kol., 2002), prostaglandínov F2 alpha a PGE2 (Harper, 1998), oxidu dusnatého (NO) (PerezMartiney a kol., 1997), rastových faktorov (Makarevich a Sirotkin, 1997) a cytokínov
(Wijayagunawardane a kol., 2003). Tieto faktory môžu ovplyvňovať delenie a diferenciáciu
buniek embrya a iné zmeny v epitely vajcovodu.
Leptín je dôležitou látkou, ktorá môže ovplyvňovať funkcie reprodukčných organov
samíc, vrátane vajcovodu. Primárnym zdrojom leptínu je tukové tkanivo, predovšetkým biele
adipocyty. Má preukázateľný vplyv na regulátory reprodukcie na úrovni hypotalamu
a adenohypofýzy (Swain a kol., 2004). Zatiaľ čo vplyv leptínu na ováriá je dobre
dokumentovaný (Chehab a kol., 1996), jeho efekty na vajcovod nie sú preskúmané. Cieľom
tejto štúdie bolo zistiť efekty leptínu na apoptotické a proliferačné procesy vo fragmentoch
bovinných vajcovodov in vitro a porovnať ich s efektmi známeho mitogénu – inzulínu
podobného rastového faktoru I (IGF-I), ktorý je taktiež regulátorom sekrécie a antiaptotickým faktorom.
Materiál a metodika
Vajcovody v periovulačnej fáze pohlavného cyklu boli odobraté od kráv (Holstein, vo
veku 23 mesiacov, n = 10) porazených na bitúnku a očistené od tukového a svalového
63
tkaniva. Z takto izolovaných vajcovodov sa v sterilných podmienkach izolovali fragmenty
vajcovodov, ktoré sa použili na založenie primárnej kultúry v 24- dierových platničkách
(Nunclon Surface, Nunc, Roskilde, Dánsko) a v Chamber slides (Nunclon Surface, Nunc,
Roskilde, Dánsko). Kultivácia prebehla v sterilnom médiu DMEM/F12 +
20 % FCS
(BioWhittaker™, Verviers, Belgium) + 1% antibiotikum-antimykotikum (Sigma, St. Louis,
Mo, USA). Po dvoch dňoch kultivácie sa médium vymenilo za médium s prídavkami leptínu
(Peptides International, Luisville, USA) a IGF-I (Dr.A.P.F.Parlow, NHPP, Torrance, USA)
v koncentráciách 1, 10, 100 ng/ml média a kultivácia trvala tri dni v CO2 inkubátore pri
38,50C.
Bol študovaný vplyv prídavkov leptínu a IGF-I na expresiu pro-apoptotických
peptidov (Bax, kaspáza-3), anti-apoptotického peptidu (Bcl2) a proliferačného peptidu
(PCNA) a na vylučovanie IGF-I kultúrou fragmentov vajcovodov kráv. Vylučovanie leptínu
a IGF-I fragmentmi vajcovodov do média sme analyzovali metódou rádioimunoanalýzy.
Expresiu proliferačných peptidov (PCNA, Bax, Bcl2) (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa
Cruz , USA) v bunkových lyzátoch bol analyzovaný pomocou elektroforézy a Westernblottingu (Leammli, 1970). Výsledky boli spracované a vyhodnotené bežnými štatistickými
metódami pomocou programu Sigma Plot 9.0 (Systat Sofware, Inc., Point Richmond, CA,
USA ).
Výsledky
Leptín v našich pokusoch stimuloval sekréciu IGF- I v kultúre in vitro (Obr. 1),
pričom jeho efekt bol závislý od koncentrácie. Najvyššia stimulácia bola dosiahnutá po
pridaní 100 ng/ml média.
180
*
*
160
*
Vylučovanie IGF-I, ng/ml
140
120
100
80
60
40
20
0
0
1
10
100
Koncentrácia leptínu, ng/ml
Obr. 1. Vplyv leptínu na vylučovanie IGF-I fragmentmi vajcovodov kráv
Hodnoty v grafe: priemer ± chyba strednej hodnoty
preukazné rozdiely (p<0,05) v porovnaní s kontrolou bez prídavku leptínu
*
64
Leptín podaný pri všetkých koncentráciách (1, 10, 100 ng/ml) stimuloval expresiu
anti-apoptotického peptidu Bcl2. Vyššie koncentrácie leptínu (10, 100 ng/ml) zvyšovali
expresiu pro-apoptotického peptidu Bax, zatiaľ čo najnižšia koncentrácia (1 ng/ml)
neovplyvnila expresiu daného peptidu. Percento proliferujúcich (PCNA-pozitívnych) buniek
bolo účinkom leptínu pri najvyššej koncentrácii (100 ng/ml) znížené, čím sa potvrdil
inhibičný efekt leptínu na proliferáciu buniek. Percento proliferujúcich buniek pri nižších
koncentráciách (1, 10 ng/ml) sa výrazne nezmenilo v porovnaní s kontrolou. Leptín pri
nižších koncentráciách (1 ng/ml) stimuloval expresiu kaspázy-3 a pri vyšších koncentráciách
leptínu (10, 100 ng/ml) neboli pozorované zmeny v porovnaní s kontrolou.
IGF-I podaný pri všetkých koncentráciách (1, 10, 100 ng/ml) stimuloval expresiu antiapoptotického peptidu Bcl2. Inhibičný účinok IGF-I na expresiu Bax bol pozorovateľný len
pri nižších koncentráciách (1 ng/ml), vyššie koncentrácie IGF-I (10, 100 ng/ml)
neovplyvňovali expresiu Bax v porovnaní s kontrolou. IGF-I naopak redukoval pri vyšších
koncentráciách (10, 100 ng/ml) akumuláciu frakcie zodpovedajúcej kaspáze-3, pričom pri
najnižšej koncentrácii (1ng/ml) nebola pozorovaná zmena v expresii kaspázy-3 v porovnaní s
kontrolou .
Vplyv oboch biologicky aktívnych látok znázorňujú tabuľky č. 1 a 2.
Tabuľka č. 1: Vplyv leptínu na apoptotické a proliferačné peptidy
Látka
Analytická metóda Charakter vplyvu
LEPTÍN
Bax
WB
+
Bcl 2
WB
+
PCNA
WB
-
Kaspáza-3 WB
+
Vysvetlivky: WB- Western- blotting, „+“- stimulácia, „-„ - inhibícia
Tabuľka č. 2: Vplyv IGF-I na apoptotické a proliferačné peptidy
Látka
Analytická metóda Charakter vplyvu
IGF-I
Bax
WB
-
Bcl 2
WB
+
Kaspáza-3 WB
-
65
Diskusia
IGF-I je známy svojimi stimulačnými účinkami na sekréciu a proliferáciu buniek
a preimplantačný vývoj embryí. IGF-I potláča apoptózu a zvyšuje počet proliferujúcich sa
buniek v embryách kráv (Makarevich a Markkula, 2002). IGF- I vylučovaný do vajcovodovej
tekutiny môže účinkovať ako parakrinný regulátor skorého embryonálneho delenia.
Ovplyvňuje metabolizmus a rast buniek vajcovodu, prenos vnútrobunkových signálov (Buhi
a kol., 1996). IGF-I je zapojený do procesov reprodukčnej sústavy. Má vplyv na dozrievanie
a selekciu folikulov a podporuje proliferáciu a diferenciáciu granulóznych buniek. Zvyšuje
biosyntézu a sekréciu progesterónu a estrogénu v granulóznych bunkách hovädzieho dobytka
a ľudí, sekréciu androgénov buniek z vaječníkov. Stimuluje jadrové dozrievanie oocytov
ošípaných. Aktivuje proliferáciu a brzdí apoptózu v kumulárnych bunkách obklopujúcich
oocyty. Všeobecne má proliferačné a antiapoptické účinky, stimuluje sekréciu a generačné
funkcie ovárií (Sirotkin et al., 2004).
Leptín pôsobí ako modulátor rôznych reprodukčných funkcií vrátane vývinu ranného
embrya u cicavcov (Buhi a kol.,1996). O vplyve leptínu na vajcovod existujú len nepatrné
poznatky (Wollenhaupt a kol., 2002). Receptory pre leptín boli dokázané vo vajcovode
niektorých živočíšnych druhov vrátane človeka (Liu a kol., 2003), myší a krysy (Tartaglia,
1997). Z toho vyplýva, že leptín môže ovplyvňovať vajcovod cez špecifické receptory a to
buď autokrinným alebo parakrinným spôsobom.
Predpokladáme, že leptín sa môže dostavať do vajcovodu z krvného obehu. Napriek
tomu u ošípaných bolo dokázané, že leptín sa produkuje vajcovodom, stimuluje dozrievanie
oocytov in vitro a má vplyv na vývin embryí do štádia blastocysty (Craig a kol., 2005).
V našich pokusoch sme potvrdili vplyv leptínu pri všetkých dávkach na sekréciu IGF-I
bunkami vajcovodu. Výsledky našich výskumov sú prvými poznatkami o účinku leptínu na
sekréciu IGF-I vo vajcovode kráv.
Leptín v našich experimentoch znižoval akumuláciu proliferačného markera PCNA
a zvyšoval expresiu apoptotických peptidov (Bax a kaspáza-3) v bunkách, čím sa potvrdil
modulačný vplyv tohto hormónu. Nakoľko proliferačný antigén PCNA sa objavuje v S fáze
bunkového cyklu (Makarevich a kol., 2002), môžeme predpokladať úlohu leptínu v regulácii
bunkového cyklu.
Záver
Nakoľko vplyvy leptínu a IGF-I sa navzájom odlišujú vo vzťahu k procesom apoptózy
a proliferácie, predpokladáme že tieto dve látky môžu mať rôzny biologický význam vo
66
vajcovode. Naše pozorovania potvrdzujú stimulačný vplyv leptínu na sekréciu IGF-I a na
proliferáciu buniek vajcovodu. Zvýšená koncentrácia leptínu inhibuje proliferáciu a stimuluje
expresiu pro-apoptotických látok, ale stimuluje vylučovanie IGF-I, ktorý ovplyvňuje opačne
expresiu týchto peptidov. Tieto protichodné efekty leptínu a IGF-I na apoptózu a proliferáciu
predpokladajú existenciu mechanizmu spätnej väzby medzi týmito látkami. To znamená, že
zvýšená koncentrácia IGF-I pod vplyvom leptínu začína ovplyvňovať vajcovod cestou
potláčania apoptózy a stimulácie proliferačného potenciálu. Nie je vylúčené že tieto
biologicky aktívne látky môžu byť antagonistami v efektoch na funkcie vajcovodu.
Literatúra
1. BUHI, W., ALVARES, I. M., CHOI, I., CLEAVER, B. D., SIMMEN, F.A.1996. Molecular cloning
and characterization of an estrogen- dependent porcine oviductal secretory glycoprotein. Biol Reprod. 55:13051314.
2. CRAIG, J. A., ZHU, H., DYCE, P. W., WEN, L., LI, J. 2005. Leptin enhances porcine
preimplantation embryo development in vitro. Mol Cell Endocrinol 229: 141-147.
3. CHEHAB, F.F., LIM, M.E., LU, R. 1996. Correction of the sterility defect of homozygous obese
female mice by treatment with the human recombinant leptin. Nat Genet, 12: 318-320.
4. HARPER, M. J. K., 1998. Gamete and zygote transport. Physiol. Reprod. Raven Press, New York,
USA, pp. 103- 104.
5. LEESE, HJ., TAY, JI., REISCHEL, J., DOWNING, SJ., 2001 Formation of Fallopian tubal fluid:
role of a neglected epithelium. Reproduction 121 339-346.
6. LIU, L. L., QIAO, J., WANG, Y. Z., CHEN, Y. J., GAO, Y. Q. 2003. Expression of leptin and leptin
receptor system in woman reproductive organs. Zhonghua Yi Xue Za Zhi 83: 666- 668.
7. LEAMMLI, U.K.1970. Nature 277, 680-8.
8. MAKAREVICH, A. V., MARKKULA, M., 2002. Apoptosis and cell proliferation potential of
bovine embryos stimulated with insulin-like growth factor I during in vitro maturation and Culture. Biol.
Reprod. 66, 386-392.
9. MAKAREVICH, A. V., SIROTKIN, A. V., 1997. The involvement of the GH/IGF-I axis in the
regulation of secretory activity by bovine oviduct epithelial cells, Animal Reproduction Science 48: 197-207.
10. MAKAREVICH, A. V., SIROTKIN, A. V., CHRENEK, P., BULLA, J. 2002. Effect of EGF on
steroid and cyclic nukleotide section proliferation and ERK- related MAP- kinase in culture rabbit granulose.
Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes, 110: 124-129.
11. PEREZ- MARTINEZ, S., FRANCHI, A. M., SUBURO, A., HERRERO, B., GOIN, J. C.,
OSHIMA, H., GIMENO, M.A.F., 1997. Several isoforms of nitric oxide synthase are present in the rat oviduct.
Biocell 21:215- 223.
12. SIROTKIN, A.V., SANISLO, P., SCHAEFFER, H.-J., FLORKOVIČOVÁ, I., KOTWICA, J.,
BULLA, J., HETÉNYI, L. 2004 Thrombopoietin regulates proliferation, apoptosis, secretory activity and
intracellular messengers in porcine ovarian follicular cells: involvement of protein kinase A. Journal of
Endocrinology 183, 595-604
13.SWAIN, J.E., DUNN, R.L., MCCONNEL, D., MARTINEZ, J.G., SMITH, G.D. (2004): Direct
effects of leptin on mouse reproductive function: Regulation of follicular, oocyte and embryo development.
Biology of Reproduction 71, 1446-1452.
14. TARTAGLIA, L.A. 1997. The leptin receptor. J Biol Chem 272:6093-6096.
15. WIJAYAGUNAWARDANE, M. P. M., MIYAMOTO, A., GABLER, KILLIAN, G., 2003. Tumor
Necrosis Factor α in the bovine oviduct during the estrous cycle: Messenger RNA expression and effect on
secretion of prostaglandins, endothelin- 1, and angiotensin II. Biol. Reprod. 69: 1341- 1346.
16. WOLLENHAUPT, K., TOMEK,W., BRUSSOV, K.P., TIEMANN,U., VIERGUTZ, T.,
SCHNEIDER, F., NURNBERG, G. 2002. Effects of ovarian steroids and epidermal growth (EGF) on expression
and bioactivation of specific regulators of transcription and translation in oviductal tissue in pigs. Reprod. and
Fertil. 35:588-644.
17. YEUNG, W. S. B. , LEE, K. F., XU, J. S., 2002. The oviduct and development of pre- implantation
embryo. Reprod Med. Rev. 10:21- 44.
67
Kontaktná adresa: Ing. Jana Fazekašová, Katedra fyziológie živočíchov, Fakulta
biotechnológie a potravinárstva, SPU Nitra, Tr. A. Hlinku 2. [email protected]
MVDr. Alexander V. Makarevič, CSc., SCPV Nitra, [email protected]
CAROTENOID ABSORPTION IN LAYING HENS
Gregosits, B., Kerti, A., Szabó, Cs., Bárdos, L.
Szent István University, School of Agricultural and Environmental Sciences, Department of Animal Physiology and
Health, 2103 Gödöllő, Hungary (www.mkk.szie.hu/dep/aeet)
Abstract
In the present study the effects following a large dose (20ppm) of ß-carotene (BC), lutein
(LU) and lycopene (LY) supplementations (192.3 mg ß-carotene 10.4%; 357 mg Lutein
CWS/S-TG 5.6%; 384.6 mg Redivivo lycopene 5% DSM NUTRITIONAL PRODUCTS) both when
given separately (20ppm) and together (20-20-20ppm, ∑20ppm) on LU+zeaxanthin, ßcryptoxanthin, LY, BC, tocopherol, retinol and retinyl palmitate absorption were investigated
in laying hens. Serial blood samples were taken at 6 hourly intervals before the
supplementation and for up to 48h post-dosing and analyzed with rpHPLC for the carotenoid
and retinoid levels. In cases of all the three applied carotenoids (BC, LU and LY)
supplemented both separately and combined the concentration of the respective carotenoid
significantly increased in response to the high-carotenoid intake. The response curves
occurred maximally over the 6-12 hours after doses. The plasma appearance of LY in order of
magnitude was weaker (near the baseline) although the dosages were identical (20ppm), in
contrast with BC and LU. When the combined carotenoid doses were (∑20ppm) applied, the
smaller individual supplementation (6.6ppm/each) resulted greater increase in the plasma
concentrations in case of all three carotenoids. Our data confirm an interactions between LU,
LY and BC when given in a combined dose in the concentrations of plasma carotenoids,
namely the non polar carotenoid (LY) worsened the effectiveness of the other two
oxycarotenoids (LU and zeaxanthin).
Introduction
Carotenoids are synthesized in plants and in certain microorganisms such as some bacteria,
algae, and fungi. Animals are unable to synthesize carotenoids de novo, they rely upon the
diet as the source of these compounds. Carotenoids are a group of dyes that are widespread in
nature and responsible for the yellow/orange/red/purple colors of many fruits, flowers, birds,
insects, and marine animals. Over 600 carotenoids have been isolated from natural sources,
but only about 60 of them are detected in the human diet and no more than 20 of them in
68
human blood and/or tissues. Among them ß-carotene (BC), α-carotene, lycopene (LY), lutein
(LU) and β-cryptoxanthin are the five most prominent carotenoids present in the human body
(DURING & HARRISON 2004). The role of dietary carotenoids in health and disease has attracted
increasing interest at the moment, and numerous investigations are currently in progress to
clear up the benefits of these compounds in the diet. Most of the detectable carotenoids (LU,
zeaxanthin, cryptoxanthin, alfa-carotene, all-trans-BC, 13-cis-BC, and four geometric isomers
of LY (l5-cis-, 13-cis-, 9-cis-, and all-trans-LY) of human plasma can be increased by
moderate alterations in diet within a short time (15-d periods), although the extent of the
plasma response may be related to the baseline carotenoid concentrations (YEUM ET AL. 1996).
In the present study the effects following a large dose of BC, LU and LY supplementations
both when given separately and together on LU+zeaxanthin, ß-cryptoxanthin, LY, BC,
tocopherol, retinol and retinyl palmitate absorption were investigated in laying hens.
Material and Methods
The study was designed to provide detailed information by using a 48 h sampling period and a
distinct dosing (20ppm, 20-20-20ppm, ∑20ppm) of single dose consumption of different
carotenoids (192.3 mg ß-carotene 10.4%; 357 mg Lutein CWS/S-TG 5.6%; 384.6 mg
Redivivo lycopene 5% these supplements made by; DSM NUTRITIONAL PRODUCTS) delivered to
laying hens (Bovans Nera) in a well-standardized system.
Responses of carotenoids and retinoids after a separate 20ppm BC/LU/LY dose were
compared with those after a dose of 20ppm BC combined with 20ppm LY and 20ppm LU or
with 6.6ppm BC combined with 6.6ppm LY and 6.6ppm LU. The water soluble carotenoid
preparations were mixed with oil in 1:1 ratio. The suspensions were provided with blow out
pipette to the crop. After single oral doses the animals were provided with feed and water ad
libitum. The supplementation was derived from the average daily feed consumption of laying
hens corresponding to the literature. Serial blood samples were taken at 6 hourly intervals
before the supplementation (zero time when the single dose was given) and for up to 48h
post-dosing. Plasma was separated and subsequently analyzed with rpHPLC for the
carotenoid and retinoid levels (KERTI & BÁRDOS 2006). The administered compounds as well as
other carotenoids (three oxy-carotenoids (LU, zeaxanthin, and ß-cryptoxanthin), and the
hydrocarbon carotenoids (BC and LY), and retinol and its palmitate-ester were separated by
using a C18 column.
69
Result and Discussion
In cases of all the three applied carotenoids (BC, LU and LY) supplemented both separately
and combined the concentration of the respective carotenoid significantly increased in
response to the high-carotenoid intake (Fig. 1.). The elevations of carotenoid levels related to
the different nature of the carotenoid compound (polarity, i.e. solubility) which resulted the
proportion of the incorporation into portomicrons. Contrary to the literature where the kinetics
of the hydrocarbon carotene BC and the oxycarotenoid LU in plasma are distinct, in our
experiment the plasma appearance of all carotenoids were monophasic, probably due to the
occasional blood sampling appointments (6h versus the hourly in human studies).
120
ug/L
A
100
LU
300
BC
ug/L
LY
60 ppm
LU
BC
B
250
LY
60 ppm
20 ppm
20 ppm
80
200
60
150
40
100
20
50
0
0
0
6
12
18
24
30
36
42
48 h
12
LU
ug/L
BC
C
10
0
6
12
18
24
36
42
25
48 h
LU
ug/L
BC
D
LY
60 ppm
30
20
LY
60 ppm
20 ppm
20 ppm
8
15
6
10
4
5
2
0
0
0
6
12
18
24
30
36
42
48 h
0
6
Figure
12
18
24
30
36
42
48 h
1.
Carotenoid and retinoid profiles of blood in laying hens
A: lutein, B: ß-carotene, C: lycopene, D: retinyl palmitate
We observed a greater postprandial appearance of BC than of LU. The response
curves in the plasma for carotenoids occurred maximally over the 6-12 hours after doses. The
plasma appearance of LU developed with an increase at 12 h postdosing, while of BC and LY
70
at 6 h, and followed by a gradual decline until concentrations reached baseline at the last
measurement at 48 h.
The values of BC and LU after reaching a maximum level gradually returned to the
baseline in absence of additional supplies. The plasma appearance of LY in order of
magnitude was weaker (near the baseline) although the dosages were identical (20ppm), in
contrast with BC and LU. This slightest polar compound (LY) probably has a distinct
transport mechanism in the blood, which consequence its slower elevation and disappearance
from the plasma.
When the combined carotenoid doses were (∑20ppm) applied, the smaller individual
supplementation (6.6ppm/each) resulted greater increase in the plasma concentrations in case
of all three carotenoids. In case of larger doses (3x20ppm) the odds are that competition might
be occurred for the binding proteins of mucosa cells and/or saturation of absorptive
mechanism. Not all investigated carotenoids have provitamin A activity. This was confirmed
by the results, that only the BC supplementation called forth significant increases in retinyl
palmitate plasma concentrations both at separate and combined doses. This was the result of
the effective dioxygenase activity and esterification processes in the mucosa (BC → RAL →
ROL → RYL).
Conclusion
The concentrations of carotenoids in plasma and tissue are often taken as an index of
absorption. Serum carotenoid concentrations depend on intestinal absorption as well as on
tissue uptake and release of carotenoids, doubtless mainly reflect the immediate dietary
carotenoid intake. Only few studies to date have directly measured intestinal carotenoid
absorption in fowls. The differences among carotenoids in lipoprotein transport and tissue
uptake and their activity as provitamin-A results that these measurements do not reflect
carotenoid absorption accurately. Our data confirm an interactions between LU, LY and BC
when given in a combined dose in the concentrations of plasma carotenoids, namely the non
polar carotenoid (LY) worsened the effectiveness of the other two oxycarotenoids (LU and
zeaxanthin). Our results showed a significant decrease in the LU and zeaxanthin responses
when mixed doses were given.
71
Literature
1. During A., Harrison E. H.: Intestinal absorption and metabolism of carotenoids: insights from cell
culture. Arch Biochem Biophys. 2004. 430: 77–88.
2. Kerti A., Bárdos L.: Simultaneous analyses of retinoids (retinol, retinyl palmitate), carotenoids (lutein,
zeaxanthin, ß-cryptoxanthin, lycopene, ß-carotene) and vitamin E with rpHPLC (in Hungarian). MLDT
53. Nagygyűlése, Szeged, 2006. In: Klinikai és Kísérletes Laboratóriumi Medicina, Szeged, 2006. 32S:
p. 106.
3. Yeum K. J., Booth S. L., Sadowski J. A., Liu C., Tang G., Krinsky N. I., Russell R. M.: Human plasma
carotenoid response to the ingestion of controlled diets high in fruits and vegetables. Am J Clin Nutr.
1996. 64: 594-602.
Contact address:
Szent István University, School of Agricultural and Environmental Sciences, Department of
Animal Physiology and Health, 2103 Gödöllő, Hungary
Email address: [email protected]
HODNOTENIE SÉROVÝCH KONCENTRÁCIÍ VYBRANÝCH BIOCHEMICKÝCH
UKAZOVATEĽOV NUTRIČNÉHO A ZDRAVOTNÉHO STAVU K ÚROVNI
ŽIVOTNÉHO ŠTÝLU SLOVENSKEJ POPULÁCIE
EVALUATION OF SERUM CONCENTRATIONS OF SELECTED BIOCHEMICAL
MARKERS OF HEALTH AND NUTRITION TO THE LEVEL OF LIFESTYLE OF
SLOVAK POPULATION
Harasník V.¹, Slivková J², Marcinková M², Čižmárová M¹
¹ ) Katedra výživy ľudí, Fakulta agrobiológie a potravinových zdrojov SPU v Nitre, SR
² ) Katedra fyziológie živočíchov, Fakulta biotechnológie a potravinárstva SPU v Nitre, SR
Abstract
This study focused on identification of biochemical indicators of nutrition and health
status of selected groups in Slovak population. This project was carried out in all Slovak areas
in July, 2004. 687 respondents took part in it (46.90 % men and 53.10 % women,
respectively). Their average age was 45.2 ± 9.2 years. The most important life-style factors
are insufficient physical activity, some bad aspects of nutrition and smoking. The high
incidence of obesity, unfavourable blood pressure values in men and worse lipid metabolism
indicators in men are the most severe factors from the objective examinations. Values of all
these biochemical indicators worsen with age. Only women and men from youngest groups
had all their examination results within normal limits. The worst results from objective
examinations with the highest average number of risk factors were found in persons with
elementary education only and respondents who come from countryside, in smokers, and in
physicially non-active and obese persons.
Key words: Nutrition, Health status, Life-style, Biochemical indicators, Serum concentration
72
Úvod
Zhoršovanie zdravotného stavu populácie a nárast civilizačných ochorení viedli
k skúmaniu príčin, ktoré spôsobovali zdravotné komplikácie v organizme človeka. Viaceré
výskumy zamerané na sledovanie biomarkerov nutričného a zdravotného stavu, ktoré sú
odrazom aplikácie životného
štýlu potvrdili závislosť zdravia od kvality výživy a jej
realizovania. V duchu najnovších poznatkov v oblasti humánnej výživy sa javí potreba
dôsledne sledovať množstvo ako aj skladbu prijímanej potravy s prihliadnutím na vek,
pohlavie, chorobu, fyzické zaťaženie, a rovnako aj rozmanitosť a pomer znášanlivosti
jednotlivých druhov prijímaných potravín. Žiadúcou by sa mala stať orientácia na zdraviuprotektívne potravinové zložky a aplikácia pohybových aktivít (Daniška et al., 2006).
Materiál a metodika
Predkladaný projekt sa uskutočnil v rámci série zdravotno-preventívnych výskumných
akcií, sledujúcich konkrétne ukazovatele zdravotného stavu (formou biochemického
vyšetrenia), najmä vo vzťahu k stravovacím návykom a životnému štýlu u vybranej časti
slovenskej populácie. Prebiehal v rokoch 2004-07 na celom území SR. Celkovo sa na projekte
zúčastnilo 687 respondentov (mužov bolo 46,9 % a žien 53,1 %). Priemerný vek bol 45,2 ±
9,2 rokov (muži 44,5 ± 9,3; ženy 45,8 ± 10,1; P = 0,078), vekové rozpätie bolo 18-75 rokov.
Prevahu mali ľudia so stredoškolským vzdelaním a tiež respondenti pochádzajúci z miest.
Nutričná analýza: Príjem energie a nutrientov bol kalkulovaný z dotazníkov sledujúcich
spotrebu jednotlivých potravín a potravinových skupín. Frekvencia konzumácie bola
vyjadrená kategóriami: nikdy, n-krát denne, týždenne, mesačne a ročne.
Antropometrické meranie: Body mass index (BMI) sme kalkulovali ako pomer hmotnosti v
kg a výšky vyjadrenej v m². Obvod pása a bokov (pre určenie WHR-indexu a stanovenie typu
obezity) sme merali pásovým meradlom (v cm) a krvný tlak ortuťovým tlakomerom.
Biochemické vyšetrenia: Kompletný lipidový profil ako aj hladiny glukózy v krvnom sére,
boli určované automatickým analyzátorom OLYMPUS AU 640 (Japan), štandardnými
laboratórnymi metódami. Kapilárna krv respondentov bola poskytnutá dobrovoľne, oboberaná
bola nalačno.
Analýza životného štýlu: Sledovali sme najmä príjem alkoholu, fajčenie a podiel telesných
aktivít.
73
Výsledky a diskusia
Hodnotením BMI (index telesnej hmotnosti) sme zistili, že až 58,7 % respondentov
(61,8 % mužov a 55,9 % žien) malo hodnotu BMI vyššiu ako 25 (v pásme nadhmotnosti ich
bolo 40,9 % a v pásme obezity 17,6 %), čo je v porovnaní s monitoringom konaným v rámci
projektu CINDI (1998) pokles o 4,2 %. Aj v porovnaní so štúdiou Jurkovičovej (2005) na
vzorke 15097 osôb, sme zistili pokles, a to takmer o 5,0 %. Z porovnania podľa pohlavia malo
nadhmotnosť 45,9 % mužov a 36,7 % žien (P < 0,0001); obezitu malo 15,8 % mužov a až
19,2 % žien (P < 0,01). Priemerné hodnoty WHR-indexu (tab. 1) boli v prípade žien a
rovnako mužov pod hranicou rizikových hodnôt (u žien 0,9 a viac; u mužov 1,0 a viac).
Priemerné hodnoty tlaku krvi na úrovni 133,8 / 82,4 mmHg (u mužov 139,1 / 84,6 a u žien
131, 7 / 81,5 mmHg) indikujú signifikantne horšie postavenie mužov v sledovanom súbore (P
< 0,0001). Optimálne hodnoty TK (120/80 mm Hg) malo len 30,2 % osôb.
Z faktorov životného štýlu sme sa zamerali najmä na príjem alkoholu, fajčenie, čas
venovaný pohybovým aktivitám a niektorým stravovacím zvyklostiam.
V sledovanom súbore fajčilo 25,8 % respondentov (31, 4 % mužov a 20,1 % žien; P < 0,01).
Najviac fajčiarov bolo vo vekovej skupine do 30 rokov (42,6 %).
Konzumáciu alkoholu maximálne 1-krát týždenne (najčastejšie uvádzaný objem bol 0,5 dl), uviedlo
až 72,1 % všetkých respondentov (častejšie mužov; P < 0,05). U majoritnej časti respondentov
prevládalo v spotrebe pivo,
pred vínom a destilátmi. Alkohol bol u väčšiny respondentov
konzumovaný mimo jedla.
Primeranej mimopracovnej fyzickej aktivite (t.j. minimálne 2-3 hodiny týždenne) sa
venovalo len 29,6 % respondentov, s väčším podielom mužov (35,7 %) ako žien (24,8 %).
Najvyššiu telesnú aktivitu udávali osoby mladších vekových skupín, a to ako muži tak aj ženy
(až 70,3 % z celkového počtu malo menej ako 40 rokov). Takmer ½ všetkých respondentov sa
nevenuje žiadnym telesným aktivitám (signifikantne častejšie najmä ženy; P < 0,0001), ako
dôvod uvádzali nedostatok času.
74
Charakteristika súboru ( x ± s )
Tabuľka 1
muži
Ženy
spolu
n = 322
n = 365
n = 687
vek (roky)
44,5 ± 9,3
45,8 ± 10,1
45,2 ± 9,2
telesná hmotnosť (kg)
82,9 ± 6,8
69,7 ± 7,3
-
telesná výška (cm)
177,6 ± 9,1
165,8 ± 6,7
-
obvod pásu (cm)
94,5 ± 8,4
83,7 ± 8,2
89,1 ± 8,3
obvod bokov (cm)
103,8 ± 5,6
104,1 ± 6,4
104,0 ± 5,7
BMI (kg.m-2)
26,9 ± 4,3
25,8 ± 4,7
26,3 ± 4,5
WHR (pás/boky)
0,92 ± 0,11
0,82 ± 0,13
0,87 ± 0,10
Údaje o respondentoch
Vybrané ukazovatele nutričného a zdravotného stavu (koncentrácie)
Tabuľka 2
Vybrané ukazovatele
spolu (n = 687)
(mmol/l)
Priemerné hodnoty sérových koncentrácií ukazovateľov
Celkový cholesterol
4,92 ± 0,98
5,06 ± 0,91
4,81 ± 1,01
0,0017
HDL-cholesterol
1,41 ± 0,53
1,32 ± 0,47
1,53 ± 0,42
0,0001
LDL-cholesterol
2,95 ± 0,92
2,98 ± 0,95
2,91 ± 0,87
0,2135
Triglyceridy (TG)
1,39 ± 0,77
1,56 ± 0,71
1,23 ± 0,84
0,0001
Glukóza (glykémia)
4,98 ± 1,04
4,83 ± 1,06
5,15 ± 1,02
0,0486
muži (n = 322)
ženy (n = 365)
P-value
Celkovo horšie majú všetky priemerné hodnoty tukových látok v krvi muži, ženy majú oproti
tomu vyššiu hladinu glukózy, ktorá však ešte stále zodpovedá normálnym hodnotám (tab. 2).
Všeobecne nepriaznivé hodnoty sledovaných biochemických ukazovateľov majú respondenti
s nedostatočnou alebo žiadnou telesnou aktivitou, rovnako tak sa medzi nimi vyskytuje aj
vyšší počet respondentov so zvýšeným tlakom krvi a nadhmotnosťou, resp. obezitou.
Uvedené zistenia identifikujú starších respondentov (t.j. nad 55 rokov) a prevažne mužov ako
rizikovú skupinu, čo nám potvrdzujú okrem sérových koncentrácii niektorých ukazovateľov
aj hodnoty BMI stúpajúce s vekom. Aj v porovnaní s výsledkami viacerých autorov ako
Kajaba et al. (2001) alebo Ginter (2003), musíme konštatovať stúpajúci trend nadhmotnosti a
obezity (najmä vo vekovej skupine 55 a viac ročných) v slovenskej populácii. Výsledky
objektívnych vyšetrení mali horšie respondenti s nižším stupňom vzdelania.
75
Vybrané ukazovatele nutričného a zdravotného stavu (%- ný podiel)
Tabuľka 3
Vybrané ukazovatele
spolu (n = 687)
(mmol/l; %)
Percentuálny (%) podiel respondentov k ukazovateľom
TCH ≥ 5,2 mmol/l
32,5
34,1
30,7
0,2981
HDL-CH < 1,0 mmol/l 12,7
16,2
8,4
0,0001
LDL-CH ≤ 3,4 mmol/l 34,0
35,9
32,3
0,2214
TG > 1,9 mmol/l
18,1
26,8
10,6
0,0001
Glu > 6,0 mmol/l
37,6
33,4
42,5
0,0056
muži (n = 322)
ženy (n = 365)
P-value
U väčšiny sledovaných biomarkerov sa celkové priemerné hodnoty nachádzajú v pásme
normálnych hodnôt, resp. v pásme tesne nad optimom. S výnimkou glukózy, sme štatisticky
signifikantné rozdiely v neprospech mužov zistili pri hodnotení sérových koncentrácii HDLcholesterolu a triglyceridov (tab. 3).
Zistené rozdiely pri sledovaných biochemických ukazovateľoch sa v najvyššej vekovej skupine
postupne zbližujú, znižuje sa hodnota BMI ako aj podiel obéznych (a to najmä u mužov), pričom
hodnoty krvného tlaku ostávajú nemenné, resp. sa len mierne zvyšujú (zvlášť u liečených
hypertonikov, ktorí predpísanú farmakoterapiu nedodržujú). Hladiny glukózy ostávajú konštantné aj
v najvyšších vekových kategóriách, napriek tomu, že počet diagnostikovaných na diabetes 2. typu
sa s pribúdajúcim vekom zvýšil.
Parametre, ktoré sme v tejto štúdii sledovali (lipidový profil a glykémia), sú odrazom
konzumácie konkrétnych druhov potravín. Hodnotením stavu výživy sme v sledovanej skupine
respondentov zistili zvýšený príjem saturovaných mastných kyselín, ktorých zdrojom boli najmä
mäsové výrobky a bravčové mäso, v menšej miere aj tučné mliečne produkty; naopak úplne
nedostatočný bol príjem polynenasýtených mastných kyselín radu n-3, ktorých zdrojom sú najmä
ryby. Rovnako nedostatočný bol i príjem strukovín.
Väčšina respondentov preferovala tiež tzv. biele pečivo s nižším obsahom vlákniny a balastných
látok, čoho nepriaznivú skutočnosť znásobuje deficit príjmu čerstvého ovocia a zeleniny (situácia je
lepšia len medzi ženami nižších vekových skupín). Prílohy k jedlám ako sú zemiaky, cestoviny
alebo ryža, sú čo do počtu spotrebovaných porcií v rámci jedného týždňa konzumované takmer
optimálne, potvrdil sa aj efekt substitúcie (striedanie príloh v strave); zdraviu nevhodným je však
veľký objem týchto porcií (príloh), skonzumovaných v jedinom chode (viac ako 200 gramov).
76
Pitný režim môžme hodnotiť ako nedostatočný najmä u starších respondentov (nad 55 rokov), ktorí
prijímajú menej ako 2 litre tekutín za deň, ale tiež u respondentov mladších (do 30 rokov), z dôvodu
preferencie sladených nealkoholických nápojov v ich pitnom režime. Zistili sme tiež nadmieru
spotreby kuchynskej soli u tretiny respondentov (najmä u mužov stredného veku) a častejší konzum
sladkostí u nadpolovičnej väčšiny respondentov (najmä u žien), podobné výsledky zistili aj Kajaba
et al. (2001).
Záver
Prezentované výsledky sú príspevkom k sledovaniu stravovacích zvyklostí a
zdravotného stavu slovenskej populácie. Z faktorov životného štýlu vystupuje do popredia
nedostatočná fyzická aktivita (najmä u žien) a vysoký výskyt fajčenia (najmä u mužov).
Z objektívnych vyšetrení sa ako najzávažnejší javí vysoký výskyt nadhmotnosti a obezity
rovnako u mužov ako aj žien a tiež vysoké hodnoty tlaku krvi u mužov. Sledovanú skupinu
respondentov vystihujú nasledovné charakteristiky:
-
horšie ukazovatele lipidového profilu u mužov (↓ HDL-cholesterol a ↑
triglyceridy),
-
totálny cholesterol má vyššiu priemernú hladinu v celom súbore (je však stále
v norme),
-
v kategórii rizikových hladín majú väčšie zastúpenie muži (najmä u triglyceridov),
-
priemerná hladina glukózy je vyššia u žien (prevládajú ženy starších vekových
skupín),
-
hodnoty väčšiny ukazovateľov sa zhoršujú s pribúdajúcim vekom, rapídnejšie
u mužov,
-
všetky vyšetrenia v norme majú respondenti v zastúpení najmladšej vekovej
kategórie,
-
najhoršie výsledky vyšetrení sa zistili u osôb so základným vzdelaním
a u obéznych,
-
obecne horšie výsledky objektívnych vyšetrení mali aj fajčiari a osoby žijúce na
vidieku,
-
ukazovatele nutričného a zdravotného stavu boli vôbec najhoršie u fyzicky
inaktívnych.
Práca bola riešená s podporou projektu VEGA 1/2321/05.
77
Literatúra
1. DANIŠKA, J., CHLEBO, P., HARASNÍK, V., ŠRAMKOVÁ, K. 2006. Stravovacie zvyklosti slovenskej
populácie a ich dopad na zdravotný stav. In: Výživa a zdraví 2006: Výživa - základní nástroj prevence.
Celostátní konference s mezinárodní účastí, Teplice 19.-21. září 2006. Krajská hygienická stanice a
Zdravotní ústav se sídlem v Ústí nad Labem, 2006. s. 66-74.
2. GINTER, E. 2003. Priepasť medzi zdravotným stavom obyvateľov SR a Západom sa na rozhraní XX. – XXI.
storočia prehlbuje. In: Med Monitor, 2003, 2, s. 14-16.
3. JURKOVIČOVÁ, J. 2005. Vieme zdravo žiť? Bratislava: Univerzita Komenského v Bratislave, 2005. 166 s.
ISBN 80-223-2132-X.
4. KAJABA, I., ONDREJKA, J., KALÁČ, J., NAGY, L. Vývoj prevalencie obezity u dospelých obyvateľov
Slovenska. In: Životné podmienky a zdravie. Bratislava, NCPZ, 2001, s. 240-245.
Kontaktná adresa: Mgr. Viliam Harasník, Katedra výživy ľudí, Fakulta agrobiológie
a potravinových zdrojov, SPU v Nitre, Tr. A. Hlinku 2, 949 76 Nitra, Slovenská republika; Email: [email protected]
SLEDOVANIE STAVU VÝŽIVY A VYBRANÝCH BIOMARKEROV ZDRAVIA VO
VZŤAHU KU KARDIOVASKULÁRNEMU RIZIKU MEDZI VYBRANÝMI
SKUPINAMI OBYVATEĽSTVA SR
ASSESSMENT OF NUTRITIONAL STATUS AND CHOSEN BIOMARKERS IN
RELATION TO CARDIOVASCULAR RISKS AMONG SELECTED POPULATION IN
THE SLOVAC REPUBLIC
Harasník V.¹, Marcinková M.², Slivková J.², Čižmárová M.¹
¹ ) Katedra výživy ľudí, Fakulta agrobiológie a potravinových zdrojov SPU v Nitre, SR
² ) Katedra fyziológie živočíchov, Fakulta biotechnológie a potravinárstva SPU v Nitre, SR
Abstract
This work analysed nutritional habits and some health biomarkers of cardiovascular
prevention among selected groups of Slovak population. The examined group was constituted
of 817 respondents (41.90 % men and 58.10 % women respectively). Their average age was
48.70 ± 9.91 years. The „nutritional” health is entirely dependent on cardio-protective foods.
Orientation on this intake of optimal composition, is associated with significantly reduced
values of risk parameters for atherosclerosis in nutrition- rationalist group (total cholesterol,
LDL-cholesterol, triacylglycerols, atherogenic index, saturated fatty acids, high glucose) and
significantly higher values of antiatherogenic substances (fatty acids from n-3 range, HDLcholesterol, vitamins C and E). Thus, rational diet is very necessary to fully support human
health and primary prevention of nutrition associated cardiovascular diseases. The worth
results from objective examinations were found in persons with the elementary education and
subjects, who lived in cities, in non-smokers, physicially active and apparently lustily lived
persons.
Key words: Nutritional habits, Health status, Biomarkers, Cardiovascular diseases, Life-style
78
Úvod
Nesprávne
stravovacie
návyky
a
životospráva
sú
príčinou
nárastajúceho
kardiovaskulárneho rizika v slovenskej populácii, zväčša ako dôsledok ich dlhodobej
expozície a to nielen v posledných rokoch. Vplyv výživy na zdravotný stav a výskyt
kardiovaskulárnych ochorení na mortalitu ľudí je všeobecne uznávaný. Správna výživa
realizovaná orientáciou na kardio-protektívne potravinové varianty je rozhodujúcim
predpokladom
optimálneho
vývoja
organizmu
a základnou
podmienkou
prevencie
civilizačných ochorení, ktoré postihujú rozsiahle skupiny obyvateľov. Racionálna výživa v
kombinácii s dostatočnou telesnou aktivitou, sú zaručene úspešnou alternatívou, ako možno
svoj zdravotný stav zlepšiť, a postarať sa o lepšiu kvalitu života (Avdičová et al., 1999).
Materiál a metodika
Predkladaná štúdia je príspevkom v rámci série zdravotno-preventívnych výskumných
akcií, sledujúcich vybrané ukazovatele životného štýlu (prostredníctvom biochemického
skríningu) najmä vo vzťahu k zdraviu a stravovacím zvyklostiam u vybranej časti slovenskej
populácie. Prebiehala v rokoch 2004-07 na celom území SR. Celkovo sa na sledovaní
zúčastnilo 817 respondentov (mužov bolo 41,9 % a žien 58,1 %). Priemerný vek bol 48,7 ±
9,91 rokov (u mužov 47,6 ± 10,2 rokov, u žien 49,5 ± 9,6 rokov; P = 0,069), vekové rozpätie
bolo 18 až 95 rokov (tab. 1). Prevahu mali ľudia so stredoškolským vzdelaním a respondenti
pochádzajúci z miest.
Charakteristika súboru ( x ± s )
Tabuľka 1
Údaje o respondentoch
muži (n = 342)
ženy (n = 475)
spolu (n = 817)
vek (roky)
47,6 ± 10,24
49,5 ± 9,67
48,7 ± 9,91
telesná hmotnosť (kg)
83,2 ± 6,3
69,8 ± 8,3
-
telesná výška (cm)
177,8 ± 9,5
165,9 ± 6,7
-
obvod pásu (cm)
94,9 ± 10,1
83,7 ± 8,4
89,5 ± 8,2
obvod bokov (cm)
104,1 ± 6,4
104,3 ± 5,2
104,2 ± 5,7
BMI (kg.m-2)
27,1 ± 5,3
25,9 ± 4,8
26,5 ± 4,9
WHR (pás/boky)
0,92 ± 0,14
0,83 ± 0,11
0,88 ± 0,10
Nutričná analýza: Príjem energie a nutrientov bol kalkulovaný z dotazníkov sledujúcich
spotrebu jednotlivých potravín a potravinových skupín. Frekvencia konzumácie bola
vyjadrená kategóriami: nikdy, n-krát denne, týždenne, mesačne a ročne.
79
Antropometrické meranie: Body mass index (BMI) sme kalkulovali ako pomer hmotnosti v
kg a výšky vyjadrenej v m². Obvod pása a bokov (pre určenie WHR-indexu a stanovenie typu
obezity) sme merali pásovým meradlom (v cm) a krvný tlak ortuťovým tlakomerom.
Biochemické vyšetrenia: Kompletný lipidový profil ako aj hladiny glukózy v krvnom sére,
boli určované automatickým analyzátorom OLYMPUS AU 640 (Japan), štandardnými
laboratórnymi metódami. Kapilárna krv respondentov bola poskytnutá dobrovoľne, oboberaná
bola nalačno.
Analýza životného štýlu: Sledovali sme najmä konzum alkoholu, fajčenie a podiel telesných
aktivít.
Výsledky a diskusia
Sledovaním stravovacích zvyklostí sme zistili, že respondenti uprednostňujú mäso, najmä
hydinové (muži ako aj ženy). Až 48,5 % zo všetkých respondentov konzumovalo mäso vo
frekvencii 4-5-krát do týždňa (väčšinou muži). Ryby prijímalo 26,1 % respondentov s frekvenciou
1-krát týždenne. Konzumáciu zabíjačkových špecialít a mäsových výrobkov uviedla takmer ½
všetkých respondentov s frekvenciou aspoň 2-3-krát do týždňa. Najčastejšou technologickou
úpravou mäsa v sledovanej populácii bolo dusenie pred varením, pečením a vyprážaním. Spotreba
vajec zodpovedala odporúčaniam (1-3-krát týždenne).
Mlieko a mliečne výrobky (obzvlášť zakysané mlieko, jogurty a syry) konzumovala v
najčastejšie udávanej frekvencii 2-3-krát týždenne, viac ako ½ všetkých respondentov. Denná
konzumácia mlieka je nedostatočná. Mlieko nekonzumuje vôbec 32,4 % a mliečne výrobky 11,3 %
respondentov. Podľa obsahu tuku až ⅔ všetkých respondentov preferovalo konzum netučného
mlieka a mliečnych výrobkov.
Konzumácia tukov spadá do racionálnej normy, napriek tomu, že bola pomerne častá (vo
frekvencii 4-5-krát týždenne). V príjme respondentov prevládali rastlinné oleje, pred maslom a
margarínmi; nasýtené mastné kyseliny v potrave respondentov pochádzali najmä z mäsových
výrobkov a bravčového mäsa.
Pri výbere pečiva viac ako polovica respondentov (58,1 %) uprednostňovala biele pred
celozrnným, resp. tmavým pečivom. Sladké jedlá ako aj sladkosti konzumovalo 46,3 % zo všetkých
respondentov s frekvenciou aspoň 2-3-krát týždenne (častejšie ženy). V príjme príloh k jedlám,
prevládala u sledovaných osôb ryža, s frekvenciou 2-3-krát do týždňa, pred cestovinami a
zemiakmi. Konzumácia strukovín bola absolútne nedostatočná. Nadpolovičná väčšina respondentov
ich prijíma len 1-2-krát za mesiac a tretina z nich 1-krát týždenne. Zelenina ako aj ovocie je v dennej
80
konzumácii sledovaných subjektov nedostatková, iba 34,5 % (najmä žien) konzumuje aspoň 1
porciu denne (optimálne je prijímať až 5 porcií denne).
V pitnom režime respondentov prevládali minerálne vody (58,2 %) pred čajmi. Zistili sme
tiež, že väčšina mužov ako aj žien, prijíma 2 až 2,5 l tekutín denne. Nedostatočný pitný režim
sme zistili pri 27,8 % z celkového počtu respondentov (ich spotreba bola nižšia ako 1,5 l
tekutín za deň).
Väčšina respondentov (54,6 %) konzumuje kávu 1-2-krát denne (najmä ženy). Sladenie
pokrmov preferuje 53,1 % všetkých respondentov (najmä žien); solenie pokrmov preferuje až 61,2
% respondentov (najmä mužov). Alternatívne spôsoby výživy aplikuje 7,4 % všetkých
respondentov (častejšie ženy).
Stanovením BMI (index telesnej hmotnosti) sme zistili, že v pásme nadhmotnosti sa
nachádza 41,2 % osôb (46,5 % mužov a 36,8 % žien) a v pásme obezity 17,5 % respondentov
(15,6 % mužov a 19,3 % žien), čo je v porovnaní s monitoringom konaným v rámci projektu
CINDI (1999), pokles o 4,2 % (tab. 2). Pri nadhmotnosti a obezite spolu, sme porovnaním
mužov a žien zistili štatisticky signifikantný rozdiel (P < 0,0001). Priemerné hodnoty WHRindexu boli v prípade mužov ako aj žien pod hranicou rizikových hodnôt (u žien 0,9; u mužov
1,0).
Niektoré biomarkery zdravotného stavu a životného štýlu (podiel osôb v %)
Tabuľka 2
Biomarkery
zdravia
a spolu (n = 817)
muži (n = 342)
ženy (n = 475)
P-value
životného štýlu
%
n
%
n
%
n
Nadhmotnosť podľa BMI
41,2
336
46,5
159
36,8
177
0,0001
Obezita podľa BMI
17,5
143
15,6
52
19,3
91
0,1261
TK systol. (≥ 140 mmHg)
31,9
261
38,2
131
27,4
130
0,0001
TK diastol. (≥ 90 mmHg)
27,3
223
34,1
117
22,5
106
0,0035
Príjem alkoholu (> 1-x/td)
28,4
231
47,9
165
13,9
66
0,0001
Fajčenie (pravidelné)
25,9
212
31,8
109
21,7
103
0,0001
Nedostatočná fyz. aktivita
59,7
488
52,5
180
64,8
308
0,0001
Rizikové hodnoty krvného tlaku (≥ 140,0/90,0 mmHg), malo po odmeraní systolického
tlaku až 38,2 % mužov a 27,4 % žien; pri diastolickom tlak to bolo 34,1 % mužov a 22,5 %
žien. V oboch prípadoch sme zistili štatisticky signifikantné rozdiely v neprospech mužov.
Optimálne hodnoty TK (≤ 120/80 mm Hg) malo len 31,3 % zo všetkých respondentov (vyššie
zastúpenie mali ženy).
81
Z faktorov životného štýlu sme sledovali predovšetkým príjem alkoholu, fajčenie a telesnú
aktivitu. Konzumáciu alkoholu vo frekvencii viac ako 1-krát týždenne (pri najčastejšie uvádzanom
objeme 0,5 dl), sme zistili u 28,4 % respondentov (štatisticky vysoko významne častejšie v prospech
mužov; P < 0,0001). Medzi jednotlivými druhmi alkoholických nápojov prevládalo pivo pred
vínom a destilátmi.
V sledovanom súbore bolo 25,9 % fajčiarov (31, 8 % mužov a 21,7 % žien; P < 0,0001).
Najvyšší počet fajčiacich osôb sa nachádzal vo vekovej skupine do 30 rokov (43,1 %). Pri
porovnaní so štúdiou Jurkovičovej (2005), sme zistili až 5,8 %-ný nárast počtu fajčiacich osôb.
Nedostatočnú alebo žiadnu telesnú aktivitu sme zistili u 59,7 % respondentov (vysoko
signifikantne častejšie ju udávali ženy → 64,8 % vs 52,5 %). Telesná aktivita klesala s pribúdajúcim
vekom, rapídnejšie však až po 55 roku života, a to rovnako u mužov ako aj u žien. Primeranú
mimopracovnú telesnú záťaž (v trvaní minimálne 2-3 hodiny týždenne), sme zistili u 29,6 %
osôb (s vyšším zastúpením mužov).
Zo sledovaných biochemických ukazovateľov, sa priemerné hodnoty nachádzajú v
pásmach normálnych hodnôt. S výnimkou LDL-cholesterolu a glykémie sú však vysoko
významné rozdiely vo výskyte nepriaznivých hodnôt v neprospech mužov. Rovnako index
aterogenity (TCH/HDL-CH) majú muži horší nielen v celom súbore, ale takisto naprieč
spektrom všetkých vekových skupín s výnimkou najnižšej (< 30 rokov).
Vybrané
ukazovatele
nutričného
a
zdravotného
stavu
(koncentrácie)
Tabuľka 3
Vybrané ukazovatele
spolu (n = 817)
(mmol/l)
Priemerné hodnoty sérových koncentrácií ukazovateľov
Celkový cholesterol
4,91 ± 0,99
5,02 ± 0,98
4,83 ± 1,02
0,0316
HDL-cholesterol
1,46 ± 0,53
1,34 ± 0,46
1,55 ± 0,43
0,0001
LDL-cholesterol
2,95 ± 0,87
2,97 ± 0,90
2,93 ± 0,89
0,4027
TCH/HDL-cholesterol 3,45 ± 1,49
3,68 ± 1,52
3,28 ± 1,41
0,0001
Triglyceridy (TG)
1,37 ± 0,68
1,54 ± 0,73
1,25 ± 0,67
0,0001
Glukóza (glykémia)
5,02 ± 1,02
4,96 ± 1,01
5,06 ± 1,03
0,0895
muži (n = 342)
ženy (n = 475)
P-value
Priemerné hodnoty ukazovateľov, ktoré možno definovať ako kľúčové pri
kardiovaskulárnom riziku (HDL-cholesterol, triglyceridy), sú štatisticky vysoko významne
82
nepriaznivejšie pre mužov; v kombinácii s nedostatočnou pohybovou aktivitou predstavujú
vysoké riziko vzniku KVO (tab. 3).
Optimálny príjem a racionálna skladba konzumovaných potravín (najmä tukov a
cukrov) sú aspekty, ktoré sa odzrkadľujú v priaznivých lipidových a glykemických
parametroch. Respondenti orientujúci sa na kardio-protektívne potravinové varianty vo
výžive, majú preukazne nižšie hodnoty rizikových faktorov aterosklerózy (celkový
cholesterol, LDL-cholesterol, triglyceridy, saturované mastné kyseliny ako i aterogenný
index) a významne vyšší obsah látok s antisklerotickým účinkom (HDL-cholesterol,
polynenasýtené mastné kyseliny z radu n-3 a vitamíny C a E). Odhadli sme tiež pokles
mortality na ischemickú chorobu srdca (ICHS) z poklesu sérového cholesterolu u viac ako 55ročných respondentov stravujúcich sa racionálne. Gerová et al. (1999) uvádzajú, že pri
poklese celkového cholesterolu o 1,2 mmol/l je kardiovaskulárne riziko redukované až o 47
%, ak celkový cholesterol poklesne o 0,6 mmol/l, znamená to pokles rizika o 26 %.
Hoci priemerné hodnoty lipidových parametrov v našej štúdii nenaznačujú
kardiovaskulárne riziko, ktoré by sme mohli kvalifikovať ako vysoké, je správne predchádzať
možným komplikáciám zaradením takých potravín do svojho jedálnička, ktoré hodnoty
lipidových parametrov udržujú na optimálnej úrovni (napr. morské ryby s obsahom PUFA
radu n-3), a to v rámci primárnej prevencie. Mastné kyseliny radu n-3 pôsobia ochranne v
prípade arytmie, majú hypolipidemické vlastnosti s účinkom na triglyceridy a LDLcholesterol, a ako prekurzory prostaglandínov a leukotriénov majú antitrombotické ako aj
protizápalové vlastnosti, inhibujú syntézu cytokínov a stimulujú endotelom derivovaný oxid
dusnatý. Suplementácia n-3 mastnými kyselinami spolu so zaradením významného množstva
pohybových aktivít u respondentov s kardiovasulárnym rizikom, znížila mieru mortality v
nedávno spracovanej štúdii Danišku et al. (2006) o takmer 30 %, a riziko náhlej smrti až o 45
%.
Koncentrácie
sérových
lipidov
sú
primárnym
ukazovateľom
rizika
vzniku
kardiovaskulárnych ochorení. Dyslipidémia, ktorú sme zistili najmä u mužov stredného veku,
patrí spolu s hypertenziou a fajčením k hlavným ovplyvniteľným rizikovým faktorom;
Avdičová et al. (1999) k nim zaraďujú aj pohybovú aktivitu, ktorú charakterizujú ako hlavný
regulátor kardiovaskulárnych komplikácií, priamo korelujúcich s narastajúcou hmotnosťou.
Samotná prítomnosť obezity môže byť zodpovedná za väčšie riziko než je determinované
sumáciou ostatných rizikových faktorov.
83
Zvýšené sérové koncentrácie glukózy, ktoré sme zistili u menšieho podielu sledovaných
osôb, predstavujú taktiež rizikové faktory pre kardiovaskulárne ochorenia (hyperinzulinémia,
aterogenná dyslipidémia, hypertenzia, abdominálna obezita, atď). Vo výžive väčšiny
vyšetrených respondentov boli obsiahnuté sacharidy s vysokým glykemickým indexom,
produkujúce ich rýchlu absorpciu a tým tiež nerovnomerné postprandiálne píky krvnej
glukózy, ako aj horšiu udržateľnosť inzulínovej senzitivity. S rizikom asociované hodnoty
glykémie (≥ 6,2 mmol/l) sa vyskytli u 8,9 % subjektov (najmä pri ženách stredného veku).
Strava bohatá na komplexné sacharidy s nízkym glykemickým indexom a vysokým obsahom
vlákniny (zelenina a ovocie) je vhodnou ale aj žiadúcou alternatívou. Významný efekt na
metabolizmus sacharidov a lipidov má rozpustná vláknina a aj tzv. antinutrienty (fytáty,
lektíny), ktoré redukujú stupeň digescie škrobov, čím splošťujú postprandiálnu glykémiu.
Záver
Na základe výsledkov získaných zo sledovania stravovavích zvyklostí a zdravotného
stavu vybraných skupín obyvateľov sr vo vzťahu k riziku vzniku kvo konštatujeme, že
z jednotlivých parametrov hodnotenia kardiovaskulárneho rizika, vystupujú do popredia
nepriaznivé ukazovatele lipidového profilu (hodnoty hdl-cholesterolu a triglyceridov
u mužov) ale i zvýšenej koncentrácie glukózy v krvi (u žien stredného veku) a to aj napriek
tomu, že celkové priemerné hodnoty týchto indikátorov boli v norme. Medzi respondentmi
prevládala tiež nedostatočná fyzická aktivita (najmä u žien), vysoký výskyt fajčenia (najmä
u mužov), vysoký výskyt nadhmotnosti a obezity (u oboch pohlaví) a vysoký výskyt
hypertenzie (najmä u mužov). Zistené boli aj nasledovné nutričné profily:
-
príjem potravy s vyšším obsahom tuku (bravčové mäso, mäsové výrobky,
zabíjačky),
-
nízky príjem rýb a zároveň zdraviu protektívnych, omega-3 mastných kyselín,
-
celkovo nedostatočná konzumácia strukovín (a tým aj rastlinných bielkovín),
-
uprednostňovanie bieleho pečiva pred celozrnným, rovnako u mužov ako aj u žien,
-
nízky príjem mlieka a mliečnych výrobkov, orientácia na tučné mliečne produkty
(muži)
-
veľmi nízka konzumácia ovocia a zeleniny (má byť 3-5 porcií za deň) a vlákniny,
-
preferencia sladkostí u žien a častejšie používanie kuchynskej soli u mužov,
-
nízky objem denne prijatých tekutín najmä u starších osôb (odporúča sa aspoň 2,5
l)
Práca bola riešená s podporou projektu VEGA 1/2321/05.
84
Literatúra
1.
AVDIČOVÁ, M., et al. Prevalencia rizikových faktorov srdcovo-cievnych ochorení v skríningu programu
CINDI. In: Vybrané informácie zo zdravotníckej štatistiky o vývoji ochorení obehovej sústavy v SR.
Bratislava, ŠZÚ SR, 1999; s. 95-108.
2. DANIŠKA, J., CHLEBO, P., HARASNÍK, V., ŠRAMKOVÁ, K. 2006. Stravovacie zvyklosti slovenskej
populácie a ich dopad na zdravotný stav. In: Výživa a zdraví 2006: Výživa - základní nástroj prevence.
Celostátní konference s mezinárodní účastí, Teplice 19.-21. září 2006. Krajská hygienická stanice a
Zdravotní ústav se sídlem v Ústí nad Labem, 2006. s. 66-74.
3. GEROVÁ, Z., PANÁKOVÁ, I., MATUŠKOVÁ, M. Risk factors of the cardiovascular diseases. In:
Bratislavské lekárske Listy, 1999; vol. 100, no. 5, p. 231-237.
4. JURKOVIČOVÁ, J. 2005. Vieme zdravo žiť? Bratislava: Univerzita Komenského v Bratislave, 2005. 166 s.
ISBN 80-223-2132-X.
Kontaktná adresa: Mgr. Viliam Harasník, Katedra výživy ľudí, Fakulta agrobiológie
a potravinových zdrojov, SPU v Nitre, Tr. A. Hlinku 2, 949 76 Nitra, Slovenská republika; Email: [email protected]
VPLYV PROBIOTICKÉHO PREPARÁTU NA TVORBU TUKU V TELE KURČIAT
EFFECT OF PROBIOTIC PREPARATION ON PRODUCTION OF FAT IN BODY OF
CHICKENS
Haščík, P1., Bobko, M.1, Kačániová, M.2, Čuboň, J.1, Kulíšek, V.3, Pavličová, S.4
1Katedra hodnotenia a spracovania živočíšnych produktov, 2Katedra mikrobiológie, 3Katedra veterinárskych disciplín,
4Katedra hygieny a bezpečnosti potravín SPU Nitra
Abstract
Probiotic preparation at base Enterococcus faecium with content of spore 2,0.1010 cfu.g-1 and
it’s application 6.6 ml for two weeks of it’s feeder and 3.7 ml into water at the feeders
chicken ROSS 308 gained up dynamic weight at the age of 42 days ( end of feeding ) about
+111.00 g at ♀ (P≤0.01) and about +185.00 g at ♂ (P≤0.001). At the same time there was
an increase of slaughtered chicken body after handling up to + 157.22 g at ♂ (P≤0.001)
and about 80.36g at ♀ (P≤0.05) in experimental group .
Abdominal fat fraction has encreased in experimental group within both sexes about / up
to 0.24 % at ♂ and about 0.48 % by little chickens, but without statistic differencies (P≥0,05).
Stomach fat volume probiotic preparation did not affect and a heart volume fat was just a little
higher in experimental group, but again without statistic differencies (P≥0,05).
After the evaluation of total inward fat from JOT we can state it’s slight increase within the
probiotic group at both sexes ( +0.18 % ♂, + 0.39 % ♀).
A slight increase of inward fat in the group that was applicated probiotic preparation on the
bacteria base Enterococcus faecium does not have a negative impact to Ekonomy production
of chicken poultry meat, but on the other hand it has a possitive influence on achieve utility
and therefore there might be an increasement for rentability of poultry meat production.
85
Úvod
Kvalitatívnu hodnotu mäsa výkrmových kurčiat môže významne ovplyvniť genotyp
zvierat, výživa, vek a ďalšie činitele prostredia (Haščík et al., 2005).
Pre vlastnú výživu brojlerových kurčiat sa používajú kompletné kŕmne zmesi často
obohacované v poslednom období o prídavok probiotických preparátov, ktoré sú často do
kŕmnych zmesí pridávané ako možná náhrada za vyraďované živočíšne múčky, antibiotické
preparáty, respektíve kokcidiostatiká z hľadiska novej legislatívy, ktorá je daná zákonmi
a nariadeniami Európskej únie, ako aj za účelom zlepšenia zdravotného stavu, znižovania
mortality, lepšieho využitia živín z krmiva s následnou správnou dosahovanou jatočnou
hodnotou zvieraťa ako to vo svojich prácach popisujú Nahashon et al. (1992), Kumprecht
a Zobač (1998), resp. Haščík et al. (2004).
Okrem zaraďovania probiotických preparátov do výživy hydiny ako aj iných
monogastrických a polygastrických zvierat pokračuje neustále intenzívne šľachtenie v oblasti
hydiny zamerané na skracovanie doby výkrmu pri zachovaní hmotnosti produkovaných
kurčiat ako aj kvality mäsa (Henderson, 1981), pričom s intenzívnym rastom kurčiat sa však
zvyšuje aj ukladanie tukových zásob v tele a tukové väzivo sa ukladá nielen v podkoží, medzi
svalmi, vo svaloch a orgánoch, ale aj v brušnej dutine ako abdominálny tuk.
Zatiaľ, čo priemerný podiel podkožného a najmä intramuskulárneho tuku zlepšuje kvalitu
hydinového mäsa, nadbytočný podkožný ako aj brušný tuk je nežiaduci a v tele brojlerových
kurčiat sa v priemere nachádza 1,98 % vo forme výstelkového tuku, 0,66 % žalúdkového
tuku, 0,50 % črevného tuku a spolu 3,14 % vnútorného tuku (Horváthová a Lagin, 1985).
Podobne aj Csuka (1988), Horovský et al.(1990) a Uhrín et al. (1993) konštatujú, že
z tukových zásob brojlerových kurčiat sa najväčšia pozornosť venuje depotom v brušnej
dutine, nakoľko tento tuk predstavuje 1-4 % z telesnej hmotnosti kurčiat, pričom Okáľ et al.
(1976) upozorňujú, že v trupe hydiny môže byť aj viac tuku a to od 2 do 5 %, kým v mäse je
jeho obsah od 0,5 do 1,5 %.
V konečnom dôsledku a z hľadiska viacerých literárnych zdrojov sa dá vysloviť názor, že
tukovému väzivu pri šľachtení hydiny sa nevenovala patričná pozornosť a tak súčasne
s ostatnými
vlastnosťami, ktoré možno považovať za pozitívne sa menili aj genetické
dispozície pre zvýšenú tvorbu a ukladanie tuku v organizme a to ako brušného, tak
i celotelového, pričom tuk v takejto forme je nežiaduci pre konzumenta aj spracovateľa
hydiny a tak sa stáva odpadovým produktom, ktorý spôsobuje problémy pri čistení
a opracovaní hydiny (Csuka, 1988).
86
V nadväznosti na uvedené literárne zdroje, bolo cieľom nášho experimentu na
výkrmových kurčatách hybridnej kombinácie ROSS 308 vyhodnotiť podiel tukov v jatočne
opracovanom tele kurčiat, ktoré boli kŕmené rovnakými komerčne vyrábanými kompletnými
kŕmnymi zmesami, respektíve do pokusnej skupiny cez vodu bol pridávaný probiotický
preparát na báze Enterococcus faecium s obsahom 2,0.1010 KTJ.g-1 .
Materiál a metódy
Experiment sme realizovali na testačnej stanici hydiny Katedry hydinárstva a malých
hospodárskych zvierat, pri fakulte Agrobiológie a potravinových zdrojov Slovenskej
poľnohospodárskej univerzity v Nitre na výkrmových kurčatách hybridnej kombinácie ROSS
308.
V pokuse boli vytvorené dve skupiny zvierat, kontrolná (K) a pokusná (P), do ktorých bolo
zaradených po 100 ks výkrmových kurčiat. Vlastný výkrm brojlerových kurčiat v oboch
pokusoch trval 42 dní.
Kurčatá boli kŕmené systémom ad libidum rovnakou štartérovou KKZ HYD-01 (sypká
forma) do 21. dňa veku a od 22. dňa do 42. dňa výkrmu KKZ HYD-02 (granulovaná forma).
Pokusnej skupine bol pridávaný probiotický preparát na báze Enterococcus faecium
s obsahom 2,0.1010 KTJ.g-1 do vody v množstve 6,6 ml do 2. týždňa výkrmu a 3,7 ml do
konca výkrmu (42 dní).
Na konci výkrmu bolo z každej skupiny experimentu vybratých po 30 ks kurčiat na
jatočný rozbor, ktorý sa uskutočnil na Katedre hodnotenia a spracovania živočíšnych
produktov pri FBP SPU Nitra, spolu s následným sledovaním základných hodnôt (živá
hmotnosť, hmotnosť jatočne opracovaného tela bez abdominálneho tuku) a podielom
vnútorných tukov zo živej hmotnosti a z JOT (žalúdkový, srdcový a abdominálny tuk), resp,
celkového vnútorného tuku.
Dosiahnuté výsledky boli štatisticky spracované pomocou štatistického programu SAS,
kde boli vypočítané základné štatistické charakteristiky (aritmetický priemer, smerodajná
odchýlka, koeficient variability) a na určenie preukaznosti rozdielov medzi sledovanými
skupinami bol použitý t-test.
87
Tabuľka 1
Pohlavie
Základné ukazovatele jatočných kurčiat (g)
Skupina
Živá hmotnosť
sx
v
x
sx
v
44,64
2,62
1206,12a
33,18
2,77
43,82
2,42
1286,48b+
52,95
4,12
33,22
1,79
1300,08a
50,17
3,86
43,56
2,99
x
sliepočky Kontrolná 1701,00a
Pokusná
kohútiky
1812,00b++
Kontrolná 1857,40a
Pokusná
+++
2042,00b
Hmotnosť JOT
31,14
+++
1,53
1457,30b
Pozn: Priemerné hodnoty v tom istom stĺpci podľa pohlavia a pokusu, po ktorých nasledujú rôzne
písmená sú preukazne rozlišné ( + P≤0,05, ++ P≤0,01, +++P≤0,001) (t-test )
Tabuľka 2
Pohlavie
Zastúpenie vnútorných tukov z jatočne opracovaného tela kurčiat (%)
Skupina
abdominálny tuk
x
sx
žalúdkový tuk
v
x
sx
v
srdcový tuk
x
v
sx
sliepočky Kontrolná 1,39a 0,68 48,79 0,69a 0,41 59,53 0,04a 0,04 101,3
Pokusná
kohútiky
1,87a 0,34 18,05 0,59a 0,21 35,38 0,06a 0,02 39,12
Kontrolná 1,35a 0,41 305,2 0,65a 0,16 24,32 0,02a 0,01 47,51
Pokusná
Tabuľka 3
1,59a 0,68 43,02 0,59a 0,18 30,61 0,03a 0,01 43,85
Zastúpenie vnútorného tuku z jatočne opracovaného tela (%)
Pohlavie
Skupina
x
sx
v
Sliepočky
Kontrolná
2,13a
0,77
36,29
Pokusná
2,52a
0,32
12,76
Kontrolná
2,03a
0,31
15,47
Pokusná
2,21a
0,70
31,86
kohútiky
Výsledky a diskusia
Priemerná živá hmotnosť sliepočiek brojlerových kurčiat hybridnej kombinácie ROSS
3O8 bola nižšia v kontrolnej skupine (1701,00 g) a vyššia v pokusnej skupine s prídavkom
probiotického preparátu
do vody (1812,00 g). Podobná tendencia sa zaznamenala aj u
kohútikov, kde v kontrolnej skupine bola vo veku 42 dní živá hmotnosť 1857,40 g a
v pokusnej skupine 2042,00 g. Pri štatistickom porovnaní výsledkov v rámci pohlavia medzi
88
skupinami sa zaznamenali preukazné rozdiely u kohútikov (P≤0,001) a u sliepočiek (P≤0,01)
v prospech pokusných skupín, t.j. s prídavkom probiotického preparátu (tabuľka 1).
Zistené priemerné hodnoty živej hmotnosti kurčiat oboch pohlaví v našich pokusoch sú
nižšie ako uvádza Rychlá a Řezníček (2000) resp. Benková (2001), ktorých porážková
hmotnosť bola v priemere 2240,0 a 2083,5 g a podobne nižšie ako uvádzajú Straková et al.
(2002), ktorí zistili priemernú hmotnosť kurčiat ROSS 308 po 42. dňoch výkrmu u sliepočiek
2360 g a u kohútikov 2700 g.
Z hľadiska hmotnosti jatočne opracovaného tela (JOT) bez abdominálneho tuku bola
podobná tendencia ako pri živej hmotnosti v prospech pokusnej skupiny, kde u sliepočiek boli
hodnoty (kontrola – 1206,12 g : pokusná -1286,48 g) a u kohútikov (kontrola -1300,08 g :
pokusná – 1457,03 g), čo sa prejavilo aj štatisticky preukazne(P≤0,05 u sliepočiek, resp.
P≤0,001 u kohútikov).
Pri vyhodnocovaní podielu jednotlivých tukov z JOT (tabuľka 2,3) sme zistili tendenciu
vyššieho ukladania abdominálneho tuku u oboch pohlaví v skupine s prídavkom
probiotického preparátu, ale bez štatisticky preukazných rozdielov (P≥0,05).
Nami
dosiahnuté hodnoty abdominálneho tuku z JOT sú v súlade s výsledkami Uhrína et al. (1993) ,
Křížkovej et al. (1995), ktorí deklarujú hodnoty abdominálneho tuku z JOT na úrovni
% resp. s Laginom (1985), ktorí zistil
1,5-3
u sliepok 2,75 a u kohútov 3,04 %-ný podiel
výstelkového tuku z JOT. Nižšie hodnoty tvorby abdominálneho tuku pod 1 % zistila vo
svojich pokusoch Angelovičová (1997), ktorá ale pre výkrm kurčiat použila zníženú úroveň
metabolizovateľnej energie v kŕmnych zmesiach.
Pri porovnaní podielu abdominálneho tuku z JOT z hľadiska pohlavia sa v 1. pokuse
potvrdila tendencia vyššieho ukladania tuku u sliepočiek ako u kohútikov a podobné výsledky
zaznamenali aj
Becker et al. (1979), resp. Gyles et al. (1982). V súvislosti
s tvorbou
abdominálneho tuku si je nutné uvedomiť, že tento tuk pre samotného konzumenta je stratou,
nakoľko pri spracovaní hydiny je len prekážkou a pre samotného konzumenta v potravinovom
reťazci je prakticky nevyužiteľný.
Hodnoty podielu žalúdočného tuku z JOT vo všetkých nami sledovaných skupinách boli
nižšie od 0,59 % (sliepočky a kohúty pokusnej skupiny) po 0,69 % (sliepočky –kontrolnej
skupiny) v porovnaní s hodnotami, ktoré dosiahli vo svojom pokuse Horváthová a Lagin
(1985) 1,02 % resp. Lagin (1989) 0,99 % u sliepočiek a 1,44 % u kohútov. Probiotický
preparát svojím účinkom nevplýval na zvyšovanie žalúdočného tuku u výkrmových kurčiat
ROSS 308. Z pohľadu štatistického sa medzi skupinami a pohlavím nedosiahli štatisticky
preukazné rozdiely (P≥0,05).
89
Pri hodnotení obsahu vnútorného tuku sa často zabúda, že časť tuku je lokalizovaná aj na
srdci, ktoré tvorí jednu z jedlých častí vnútornosti hydiny pre kulinárske účely, kde hodnoty
v nami preverovaných pokusoch sa dosiahli od 0,02 % (kohútiky – kontrolná až 0,06
(sliepočky – pokusná skupina). Zo štatistického hľadiska sa medzi skupinami podľa pohlavia
v tomto ukazovateli nezistili štatisticky významné rozdiely (P≥0,05).
Záver
Z výsledkov experimentu vyplýva, že probiotický preparát na báze Enterococcus faecium
s obsahom 2,0.1010 KTJ.g-1 pridávaný do vody svojim účinkom zvýšil tak živú hmotnosť na
konci výkrmu ako aj hmotnosť JOT.
Pri vyhodnotení podielu vnútorných tukov z JOT sa zistila tendencia vyššieho ukladania
tukov u pokusnej skupiny oproti kontrolným skupinám u oboch pohlaví.
Pri vyhodnotení podielu abdominálneho tuku z JOT u brojlerových kurčiat ROSS 308,
ktorý sa v posledných desaťročiach rapídne zvýšil a predstavuje ekonomickú stratu a na
druhej strane zhoršuje aj opracovanie brojlerov, resp. zvyšuje množstvo jatočného odpadu
a v konečnom dôsledku vplýva aj na jatočnú výťažnosť sa potvrdzuje tendencia zvýšenej
tvorby abdominálneho tuku pri použití probiotík cez vodu, čo môže vplývať na dietetiku
hydinového mäsa konzumovaného spoločne s abdominálnym tukom. Zároveň si ale musíme
uvedomiť, že probiotické preparáty v prevažnej miere pozitívne ovplyvňujú dosahovanú
úžitkovosť, čo v konečnom dôsledku len pri malom náraste abdominálneho tuku neprináša
žiadne ekonomický straty, práve naopak pre samotných výrobcov väčší finančný zisk
Literatúra
Angelovičová, M. 1997. Vplyv nízkobielkovinových tukovaných kŕmnych zmesí na živú hmotnosť a vybrané
ukazovatele jatočnej kvality výkrmových kurčiat. In: Poľnohospodárstvo, roč. 43, 1997, č.10, s. 764–771.
Becker, W. A. – Spenger, J. V. – Mirosh, J. A. – Verstrafe. 1979. Heritabilities and genetic correlation of live
and carcass weights and abdominal fat in female broilers. In: Poult. Sci., vol. 58, 1979, p. 1035.
Benková, J. 2001. Analýza jatočnej kvality a nutričnej hodnoty genofondu importovaných kurčiat do SR v roku
2001. In: Správa za účelovú činnosť. Nitra, VUŽV, SCHŠH Ivánka pri Dunaji, 2001, s. 1–16.
Csuka, J. 1988. K problematike pretučnenia brojlerov. In: Hydina, roč. 30, 1988, č.1–2, s. 33–38.
Gyles, N. R – Maeza, A. – Goodwin, T. L. 1982. Regression of abdominal fat in broilers on abdominal fat in spet
parents. In: Polt. Sci., vol. LXI, 1982, p. 1809–1814.
Haščík, P. – Čuboň, J. – Vagač, V. 2004. Hodnotenie senzorickej kvality hydinového mäsa vplyvom
probiotického prepaáru IMB 52. In: Maso, roč. 15, 2004, č.1, s.62–65.
Haščík, P. – Čuboň, J: - Horniaková, E. – Krivánek, L. – Kulíšek, V. 2005. Vzťah medzi aplikáciou
probiotického preparátu a množstvom abdominálného tuku u výkrmových kurčiat. In: Agriculture
(Poľnohospodárstvo), roč. 51, 2005, č. 11, s. 574 – 579, ISSN 0551 – 3677.
Henderson, M. 1981. UK broiler industry needs to change direction. In: Poult. Int., vol. 20, 1981, no. 12,
p.116–118.
Horovský, Š. – Kočiová, Z. – Kočí, Š. 1990. Výživársko-technologické aspekty pretučnenia brojlerov. In:
Hydina, roč. XXXI, 1990, č. 5–6, s. 112–116.
90
Horváthová, V. – Lagin, L. 1985. Technologická a nutričná hodnota brojlerových kurčiat hybrida Slovgal. In:
Živočíšna výroba, roč. LVIII, 1985, č. 8, s. 761–768.
Křížková, E. – Čermák, B. – Kadlec, J. - Lád F. 1995. Zhodnocení podílu jednotlivých partií drůbežího masa po
porážce. In: Aktuální problémy zdraví, růstu a produkce drůbeže, České Budějovice Scientific Pedagogoc
Publishing, 1995, s. 139–140, ISBN 80–85645–15–7.
Kumprecht, I. – Zobač, P. 1998. Účinek probiotických praparátů na bázi Sacharomyces cerevisiae
a Enterococcus ve směsích s rozdílnou hladinou vitamínů skupiny B na úžitkovost kuřecích brojlerů. In: Czech.
J. Animm.Sci., roč. 43, 1998, s. 63–70.
Lagin, L. 1989. Jatočná hodnota kurčiat kombinácie Hybro. In: Živ.výroba, roč. LXII, 1989, č. 7, s.655–662.
Nahashon, S. N. – Nakaue, H. S. – Mirosh, L.W. 1992. Effect of direct-feed microbilas on nutritient retention
and production parameters of laying pullets. In: Poult. Scien., vol. 71, 1992, no. 1, p. 111.
Okáľ, A. – Buriánková, J. – Greser, E. – Matušovičová, E. 1976. Technológia hydinárskeho priemyslu.
Bratislava: Príroda, 1976, 302 s.
Rychlá, J. – Řezníček, M. 2000. Vyhodnocení výkrmu brojlerů v Roštenicích. In: Náš chov, roč. LX, 2000, č.
11, s. 35–36.
Straková, E. – Suchý, P. – Pažout, V. 2002. Efekt výkrmu brojlerových kuřat do vyššího věku a hmotnosti. In:
Technologické systémy v chovu drůbeže (sbor. z mezin. konfer.), Brno, MZLU, 2002, s. 165–168, ISBN 80–
7157–579–8.
Uhrín, V. – Horváthová, V. – Horniaková, E. – Chmelničná, Ľ. – Bulla, J. 1993: Kvalita hydinového mäsa. In:
Acta Zootechnica, Nitra, VŠP, 1993, 111 s., ISBN–80–7137–124–6.
Kontaktná adresa::Ing. Peter Haščík, PhD. Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre,
Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Katedra hodnotenia a spracovania živočíšnych
produktov. Tr.A.Hlinku 2, 949 76 Nitra, email: [email protected]
FOTOINDUKOVATEĽNÁ EXPRESIA KURACIEHO PERIOD GÉNU V EPIFÝZE.
PHOTOINDUCIBLE EXPRESSION OF CHICKEN PERIOD GENE IN THE PINEAL
GLAND.
Herichová I.1, Monošíková J.1, Zeman M.1,2
1
2
Katedra živočíšnej fyziológie a etológie, Univerzita Komenského v Bratislave, Bratislava
Ústav biochémie a genetiky živočíchov, SAV, Ivanka pri Dunaji
Abstract
The pineal gland is a key component of the avian circadian system. Besides its capacity to
generate oscillations, the avian pineal gland is able to synchronize to external light-dark
cycles and generate an output signal – melatonin. The aim of our work was to study
responsivnes of embryonic pineal gland to external light pulses. We measured expression of
clock gene per2 in 19-day old embryos by real time PCR after 3h lasting light pulse. We
conclude that per2 has capacity to mediate information about external light:dark cycle already
on day 19 of development but this ability is limited to the phase of day when per2 expression
is highest.
91
Úvod
Epifýza patrí spolu s retinou a hypotalamom ku kľúčovým komponentom aviárneho
cirkadiánneho systému (Cassone a Menaker, 1984). Okrem kapacity generovať oscilácie je
tiež schopná nasynchronizovať sa na externý svetelný režim pomocou funkčných
fotoreceptorov a generovať výstupný signál (Takahashi a kol., 1989).
Činnosť biologických hodín je na molekulárnej úrovni determinová rytmickou expresiou
tzv. hodinových génov, ktorých delécia spôsobuje disrupciu rytmického profilu aktivity v
konštantných podmienkach. U vtákov je funkčný model činnosti cirkadiánneho pacemakera
založený na spätnoväzobnej slučke tvorenej hodinovými génmi per2, per3, cry1 a cry2 a
transkripčnými faktormi CLOCK a BMAL1 (alebo ich funkčnými homológmi). Proteínové
produkty hodinových génov per2-3 a cry1-2 inhibujú transkripciu svojej vlastnej mRNA
interferenciou
s
komplexom
stimulačne
pôsobiacich
transkripčných
faktorov
CLOCK:BMAL1. Transkripčné faktory CLOCK a BMAL1 naopak indukujú expresiu
hodinových génev prostredníctvom väzby na E-box v ich promotori (Okano a kol., 2001).
Kurací per2 gén je v epifýze exprimovaný už od 18. dňa embryonálneho vývinu, ale
rytmické zmeny vykazuje len ak sú embryá vystavené svetelnému režimu, nie v konštantnej
tme (Okabayashi a kol., 2003). Na druhej strane naše výsledky ukazujú, že kuracia
embryonálna epifýza je schopná nasynchronizovať sa na svetelný aj teplený režim (Zeman a
kol., 1999; Zeman a kol., 2004) a generovať rytmus melatonínu aj po expozícii embyrí
konštantým podmienkam (Zeman a kol., 1999). Jediný kompletný svetelný cyklus po
vyliahnutí stačí na demonštrovanie rytmickej syntézy melatonínu v epifýze čerstvo
vyliahnutých kurčiat (Zeman a kol., 1999). Tieto pozorovania predpokladajú prítomnosť
funkčného pacemakera v mozgu kurčiat už na konci embryonálneho vývinu. Funkčný
oscilátor implicitne predpokladá prítomnosť rytmickej expresie hodinového génu per2, ktorý
patrí medzi kľúčové komponenty molekulárnehoh oscilátora.
Za účelom štúdia ontogenézy kuracieho epifyzárneho oscilátora sme charakterizovali
expresiu per2 génu v epifýze 19-dňových embryí počas 24 hodinového cyklu v
synchronizovaných podmienkach aj konštantnej tme a testovali sme indukovateľnosť expresie
per2 génu svetelnými pulzami v tmavej aj subjektívnej svetlej fáze dňa.
Materiál a metódika
V pokusoch sme použili 66 násadových vajec brojlerových kurčiat, ktoré boli inkubované
v liahniach (Bios Sedlčany, ČR) s automatickým otáčaním. Inkubačná teplota bola udržiavaná
v rozsahu 37,5 ± 0,2 ºC a vlhkosť 50 – 60 %. Počas inkubácie boli embryá vystavené
92
svetelnému režimu svetlo (L) : tma (D) 12:12, ktorý bol kontrolovaný automaticky a intenzita
osvetlenia na úrovni vajec bola v rozsahu 140 – 200 lux. Odbery vzoriek boli robené
pravidelne počas 24h v 4 hodinových intervaloch so začiatkom v čase ZT 14 (ZT – Zeitgeber
time; ZT0 je definovaný ako začiatok svetlej fázy dňa). Svetelné pulzy sa uskutočnili v čase
ZT 3-6 a ZT 15-18. Svetelné pulzy počas svetlej fázy dňa sa realizovali na skupine embryí,
ktoré boli po skončení pravidelnej tmavej fázy dňa vystavené konštantnej tme. V tmavej fáze
24h cyklu sme odbery uskutočnili pri matnom červenom svetle. Vzorky tkanív boli uložené
pri –80 oC až do izolácie celkovej RNA.
Celková RNA bola izolovaná pomocou Tri-reagentu (MRC, USA) (Chomczynski a
Sacchi, 1987). Epifýzy boli izolované individuálne a po homogenizovácii v 350 µl Trireagentu bola RNA vyzrážaná v prítomnosti koprecipitantu GlycoBlue (Ambion, USA).
Ostatné kroky izolácie prebiehali podľa pokynov dodávateľa Tri-reagentu. Na kontrolu
integrity RNA sme použili 1 % agarózový gél obsahujúci MOPS a formaldehyd. Gél bol
vizualizovaný pomocou systému Gel Doc XR (Bio-Rad, USA) a záznam gélu bol uložený v
digitálnej forme.
Syntéza cdna bola urobená pomocou kitu improm-ii reverse transcription system
(promega, usa) s použitím oligo(dt)15 a 1 µg celkovej rna. Rna s primermi sme denaturovali 5
minút pri 75 °c. Reakčná zmes pozostávala z nasledujúcich zložiek: 1 x reakčný pufor, 2 µl 25
mm mgcl2, 1µl 10 mm dntps, 0,5 µl rnasin ribonukleázový inhibítor, 1 µl reverznej
transkriptázy. Po 5 minútovej inkubácii pri 25 oc, prebiehal prepis pri 42 oc 60 minút. Na
záver sme reverznú transkriptázu tepelne inaktivovali 15 minútovou inkubáciou vzoriek pri 70
o
c. Prepísaná cdna bola uložená do kvantifikácie pri –18 oc.
Expresiu per2 génu sme analyzovali pomocou real time PCR s použitím špecifických
primerov. Signál sme normalizovali vzhľadom na expresiu konštitutívne exprimovaného génu
kódujúceho proteín S17. Sekvencie primerov boli: s17 (X07257) sense primer 5’ACACCCGTCTGGGCAACGAC-3’, antisense primer 5’-CCCGCTGGATGCGCTTCATC3’
(Dragon
et
al.,
2002);
for
cPer2
(AF246956)
sense
primer
5’-
ACCTAAAGGAAGGCCTGGTG-3’, antisense primer 5’-CGCTGAGTAGCTTGCTTGTG3’.
Na kvantifikáciu sme použili 0,5-2,0 µl cDNA a QuantiTect SYBR Green PCR Kit
(QIAGEN, Germany). Intenzita signálu počas amplifikácie v 20 µl reakčnej zmesi sa
hodnotila na prístroji ABI PRISM® 7900HT Sequence Detection System (Applied
Biosystems, USA). Podmienky PCR boli: 95°C, 15 min a následne 50 cyklov pri teplotách
93
94°C, 15 s; 47.5 - 55 °C, 30 s a 72°C, 30 s. Špeckosť reakcie a molekulová veľkosť
amplifikovaného produktu bola zistená pomocou analýzy teploty topenie, ktorá sa uskutočnila
ako posledný krok po ukončení amplifikácii v cykleri a elektroforetickým rozdelením
produktu na 2% agarózovom géli. Na normalizáciu možných nepresnotí v pipetovaní
reakčného mixu bola použitá fluorescenčná referenčná farbička ROX, ktorá je súčasťou kitu a
slúži ako interný štandard merania.
Rytmicita denného profilu expresie per2 génu bola posudzovaná kosínovorovou analýzou,
ktorá pomocou analýzy variancie testuje ako najlepšie nafitovaná kosínusová krivka koreluje
s exprimentálnymi dátami (Nelsom et al., 1979; Klemfus and Clopton, 1993). Účinnosť
svetelných pulzov bola posudzovaná pomocou nepárového t-testu.
Výsledky
Expresia per2 v epifýze 19-dňového kuracieho embrya vykazovala singifikantný rytmus
aj v synchronizovaných podmienkach, aj v konštantnej tme. V konštantnej tme však stredná
hodnota rytmu bola signifikantne znížená oproti hodnotám nameraným v podmienkach
svetelného režimu.
Aplikácia svetelného pulzu počas subjektívnej svetlej fázy dňa spôsobila signifikantné
zvýšenie expresie per2 génu v epifýze (32,08±4,18 vs. 71,54±6,53 per2/s17 mRNA). Na
druhej strane svetelný pulz nemal vplyv na expresiu per2 génu počas tmavej fázy dňa.
Diskusia
Naše výsledky potvrdili, že aviárny cirkadiánny systém sa vyvýja a je čiastočne funkčný
už počas embryonálneho vývinu. Rytmická expresia per2 génu vykazuje vrchol na začiatku
svetlej fázy dňa u 19-dňových embryií, podobne ako to bolo dokázané u vyliahnnutých
kurčiat (Doi a kol., 2001). Rozdiel medzi embryonálnym a postembryonálnym vývinovým
štádiom je, že v konštantných podmienkach rytmus epxresie per2 génu u 19-dňových embryí
perzistuje so zásadne zníženou amplitúdou.
Postnatálne aplikovaný svetelný pulz dokáže indukovať expresiu hodinového génu per2 v
aviárnej epifýze počas svetlej a tmavej fázy dňa (Yoshimura a kol., 2000). U 19-dňových
kurčiat je svetelný pulz efektívny len v tej fáze dňa, kedy expresia per2 génu vykazuje svoje
maximum.
Predpokladáme, že na kompletný priamy a synchronizujúci účinok svetelného pulzu na
aviárny cirkadiánny systém je potrebná aktivita ďalších komponentov molekulového
oscilátora. Na kompletnú analýzu ontogenézy aviárneho epifyzárneho ocilátora budú
94
zamerané ďalšie experimentálne práce našej skupiny.
Záver
Naše výsledky demonštrujú, že hodinový gén per2 je rytmicky exprimovaný už počas
embryonálneho vývinu. Rytmická expresia per2 génu perzistuje v konštantných
podmienkach, aj keď so zníženou amplitúdou. Indukovateľnosť expresie per2 génu svetlom je
u 19-dňových embryí už vyvinutá, ale je obmedzená na tú fázu dňa, ktorú oscilátor vníma ako
subjektívnu svetlú fázu. Predpokladáme, že na indukovateľnosť expresie per2 génu počas
tmavej tázy dňa je potrebná aktivita ďalšieho komponentu oscilátora, ktorý v tomto
ontogenetickom štádiu ešte nie je vyvinutý.
Naše výsledky implikujú, že epifyzárny aviárny cirkadiánny pacemaker sa vyvíja
postupne, pričom aj v tých vývinových štádiách, počas ktorých nie sú aktívne všetky jeho
komponenty, je schopný plniť viaceré fyziologické funkcie a synchronizovať svoju činnosť s
vonkajšími podmienkami prostredia.
Poďakovanie
Táto práca bola podporená grantami APVV-20-022704, VEGA 1/4343/07, VEGA 1/4328/07.
Literatúra
Cassone V.M., Menaker M.: Is the avian circadian system a neuroendocrine loop? J Comp Physiol. 156: 145152, 1984
Chomczynski P, Sacchi N: Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenolchloroform extraction. Anal Biochem. 162: 156-159, 1987
Doi M, Nakajima Y, Okano T, Fukada Y. Light-induced phase-delay of the chicken pineal circadian clock is
associated with the induction of cE4bp4, a potential transcriptional repressor of cPer2 gene. Proc Natl Acad
Sci U S A. 98: 8089-80, 2001
Dragon S, Offenhauser N, Baumann R.: cAMP and in vivo hypoxia induce tob, ifr1, and fos expression in
erythroid cells of the chick embryo. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282: R1219-1226, 2002
Klemfuss H, Clopton PL: Seeking tau: a comparison of six methods. J Interdisciplinary Cycle Res. 24: 1-16,
1993
Nelson W, Tong YL, Lee JK, Halberg F: Methods for cosinor-rhythmometry. Chronobiologia 6: 305-323, 1979
Okabayashi N, Yasuo S, Watanabe M, Namikawa T, Ebihara S, Yoshimura T.: Ontogeny of circadian clock
gene expression in the pineal and the suprachiasmatic nucleus of chick embryo. Brain Res. 990: 231-234, 2003
Okano T, Yamamoto K, Okano K, Hirota T, Kasahara T, Sasaki M, Takanaka Y, Fukada Y. Chicken pineal
clock genes: implication of BMAL2 as a bidirectional regulator in circadian clock oscillation. Genes Cells. 6:
825-836, 2001
Takahashi JS, Murakami N, Nikaido SS, Pratt BL, Robertson LM. The avian pineal, a vertebrate model system
of the circadian oscillator: cellular regulation of circadian rhythms by light, second messengers, and
macromolecular synthesis. Recent Prog Horm Res. 45: 279-348, 1989
Yoshimura T, Suzuki Y, Makino E, Suzuki T, Kuroiwa A, Matsuda Y, Namikawa T, Ebihara S. Molecular
analysis of avian circadian clock genes. Brain Res Mol Brain Res. 78: 207-215, 2000
Zeman M, Gwinner E, Herichova I, Lamosova D, Kost'al L. Perinatal development of circadian melatonin
production in domestic chicks. J Pineal Res. 26:28-34, 1999
Zeman, M., Pavlik, P., Lamosova, D., Herichova, I., Gwinner, E. Entrainment of rhythmic melatonin production
by light and temperature in the chick embryo. Avian Poult Biol Rev. 15: 197-204, 2004
95
Kontaktná adresa:Prof. RNDr. Michal Zeman, DrSc., Katedra živočíšnej fyziológie
a etológie, Prírodovedecká fakulta, Univerzita Komenského v Bratislave, Mlynská dolina B-2,
842 15 Bratislava
ODCHÝLKY HEMATOLOGICKÝCH A BIOCHEMICKÝCH PARAMETROV PRI
SÉROLOGICKY POZITÍVNYCH PRASNICIACH NA E. INTESTINALIS
ALTERATION OF HAEMATOLOGICAL AND BIOCHEMICAL PARAMETERS IN
SEROLOGICAL POSITIVE SOWS OF E. INTESTINALIS
Hisira, V.1, Kováč, G1., Lešník, F.1,2, Novotný, J.1, Petrovová, E.1, Farkašová, Z.1, Link, R.1
1Univerzita veterinárskeho lekárstva, Komenského 73, Košice , 2Ústav živočíšné fyziologie a genetiky AV ČR, Liběchov
Abstrakt
V tomto experimente sme sledovali zmeny vybraných hematologických (erytrocyty,
hemoglobín, hematokrit, stredný objem erytrocytov, leukocyty) a biochemických parametrov
(celkové bielkoviny, albumín, kreatinín, urea) pri prasniciach sérologicky pozitívnych na E.
intestinalis. Tieto hodnoty sme porovnali s fyziologickými hodnotami. Na základe získaných
výsledkov sme zaznamenali odchýlky od fyziologického rozpätia v dvoch parametroch pri
hematologickom profile a v jednom parametri biochemického profilu.
Abstract
In our experiment we determined changes haematological (erytrocytes, hemoglobin,
hematocrit, MCV, leucocytes) and biochemical parameters (total proteins, albumin,
creatinine, urea) in serological positive sows for E. intestinalis. This values we compared with
physiological values. On the base of aquired results we determine considerable divergance in
two parameters of haematological profile and one parameter of biochemical profile.
Úvod
Encephalitozoon spp. sú obligátne intacelulárne, sporoforné parazity patriace do kmeňa
Microspora, s aktívnou metabolickou fázou v hostiteľskej bunke. Prvýkrát boli opísané pred
viac ako 100 rokmi. V súčasnosti je známych 143 rodov a viac ako 1200 druhov (Canning
a Hollister, 1992). Prirodzená infekcia bola zdokumentovaná pri protozoách, článkonožcoch,
hmyze, obojživelníkoch, vtákoch a cicavcoch (Valenčáková, 2005). Okrem toho bola
potvrdená prítomnosť tohto parazita aj vo vodných zdrojoch (Dowd a i, 1998).
96
Druhým najčastejšie sa vyskytujúcim druhom je Encephalitozoon intestinalis, ktorý
v hostiteľskom organizme postihuje tráviaci trakt vo forme enteritídy a chronickej hnačky,
respiratórny vo forme bronchitídy a rinitídy, urogenitálny vo forme nefritídy, žlčové cesty vo
forme cholangitídy a cholecystitídy a kostnú dreň (Cali a i., 1991, 1993; Orestein a i., 1992;
Field a i., 1993).
V roku 1998 Bornay a iní opísali tohto parazita aj vo vzorkách trusu niektorých druhov
zvierat ako sú svine, psy, hovädzí dobytok, kozy a somáre, čím sa poukázal ich možný
zoonotický pôvod.
Materiál a metodika
Do pokusu sme zaradili 5 prasníc vo veku 4 rokov, jeden mesiac po pôrode z chovu
v Zemplínskej Teplici.
Krv sme odoberali z očného splavu.
Sérum sa získalo centrifugáciou pri 3000 ot/min.
Hematologické prarametre - erytrocyty (Er), hemoglobín (Hb), hematokrit (Hk), stredný
objem erytrocytov (MCV), leukocyty (Leu) sme stanovovali v krvi pomocou prístroja Serono
150 Plus (Switzerland).
Biochemické parametre - celkové bielkoviny (CB), albumín (Alb), kreatinín (Creat), urea (U),
sme stanovovali v sére pomocou biochemického fotokolorimetrického analyzátora ALIZE
(Lisabio, France).
Výsledky a diskusia
Hematologické parametre
Pri sérologicky pozitívnych prasniciach sme zaznamenali v hematologických ukazovateľoch
zmeny. Zaznamenali sme znížené množstvo erytrocytov v jednom prípade (20%) a zníženú
hladinu hemoglobínu v dvoch prípadoch (40%).
Anémia spôsobená znížením počtu erytrocytov má rôznu etiológiu: nadmerné straty krvi
(posthemoragická), hemolytická anémia pri infekčných ochoreniach, pri otravách, pri
autohemolýze, pri puerperálnej, paroxyzmálnej hemoglobinémii, pri hypoplastickej anémii pri
nedostatku krvotvorných látok, pri ionizujúcom žiarení, pri aplikácii cytostatík alebo liečiv
97
inhibujúcich funkciu kostnej drene, pri niektorých orgánových a infekčných ochoreniach
(Vrzgula a i., 1990).
Hemoglobín je hlavnou súčasťou erytrocytov. Hladiny hemoglobínu kolíšu za normálnych
okolností v závislosti od veku, pohlavia, nadmorskej výšky, stavu kŕmenia a ustajnenia
(Slanina a i., 1993).
Príčinou poklesu hodnôt hemoglobínu (hypochrómie) je predovšetkým nedostatočný príjem
minerálnych látok, ktoré sú dôležité pri tvorbe hému a krvotvorbe, kde sa najväčšia časť
rezorbovaného železa nachádza v štruktúre hemoglobínu. Medzi ďalšie príčiny hypochrómie
patria: anémie, hydrémie, hemoglobínúrie, urémie, výživa deficitná na bielkoviny,
aminokyseliny, vitamíny, chronické ochorenia tráviacej a dýchacej sústavy, chronické
parazitózy a otravy (Vrzgula a i., 1990).
Tab. č. 1 Hematologické parametre v krvi sérologicky pozitívnych prasníc.
Hk
LC
5,0 – 8,0 T.l-1 10 – 14 g.dl-1
0,32 – 0,42 l.l-1
11 – 18 G.l-1 50 – 68 f.l-1
910p
4,89
9,8
0,32
14,0
63,5
723p
6,53
10,2
0,36
17,1
67,2
696p
7,6
11,3
0,25
11,8
57,3
752p
5,08
10,8
0,41
15,4
62,3
011p
6,29
9,0
0,35
16,5
56,1
Zníž.
20%
40%
-
-
-
Er
Hb
MCV
Biochemické parametre
Pri hladine urei sme zaznamenali v krvnom sére jednej prasnice vzostup nameranej hodnoty
v porovnaní s fyziologickými hodnotami. Urea je koncovým produktom katabolizmu
bielkovín. Jej vylučovanie ovplyvňuje okrem glomerulárnej filtrácie aj tubulová sekrécia. Pri
glomerulonefrítíde je prvá fáza charakterizovaná polygakysúriou a následne táto prechádza do
dizúrie (Ferenčík a i, 2000).
U psov infikovaných ďalším mikrosporidiálnym druhom E. cuniculi Botha a i. (1986)
potvrdili progresívne ireverzibilné ochorenie po biopsii obličiek. V tom čase objavil zmeny aj
v hladinách kreatinínu a urei v krvnom sére pozitívnych psov. Práve na začiatku ochorenia
98
boli tieto hladiny znížené. Vývojom ochorenia zaznamenal mierny nárast hladín týchto
parametrov. U sérologicky pozitívnych psov na prítomnosť protilátok proti E. cuniculi
zaznamenal McInnes a Stewart (1991) zvýšenú koncentráciu urei.
Tab. č. 1 Biochemické parametre v krvi sérologicky pozitívnych prasníc.
CB
Albumín
Kreatinín
Urea
70 - 90 g.l-1
35 - 45 g.l-1
141 - 239 µmol.l-1
2,5 - 5,8 µmol.l-1
910p
80,4
42,5
169,9
4,13
723p
78,9
42,4
180,4
5,03
696p
83,2
45,4
154,0
6,9
752p
82,2
40,6
172,5
4,14
011p
77,4
41,4
133,3
4,2
Zvýš.
-
-
-
20%
Záver
V našom pokuse nami namerané hodnoty jednotlivých parametrov (Er, Hb) hematologického
profilu, napriek tomu, že sú znížené nepriamo súvisia s črevnou encefalitozoonózou,
spôsobenou E. intestinalis. Naopak pokles hladiny urei nám preukazuje prítomnosť tohto
ochorenia pri týchto zvieratách.
Literatúra
1. Bornay-Llinares, F. J., Da Silva, A. J., Moura, H., Schwartz, D. A., Visvesvara, G. S., Pieniazek, N. J., CruzLopez, A., Hernandez-Jauregui, P., Guerrero, J., Enriquez, F. J. 1998 Immunologic, microscopic, and molecular
evidence of Encephalitozoon intestinalis (Septata intestinalis) infection in mammals other than humans. J Infect
Dis. 178:820–826.
2. Botha, W.S., Dormehl, I.C., Goosen, D.J. 1986. Evaluation of kidney funcion in dogs suffering from canine
encephalitozoonosis by standard clinical phatological and rathioparmaceutical techniques. Journal of the South
African Veterinary Association. 57:79-86.
3. Cali, A., Orenstein, J. M., Kotler, D. P., Owen, R. L. 1991. A comparison of two microsporidian parasites in
enterocytes of AIDS patients with chronic diarrhea. J. Protozool 38: 96-98.
4. Dowd, S. E., Gerba, C. P., Pepper, I. L. 1998. Confirmation of the human pathogenic microsporidia
Enterocytozoon bieneusi, Encephalitozoon intestinalis, and Vittaforma corneae in water. Appl. Environ.
Microbiol. 64:3332-3335.
5. Ferenčík, M., Škárka, B., Novák, M., Turecký, L. 2000. Biochémia. Slovak academic press. Bratislava. 794795, 856.
6. Field, A. S., Hing, M. C., Marriott, D. J. 1993. Small intestinal microsporidiosis in HIV infected patients in
Sydney, Australia. In Abstract 1st Workshop on Microsporidiosis and Cryptosporidiosis in Immunodeficient
Patients, Ceske Budejovice, Czech Republic.
7. Hollister, W. S., Canning, E. U. 1987. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of
antibodies to Encephalitozoon cuniculi and its use in determination of infections in man. Parasitology. 94 :209–
219.
99
8. McInnes E. F., Stewart C. G. 1991. The pathology of subclinical infection of Encephalitozoon cuniculi in
canine
dams
producing
pups
with
overt
encephalitozoonosis.
J. S. Afr. Vet. Med. Assoc. 62:51-54.
9. Orenstein, J. M., Dieterich, D. T., Kotler, D. P. 1992. Systemic dissemination by a newly recognized intestinal
microsporidia species in AIDS. AIDS. 6(10):1143–1150.
10. Slanina, Ľ., Dvořák, R., Bartko, P., Hofírek, B., Lehocký, J., Zendulka, I. 1993. Veterinárna klinická
diagnostika vnútorných chorôb. Príroda. Bratislava. 314-315.
11. Valenčáková, A. 2005. Encephalitozoonosis. Vet. Nov. 31:93-98.
12. Vrzgula, L., Alijev, A.A., Barej, W., Bartko, P., Bouda, J., Dvořák, R., Garbašanski, P., Illek, J., Jagoš, P.,
Karsai, F., Kóňa, E., Kováč., G., Nedková, L., Sokol, J., Sova, Z., Schäfer, M. 1990. Poruchy látkového
metabolizmu hospodárskych zvierat a ich prevencia. Príroda. Bratislava. 168-170, 470.
ULTRAŠTRUKTÚRA M. GASTROCNEMIUS U JAPONSKÝCH PREPELÍC POČAS
HYPODYNAMIE SIMULUJÚCEJ MIKROGRAVITÁCIU V KOZME
THE ULTRASTRUCTURE OF M. GASTROCNEMIUS IN JAPANESE QUAILS UNDER
HYPODYNAMY SIMULATING MICROGRAVITY IN SPACE
Holovská, K.,Kočišová, J., Cigánková, V., Almášiová, V.,Tomajková, E.,Škrobánek,P*.,
Zibrín, M.
Katedra normálnej anatómia, histológie a fyziológie, Univerzita veterinárskeho lekárstva , Košice
*Institute of Animal Biochemistry and Genetics, SAS, Ivanka pri Dunaji
Abstract
Hypodynamy is one of the models simulating weightlessness in space. We studied the effect
of long-term hypodynamy of Japanese quails on ultrastructure of skeletal muscle (m.
gastrocnemius) since hatching up to 126 days. Three days after hatching the quails were
suspended in the special shirts so their feet did not touch the floor. They could consume food
and water ad libitum. Experimental and control animals were killed after 14, 28, 42, 56 and
126 days of hypodynamy. The most extensive morphological changes were found in the m.
gastrocnemius after 14 days of hypodynamy. Internal structure of mitochondria was altered
and they accumulated on the larger areas. After 28 days of hypodynamy we observed the
occurrence of giant mitochondria. After 42 days of hypodynamy sarcoplasmic reticulum were
dilated, mitochondria were vacuolised and after 126 days of hypodynamy vacuolised
mitochondrial matrix and preserved sarcomeres were found.
Key words: hypodynamy, m. gastrocnemius, ultrastructure, Japanese quail.
Úvod
Experimenty s hypodynamiou slúžia ako pokračovanie našich štúdií vplyvu beztiaže
na organizmus japonskej prepelice. Tieto štúdie smerujú k vytvoreniu uzavretého
ekologického systému, ktorý by zabezpečil dlhodobý pobyt v kozmických podmienkach.
Cieľom je, aby vyliahnuté japonské prepelice v podmienkach kozmickej lode dosiahli
dospelosť a boli schopné reprodukcie. Keďže kozmické experimenty sú náročné a najmä
100
drahé, hľadajú sa modelové pokusy na Zemi. Jedným z modelov je hypodynamia. Spolu
s Ústavom genetiky živočíchov a biochémie SAV v Ivanke pri Bratislave už dlhšie sledujeme
ako hypodynamia ovplyvňuje štruktúru orgánov prepelíc.
Materiál a metodika
Japonské prepelice (Coturnix coturnix japonica) boli vystavené pôsobeniu
hypodynamie 14, 28, 42, 56 a 126 dní [15]. M. gastrocnemius bol odobratý z kontrolných
a hypodynamii vystavených prepelíc pre transmisnú elektrónovú mikroskopiu. Tkanivo sme
fixovali v 3% glutaraldehyde, 1%OsO4, oba v 0,15 mol.dm-3 kakodylátový tlmivý roztok pH
7,2 a zaliali do durkupanu. Ultratenké rezy sme študovali a fotografovali v transmisnom
elektrónovom mikroskope Tesla 500.
Výsledky
Pre štúdium sme použili m. gastrocnemius. V skupine experimentálnych zvierat, ktoré
boli 14 dní v hypodynamických podmienkach sme pozorovali v porovnaní s kontrolnou
skupinou najmä zmeny na mitochondriách. Zmeny sa týkali ich počtu, veľkosti a štruktúry.
Zmenená bola nielen ich vnútorná štruktúra, ale hromadili sa aj na väčších plochách.
Intermyofibriálne priestory boli rozšírené, sarkoméry sa vyznačovali nepravidelnosťou
a v sarkoplazme sa objavovali tukové kvapky. Vývoj zmien bol pozorovaný aj v ďalšej
skupine experimentálnych zvierat, ktoré boli vyvesené 28 dní. Mitochondrie sa spájali do
gigantických mitochondrií a tie často presahovali dĺžku jednej sarkoméry. Intermyofibriálne
priestory boli rozšírené, vyplnené nakopenými mitochondriami a tukovými kvapkami.
Pozorovali sme nevýrazné hranice medzi I a A pruhmi v sarkomére. Z línie mali nerovný
priebeh. V skupine 42 dňových hypodynamických prepelíc sme okrem zmien nachádzajúcich
sa v predchádzajúcich skupinách pozorovali dilatované sarkoplazmatické retikulum ako aj
vakuolizované mitochondriové kristy. M. gastrocnemius po 56 dňovom vplyve hypodynamie
v elektrónovom mikroskope mal podobný morfologický obraz ako v predchádzajúcej skupine.
Pridružili sa zmeny v priebehu Z línií, ktoré boli často prerušované alebo mali nerovný
priebeh. V poslednej skupine prepelíc, ktoré žili v podmienkach hypodynamie 126 dní, sme
pozorovali široké intermyofibriálne priestory, vakuolizovaný mitochondrialný matrix.
Sarkoméry zostali zachované.
101
Diskusia
Hypodynamia a mikrogravitácia majú výrazný vplyv na človeka a experimentálne
zvieratá, najmä na kostrovú svalovinu a kosti. Svaly zvierat výrazne atrofujú, čo vedie
k úbytku svalovej hmoty o 30% [11], u japonských prepelíc o 14% [14]. V prvej etape
dochádza k mobilizácii energetických rezerv, čo sa prejavilo zmenou v myónoch m.
gastrocnemius už po 14 dňoch hypodynamie. Najviac boli postihnuté mitochondrie, ktoré boli
väčšie a hromadili sa. V sarkoplazme sa objavili tukové kvapky. Uvedené zmeny sú
morfologickým prejavom prvej etapy adaptácie na hypodynamiu. Pre 28 deň hypodynamie sú
charakteristické gigantické mitochondrie a nevýrazné hranice medzi I a A pásmi v sarkomére.
Na 42 deň hypodynamie sme pozorovali dilatovaný sarkotubulárny aparát a vakuolizované
mitochondriové kristy. Po 126 dňovej hypodynamii priestory medzi myofibrilami boli široké,
čo pravdepodobne súvisí s celkovým úbytkom svalovej hmoty. Po 56 a 126 dňoch
hypodynamie je poškodenie myónov menej výrazné. Preto predpokladáme, že zmeny sú
ďalšími morfologickými prejavmi adaptácie a pravdepodobne sú reverzibilné.
Je veľa prác študujúcich bezváhový stav v laboratórnych podmienkach. Zmeny, ktoré
opísali mnohí autori, poukazujú na zníženú funkciu orgánov s následným poklesom rôznych
syntetických procesov. Svalová atrofia je sprievodným znakom bezváhového stavu [15].
Jakowska a kol. [5] pri morfometrickom vyšetrení satelitných buniek v m. gastrocnemius
zistili zmenšenie objemu Golgiho aparátu a granulovaného endoplazmatického retikula ako aj
zníženie počtu ribozómov. Zmenené boli aj jadrá, kde došlo k relatívnemu zmenšeniu objemu
heterochromatínu. Tieto nálezy poukazujú na zredukovanú aktivitu týchto buniek. Zmeny boli
aj v kapilárnej sieti imobilizovaných svalov. Endotel ciev bol veľmi tenký a nesúvislý [10],
jadrá mali nepravidelný tvar s kondenzovaným chromatínom [13].
Dlhodobá hypodynamia vo všeobecnosti má nepriaznivý účinok na japonské
prepelice. Spôsobuje zníženie hmotnosti prepelíc až o 14% [12] na čom sa výrazne podieľa
pokles svalovej hmoty. V konečnej fáze dochádza k deštrukcii svalových bielkovín a tým
k úbytku svalového objemu [9]. Mnohé experimenty demonštrujú, že imobilizácia u zvierat
zahrňuje metabolické, funkčné a štrukturálne zmeny v kostrovej svalovine [6, 1]. Aj naše
experimenty poukazujú na to, že hypodynamia spôsobuje štrukturálne zmeny buniek tkanív
a orgánov [2, 16, 17, 8]. Ale aj napriek tomu sú prepelice schopné adaptácie a existencie
v experimentálnych podmienkach hypodynamie ako aj v kozmických podmienkach beztiaže [
7, 4, 3].
102
Záver
Vplyv hypodynamie bol sledovaný u 14, 28, 42, 56 a 126 dňových japonských
prepelíc. Hypodynamia japonských prepelíc bola vypracovaná na UBGŽ v Ivánke pri Dunaji
ako model pre sledovanie vplyvu beztiaže v podmienkach na Zemi. Zistili sme, že
najrozsiahlejšie morfologické zmeny v m. gastrocnemius boli po 14. dňoch hypodynamie.
V ďalšom období hypodynamie zmeny ktoré nastali v mitochondriách a myofibrilách boli
rôzneho rozsahu. V období 56 a 126 dňovej hypodynamie prepelíc boli zmeny v sledovanom
tkanive menej výrazné. Domnievame sa, že pozorované morfologické zmeny sú prejavom
adaptácie na hypodynamiu a predpokladáme, že všetky nami zistené zmeny v m.
gastrocnemius sú reverzibilné.
Práca vznikla v rámci grantu 1/3495/06, ktorý finančne podporila VEGA MŠ SR
Literatúra
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
BOOTH, F. (1977): Time course of muscular atrophy during immobilization of hindlimbs in rats. J.
Appl. Physiol., 43, 656-661.
CIGÁNKOVÁ, V., - LENHARDT, Ľ., - ZIBRÍN, M.,- KOČIŠOVÁ, J.,- TOMAJKOVÁ, E.,KOMOROVÁ, T.,- SABO, V.,- BOĎA, K.,- DADASHEVA, O. A.,- GURYEVA, T. S. (2001):
Morphological changes in the small intestine of Japanese quail chicks hatched under the conditions of
microgravitation. Folia Vet., 45, 27-31.
DADASHEVA, O. A., - GURYEVA, T. S.,- SABO, V.,- BOĎA, K.,- KOČIŠOVÁ, J. (2001): Research
into the morphology of Japanese quail chicks hatched under conditions of microgravity. Folia Vet., 45,
12-16.
GURYEVA, T. S., - DADASHEVA, O. A.,- MELESHKO, G. I.,- SHEPELEV, YE. YA., BOĎA, K.,SABO, V. (1993): The quail embryonic development under the conditions of weightlessness. Acta Vet.
Brno, 62, 25-30.
JANKOWSKA, E.,- BARANSKA, V.,- BARAN, W. (1996): Morfometric ultrastructural evaluation of
satellite cells in musculus gastrocnemius and musculus latissimus dorsi anterior of rats subjected to 7
day hypokinesia. Folia Morphol., 55, 21-29.
JASPER, R. S., - HENRIKSEN, E. J.,- SATARUG, S.,- TISCHLER, M. E. (1989): Effects of stretching
and disuse on amino acids in muscles of rat limbs. Metabolism., 38, 303-310.
JURÁNI, M., - VÝBOH, P., - LAMOŠOVÁ, D.,- BAREŠKOVÁ, Ž.,- SOMOGYOVÁ, E.,- BOĎA,
K.,- SABO, V. (1983): The effect of a 90-day hypodynamia on the neurohumoral system, egg laying
and metabolism of protein in Japanese quail. Physiologist , 26, 145-148.
KOČIŠOVÁ, J., - CIGÁNKOVÁ, V., - ZIBRÍN, M., - TOMAJKOVÁ, E.,- LENHARDT, Ľ.,- SABO,
V.,- BOĎA, K.,- DADASHEVA, O.A.,- GURYEVA, T.S. (2001): The morphological picture of m.
gastrocnemius in Japanese quail chicks hatched on the orbital station “Mir”. Folia Vet., 32-35.
LEBEDEVA, Z. N., - MEDNIKOVA, E. I.,- GURYEVA, T. S.,- DADASHEVA, O.,TRESVATSKAYA, N.A.,- KALIUZHNAYA, M.V. (1998): Effect of hypodynamia on the organism of
Japanese quail. Folia Vet., 42, 53-56.
OKI, S.,- DESAKI, J.,- MATSUDA, Y.,- OKUMURA, H.,-SHIBATA, T. (1995): Capillaries with
fenestrae in the rat soleus muscle after experimental limb immobilization. J. Electron Microsc., 44, 307310.
PLANEL, H., (2004): Space and life. Press LLC, London.
SABO, V., - CHRAPPA, V., - BOĎA, K. (1998): Effect of long-term (84-days) hypodynamy on the
efficiency of Japanese quails. Folia Vet., 42, Supplementum 1: 59-62.
SMITH, H. K., - MAXWELL, L.,-MARTYN, J. A., - BASS, J. J. (2000): Nuclear DNA fragmentation
and morphological alterations in adult rabbit skeletal muscle after short-term immobilization. Cell
Tissue Res., 302, 235-241.
ŠKROBÁNEK, P., - HRBATÁ, M., - BARANOVSKÁ, M.,- JURÁNI, M. (2004): Growth of Japanese
quail chicks in simulated weightlessness. Acta Vet. Brno, 73, 157-164.
103
15. TADA O., - YOKOGOSHI H. (2002): Effect of different dietary protein composition on skeletal
muscle atrophy by suspension hypokinesia/hypodynamia in rats. J. Nutr. Sci. Vitaminol., 48, 115-119.
16. ZIBRÍN, M.,- CIGÁNKOVÁ, V.,- KOČIŠOVÁ, J.,- TOMAJKOVÁ, E.,- KOMOROVÁ, T.,LENHARDT, Ľ.,- PÁLENÍK, L.,- SABO, V.,- BOĎA, K.,- DADASHEVA,- O. A., GURYEVA, T. S.
(2001): The structure of some tissues and organs of Japanese quail chicks hatched on the orbital space
station “Mir”. Folia Vet., 45, 17-22.
17. ZIBRÍN, M., - BOĎA, K.,- CIGÁNKOVÁ, V.,- KOČIŠOVÁ, J.,- TOMAJKOVÁ, E.,- KOMOROVÁ,
T.,- SABO, V.,- PIVKO, J. (2003):Long term experimental hypodynamy affects the structure of spongy
bone and osteoclasts in Japanese quail. Acta Vet. Brno, 72, 143-149.
Kontaktná adresa: Katarína Holovská, MVDr.,.Univerzita veterinárskeho lekárstva, Ústav
histológie a embryológie, Komenského 73, 041 81 Košice, e-mail: [email protected]
OVERENIE ÚČINKU HOMEOPATÍK NA NIEKTORÉ FYZIOLOGICKÉ
UKAZOVATELE U ODSTAVČIAT
VERIFICATION OF HOMEOPATHICS EFFECT ON SELECTED PHYSIOLOGICAL
PARAMETERS IN WEANED PIGLETS
Húska M., Link R., Buleca J., Dudríková E.
II. interná klinika, UVL v Košiciach, Komenského 73, 04181 Košice, SR
Abstract
The benefit of homeopatics is that no residues persist in organism in comparison to
classic therapeutics. This fact positively acts at health creation not only in animals but also in
humans. We applied homeopatics in post weaning piglets as prevention to diarrheic syndrome
occurrence. Preparation PVB Diarrhées is veterinary homeopathic specialty from Boiron
company that is used for diarrhea treatment and prevents complications like weight loosing,
chronic enterocolitis and hepatitis. Experiment was realized in ŠPP in Zem. Teplica on 28
piglets. Each swine was applied 2 ml of solution per orally in period since 3 days before
weaning to 70 days after weaning.
Kľúčové slová: homeopatiká, ošípané, metabolizmus, diarhoický syndróm
Úvod
Homeopatia je umenie medicíny založené na základe podobnosti. Jej zakladateľom bol
nemecký lekár a chemik Samuel Hahnemann. Uplatňoval zákon podobnosti, ktorý spočíva na
poznatku, že každá látka, ktorá je schopná v merateľných koncentráciách vyvolať u zdravého
jedinca určité príznaky choroby, je potom aj schopná v nekonečne malých dávkach tieto
príznaky potlačiť (Ramakrishnan a Coulterová 2005). Výhodou homeopatie je, že na rozdiel
od klasických terapeutík homeopatiká nezanechávajú v organizme reziduá, čo sa pozitívne
odráža na tvorbe zdravia nielen zvierat , ale aj ľudí (Lockie, 2002,). Odskúšali sme
104
homeopatiká pri odstave prasiat ako prevenciu vzniku diarhoického syndrómu. Liek PVB
Diarrhées je veterinárna homeopatická špecialita firmy Boiron, ktorý sa používa na liečenie
hnačkových stavov a zabraňuje komplikáciám typu chudnutie, chronické enterokolitídy
a žltačka.
Materiál a metodika
Pokus bol realizovaný na ŠPP v Zemplínskej Teplici. Do pokusu bolo náhodným
výberom vybratých 28 prasiat krížencov plemena Slovenská biela ušľachtilá 75% a Landras
25%, približne rovnakej hmotnosti a rovnakého veku. Každé zviera bolo opatrené
identifikačným číslom, a boli rozdelené do skupín A1, A2, B1, a B2.
Experiment spočíval v dennom podávaní homeopatických roztokov ošípaným 3 dni
pred odstavom až 70 dní po odstave. Skupine A1 bol podaný prípravok Boiron 69 110 šarža
SL 133 58, B1 - prípravok Boiron 69110 šarža SL 133 58, 2 ml na kus jeden krát denne, prvé
3 dni individuálne pomocou dávkovacej pumpy, potom potencovaný v 100 ml vody,
aplikovaný v potrave. Kontrolným skupinám A2, B2 bolo podávané placebo v množstve 2 ml,
prvé tri dni individuálne pomocou dávkovacej pumpy, potom aplikovaný v potrave.
Váženie odstavčiat sa vykonávalo 3 krát, vo veku 5, 7 a 9 týždňov.
Krv sa odoberala v deň odstavu, 14 a 28 dní po odstave, zo sinus ophtalmicus. Táto
bola následne spracovaná v laboratóriu II. Internej kliniky UVL v Košiciach.
Výsledky a diskusia
Homeopatické prípravky neovplyvnili hodnoty zložiek hematologického profilu
(tab.č.1). Leukocyty (Lc) tvoria bielu krvnú zložku hematologického profilu, sú základným
komponentom lymfoidného a imunologického systému (Issautier, M.N., Calvet, H., 1993).
Pri experimente sa hodnoty zinku (tab.č.2) pohybovali hlboko pod spodnou
referenčnou hodnotou pri všetkých odberoch vo všetkých skupinách. Metabolizmus zinku
(Zn) súvisí s metabolizmom vitamínov A, D, B1 a B6 (Vrzgula a kol., 1990).
Poruchy energetického metabolizmu (tab.č.3) patria medzi najzávažnejšie produkčné
choroby. Príčiny týchto porúch sú v úzkom vzťahu s kŕmnym režimom a inými
etiopatogenetickými faktormi, ako sú choroby gastrointestinálneho traktu, parazity, poruchy
funkčnej činnosti pečene, obličiek a centrálnej nervovej sústavy (Ammerman C. B. a kol.,
1998).
105
Analýzou výsledkov enzymatického a hepatálneho profilu v sére odstavčiat (tab.č.4)
sme zistili, že aktivita AST mala vo väčšine prípadov klesajúcu tendenciu. AST sa nachádza
predovšetkým v bunkách pečene, srdcového svalu a je lokalizovaný tak v cytoplazme, ako aj
v mitochondriách. ALT je cytoplazmatický enzým, lokalizovaný najmä v hepatocytoch.
Aktivita tohto enzýmu v sére odstavčiat mala v skupinách, kde boli podávané homeopatické
prípravky, teda v skupinách A1 a B1, klesajúcu, respektíve ustálenú hladinu. Namerané
hodnoty však boli v hornej hranici RH, alebo ju mierne prekračovali. Hodnoty GGT, enzýmu
viazaného na bunkové membrány, sa zvyšujú pri enteritídach (Košťálová a Siveková, 1993).
ALP sa vyskytuje takmer vo všetkých orgánoch a tkanivách, i v erytrocytoch a leukocytoch.
Hladiny ALP sa počas celého experimentu pohybovala vo fyziologickom rozpätí, výnimku
tvorí skupina A1 v druhom odbere, kde nameraná hodnota bola nižšia ako je udávaná RH 1,9
µkat/l. Hladina ALP sa zvyšuje pri zápalových črevných ochoreniach a malabsorpčnom
syndróme. LDH sa nachádza hlavne vo svalovine, pečeňových bunkách a obličkách. Vo
všetkých odberoch a vo všetkých skupinách aktivita tohto enzýmu výrazne prekračovala
hornú hranicu RH, čo naznačuje zvýšenú stresovú záťaž u odstavčiat. Celkový bilirubín (Bi)
vo väčšine odberov prekračovala hornú hranicu 5,13 µmol/l.
Analýza výsledkov dusíkatého a bielkovinového profilu v sére odstavčiat (tab.č.5)
ukázala, že koncetrácia CB nedosahovala referenčné hodnoty 70 – 90 g/l. Počas celého
experimentu pretrvávala mierna hypoproteinémia. Nedostatok bielkovín v kŕmnej dávke, resp.
pri ich syntéze má za následok zníženie úžitkovosti, zhoršenie obranných reakcií organizmu,
poruchy v procese trávenia (tab.č.6), endokrinného a nervového systému, stresu. Ich deficit je
spôsobený nedostatočným prísunom stráviteľných dusíkatých látok, celkového množstva
a kvality v kŕmnej dávke (Fehse a kol., 2000).
Na zdravotný stav zvierat majú vplyv faktory prostredia pri chronických zápaloch
v jednotlivých chovoch. sú to faktory vonkajšieho prostredia, technológia ustajnenia
a kŕmenia, hygiena pôrodu, technológia dojenia, regionalizácia podľa chovateľských
podmienok, stresové faktory. Nie menej významné faktory vnútorného prostredia,
metabolické poruchy a orgánové poruchy(Straw a kol. 2003)
Záver
Záverom experimentu bolo overenie teórie biochemicko – homeopatickej regulácie
metabolizmu, ktorého výsledkom je súhrn analýz látkového metabolizmu a homeostázy
106
u odstavčiat po perorálnej aplikácii homeopatických prípravkov BOIRON 69110 Sainte-FoyLés-Lyon šarža SL 133 58 a 133 59 a porovnanie so skupinami kontrolných odstavčiat.
Zistili sme že prípravky:
•
neovplyvnili hematologický profil, zvýšené hladiny Lc vo všetkých odberoch
a skupinách poukazujú na zvýšenú aktivitu imunitného systému
•
neovplyvnili mikro a makrominerálny profil, počas celého experimentu pretrvávala
výrazná hypozinkémia vo všetkých skupinách a odberoch, čo bolo zapríčinené
deficitom prísunu zinku v kŕmnej dávke
•
neovplyvnili energetický profil, koncentráciu glukózy a TCH
•
enzymatický a hepatálny profil bol v skupinách A1 a B1 vyrovnanejší a ustálenejší, čo
pozitívne ovplyvnilo celkový zdravotný stav
•
neovplyvnili dusíkatý a bielkovinový profil
•
priaznivo ovplyvnili zdravotný stav v skupinách A1 a B1, kde nedošlo k úhynom
a zabránili výskytu diarrhoického syndrómu; v skupinách A2 a B2 došlo k výskytu
hnačiek a úhynu v skupine B2
•
priaznivo ovplyvnili hmotnostné prírastky v skupinách A1 a B1
Homeopatický liek je nositeľom informácie, ktorej prenesenie do organizmu navodí
stimuláciu vlastných obranných mechanizmov. Pre predstavu je možné homeopatický liek
prirovnať ku katalyzátoru, alebo ku špecifickému imunomodulátoru (Busserová a kol., 2006).
Tým by mohol byť vysvetlený účinok homeopatického prípravku na odstavčatá bez
výrazného vplyvu na metabolický profil.
Dosiahnuté výsledky poukazujú na priaznivý vplyv podávania testovaných
homeopatických prípravkov na zdravotný stav odstavčiat a odporúčame ich pre praktické
využitie vo farmových chovoch ako alternatívnu náhradu suplementácie medikovaných
kŕmnych zmesí antibiotikami, chemoterapeutikami a sulfonamidmi.
Literatúra
AMMERMAN, C. B., HENRY, P. R., LEWIS, A. J.: Supplemental organically – bound mineral compounds in
livestock nutrition. In: Recent Advances in Animal Nutrition, 1998, 67 – 91
BUSSEROVÁ, M., CHEFDEVILLE, F., COUSIN, J.M., DESOBEAU, P., LAMBERT, J., MARCKEL, J.,
MOUGUEZOVÁ.: Homeopatické memento- Od symptómu k Materii medike, CEDH INTERNATONAL, ISBN
80-969483-9-3,2006, 220-230.
DEMARQUE, D.: Homeopatie, Experimentální medicína.Nakladatelsví Boiron,2005, ISBN 2-95216-008-2,
273-299
FEHSE, R., CLOSE, W. H.: The effect of the addition of organic trace elements on the performance of a hyperprolific sow herd. In: Biotechnology in the Feed Industry. Edited by T. P. Lyons and K. A. Jaques. Nottingham
University Press, Nottingham, 2000, 309 – 325
107
ISSAUTIER, M.N., CALVET, H.: Veterinární homeopatická terapie, Editions BOIRON, nakladatelství
VODNÁŘ, 1993, ISBN 80-85255-28-6, 274-305
KOŠŤÁLOVÁ, D., SIVEKOVÁ, D.: Homeopatia a prírodné liečivá, Homeopatiká rastlinného a živočíšneho
pôvodu. Príroda, Bratislava, 1993, ISBN 80-07-00524-2, 207-223
RAMAKRISHNAN, A.,U., COULTEROVÁ, C., R.: Homeopatický přístup k léčbě rakoviny. Alternativa, 2005,
ISBN 80-85993-99-6, 22-35
STRAW, B., E., D´ALLAIRE, S., MENGELING, W., L., TAYLOR, D., J.: Choroby ošípaných, Nemoci prasat,
Hajko & Hajková, Bratislava,2003, ISBN 80-88700-58-2
LOCKIE, A.: Encyklopédia homeopatie, Perfekt, 2002, 45 - 66
VRZGULA, L.a kol.: Poruchy látkového metabolizmu hospodárskych zvierat a ich prevencia,1990,169– 198
Experiment bol realizovaný za pomoci grantových agentúr: VEGA pod číslom 1/3487/06 a APVV
20-06
tab. č.1
Štatistické výsledky hematologického profilu
A1 – A2 a < 0,05
Hb
Ec
Hk
Lc
Štatistické výsledky makro a mikrominerálneho profilu
tab. č 2
MCV
1. odber
+
+
+
-
-
2. odber
-
-
-
-
-
3. odber
-
-
-
+
-
B1 – B2 a < 0,05
Hb
Ec
Hk
Lc
MCV
1. odber
-
-
-
-
-
2. odber
-
-
-
+
-
3. odber
-
-
-
+
-
Štatistické výsledky energetického profilu
A1 - A2
a < 0,05
Ca
Mg
P
Na
K
Fe
Zn
1. odber
-
-
-
-
-
+
-
2. odber
-
-
-
-
-
-
-
3. odber
-
-
-
-
-
-
-
Zn
B1 – B2
a < 0,05
Ca
Mg
P
Na
K
Fe
1. odber
-
-
-
-
-
+
-
2. odber
-
-
-
-
-
-
-
3. odber
-
-
-
-
-
-
-
Štatistické výsledky enzymatického profilu
tab.č.3
tab.č.4
A1 – A2 a < 0,05
Gluk
TCH
1. odber
-
-
2. odber
-
A1 – A2 a
< 0,05
AST
ALT
GGT
ALP
LDH
Bi
1. odber
-
-
-
-
-
+
2. odber
+
-
-
+
-
-
3. odber
+
+
-
+
-
+
B1 – B2
a < 0,05
AST
ALT
GGT
ALP
LDH
Bi
-
3. odber
-
-
B1- B2 a < 0,05
Gluk
TCH
1. odber
-
-
2. odber
-
-
1. odber
-
-
+
-
-
-
-
2. odber
-
-
+
+
+
+
3. odber
+
-
+
+
-
-
3. odber
-
tab.č.5
tab.č.6
Štatistické výsledky bielkovinového profilu
A1 – A2
a < 0,05
CIg
CB
Alb
Creat
Urea
1. odber
-
-
-
-
-
Výskyt hnaciek a úhyn odstavciat
A1
A2
B1
B2
hnacka ks
2
4
3
5
2. odber
-
-
-
-
-
3. odber
-
-
-
-
-
hnacka %
28,5
57,0
42,8
71,4
B1 – B2
a < 0,05
CIg
CB
Alb
Creat
Urea
úhyn ks
0
0
0
1
1. odber
+
-
-
-
-
úhyn %
0
0
0
14,3
2. odber
-
-
-
-
-
3. odber
-
-
-
-
-
108
DIAGNOSTIKA DEDIČNÉHO OCHORENIA POLYCYSTICKÉHO OCHORENIA
OBLIČIEK /PKD/ U MAČIEK DNA TESTOM NA SLOVENSKU.
DIAGNISTICS OF HEREDITAR DISEASE – FELINE POLYCYSTIC KIDNEY DISEASE
USING DNA TEST IN SLOVAKI
Jakabová D.1, Židek R.1, Trandžík J.1, Rajtarová K.1, Massányi P.2, Haško M.1, Kozlík P.1,
Buleca J. Jr.3, Ryba Š.1
Štátny plemenársky ústav SR, Nitra, 2 Slovenská poľnohospodárska univerzita, Nitra, 3 Univerzita veterinárneho
lekárstva, Košice
1
Abstract:
Feline polycystic kidney disease (PKD) is autosomal dominant disease,that causes the
formation of fluid-filled renal cysts, often leading to renal failure. That disease is most
diagnosed by ultrasound, but 98% accurate is after approximately 10 month of age. A genetic
test for feline PKD will provide breeders with an efficient and accurate means to selectively
breed their cats and remove PKD from the population.
PKD is most common in the Persian breed and breeds that are related to Persians or
have used them in their breeding programs. In our report, feline PKD1 gene was screened for
transversion C>A, causing a stop codon (OPA) in exon 29 (Lyons et al., 2004), in Slovak
different breeds of cats. This mutation has identified in the heterozygous state in 23 affected
cats, including Persian and Exotic breeds. The causative mutation has not observed in SBI,
SIB, BRI breeds.
Úvod:
Vo veterinárnej literatúre sa ochorenie PKD spomína približne už 30 rokov, pričom sa
charakterizuje ako pomalé progresívne ireverzibilné dedičné ochorenie obličiek, s
autozomálne dominantným typom dedičnosti. Podstatou tohto ochorenia je zväčšenie obličiek
s následnou renálnou dysfunkciou (Eaton et al.,1997). Mnohopočetné cysty sú detegované už
od narodenia a ich pomalý rast spôsobuje zväčšenie obličiek a postupne redukuje ich funkciu.
Cysty majú rôzny tvar a veľkosť, a to od 1 mm až po 1 cm. Čím je postihnuté zviera staršie,
tým rastie počet cýst aj ich veľkosť. Cysty sa môžu vyskytovať nielen v obličkách, ale v iných
orgánoch, hlavne v maternici a v pečeni. Klinické príznaky PKD sú nešpecifické – je to
poväčšine depresia, anorexia alebo inapetencia, polyúria, polydypsia a strata hmotnosti.
Najskoršia diagnostika ultrasonografickým vyšetrením je možná vo veku 7 týždňov, nakoľko
sú však cysty veľmi malé, môže byť nepresná (Beck, 2001).
109
K eliminácií PKD prispieva skorá diagnostika postihnutých jedincov. Majitelia
mačiek, hlavne perských a exotických ale i plemien, kde bolo povolené prikríženie perzských
mačiek, ako sú britské mačky, kartúzske, burmily, birmy, ragdoll, cornish rex, devon rex
(Eaton et al., 1997), by mali byť informovaný o dedičnosti tohoto ochorenia a postupnom
nástupe príznakov. Toto ochorenie sa môže objaviť objaviť i u iných plemien, ale tu je už
nižšie riziko výskytu PKD. Keďže postihnutá mačka môže žiť roky bez akýchkoľvek
problémov jedinou spoľahlivou metódou diagnostiky sa stáva DNA test.
Materiál a metódy:
V našej analýze sme vyšetrili 122 jedincov patriace k plemenám exotické, perzské,
sibírske a birma. DNA sme izolovali z periférnej krvi pomocou Wizard kitu (Promega). PCR
reakciu sme uskutočňovali pomocou primerových sekvencií (Lyons et al., 2004) a cykléra
(PTC 200). Amplifikačný produkt o dĺžke 559 bp sme štiepili restrikčnou endonukleázou
MLY 1 po dobu 4 hodín pri teplote 370C, ktorý sa v prítomnosti tranzverzie (mutácie) štiepi
na dva fragmenty o dĺžke 316 a 243 bp (Obr.1).
Obr.1 Rozdelenie PCR produktov na 2% agarózovom géli štiepených restrikčnou
endonukleázou
MLY 1
1
2
3
4
5
6
7
1, 7
100 bp veľkostný štandard
2, 3
N/n – postihnutý jedinec fragmenty (559, 316, 243 bp)
4, 5, 6
N/N – zdravý jedinec fragment neštiepený 559 bp
Fragmenty sme následne separovali na 2% agarózovom géli farbenom Gold View (SBS
Genetech). Ako pozitívna vzorka nám slúžila DNA od postihnutého zvieraťa ochorením PKD.
110
Výsledky a diskusia
V našej práci sme optimalizovali metódu DNA testu pre vyšetrenie ochorenia PKD v
našom laboratóriu. Pri skríningu plemien mačiek EXO, PER, SIB, SBI, BRI
na dané
ochorenie, a to o počte 122 jedincov sme detegovali prítomnosť uvedeného ochorenia u 23
jedincov plemien EXO a PER (tab.1).
V našej práci sme potvrdili, že uvedené ochorenie sa vyskytuje predovšetkým u týchto
plemien podobne ako opisujú výskyt PKD aj iní autori (Barthez et al., 2003, DiBartola, 2000,
Beck et al.,2001, Barrs et al., 2001). Uvedená metóda DNA testu môže slúžiť na diagnostické
účely a tak zabezpečiť účinnú selekciu postihnutých zvierat už v ranom štádiu, ktoré sú
využívané v plemenitbe. Preto základom eliminácie je nezaraďovanie takýchto jedincov do
chovu, prípadne ich kastrácia alebo sterilizácia.
Tab. 1 Prehľad počtu postihnutých jedincov PKD (genotyp N/n) a zdravých jedincov
(genotyp N/N) v závislosti od plemena. Plemená sú označené systémom EMS.
Plemeno mačiek
Výsledok DNA testu
Počet jedincov
EXO (Exotická) Exotic
N/N
24
EXO (Exotická) Exotic
N/n
8
BRI (Britská) British Shorthair
N/N
5
BRI (Britská) British Shorthair
N/n
0
PER (Perzská) Persian
N/N
62
PER (Perzská) Persian
N/n
15
SBI (Birma) Sacred Birman
N/N
2
SBI (Birma) Sacred Birman
N/n
0
SIB (Sibírska) Siberian
N/N
6
SIB (Sibírska) Siberian
N/n
0
Zoznam literatúry:
Barrs V.R., Gunew M. (2001): Prevalence of autosomal dominant polycystic kidney disease in Persian cats and
related –breeds in Sydney and Brisbane. Austr Vet 79, 257-259.
Barthez P.Y., Rivier P., Begon D. (2003): Prevalence of polycystic kidney disease in Persian and Persian
related cats in France. J. Feline Med Surg 5, 345-347.
Beck C., Lavelle R.B.(2001): Feline polycystic kidney disease in Persian and the other cats. A prospective study
using ultrasonography. Aust Vet J 79, 181-184
DiBartola S.(2000): Autosomal dominant polycystic kidney disease. Proceedings of the 18 th Annual Veterinary
Internal Medical Forum of the American College of Veterinary Internal Medicine, 438-440.
Eaton K.A., Biller D.S., DiBartola S.P., Radin M.J., Wellman M.L. (1997): Autosomal dominant polycystic
kidney disease in Persian and Persian –cross cats. Vet Pathol 34, 117-126.
111
Lyons A. L., Biller D.S., Erdman C.A., Lipinski M.J., Young A.E., Roe B.A., Qin B., Grahn R.A.(2004):
Feline polycystic kidney disease mutation identified in PKD1, J.Am.Soc. Nephrol 15, 2548- 2555.
Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe Zmluvy
č.APVV-20-063205
ŤAŽKÉ KOVY A ŠTRUKTÚRA SEMENNÍKOV A MATERNICE APODEMUS
FLAVICOLLIS Z OBLASTI JADROVEJ ELEKTRÁRNE
HEAVY METALS AND STRUCTURE OF TESTES AND UTERUS OF APODEMUS
FLAVICOLLIS FROM AREA OF NUCLEAR POWER STATION
1
Jančová, A., 2Massányi, P., 3Drábeková, J.
1Katedra
zoológie a antropológie, UKF, Nábrežie Mládeže 91, 949 01 Nitra, [email protected]
fyziológie živočíchov, SPU, Tr. A. Hlinku 2, 949 01 Nitra
3Katedra matematiky, SPU, Tr. A. Hlinku 2, 949 01 Nitra
2Katedra
Abstract
In testes and uterus of individuals Apodemus flavicollis coming from vicinity of nuclear
power station Mochovce there was an AAS method used to discover relatively low average
concentrations of Cu, Fe, Mn, Zn and Cd. Copper, zinc and cadmium were accumulated in
higher level in testes when compared with uterus. The levels of iron and manganese were
higher in uterus.
Microscopically picture of testes showed normally formed structures without pathological
changes, what was also confirmed by quantitative morphometric analysis. Relative volume of
epithelium of Apodemus flavicollis is 67.552 %, lumen was 24.688 % and stroma 7.760 %.
The tubular diameter was 142.5 µm. An average number of sperm elements on the surface of
the sample 10 000 µm2 was 90.53.
In the yellow-necked mouse the relative volume of the endometrium is 61.5045 % and of
the myometrium 38.4955 %, the stroma forms the highest relative volume (83.515%). The
relative volume of surface epithelium is 13.651% and glandular epithelium forms 2.834%.
The results of analysis indicate that vicinity of nuclear power station Mochovce is not
highly contaminated with heavy metals and it is not risky for health condition of small
mammals.
Key words: heavy metals, cadmium, copper, iron, manganese, zinc, Apodemus flavicollis,
testes, uterus
112
Úvod
Účinky ťažkých kovov na drobné cicavce boli študované v rozličných situáciách.
Laboratórne experimenty realizovali KRAMÁROVÁ et al. (2000), LUKÁČ et al. (2004). Jedince
z prostredia so silným priemyselným znečistením analyzovali GDULA-ARGASIŃSKA et al.
(2004), DAMEK-POPRAWA & SAWICKA-KAPUSTA (2004), JANČOVÁ et al. (2006). Množstvo
prác je zo sídelných aglomerácií, pre ktoré je charakteristická vysoká záťaž emisiami
z dopravy (IERADI et al., 1996; KOMARNICKI, 2000).
Pre lepšie poznanie a pochopenie vplyvu ťažkých kovov na biologické systémy je
potrebné získať čo najviac informácií o ich pohyblivosti a akumulácii v konkrétnych
ekosystémoch. Dôležitou súčasťou skúmania vplyvu emisií na živočíšny organizmus je aj
patologicko-anatomické a histologické posúdenie zmien parenchymatóznych orgánov
(GÁLOVÁ et al., 2001). Najmä obličky, pečeň a pohlavné orgány, sú mimoriadne senzitívne
a už pri určitej záťaži a nízkej toxicite vykazujú štruktúrne zmeny alebo funkčné poruchy.
Cieľom práce je zistiť koncentrácie ťažkých kovov v orgánoch Apodemus flavicollis
a vykonať kvantitatívnu analýzu mikroskopickej štruktúry semenníkov a maternice.
Materiál a metodika
Analyzované vzorky boli odobraté zo semenníkov a maternice ryšavky žltohrdlej
(Apodemus flavicollis, Rodentia). Jedince boli získané pomocou teriologických metód
z lesného prostredia v blízkosti Jadrovej elektrárne Mochovce. Boli adultné, v dobrej telesnej
kondícii a neboli pozorované žiadne chorobné procesy ani patologicko-anatomické zmeny.
Koncentrácie Cu, Fe, Mn, Zn a Cd boli stanovené pomocou metódy atómovej absorpčnej
spektrofotometrie. Koncentrácie jednotlivých prvkov boli prepočítané a vyjadrené v mg.kg-1.
Histologické preparáty boli zhodnotené subjektívne a následne kvantitatívne pomocou
mikrofotografií, s využitím morfometrických metód (UHRÍN & KULÍŠEK, 1980). V
semenníkoch sme zhodnotili relatívny objem (%) semenotvorného epitelu, lumenu a
intersticiálneho väziva, priemer semenotvorných kanálikov a počet spermatogénnych
elementov na jednotke plochy. V maternici sme kvantifikovali relatívny objem (%)
endometria a myometria a v endometriu relatívny objem (%) epitelu, žliaz a väziva.
Zo získaných kvantitatívnych hodnôt sme vypočítali základné variačno-štatistické
ukazovatele a určili korelačné koeficienty.
113
Výsledky
Koncentrácia medi, železa, mangánu, zinku a kadmia v semenníkoch a maternici
Apodemus flavicollis z oblasti Jadrovej elektrárne Mochovce je uvedená v tab. 1. Najvyššie
hladiny akumulácie boli zistené pri železe. Koncentrácie kadmia a mangánu boli nízke. Meď,
zinok a kadmium sa vo väčšej miere akumulovali v semenníkoch v porovnaní s maternicou.
Hladiny železa a mangánu boli vyššie v maternici.
Subjektívnym posúdením mikroskopických preparátov semenníkov A. flavicollis sme
pozorovali normálne utváraný semenotvorný epitel, obsahujúci všetky vývojové štádiá
pohlavných buniek. Kanáliky boli oválne, na ich stenách neboli pozorované žiadne zmeny.
Tab. 1 Koncentrácia vybraných prvkov v semenníkoch a v maternici A. flavicollis
Orgán
Prvok
Cu (mg.kg-1)
Fe (mg.kg-1)
Mn (mg.kg-1)
Zn (mg.kg-1)
Cd (mg.kg-1)
3,9413
239,2250
0,0013
77,4903
0,0090
sd
3,4672
80,6869
0,0005
72,2332
0,0034
min
0,0440
168,6000
0,0010
39,6300
0,0040
max 8,4870
355,0000
0,0020
185,800
0,0110
med 3,6170
216,6500
0,0010
42,2655
0,0105
0,0077
471,7333
0,0103
51,6000
0,0077
sd
0,0015
287,8126
0,0162
27,7230
0,0015
min
0,0060
221,8000
0,0010
29,4500
0,0060
max 0,0090
786,4000
0,0290
82,6900
0,0090
med 0,0080
407,0000
0,0010
42,6600
0,0080
Semenníky
Maternica
x - priemerná hodnota; sd - smerodajná odchýlka; min – minimálna nameraná hodnota; max – maximálna
nameraná hodnota; med – medián
Priestor medzi kanálikmi vypĺňalo úzke intersticiálne tkanivo, v ktorom sa nachádzali
krvné cievy rôznej veľkosti. V semenníku A. flavicollis je zárodočný epitel zastúpený 67,552
%, lumen 24,688 % a väzivo 7,760 % (tab. 2). Priemer semenotvorných kanálikov bol 142,5
µm. Priemerný počet spermatogénnych elementov na ploche preparátu 10 000 µm2 bol
90,53.
114
Tab. 2 Relatívny objem zárodočného epitelu, väziva a lumenu v semenníkoch A.
flavicollis
x
±s
v%
Epitel (%)
76,903
4,912
6,389
Väzivo (%)
8,311
1,573
18,909
Lumen (%)
14,786
5,985
40,434
Priemer kanálika (µm)
142,500
30,525
22,569
x – priemer, ±s – smerodajná odchýlka, v% - variačný koeficient
Zaznamenali sme silný negatívny korelačný vzťah medzi relatívnym objemom
zárodočného epitelu a lumenom kanálikov A. flavicollis (-0,904). Znamená to, že
zväčšovaním objemu epitelu sa zmenšuje objem lumenu. Epitel a väzivo sú v silnom
negatívnom vzťahu a lumen s väzivom v slabom pozitívnom korelačnom vzťahu (tab. 3).
Tab. 3 Korelačné koeficienty medzi epitelom, lumenom, väzivom a priemerom
kanálikov semenníkov A. flavicollis
Epitel
Epitel
Lumen
Väzivo
∅ kanálika
1,000
-0,904
-0,591
0,758
1,000
0,191
-0,564
1,000
-0,677
Lumen
Väzivo
∅ kanálika
1,000
Medzi priemerom lumenu kanálika a zárodočným epitelom A. flavicollis existuje silná
pozitívna korelačná závislosť (0,758). Medzi priemerom kanálika a väzivom je silný
negatívny vzťah (-0,677), čiže zvýšením priemeru kanálika sa podstatne zníži jeho väzivo.
Silne negatívne závislý je vzťah medzi priemerom kanálika semenníka a jeho lumenom
(0,564), zvýšením priemeru sa zníži jeho lumen.
Tab. 4 Percentuálne zastúpenie hlavných zložiek maternice A. flavicollis
x
±s
v%
Endometrium (%)
61,5045
7,172
11,661
Myometrium (%)
38,4955
7,172
18,631
Epitel endometria (%)
13,651
4,875
35,710
Žľazy endometria (%)
2,834
1,121
39,572
Väzivo endometria (%)
83,515
5,996
7,179
x – priemer, ±s – smerodajná odchýlka, v% - variačný koeficient
115
Stenu maternice tvorilo normálne formované endometrium a myometrium. Na povrchu
endometria sa nachádzal povrchový epitel. V riedkom väzive sa vyskytovali maternicové
žľazy. Endometrium tvorilo 61,5045 % a myometrium 38,4955 % (tab. 4). V endometriu sme
rozlíšili tri zložky: povrchový epitel, väzivo a žľazy. Najvýraznejšie zastúpenie malo väzivo
(83,515%), nasledoval epitel (13,651%) a najnižší podiel mali žľazy (2,834%).
Diskusia
Hladiny kovov, ktoré boli zistené v samčích aj samičích pohlavných orgánoch Apodemus
flavicollis sú pomerne nízke. Stopové množstvá vysoko rizikového prvku kadmia (0,0090
mg.kg-1; 0077 mg.kg-1) svedčia o nízkej kontaminácii oblasti týmto xenobiotikom.
V orgánoch a v tele drobných zemných cicavcov rodov Apodemus, Clethrionomys,
Microtus, Peromyscus sa priemerné koncentrácie Zn pohybujú v intervale 22,1 – 309 mg.kg-1
a priemerné koncentrácie Cu v intervale 0,4 – 23,7 mg.kg-1 (ŠUMBERA et al., 2003). Priemerná
koncentrácia Zn v semenníkoch (77,4903 mg.kg-1) a aj v maternici (51,600 mg.kg-1) ryšavky
žltohrdlej sa nachádza v blízkosti spodnej hranice publikovaného intervalu. Koncentrácia Cu
v semenníkoch dosiahla opäť nízku hodnotu (3,9413 mg.kg-1) a v maternici to bolo len
stopové množstvo (0,0077 mg.kg-1). V oblasti so silne narušenými zložkami životného
prostredia boli v semenníkoch a v maternici A. flavicollis zistené vyššie hladiny Fe (259,143
mg.kg-1; 618,5 mg.kg-1) a aj Mn (0,171 mg.kg-1; 2,272 mg.kg-1) (JANČOVÁ et al., 2006).
Mikroskopický obraz semenníkov a maternice ukázal neporušené štruktúry. Neboli
pozorované žiadne patologické procesy a kvantitatívne ukazovatele korešpondujú s prácami
viacerých autorov.
BÁBIKOVÁ et al. (2006) pre potkany línie Wistar uvádzajú, že semenotvorný epitel tvoril
72,50 %, lúmen kanálika 11,49 % a inresticiálne väzivo 16,03 %. Podľa TOMANA et al. (2006)
je relatívny objem semenotvorného epitelu potkanov 77,49 %, myší 79,95 % a chrčkov 72,48
%. Relatívny objem semenotvorného epitelu laboratórnych myší je 89,13 %, interstícium
10,87 % a priemer kanálikov 272,06 µm (LUKÁČ et al., 2006). MASSÁNYI et al. (1997)
uvádzajú, že počas roku sa relatívny objem semenotvorného epitelu zajaca poľného
pohyboval v rozmedzí 57,34 - 73,38 %, väziva od 6,33% do 34,03% a lumenu od 8,63 % do
24,16 %, v závislosti od mesiaca (sezóny), t.j. pohlavnej aktivity.
Priemer semenotvorných kanálikov chrčkov je 166,24 µm (TOMAN et al., 2006),
holandských králikov 196 – 206 µm (PAUFLER & FOOTE, 1969), potkana 253,6 µm
(MASSÁNYI et al., 1991), králika 118,69 µm (TOMAN, 1994). Z toho vyplýva, že priemer
116
výrazne kolíše v závislosti od druhu, ale že existuje i veľká vnútrodruhová variabilita.
V epiteli lišiaka obyčajného sa nachádza v priemere 49,37 ± 6,73 spermatogénnych buniek na
10 000 µm2 (MASSÁNYI et al., 1996b).
MASSÁNYI (1996a) zistil u králikov nasledujúce zastúpenie: endometrium 48,73 % a
myometrium 51,27 %. Epitel endometria predstavoval 5,87 %, žľazy 5,78 % a väzivo 88,35
%. U zajaca poľného endometrium formuje stenu maternice v rozmedzí 22,86 % - 43,05 % a
myometrium 56,95 % - 77,14 % (MASSÁNYI & TOMAN, 1997). Analýza endometria ukázala,
že povrchový epitel sa pohybuje v rozmedzí 3,06 - 9,45 %, žľazový epitel 8,55 - 35,4 % a
najvýraznejšie je zastúpené väzivo tvoriace 61,32 - 88,39 % relatívneho objemu endometria.
Záver
V semenníkoch a maternici jedincov Apodemus flavicollis pochádzajúcich z okolia
Jadrovej elektrárne Mochovce boli pomocou metódy AAS zistené pomerne nízke priemerné
koncentrácie Cu, Fe, Mn, Zn a Cd. Meď, zinok a kadmium sa vo väčšej miere akumulovali
v semenníkoch v porovnaní s maternicou. Hladiny železa a mangánu boli vyššie v maternici.
Mikroskopický obraz semenníkov aj maternice ukázal normálne formované štruktúry, bez
patologických zmien, čo potvrdila i kvantitatívna morfometrická analýza.
Výsledky analýz naznačujú, že okolie Jadrovej elektrárne Mochovce nie je vysoko
kontaminované ťažkými kovmi a nie je zdravotne rizikové pre drobné cicavce.
Poďakovanie
Práca bola finančne podporená grantovým projektom VEGA 1/2364/05 a CGA VI/2/2006.
Literatúra
BÁBIKOVÁ, L., TOMAN, R., HLUCHÝ, S., MASSÁNYI, P., LUKÁČ, N., GOLIAN, J., ŠIŠKA, B.,
2006: Rizikové faktory potravového reťazca. SPU Nitra, 42 – 44.
DAMEK-POPRAWA, M., SAWICKA-KAPUSTA, K., 2004: Environmental Research 96, 72 – 78.
GÁLOVÁ, J., UHRÍN, V., PIVKO, J., PAVLÍK, V., GALLO, M., 2001: Zb. prác z medzinárodnej
vedeckej konf. „Rizikové faktory potravového reťazca“. SPU Nitra, s. 34-36.
GDULA-ARGASIŃSKA,
J.,
APPLETON,
J.,
SAWICKA-KAPUSTA,
K.,
SPENCE,
B.,
2004:
Environmental Pollution 131, 71 – 79.
IERADI, L.A., CRISTALDI, M., MASCANZONI, D., CARDARELLI, E., GROSSI, R., CAMPANELLA,
L., 1996: Environmental Pollution 92, 3, 323 – 328.
JANČOVÁ, A., MASSÁNYI, P., NAĎ, P., KORÉNEKOVÁ, B., SKALICKÁ, M., DRÁBEKOVÁ, J.,
BALÁŽ, I., 2006: Ekológia 25, 1, 19 – 26.
KOMARNICKI, G.J.K., 2000: Chemosphere 41, 1593 – 1602.
KRAMÁROVÁ, M., MASSÁNYI, P., RENON, P., TOMAN, R., KOVÁČIK, J., 2000: Slov. Vet. čas.,
25, 2: 108 – 110.
LUKÁČ, N., BÁRDOS, L., MASSÁNYI, P., KRAMÁROVÁ, M., BULLA, J., TOMAN, R., STAWARZ,
R., FORMICKI, G., 2006: Procs. Trace Elements in the Food Chain, Budapest, 384 – 388.
117
LUKÁČ, N., MASSÁNYI, P., TOMAN, R., SLÁDEČKA, A., 2004: Rizikové faktory potravového
reťazca IV. Nitra: SPU, s. 155 – 159.
MASSÁNYI, P., 1996a: VŠP Nitra, 70.
MASSÁNYI, P., HLUCHÝ, S., LUKÁČ, N., SLAMEČKA, J., JURČÍK, R., 1996b: Chov zveri
v meniacich sa spoločenských a ekologických podmienkach. Nitra VÚŽV, s. 259 - 261.
MASSÁNYI, P., JANOVIČOVÁ, O., BAKITOVÁ, Ľ., PAŠKA, J., TOMAN, R., 1991: Poľnohospodárstvo,
37, 9 - 10, s. 830 - 848.
MASSÁNYI, P., LUKÁČ, N., HLUCHÝ, S., SLAMEČKA, J., JURČÍK, R., 1997: Acta Sc. Nat. Brno,
31, 3 - 4, s. 60 - 66.
MASSÁNYI, P., TOMAN, R., 1997: Záverečná správa, VÚŽV Nitra.
PAUFLER, S.K., FOOTE, R.H., 1969: J. Reprod. Fert., 19, 309 – 319.
ŠUMBERA, R., BARUŠ, V., TENORA, F., 2003: Folia Zool. 52, 2: 149 – 153.
TOMAN, R., 1994: DDP, VŠP, Nitra, 153s.
TOMAN, R., MASSÁNYI, P., LUKÁČ, N., BÁBIKOVÁ, L., CAPCAROVÁ, M., 2006: Rizikové faktory potravového
reťazca. SPU Nitra, 311 – 317.
UHRÍN, V., KULÍŠEK, V., 1980: Živočíšna výroba, 25,s. 935-942.
Kontaktná adresa: RNDr. Alena Jančová, PhD., Katedra zoológie a antropológie, Nábrežie
Mládeže 91, FPV UKF, 949 01 Nitra
INDUKCIA ESTRU OVIEC KOMBINÁCIOU FLUOROGESTÓN ACETÁTU A
EKVINNÉHO CHORIOVÉHO GONADOTROPÍNU V ANESTRICKEJ SEZÓNE
INDUCTION OF OESTRUS IN ANOESTROUS EWES WITH COMBINATION
FLUOROGESTONE ACETATE AND EQUINE CHORION GONADOTROPHINE
Jankurová, J., Vlčková, R., Maraček, I., Halagan, J.
Ústav fyziológie Katedry normálnej anatómie, histológie a fyziológie, UVL Košice
Abstract
In our study we followed the effect of combination Fluorogeston acetate (FGA) and
differ doses of Equine chorion gonadotrophine (eCG) for induction of oestrus in anoestrous
ewes. Blood samples (n=10) were taken to determine concentrations of hormones
(progesterone, P4 and estradiol 17ß, E2).
Every of experimental ewes were subsequently
induced to oestrus with 40 mg of FGA per head/13 days (intravaginal sponges). After 8 days,
we taken blood sampling and next five ewes (group 1) were treated with 500 IU eCG per head
and to other five ewes (group 2) with 1000 IU eCG per head. Seven days after application of
eCG blood samples were taken again to determine concentrations of P4 and E2 using RIA
methods. There was no significance changes in hormones concentrations determined in blood
samples in group 1 before even after treatment. Concentration of P4 was significantly decreased
(P<0.05) and E2 was significantly increased (P<0.001) in group 2. From our results follow, that
the combination of FGA and eCG can stimulate secretion of gonadotrophin and ovulation in
anestrous ewes.
118
Úvod
V súčasnej dobe sú najaktuálnejšie biotechnické metódy cielené na ovplyvnenie
pohlavného cyklu. Stimuláciou a reguláciou nástupu a priebehu ruje (estru), spresnením doby
ovulácie, vyvolaním superovulácie je možné (a) získať väčší počet embryí od geneticky
najkvalitnejších jedincov (transfer embryí), (b) regulovať pohlavie potomstva, včasné zistenie
výsledkov inseminácie, (c) riadenie nástupu a priebehu pôrodu, vedenie puerpéria a prevencia
vzniku popôrodných komplikácií. Efektom týchto metód je zaistenie vyššej plodnosti a
natality. K dosiahnutiu cieľa sa v praxi využívajú prirodzené metódy synchronizácie a
indukcie estru (napr. vplyv barana - „ram effect“) (8), či farmakologické, aplikácia vhodnej
dávky prípravkov na báze jednak progestagénov (2), jednak prostaglandínov. Prípadne je
možné využiť aj vzájomnú kombináciu vplyvu barana a syntetického prípravku GnRH v
určitej fáze reprodukčného cyklu samíc.
Na základe získaných poznatkov a skúseností sa neustále rozvíjajú a zdokonaľujú tak, aby sa
dosiahol maximálny efekt pri minimalizácii zásahov a použitia syntetických stimulačných
prípravkov na báze steroidov bez narušenia úžitkových vlastností. Metódy riadenej
reprodukcie nachádzajú čoraz väčšie uplatnenie aj pre plemená oviec chovaných v regiónoch
Slovenska. Cieľom našej práce bolo overiť a porovnať vplyv Fluorogestón acetátu (FGA,
syntetický gestagén) v kombinácii s rôznymi dávkami extrahypofýzového choriového
gonadotropínu zo séra žrebných kobýl (500 IU, 1000 IU eCG) na hladiny progesterónu a 17βestradiolu pri indukcii estru oviec počas anestrickej sezóny.
Materiál a metodika
Do experimentu počas anestrickej sezóny (máj – jún) sme zaradili 10 oviec, u ktorých
sme vykonali synchronizáciu a indukciu k estru pomocou intravaginálnych polyuretánových
tampónov s obsahom 40 mg fluorogestón acetátu na kus (Chrono-gest, Intervet International
B.V. Boxmeer, Holandsko ) po dobu 13-tich dní. Na 8. deň, ešte počas trvania účinku FGA
v tampónoch, sme zvieratá rozdelili do dvoch skupín, 1. skupine bola aplikovaná
intramuskulárne (i. m.) dávka 1000 IU (2 ml)/ks eCG, 2. skupine i.m. dávka 500 IU (1 ml)
eCG/ks (Sergon, a.u.v., Bioveta a.s., Ivanovice na Hané, ČR). Vzorky krvi sme odobrali pred
samotnou instiláciou tampónov (0. deň pokusu), pred aplikáciou eCG (8. deň pokusu) a po
všetkých vykonaných zásahoch (15. deň pokusu). Krv sme centrifugovali pri otáčkach 2000
× g a pri teplote 4 °C po dobu 15-tich minút. Získané sérum bolo zmrazené do ďalšieho
spracovania. Koncentrácie hormónov (progesterónu – P4 a 17β-estradiolu – E2 sme stanovili
v krvnom sére oviec rádioimunologickou analýzou komerčnou súpravou RIA Progesterone,
119
RIA Estradiol (Immunotech Sa, Beckman Coulter Company, Marseille Cedex, France).
Získané výsledky sme spracovali a štatisticky vyhodnotili Studentovým t-testom.
Výsledky
Analýza výsledkov prvej pokusnej skupiny nám ukázala, že došlo k zvýšeniu
koncentrácií progesterónu v krvnom sére oviec na 8. deň od
aplikácie intravaginálnych
tampónov ale aj na 15. deň pokusu, teda 7 dní po podaní 1000 IU eCG. Tieto zmeny však boli
nesignifikantné.
U druhej skupiny ošetrenej kombináciou FGA a 500 IU eCG sme
zaznamenali na 8. deň po aplikácii
FGA nesignifikantný vzostup hladín progesterónu,
štatisticky významný pokles však vykazoval P4 7 dní po podaní eCG (15. deň) (Graf 1).
Koncentrácie estradiolu u prvej skupiny
nevykazovali 8. deň
od aplikácie tampónov
výrazný vzostup v porovnaní s 0. dňom, kontrolným odberom. Došlo k nemu až 7 dní po
podaní 1000 IU eCG, zmeny opäť nevykazovali signifikanciu. U druhej skupiny sme 8 dní po
aplikácii
FGA zaznamenali nevýrazný pokles hladín estradiolu oproti koncentráciám
zisteným v 0. deň, pred samotnou aplikáciou tampónov. Signifikantný nárast hladín E2 sme
zistili po 7. dňoch od podania 500 IU eCG (Graf 2).
Graf 1 Hladiny progesterónu po ošetrení oviec kombináciou: FGA a 1000 IU eCG (1. sk) a
FGA a 500 IU eCG (2. sk)
ng/ml
P4
3,5
3
1.sk
2.sk
* P < 0,05
*
2,5
2
1,5
*
1
0,5
0
0. de ň
8. deň
15. de ň
dni pokusu
Graf 2 Hladiny estradiolu po ošetrení oviec kombináciou: FGA a 1000 IU eCG (1. sk) a
FGA a 500 IU eCG (2. sk)
120
E2
pg/ml
160
1.sk
2.sk
140
* P < 0,001
*
120
*
100
80
60
40
20
0
0. deň
8. deň
15. deň
dni pokusu
Diskusia
Pre ovce v našich klimatických podmienkach je charakteristická pohlavná sezónnosť,
pričom fertilná ruja sa vyskytuje koncom leta a začiatkom jesene.
zvolených
Aplikácia vhodne
prípravkov na synchronizáciu a indukciu ruje umožňuje u oviec vyvolať
plnohodnotnú ruju takmer počas celého roka. Túto skutočnosť skrátenia anestrickej sezóny
využíva čoraz viac chovateľov.
Metódy na báze progestagénov využívajú
účinok
progesterónu prípadne jeho analógov, kde stupeň získanej synchronizácie a interval medzi
skončením ošetrenia a začiatkom ruje závisí od použitého farmaka (3).
Podávanie
progestínov alebo látok blokujúcich produkciu GnRH (hypofýzové inhibítory) pracuje na
princípe blokovania produkcie FSH a oddialenia dozrievania folikulov, ruje a ovulácie skôr
než prebehne regresia periodického žltého telieska – predlžovanie luteálnej fázy cyklu.
Pohlavný cyklus je dočasne a reverzibilne potlačený a po prerušení medikácie sa uvoľní jeho
blokujúci účinok na hypotalamo – hypofýzovo – ovariálny systém a cyklus pokračuje.
Progestagény môžu byť aplikované v rôznej forme – vaginálne tampóny, implantáty a pod.,
rôznymi spôsobmi – intravaginálne, intramuskulárne (i.m.), subkutánne (s.c.) a v rôznych
dávkach (1, 5, 6, 7). Výhodou polyuretánových tampónov je ich ľahká aplikácia a poskytujú
nám spoľahlivé výsledky po prirodzenom pripúšťaní alebo umelej inseminácii (9). Po ich
odstránení je vhodná injekcia eCG, ktorého dávka musí byť prispôsobená plemenu, váhe,
sezóne, stádu, veku a fyziologickému stavu zvierat.
O gonadotropínoch je známe, že
indukujú ovuláciu anestrických oviec. Tá však obyčajne nie je sprevádzaná estrom- rujou. Ak
ošetreniu predchádza podanie progesterónu, ovulácia je sprevádzaná estrom.
V praxi sa
121
zaužívala vhodná kombinácia tampónov po dobu 12 - 13 dní a injekčné podanie eCG, počas
anestrickej sezóny vo vyššej dávke (400 – 600 IU) v porovnaní s dávkou počas chovnej
sezóny (300 – 500 IU) (3, 4).
Nami dosiahnuté výsledky sú v súlade s literárnymi údajmi, ktoré uvádzajú ako vhodnú
i nami použitú dávku 500 IU eCG (7) . Po aplikácii tejto kombinácie dochádza k štatisticky
významným dynamickým zmenám koncentrácií sledovaných hormónov v krvnom sére oviec.
Pokles P4 (regresia CL) stimuluje sekréciu E2 a rast folikulov, odstránením negatívnej spätnej
väzby vplyvu P4 na hypotalamus nastáva znovu uvoľnenie GnRH vo vyšších amplitúdach, čo
spôsobí uvoľnenie FSH a LH vo vyšších koncentráciách a podporí sa vývoj folikulov. Stúpa
produkcia E2, pri dosiahnutí jeho prahovej úrovne nasleduje uvoľnenie veľkého množstva LH
(LH pík) a nasleduje plnohodnotná ovulácia. Koncentrácie E2 v krvi rastú krátko pred
ovuláciou, detekcia estrogénov je preto cenným indikátorom prebiehajúcich cyklov ruje.
Estrogény kontrolujú nástup preovulačného píku LH, po ktorom nasleduje ovulácia.
Záver
Naše čiastkové výsledky poukazujú na to, že pri súčasnej aplikácii tampónov s FGA
a podávania eCG v určitom časovom intervale dochádza k vzostupu hladín 17β-estradiolu
v krvnom sére oviec. Táto skutočnosť súvisí so stimuláciou nástupu náboru antrálnych,
terciárnych folikulov na trajektóriu rastu, keďže eCG má podobný účinok ako FSH.
Rozdielna dávka eCG mala za následok, že pri podaní vyššej dávky eCG (1000 IU) bol
zaznamenaný výrazný vzostup hladín progesterónu ako dôsledok luteinizácie i 17β-estradiolu
z novej vlny rastúcich folikulov.
Literatúra
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
BARI, F. – KHALID, M. – OLF, B. – HARESIGN, W. – MURRAY, A. – MERREL, B., 2001. The
repeatability of superovulatory response and embryo recovery in sheep. Theriogenology, 56 (1): 147 – 155.
BOSCOS, C. M., SAMARTZI, F. C., DELLIS, S., ROGGE, A., STEFANAKIS, A., 2002. Use of
progestagen-gonadotrophin treatments in estrus synchronization of sheep. In: Theriogenology, 58, (7), 1261
– 1272.
COGNIE, Y., 1990. Current technologies for synchronization and artificial insemination of sheep. In:
Reproductive physiology of merino sheep Eds.: C.M. Oldham, G.B. Martin and I.W. Purvis, University of
Western Australia, p. 207.
EVANS, G. – MAXWELL, W. M. C., 1987. Salamon`s artificial insemination of sheep and goats. Sydney:
Butterworth.
GODFREY, R. W. – COLLINS, J. R. – HANSLEY, E. L. – WHEATON, J. E., 1999. Estrus
synchronization and arteficial insemination of hair ewes in the tropics. Theriogenology, 51: 985 – 997.
HARESIGN, W., 1992. Manipulation of reproduction in sheep. J. Reprod. Fertil., Suppl. 45: 127 – 139.
HENDERSON, D. C. and ROBINSON, J. J., 2000. The reproductive cycle and its manipulatuion. In: Martin
W.B., Aitken I.D.: Diseases of sheep. 3rd ed. Oxford: Blackwell Scientific Publications.
UNGERFELD, R., 2005. Sixty years of the ram effect (1944 – 2004): How have we learned what we know
about it. J. Anim. and Vet. Advances, 4 (8): 716 – 718.
122
9.
WILDEUS, S., 1999. Current conceps in synchronization of estrus: Sheep and goats. Proceedings of the
American Society of Animal Science.
Kontaktná adresa: Mgr. Jana Jankurová, Ústav fyziológie KNAHF, Univerzita
veterinárskeho lekárstva, Komenského 73, 041 81 Košice
Práca bola podporená grantom VEGA 1/0612/03 a projektom aplikovaného výskumu AV
4/0113/06
HISTOLOGICAL FINDINGS IN THE ADRENAL GLANDS FROM
SLAUGHTERED CATTLE
Jelinek, F., a* Konecny, R. b
Veterinary Histopathological Laboratory, Sojovicka 16, 197 00 Prague 9, Czech Republic
Department of Anatomy and Physiology of Farm Animals, Faculty of Agriculture, University of South Bohemia in
Ceske Budejovice, Czech Republic
a
b
* Correspoding author. Tel. +420 286 851 765; fax: +420 286 851 765.
E-mail address: [email protected]
Abstract
Adrenal glands from healthy slaughtered cattle, 13 bulls, 10 heifers and 10 cows, were
examined by means of histology and immunohistochemistry.. The samples were fixed in 10%
bufferd formalin, processed by common parafin technique and sections were stained with
haematoxylin and eosine. Presence of S100 protein, chromogranin A and synaptophysin was
studied in duplicate sections by means of immunoperoxidase method.
The following findings were recorded: Unequal thickness of connective capsule and nodular
formations of zona glomerulosa, eosinophilic granules in the cells of zona glomerulosa,
globoid arrangement of zona fasciculata, strips and nests of cortical tissue in the medulla,
mutual interlace of superficial and deep zones of the medulla, growth of cortical or medullary
cells into the wall
of blood vessels in the medulla and focal infiltrates composed of
lymphocytes or granulocytes. Cortical cells and noradrenergic cells in the medulla expressed
positivity for S100 protein. Both adrenergic and noradrenergic cells in the medulla were
positive for synaptophysin. Majority of the cells in the cortex and noradrenergic cells in the
medulla displayed positivity for chromogranin.
Keywords: Bovine, adrenal glands, histology, immunohistochemistry
Acknowledgement: This work was partially supported by a Grant Agency of the Czech
Republic, No. 523/03/H076 and by MSM Agency, No. 6007665806.
123
MINERÁLNY PROFIL KRÁLIKOV PO EXPERIMENTÁLNEM PODANÍ NIKLU
A ZINKU
MINERAL PROFILE IN RABBITS AFTER AN EXPERIMENTAL NICKEL AND ZINC
ADMINISTRATION
Kalafová, A., Kováčik, J., *Jurčík, R., Lukáč, N., Massányi, P., Capcarová,
M.,Schneidgenová, M., Čupka, P.
Katedra fyziológie živočíchov, Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, * Výskumný ústav živočíšnej výroby SCPV
v Nitre,
Abstract
In this study the effect of selected trace elements – nickel and zinc, on serum mineral
profile of rabbit was studies. Adult females (Californian and New Zeland white breed, n=25)
were fed ad libitum with different concentration of nickel and/or combination with zinc. In
first group (P1; n=5) animals were fed with granular feed mixture with addition of 17.5 g
NiCl2 per 100 kg of mixture and second group (P2; n=5) with 35 g NiCl2 per 100 kg of
mixture. In group P3 (n=5) animals were fed with mixture containing 17.5 g NiCl2 and 30 g
ZnCl2, and in group P4 (n=5) 35 g NiCl2 and 30 g ZnCl2 per 100 kg of mixture. All results
were compared with control group (n=5).
After experimental period (90 days) concentration of serum mineral elements (sodium,
potassium, chlorides, calcium, phosphorus, magnesium) was detected. The level of sodium
was similar in all groups reaching 142.70 – 159.80 mmol.l-1. The highest potassium level was
in group P3, but the differences were not significant (4.75 – 5.25 mmol.l-1). Average
concentration of chlorides was 106.34 – 110.45 mmol.l-1. Phosphorus level was very similar
in all groups (1.32 – 3.74 mmol.l-1) with the highest level in group P4. Calcium concentration
was lower in control group (3.12 ± 0.36 mmol.l-1) in comparison with other groups where the
values reached 3.23 – 3.49 mmol.l-1. During 90 days of experiment a significantly higher (P
<0.05) calcium concetration was detected in group P4 in comparison with control. The
average level of magnesium was in control group 1.03 mmol.l-1, P1-1.15 mmol.l-1, P2-1.13
mmol.l-1, P3-1.06 mmol.l-1 and in P4-1.17 mmol.l-1.
Úvod
V poslednom období sa stále väčšia pozornosť sústreďuje na štúdium prítomnosti
a vplyvu kontaminujúcich látok v potravinách. Chemizáciou poľnohospodárstva a nástupom
veľkovýroby v potravinárstve sa rozšírilo množstvo látok znečisťujúcich potraviny, ktoré
negatívne ovplyvňujú ľudský organizmus. Najnebezpečnejšie sú tie, ktoré majú toxické
124
účinky. K vstupu najdôležitejších toxických prvkov do potravinového reťazca prispieva celý
rad antropogénnych i prirodzených zdrojov (Naď et al., 2005).
Ťažké kovy sa do potravín dostávajú rôznymi cestami, podobne ako ďalšie
kontaminanty. Sú považované za chemické kontaminanty potravín, pričom prítomnosť
niektorých z nich v potravinách môže byť výsledkom bioakumulácie geneticky vlastnej
určitým rastlinným alebo živočíšnym organizmom (Kováč a Šuhaj, 1996).
Nikel je esenciálny ťažký prvok. Hlavnými zdrojmi niklu sú pitná voda a potraviny.
Fyziologická úloha niklu v organizme sa prejavuje v procesoch, kde pôsobí ako kofaktor
v metaloenzýmoch alebo metaloproteínoch, ktorý uľahčuje črevnú absorpciu železa (Fay et
al., 2003). Zlúčeniny dvojmocného niklu sú kancerogénne ako pre zvieratá, tak aj pre ľudí
(Prokeš et al., 2005).
Toxicita niklu vyvoláva veľký záujem kvôli rozšírenému výskytu niklu v prostredí.
Možným vysvetlením ako nikel spôsobuje poškodenie a smrť buniek, je peroxidácia lipidov a
tvorba reaktívnych foriem kyslíka. V experimentoch sa už po 1. hodine od aplikácie niklu
ľudským lymfocytom zistila zvýšená tvorba hydroxylových radikálov, čo hrá úlohu pri
oxidatívnom poškodení ľudských lymfocytov akútnym účinkom niklu (Chang-Yo et al.,
2003). Funakoshi et al. (1997) zistili, že príjem niklu hepatocytmi sa deje procesmi transportu
vápníkovými kanálmi. Nikel poškodzuje však aj ďalšie orgány – najmä obličky, pečeň, srdce
a pľúca (Das a Dasgupta, 2000) a kumuluje sa v pečeni a v obličkách (Koréneková et al.,
2000). Zaznamenali sa však aj účinky na pohlavný systém najmä samcov.
Zinok plní v organizme veľa rozličných funkcií. Patrí medzi esenciálne prvky pre
všetky druhy žijúcich organizmov . Nachádza sa v rôznych formách. Stimuluje a aktivizuje
približne 100 enzýmov. Zinok je nenahraditeľným prvkom nachádzajúci sa v každej bunke
(Sandstead, 1994; Solomons, 1998). Zohráva kľúčovú úlohu v procesoch aktivácie
transkripcie, proliferácie buniek, neovaskularizácie, apoptóze a vírusovej infekcii. Je známe,
že nedostatok zinku v bunkových kultúrach indukuje apoptózu v bunkách transformovaných
vírusom, bunky s príjmom zinku zostávajú neovplyvnené infektom. Zinkové metaloproteíny
sú užitočné preventíva pri prenosných vírusových ochoreniach (Fernandez–Pol, 2001).
Cieľom práce bolo stanoviť prípadné rozdielnosti v minerálnom profile králikov po
experimentálnom podávaní niklu resp. zinku.
125
Materiál a metodika
V experimente bolo použitých 25 samíc králika domáceho línie Kalifornský a
Novozélandský biely (SCPV – VUŽV, Nitra) o hmotnosti 3,5 – 4,0 kg vo veku 4 mesiace,
ktoré boli rozdelené do piatich skupín (P1, P2, P3, P4, K). V prvej skupine (P1) zvieratá (n=5)
dostávali nikel (NiCl2, Reachem) v dávke 17,5 g NiCl2.100 kg-1 (KZ) po dobu 90 dní. V
druhej skupine (P2) zvieratá (n=5) dostávali dvojnásobnú dávku niklu v rovnakom časovom
období. V ďalšej skupine (P3) sme podávali piatim samiciam nikel v dávke 17,5 g NiCl2.100
kg-1 v kombinácii so zinkom v koncentrácii 30 g ZnCl2 (ZnCl2, Reachem) po dobu 90 dní.
V poslednej pokusnej skupine (P4) zvieratá (n=5) prijímali krmivo s prímesou niklu (35 g
NiCl2.100 kg-1 KZ) a zinku (30 g ZnCl2.100 kg-1 KZ) po dobu 90 dní. Na porovnanie
výsledkov sme zostavili skupinu piatich samíc (K – kontrolná skupina), ktorá prijímala
rovnakú kŕmnu zmes (KKV1) ale bez pridania niklu a zinku. Všetky zvieratá boli umiestnené
v klimatizovaných
halách,
v jednopodlažných
individuálnych
kovových
klietkach
typizovaných rozmerov. Voda bola k dispozícii z automatických napájačiek. Zvieratám bola
v pravidelných mesačných intervaloch odoberaná krv z vena auricularis centralis. Zo vzoriek
krvi sme separovali krvné sérum centrifugáciou pri otáčkach 3000/min. po dobu 30 minút.
V krvnom sére sme stanovili sodík, draslík, chloridy, vápnik, fosfor, horčík. Minerálne
parametre boli zisťované použitím automatického klinického analyzátora Microlab 300 (Vital
Scientific, Holandsko).
Výsledky a diskusia
V pokuse sme sledovali a hodnotili koncentrácie minerálnych prvkov (sodíka,
draslíka, chloridov, vápnika, fosforu a horčíka) v krvnom sére králikov – samíc.
Množstvo sodíka sa v kontrolnej skupine pohybovalo v rozmedzí od 142,70 mmol.l-1
do159,80 mmol.l-1 s priemernou hodnotou 147,05 mmol.l-1. V pokusných skupinách sa
hodnoty pohybovali v rámci referenčných noriem (Merc & Co., 2006 ).
Najvyššia priemerná hodnota draslíka sa zistila v P3 skupine (17,5 g NiCl2 a 30 g
ZnCl2). V ostatných skupinách boli hodnoty nižšie a pohybovali sa v rámci referenčných
noriem.
Pri porovnávaní priemerných hladín chloridov, v kontrolnej skupine a pokusných
skupinách bola v rozmedzí od 106,34 mmol.l-1 do 110,45 mmol.l-1.
Priemerná hladina vápnika bola najnižšia v kontrolnej skupine 3,12 mmol.l-1,
v ostatných skupinách sa pohybovala od 3,23 mmol.l-1 do 3,49 mmol.l-1.
126
Obsah fosforu v skupine bez prídavku niklu bol v rozmedzí od 1,32 mmol.l-1 - 3,74
mmol.l-1. Najvyššia priemerná hodnota bola nameraná v skupine P4 (2,30 mmol.l-1).
Množstvo horčíka v krvnom sére králikov v jednotlivých skupinách bol K - 1,03
mmol.l-1, P1 - 1,15 mmol.l-1, P2 - 1,13 mmol.l-1, P3 - 1,06 mmol.l-1, P4 - 1,17 mmol.l-1.
Tab. Základné štatistické ukazovatele minerálneho profilu králikov (x. ± SD)
K
Na
(mmol.l-1)
K
(mmol.l-1)
Cl
(mmol.l-1)
Ca
(mmol.l-1)
P
(mmol.l-1)
Mg
(mmol.l-1)
P1
P2
P3
P4
(17,5g NiCl2)
(35 g NiCl2)
(17,5g NiCl2 a 30g ZnCl2)
(35 g NiCl2 a 30 g ZnCl2)
147,05±6,68
145,87±2,96
147,86±5,99
145,80±3,45
145,66±4,79
4,76±0,46
4,96±0,61
4,75±0,48
5,25±0,31
5,12±0,39
106,98±5,78
107,55±5,47
108,7±4,93
110,45±3,73
106,34±3,87
3,12±0,36
3,23±0,39
3,25±0,33
3,29±0,47
3,49±0,37*
1,95±0,62
1,89±0,35
2,01±0,45
2,01±0,58
2,30±0,74
1,03±0,17
1,15±0,35
1,13±0,39
1,06±0,25
1,17±0,33
* P<0,05 (K vs. P4)
Po troch mesiacoch (90 dňoch) pokusu sme zistili štatisticky preukazný rozdiel(P
<0,05) v sérovej koncentrácii vápnika medzi kontrolnou skupinou a skupinou P4. V ostatných
ukazovateľoch minerálneho profile (sodík, draslík, chloridy, fosfor, horčík) neboli zistené
štatisticky preukazné rozdiely medzi skupinami.
Korelačná analýza nám ukázala vysokú negatívnu koreláciu medzi draslíkom a
chloridmi v skupine P3 (r = - 0,81), vysokú pozitívnu koreláciu (r = 0,79) v skupine P3 medzi
fosforom a chloridmi. V skupine P3 vysokú negatívnu koreláciu (r = - 0,86) medzi sodíkom a
vápnikom. Vysoká pozitívna korelácia bola zistená v skupine P2 medzi vápnikom a draslíkom
(r = 0,71), v skupineP1 medzi fosforom a chloridmi (r = 0,70), v kontrolnej skupine medzi
horčíkom a chloridmi (r = 0,72) a medzi sodíkom a chloridmi (r = 0,83) v skupine P4.
Výsledky nášho pokusu poukazujú na nesignifikantné rozdiely pri hodnotení sodíka,
draslíka, chloridov, fosforu a horčíka medzi kontrolnou skupinou a pokusnými skupinami.
Signifikantné zmeny (P<0,05) boli zistené pri hladine vápnika medzi kontrolnou skupinou a
skupinou P4. Toman et al. (1995) pri podávaní nízkych dávok kadmia dospeli k podobným
127
výsledkom. Pri podávaní kadmia do pitnej vody bažantov (Toman et al., 2004) zistili
štatisticky preukazný pokles hladiny fosforu, vápnika, sodíka, horčíka v krvnej plazme, zatiaľ
čo hladina draslíka sa mierne zvýšila v pokusnej skupine. Massányi et al. (2001) po
experimentálnom podaní kadmia pri porovnaní priemerných hladín horčíka, chloridov, sodíka
a draslíka z krvi králikov nezistili žiadne signifikantné rozdiely.
Záver
Stopové prvky sú dôležité v nízkych koncentráciách pre rastliny a niektoré sú dôležité
aj živočíchy. Rizikové stopové prvky, ku ktorým patrí aj nikel a zinok, sú často považované
za kontaminanty. V priebehu pokusu sme sledovali vplyv samotného niklu a niklu
v kombinácii so zinkom na ukazovatele minerálneho profilu. Pri porovnávaní hladiny
minerálnych prvkov sodíka, draslíka, chloridov, fosforu a horčíka sme nezistili štatisticky
preukazné rozdiely medzi skupinami. Zistili sme štatisticky preukazný rozdiel (P<0,05)
pri hladine vápnika medzi kontrolnou a pokusnou skupinou P4 (35 g NiCl2 a 30 g ZnCl2 .100
kg-1 KZ).
Práca bola podporená projektami APVV-0299-06 a VEGA 1/2417/05.
Literatúra
DAS,K. K., DASGUPTA, S. 2000. Effect of nickel on testicular nucleic acid contretrations of rats on protein
restriction. In Biol. Trace Elem. Res., roč.73, 2000, č.2,s. 175-180.
FAY, M., WILBUR, S., ABADIN, H., a kol. 2003. Toxicological profile for nickel. In ATSDR. U. S.
Department of the health and human services. 2003, p. 39.
FERNANDEZ-POL, J. A., HAMILTON, P. D. AND KLOS, D. J. 2001. Essential viral and cellular and iron
containing metalloproteins as targets for novel antiviral and anticancer agents: implications for prevention and
therapy of viral diseases and cancer. In Anti. Cancer Res., 2001, vol. 21, p. 931–957
FUNAKOSHI, T:, INOUE, T., SHIMADA, H., et al. 1997. The machanism of nickel uptake by rat primary
hepatocyte cultures: role of calcium channels. In Toxicology, vol. 124, 1997, no.1, p. 21-26.
CHANG, Y. CH., YI-FEN, W., YU-HWAN, L., SHU-FANG Y. 2003. Nickel-induced oxidative stress and
effect of antioxidants in human lymphocytes. In Arch. Toxicol., roč. 77, 2003, č. 3, s. 123-130.
KORÉNEKOVÁ, B., SKALICKÁ, M., NAĎ, P., MAKÓOVÁ, Z. 2000. In Mutual relationship of Cd and Zn
after application of sodium humate in broilers . 2000. In Biologia (Bratislava), roč. 55, 2000, č. 8, 59-62.
KOVÁČ, M., SUHAJ, M. 1996. Prírodné toxikanty a antinutričné látky v potravinách,
VÚP, Bratislava, 1996, s. 140.
MASSANYI, P., TOMAN, R., KOVÁČIK, J. 2001. Zmeny niektorých parametrov minerálneho, energetického,
enzymatického a dusíkového profilu a kumulácia kadmia u králikov po experimentálním podaní kadmia. In
Beseda I. et al.: Aktuálne problémy kontaminácie životného prostredia z hradiska toxikologie a ekotoxikológie.
FEE TU Zvolen,2 s. 197 . ISBN 80-2280980-2.
Merc & Co., 2006 ., Inc. Whitehouse Station, NJ USA, All Rights Reserved. Publisher in educational pertnership
with Merial ttd.)
NAĎ, P., SKALICKÁ, M., KORENEKOVÁ, B., MARŠALKOVÁ, S., PISTL, J., ŠUTIAKOVÁ, I.,
CIGÁNKOVÁ, V. 2005. Eliminácia účinku ťažkých kovov na kvalitu živočišných produktov a zdravie
hospodárských zvierat . Kvalita, bezpečnosť a funkčnosť primárnych potravinových zdrojov, Piešťany: VÚRV,
2005, s. 59-61. ISBN 80-8879-41-7.
PROKEŠ, J. et al. Základy toxikologie. Praha: Galen, 2005. ISBN 80-7262-301-X. s. 247.
SANDSTEAD, H. H.1994. Understanding zinc: recent observations and interpretations. In J. Lab. Clin. Med.,
vol. 124, 1994, p. 322–327.
128
SOLOMONS, N. W., Mild human zinc deficiency produces an imbalance between cell-mediated and humoral
immunity. In Nutr. Rev., vol. 56, 1998, p. 27–28.
TOMAN, R., SLAMEČKA, J., MASSANYI, P., ŠEBOVÁ, K., TATARUCH, F., JURČÍK, R.1995. Vplyv
opakovaného podávania nízkých dávok Cd 2+ na spermiogenezu, biochemické zložky krvnej plazmy a jeho
kumuláciu v organizme zajaca poľného. In Folia Venatoria, 1995,č. 25, s.77-82.
TOMAN, R., HLUCHÝ, S., MASSÁNYI, P., BÁBIKOVÁ, L.2004. Zmeny koncentrácie minerálních látok
krvnej plazmy bažantov po podaní kadmia v pitnej vode. In Acta fytotechnica et zootechnica.2004, č.4, s. 90-92.
ÚLOHA VYBRANÝCH BIOLOGICKY AKTÍVNYCH LÁTOK V POHLAVNOM
DOSPIEVANÍ PRASNIČIEK
THE ROLE OF SOME BIOLOGICAL ACTIVE SUBSTANCES IN REGULATION OF
PORCINE SEXUAL MATURATION
Kolesárová A., Sirotkin A.1, Capcarová M., Massányi, P., Lukáč N., Kováčik J.
Katedra fyziológie živočíchov, Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, 2Ústav genetiky a reprodukcie HZ,
Výskumný ústav živočíšnej výroby SCPV v Nitre, E-mail: [email protected]
Abstract
The aim of our experiments was to study the influence of level of progesterone (P4),
insulin-like growth factor I (IGF-I), IGF-binding proteins-3 (IGFBP-3) in blood plasma and
the release of these substances by porcine ovarian granulosa cells cultured in vitro on sexual
maturation. Besides the role of IGF-I, oxytocin (OT), cAMP and intracellular messengers in
the control of ovarian function and sexual maturation was studied in pigs. Gilts were divided
in two groups according to the sexual maturation (sexually immature gilts and sexually
mature gilts).
We determined the basal secretions of substances by granulosa cells, isolated from
immature and preovulatory ovaries, together with the effect of treatment by IGF-I (10 ng/ml),
OT (100 ng/ml and dbcAMP (10 µg/ml) during culture. The following products were assayed
in plasma, cell culture medium and cells using RIA, Western-immunoblotting and
immunocytochemistry: P4, IGF-I, IGFBP-3, IGFBP-4, protein kinases A (PKA) and G (PKG),
phosphotyrosine (PhT), ERK1,2 related MAP kinase, CREB1 and proliferation-associated
(PCNA, CDC2/p34, cyclin B1), apoptotic (Bax) and antiapoptotic (Bcl-2) peptides. It was
observed, that sexual maturation of gilts is associated with an increase in the production of P4,
IGF-I, IGFBP-3 in both blood plasma. There were also increases in content of IGFBP-3 and
the expression of PCNA, CDC2/p34, Bcl-2, Bax, PKA, CREB1, PhT and decreases in the
presence of IGFBP-4, cyclin B1, PKG and ERK1,2 in cultured granulosa cells. In both
groups of animals, dbcAMP increased the secretion of P4 and IGF-I and the expression of
ERK1,2 and PKG and decreased the content of IGFBP-3, IGFBP-4 and the expression of
PKA in cultured granulosa cells. In immature animals, dbcAMP stimulated PCNA,
129
CDC2/p34 and inhibited cyclin B1, Bcl-2, Bax, CREB1 and PhT, whilst in mature animals
effect was opposite. In both groups, IGF-I increased the content of P4, IGFBP-3 and the
expression of PCNA but decreased the expression of CDC2/p34 and PhT. IGF-I induced the
production of IGFBP-4 and the expression of Bax, PKA and CREB1 in immature gilts but
had the opposite effect in mature animals. In both groups, OT increased the content of IGF-I,
IGFBP-3, IGFBP-4 and the expression of PCNA but decreased the expression of Bcl-2, PKA,
PhT and ERK1,2. In immature gilts, OT increased the expression of CDC2/p34, Bax, CREB1,
PKG and decreased P4 secretion. It had the opposite effect in mature animals.
These data demonstrate that in pigs IGF-I, OT, cAMP, IGFBP-3 and IGFBP-4 control the
proliferation and apoptosis of ovarian cell, the secretion of ovarian substances and sexual
maturation. They also indicate differences in contents of P4, IGF-I, IGFBP-3 and in the
expression of IGFBP-4, PCNA, CDC2/p34, cyclin B1, Bax, Bcl-2, PKA, CREB1, PKG, PhT
and ERK1,2 produced by granulosa cells during sexual maturation in gilts. These findings
suggest the potential application of OT, IGF-I and cAMP preparation for regulation of porcine
gonadal functions.
KVALITA KRAVSKÉHO MLIEKA A METABOLICKÉ PORUCHY DOJNÍC
DAIRY COW MILK QUALITY AND METABOLIC DISORDERS
Kováčik,J., Michalcová,A., Massányi,P., Kolesárová A.
Slovenská poľnohospodárska univerzita, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Tr. A. Hlinku 2, 949 76 Nitra
Abstract
The aim of our experiments was to study technological quality of milk in relation to
parameters of internal milieu in dairy cows. We discovered that in milk of dairy cows with
metabolically malfunctions was detected higher level of urea, lower level of calcium and fall
of titrate acidity. From all studied biochemical parameters (urea, total lipids, total
protein,calcium, phosphor) the higst negative effect of blood urea on determined parameters
of technological quality of milk is reported. Significant dependence between parameters of
blood and milk were registered in the group with metabolically malfunctions of ketosis
between blood urea and milk urea, urea calcium and milk calcium, calcium and glucose. In
the group with metabolically malfunctions of asidosis were detected significant correlation
between total lipids in blood and level of fat in milk.
Key words: internal milieu, milk, blood, urea, total lipids, total protein,calcium,
130
Abstrakt
V práci sa zisťovali vzájomné interakcie medzi vybranými ukazovateľmi krvného séra
dojníc s metabolickými poruchami a kvalitatívnymi ukazovateľmi mlieka.
V mlieku dojníc
s metabolickými poruchami bol zistený vyšší obsah močoviny
(najvyšší u dojníc s poruchami acidobázickej rovnováhy), nižší obsah vápnika a pokles
titračnej kyslosti. Z hodnotených ukazovateľov bol v krvnom sére ketóznych dojníc
zaznamenaný veľmi nízky obsah močoviny so všetkými negatívnymi prejavmi na
metabolizmus dusíka v bachore a následne v mliečnej žľaze.
Signifikantné závislosti medzi ukazovateľmi v krvi a v mlieku boli zistené v skupine
ketóznych dojníc medzi močovinou v krvi a mlieku , vápnikom v krvi a v mlieku , vápnikom
a glukózou. V skupine dojníc s acidobázickými poruchami bola zistená štatisticky preukazná
korelácia medzi celkovými lipidami v krvi a obsahom tuku v mlieku.
Kľúčové slová : metabolické poruchy, mlieko, acidobázické poruchy, ketózy, močovina
Úvod
Kvalita kravského mlieka a jeho zloženie je ovplyvňovaná viacerými činiteľmi. Jedným z
rozhodujúcich exogénnych faktorov je výživa dojníc, ktorou možno podľa mnohých autorov,
(Kirst, Jakobi, 2002; Kološta et al., 2002a; Kirchnerová et al., 2002; Kološta, 2001; Kováčik,
1999; a i.) ovplyvniť produkciu a kvalitu mlieka. Vysokoúžitkové dojnice, vyšľachtené na
vysokú produkciu mlieka, sú náročné na výživu a prípadné nedostatky vo výžive sa u nich
výrazne prejavujú v znížení produkcie mlieka, ale zároveň i v zhoršení jeho technologických
vlastností (Kirchnerová et al., 2002; Kološta et al., 2002a; Hanuš et al., 2002; Kováčik,
1999; a i.).
Nedostatky vo výžive dojníc sa odrážajú v mnohých biochemických a fyziologických
procesoch a v dôsledku narušenia vzťahu medzi tzv. metabolickou kapacitou zvieraťa
a požiadavkami na produkciu vznikajú metabolické poruchy (Kováčik, 1999).
K ekonomicky najzávažnejším ochoreniam vysokoúžitkových dojníc patria ochorenia
acidobázickej rovnováhy a poruchy energetického metabolizmu.
Funkčná schopnosť mliečnej žľazy je v priamej korelácii s celkovým zdravotným stavom
dojníc a v jednotlivých zložkách mlieka sa premieta úroveň celkového metabolizmu ( Kirst,
Jakobi, 2002).
Cieľom práce bolo sledovať vplyv metabolických porúch dojníc na zloženie a kvalitu
kravského mlieka mlieka.
131
Materiál a metódy
Na metabolický profilový test bolo vo vybranom poľnohospodárskom podniku vyšetrených
30 dojníc a na základe výsledkov boli dojnice rozdelené do 3 skupín:
1. skupina – ketózne dojnice; 2. skupina – dojnice s acidobázickými poruchami; 3. skupina –
zdravé dojnice.
Odber krvi pre biochemické analýzy sa robil vždy 2 hodiny po rannom kŕmení punkciou vena
jugularis. V krvnom sére bola stanovená močovina, celkové lipidy, celkové bielkoviny,
glukóza a vápnik.
V analyzovaných vzorkách mlieka sa stanovovali : tuk, bielkoviny, laktóza, BTS – na prístroji
MilkoScan podľa STN 57 0536; PSB – prístrojom Fossomatic podľa STN 57 0532; vápnik
(Ca) – komplexometrickou titráciou podľa Cvaka, Peterkovej a Černej (1992); močovina –
spektrofotometricky Bio – La – testom; titračná kyslosť – titračne podľa Soxhlet - Henkela
podľa STN 57 0530; syriteľnosť – podľa Kažimíra a Gemeriho (1993); kysacia schopnosť –
podľa STN 57 0534; termostabilita – podľa Gajdůška (1997).
Získané výsledky sa vyhodnotili programom MS EXCEL a STATGRAPHIC Plus 5.1.
Výsledky a diskusia
Ukazovatele kvality mlieka
V priemerných hodnotách základných ukazovateľov zloženia mlieka, neboli medzi
jednotlivými skupinami dojníc zistené štatisticky preukazné rozdiely (tab. 1). V obidvoch
skupinách dojníc s metabolickými poruchami (1. a 2. skupina) boli zistené zhoršené
technologické vlastnosti mlieka poukazujúce až na nevhodnosť mlieka na jeho spracovanie.
Priemerné hodnoty ukazovateľov zloženia a vlastností mlieka
Tabuľka 1
Ukazovateľ
Skupiny dojníc
1.
2.
3.
-1
Tuk (g.100g )
3,746
4,987
4,098
Bielkoviny (g.100g-1)
2,989
2,997
3,09
Laktóza (g.100g-1)
5,086
4,663
4,973
BTS (g.100g-1)
8,791
8,41
8,798
PSB (tis . ml-1)
128,2
158,86
444,33
Ca (mg . 100ml-1)
116,38
115,86
128,92
-1
Močovina (mmol.l )
5,378
5,862
5,005
Titračná kyslosť (o SH)
6,34
6,37
6,667
Syriteľnosť (sek)
159,6
227,86
181,667
Kysacia schopnosť (o SH)
19,16c
22,83
25,183a
Termostabilita (ml 95% liehu)
1,72
1,88
2,01
a, b, c
Priemery označené rozličnými písmenami v tom istom riadku sú rozdielne pri P< 0,05
132
Deficit príjmu energie v kŕmnej dávke dojníc s vybranými metabolickými poruchami sa
prejavil i v nepreukazne nižšom obsahu laktózy a BTS (tab.1). Súčasne bol v mlieku týchto
dojníc zaznamenaný zvýšený obsah močoviny (u dojníc s poruchami acidobázickej
rovnováhy o 1,862mmol.l-1 ) nad referenčnú hodnotu uvádzanú Slaninom (1992).
V súlade s výsledkami Kološtu (2004) bol zistený najnižší priemerný obsah Ca a najvyšší
obsah močoviny v mlieku v 2. skupine dojníc – s poruchami acidobázickej rovnováhy..
V dôsledku
zvýšeného
obsahu
močoviny
a zníženému
obsahu
bielkovín,
ako
aj
predpokladaným zmenám v ich zložení, ako ich uvádza Kološta (2004), bol zaznamenaný
i nepreukazný pokles titračnej kyslosti mlieka, pričom jej hodnota sa pohybovala na dolnej
hranici rozpätia štandardných hodnôt.
V obidvoch skupinách dojníc s metabolickými poruchami boli tiež zistené signifikantne
zhoršené technologické vlastnosti mlieka
a to: kysacia schopnosť u obidvoch skupín a
syriteľnosť u 2. skupiny dojníc (tab. 1), čo zodpovedá poznatkom Kirchnerovej et al. (2002),
Kološtu (2002a,b) a Hanuša et al. (2002). Analýzou komponentov sa zistilo, že až na 78,%
boli hodnoty kysacej schopnosti ovplyvnené bielkovinami a na 21, % obsahom laktózy.
Zmenené zloženie bielkovín u obidvoch skupín dojníc s metabolickými poruchami sa
negatívne prejavilo na nízkej kysacej schopnosti mlieka u týchto skupín na čo poukazujú i
Kološta, 2004; Kirchnerová et al., 2002; Hanuš et al., 2002, Pažmová, 1992 a i.
Ukazovatele vnútorného prostredia dojníc
Hodnoty ukazovateľov krvného profilu vnútorného prostredia sledovaných dojníc (tab.2) sa
pohybovali v rozmedzí referenčného rozpätia uvádzaných Slaninom et al. (1992) okrem
priemernej hodnoty močoviny u ketóznych dojníc. Až u 50% zo všetkých analyzovaných
vzoriek krvi sledovaných dojníc bola zistená zvýšená hladina glukózy.
Poruchy energetického metabolizmu ketóznych dojníc sa premietajú aj do úrovne hodnôt
močoviny v krvi, ktoré ani v jednej z hodnotených vzoriek nedosiahli minimum referenčného
rozpätia (3, 3 – 6,6 mmol.l-1) podľa Slaninu et al. (1992). Podľa Davidsona et al. (2003)
a Reista et al. (2002) sa z hľadiska výživy znížené hodnoty močoviny v krvnom sére pozorujú
pri nedostatku NL. Disproporcia, ktorá vznikla medzi metabolickou kapacitou dojníc a ich
požiadavkami na produkciu mohla narušiť procesy bachorovej fermentácie ako na to
poukazujú Willige (2002), Hanuš et al. (2002) a (Kováčik, 1999). Poruchy bachorovej
fermentácie sa prejavujú zníženou tvorbou prekurzorov i pre produkciu bielkovín mlieka, čo
sa prejavilo v najnižšom obsahu bielkovín mlieka (x =2,989 g.100g-1) u 1. skupiny dojníc.
Tieto výsledky sú v súlade s tvrdeniami Vajdu et al. (2003) a Hofírka et al. (2002).
133
Priemerné hodnoty ukazovateľov krvného profilu
Tabuľka 2:
Skupiny dojníc
1.
2.
3.
-1
ab
močovina (mmol.l )
3,007
4,58
4,72ac
-1
celkové lipidy (g.l )
4,448
4,771
4,332
-1
celkové bielkoviny (g.l )
78,74
77,525
82,84ab
-1
glukóza (mmol.l )
3,366
3,397
3,728
-1
Ca (mmol.l )
2,43
2,41
2,389
ab
Priemery označené rozličnými písmenami v tom istom riadku sú rozdielne pri P< 0,05
ac
Priemery označené rozličnými písmenami v tom istom riadku sú rozdielne pri P< 0,01
Ukazovateľ
Signifikantné závislosti medzi ukazovateľmi v krvi a v mlieku boli zistené v skupine
ketóznych dojníc medzi močovinou v krvi a mlieku (r = -0,694; P<0,05 ), vápnikom v krvi
a mlieku (r = -0,653; P<0,05 ), vápnikom a glukózou (r = -0,648; P<0,05 ). V skupine dojníc
s acidobázickými poruchami bola zistená štatisticky preukazná korelácia medzi celkovými
lipidami v krvi a obsahom tuku v mlieku (r = -0,879; P<0,05 ).
Medzi kysacou schopnosťou mlieka a močovinou v krvi bola na rozdiel od výsledkov Kološtu
(2004) zistená negatívna nepreukazná závislosť (r = -0,318; P>0,05) u skupiny zdravých
dojníc. U obidvoch skupín dojníc s metabolickými poruchami bola táto závislosť pozitívna
a u dojníc s acidobázickými potruchami štatisticky preukazná (r = 0,747; P<0,05). Vysoká
pozitívna korelácia bola zistená aj medzi kysacou schopnosťou a hodnotami glukózy krvi (r =
0,909; P<0,05) u skupiny zdravých dojníc .
Záver
V mlieku dojníc
s metabolickými poruchami bol zistený vyšší obsah močoviny
(najvyšší u dojníc s poruchami acidobázickej rovnováhy), nižší obsah vápnika a pokles
titračnej kyslosti. Z hodnotených ukazovateľov
v krvnom sére bol u všetkých ketóznych
dojníc zaznamenaný veľmi nízky obsah močoviny so všetkými negatívnymi prejavmi na
metabolizmus dusíka v bachore a následne v mliečnej žľaze.
Signifikantné závislosti medzi ukazovateľmi v krvi a v mlieku boli zistené v skupine
ketóznych dojníc medzi močovinou v krvi a mlieku , vápnikom v krvi a mlieku , vápnikom
a glukózou. V skupine dojníc s acidobázickými poruchami bola zistená štatisticky preukazná
korelácia medzi celkovými lipidami v krvi a obsahom tuku v mlieku .
134
Pretože poruchy energeticko-dusíkového metabolizmu patria medzi najčastejšie
metabolické problémy dojníc ovplyvňujúce aj zloženie a technologickú kvalitu mlieka, je
potrebné venovať výberu ukazovateľov a štúdiu ich vzájomných interakcií náležitú pozornosť
Literatúra
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
Davidsona et al. 2003. Effects of Amounts and Degradability of Dietary Protein on Lactation, Nitrogen
Utilization and Excretion in Early Lactation Holstein Cos. In: J. of Dairy Sci., roč. 86, 2003, č. 5, s.
1681 - 1689.
Hanuš, O. et al. 2002. Ketózy, vážný problém vysoce dojných stád. In: Náš chov, roč. 62, 2002, s. 27 –
29.
Hofírek, B. - Pechová, A. - Pavlata, L. - Dvořák, R. 2002. Klinická kontrola výživy, bachorové
fermentace a konverze živín v chovu dojníc. In: Veterinářství, roč. 52, 2002, č.10, s. 403 - 410.
Kirchnerová, K. et al. 2002. Kvalitatívne a technologické vlastnosti mlieka v závislosti od intenzity
výživy dojníc počas prípravy na laktáciu. In: Výživa a potraviny pre 3. tisícročie, 2002, s. 199 – 202.
Kirst, E. - Jakobi, U. 2002. Harnstoff - und acetongehalt der milch - Indikatoren zur beurteilung der
futterung laktierender rinder. In: Practische Tierarzt, roč. 83, 2002, č. 3, s. 362 - 372.
Kološta, M. 2001. Technologická kvalita mlieka dojníc na pastve. In: Mliekárstvo, roč.32, 2001, č. 1, s.
4 – 8 príloha.
Kološta, M. et al. 2002a. Dynamika močoviny v krvnom sére, moči a mlieku dojníc na pastve. In:
Mliekárstvo, roč. 33, 2002a, č. 2, s. 39 – 42.
Kološta, M. 2004. Vybrané ukazovatele kvality mlieka a vnútorného prostredia dojníc na pastve.
Autoreferát dizertačnej práce. Nitra: SPU, 2004. 31 s.
Kováčik, J. 1999. Fyziologické aspekty výživy dojníc vo vzťahu k produkcii a kvalite mlieka. In: Nové
systémy hodnotenia kvality surového kravského mlieka.1999, s. 41 – 45.
Pažmová, J. 1992. Vplyv výživy dojníc na zloženie a vlastnosti mlieka. Kandidátská dizertačná práca.
Bratislava: VÚP, 1992. 178s.
Reista et al. 2002. Estimation of Energy Balance at the Individual and Herd Level Using Blood and
Milk Traits in High-Yielding Dairy Cows. In: J. of Dairy Sci., roč. 85, 2002, č. 12, s. 3314 - 3327.
Slanina, L. et al. 1992. Metabolický profil hovädzieho dobytka vo vzťahu k zdraviu a produkcii.
Bratislava: ŠVS SR, 1992, 115s.
Vajda, V. - Mitrík, T. - Maskaľová, I. - Bachratý, M. 2003. Nutričná regulácia bachorových funkcií
(II.časť). In: Slovenský chov, roč. 8, 2003, č. 4, s. 32 - 33.
Willige, B. 2002. Tranzitná výživa. In: Slovenský chov, roč. 7, 2002, č. 2, s. 45 – 46.
IN VITRO TOXICITA NIKLU NA GRANULÓZNE BUNKY OŠÍPANEJ
IN VITRO NICKEL TOXICITY ON PORCINE GRANULOSA CELLS
Kročková, J.1, Massányi, P.1, Sirotkin, A.2, Pivko, J.1,2, Benčo, A3
1Katedra
fyziológie živočíchov, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, SPU, Nitra
centrum poľnohospodárskeho výskumu, Nitra
3Katedra zoológie a antropológie, Fakulta prírodných vied, UKF, Nitra
2Slovenské
Abstract
Aim: To study effects of nickel (NiCl2) on production of sexual hormone (progesterone),
ultrastructure and cell apoptosis. Methods: Granulosa cells were aspirated using a 2 ml
syringe and separated from the follicular fluid by centrifugation. The medium was replaced
with new medium of the same composition containing, in addition, NiCl2 (Sigma, St. Louis,
MO) in required concentrations (62,5; 125; 250; 500 and 1000 µM.l-1). Control medium
135
contained no NiCl2. Quantification of progesterone was performed after 48 h of culture
directly from aliquots of the media from control and treated porcine granulosa cells by RIA.
Quantification of apoptosis cells was performed using Tunel assay. From each experiment 20
electron microscopy sections from three different replicates were examined. Results: The
highest production of progesterone was found in control group without NiCl2. After NiCl2
administration, there was a decrease of progesterone production.The lowest progesterone
production was after addition of 1000 µM NiCl2. Tunel assay detected higher occurrence of
apoptosis after NiCl2 administration. An increased apoptosis in each of experimental groups
apart from concentration of 250 µM NiCl2 with the lowest percentage of apoptosis cells
(42%) was detected. The highest percentage of apoptotic cells was found after administration
of 1000 µM NiCl2 (79 %). Also the ultrastructure of granulosa cells was altered after NiCl2
administration. We observed higher frequency of euchromatin in nuclei, lipid drops,
microfilaments and vacuoles in cytoplasm after NiCl2 treatment. There was also relatively
lower frequency of mitochondria and smooth endoplasmic reticulum. Conclusion: Our
findings suggest a negative effect of NiCl2 on steroidogenesis as well as on the ultrastructure
and death of granulosa cells.
Úvod
Dôležitým ekologickým fenoménom najmä dnešnej doby je skutočnosť, že človek
musí koexistovať s nadmerným množstvom chemických látok od začiatku embryonálneho
vývoja až po smrť. S rastúcim stupňom znečistenia životného prostredia sa záujem o dôsledky
pôsobenia toxických látok na živé systémy zvyšuje. Medzi tieto látky, ktorých je veľké
množstvo, patria aj ťažké kovy. Mnohé sú toxické pre človeka, zvieratá ale aj rastliny. Sú
schopné sa v organizme ukladať a akumulovať, čo zvyšuje ich toxický účinok. Hlavným
zdrojom znečistenia recipientov kovmi sú odpadové vody z ťažby a spracovania rúd, hutí,
z povrchovej úpravy kovov, fotografického, textilného priemyslu a iných odvetví. Ďalším
zdrojom môžu byť atmosferické zrážky znečistené exhaláciami vznikajúcimi pri spaľovaní
fosílnych palív a vyfukovanými plynmi motorových vozidiel. Medzi ťažké kovy patrí aj nikel.
V organizme sa podieľa na zabezpečení stability bunkových membrán a ovplyvňuje
produkciu niektorých hormónov. Je tiež kofaktorom rôznych mikrobiálnych enzýmov.
Pohlavné orgány slúžia ako veľmi citlivý barometer výskytu rizikových prvkov v životnom
prostredí. U samíc sa účinky ťažkých kovov najčastejšie prejavujú vo zvýšenej atrézii
folikulov vo vaječníkoch ako aj zmenami stavby endometria maternice. Mnohé ťažké kovy
výrazne negatívne ovplyvňujú steroidogenézu.
136
Materiál a metodika
Odber a príprava vzoriek: Vaječníky sme získali od pubertálnych samíc ošípanej
plemena Slovenská biela ušľachtilá vo veku 7 mesiacov, tesne na začiatku estrálneho cyklu
(vizuálne vyšetrenie stavu vaječníkov). Vaječníky sme uložili do sklenenej nádoby
obsahujúcej studený fyziologický roztok, následne sme ich transportovali do laboratória
v termotaške na ľadových vankúšikoch. Ihneď sme ich opláchli (1 min.) v 70% roztoku liehu
a potom dva krát v sterilnom fyziologickom roztoku. Granulózne bunky sme izolovali z dobre
prekrvených folikulov stredných rozmerov ( 3 – 5 mm v diametre) pomocou aspirácie
folikulárnej tekutiny so striekačkou a tenkou ihlou pod laminárnym boxom. Zhromaždenú
folikulárnu tekutinu v sterilnej skúmavke sme centrifugovali (500g 2000 rpm 10 min pri 4°C).
Odstredené folikulárne bunky sme premyli v médiom Hepes–buffered DME/F12.
Centrifugácia, obnovenie média a pipetovanie boli opakované trikrát. Počet buniek sme
stanovili pomocou hemocytometra a koncentráciu buniek sme upravili na 106.l-1 ml
kultivačného média TCM–199, ktoré bolo doplnené s 10% bovinného fetálneho séra a 50 mg
antibiotika gentamicin na liter média. Takto upravenú bunkovú suspenziu sme rozpipetovali
(2 ml) do kultivačných platničiek. Následne sme bunky kultivovali v CO2 inkubátore pri
37°C, v 5% CO2 vo zvlhčenom vzduchu
počas 3 – 4 dní, kým sa nevytvorila súvislá
monovrstva buniek. Životaschopnosť buniek (determinovaná farbením s Trypánovou modrou)
bola 75 – 78%. Médium sme potom nahradili novým médiom s rovnakým zložením
a s prídavkom NiCl2 (Sigma, St. Louis, MO) v požadovaných koncentráciách 62, 125, 250,
500 a 1000 µM. Kontrolné médium neobsahovalo NiCl2. NiCl2 (Sigma, St. Louis, MO) sme
rozpustili v kultivačnom médiu bezprostredne pred jeho použitím. Pre hodnotenie
ultraštruktúry buniek sme po 48-hodinovej kultivácii s niklom alebo bez neho separovali
bunky, fixovali v 2% paraformaldehyde a 2,5% glutaraldehyde v 0,2 M fosfátovom bufri pri
4°C 2 hodiny, dehydrovali v zostupnom rade roztoku etanolu a zaliali do epoxydovej živice.
Ultratenké rezy sme zafarbili s acetát uranylom a citrátom olovnatým a pozorovali použitím
JEM – 100 CX-II (JOEL, Japan). Z každého pokusu sme pozorovali 20 elektrónových
mikroskopických
rezov
z minimálne
troch
rozdielnych
opakovaní.
Hodnotenie
steroidogenézy: Kvantifikáciu progesterónu a 17-ß-estradiolu sme prevádzali priamo
z alikvotného množstva média z kontroly a ošetrovaných buniek pomocou rádioimunometódy
(RIA). V pokuse sme urobili 10 opakovaných ošetrení. Steroidy sme merali v slepej kontrole
(médium kultivované bez buniek), v kontrole (médium kultivované s bunkami bez NiCl2)
a v experimentálnych skupinách (médium kultivované s bunkami a s NiCl2). Vypočítaním
obsahov hormónov produkovaných bunkami obsahy endogénnych hormónov (slepá kontrola)
137
boli vždy odrátané z obsahov celkových steroidov meraných v médiu kultivovaných buniek
k vylúčeniu vplyvu endogénnych steroidov na stanovenie sekrécie steroidov kultivovanými
bunkami.
Minimálne detekčné limity pre progesterón boli 0,5 ± 0,02 ng.ml-1 a variácie intra- a intermetód boli 5,6 % a 7,9 %. Bol použitý izotopový (1,2,6,7-3H)-progesterón so špecifickou
aktivitou 3,26 TBq.mmol-1 a protilátky progesterónu. Intra- a inter- variácie 17-ß-estradiolu
boli 6,3 % a 9,2 %.
Hodnotenie ultraštruktúry vaječníkov: Z fotografií získaných podľa morfologických
kritérií (WEIBEL et al., 1966; MASSÁNYI a UHRÍN, 1996; ŽITNÝ et al., 2004) sme
v granulóznych bunkách hodnotili: zastúpenie jadier, mitochondrií, endoplazmatického
retikula, tukov, vakuol a mikrofilamentov.
Výsledky
Po podaní jednotlivých koncentrácií NiCl2 granulóznym bunkám sme zistili pokles
produkcie progesterónu u všetkých koncentrácií, pričom najnižšia produkcia tohto hormónu
bola pri koncentrácii 1000 µM NiCl2 (3,60 ng.ml-1 média). Najvyššia produkcia progesterónu
bola u kontroly (5,19 ng.ml-1 média) (tabuľka 1, graf 1).
Vplyv NiCl2 na produkciu progesterónu.
Tabuľka 1
Koncentrácie niklu (µM NiCl2)
kontrola 62,5
125
250
500
1000
počet pozorovaní
4
4
4
4
4
4
priemer
5,19
4,27
4,37
4,37 4,62
3,60
minimum
3,40
3,63
3,56
4,18 3,71
3,09
maximum
6,50
5,28
4,87
4,65 5,85
4,22
median
5,44
4,09
4,63
4,29 4,47
3,55
smerodajná odchylka 1,39
0,72
0,61
0,25 0,91
0,47
variačný koeficient
26,78
16,86 13,96 5,72 19,70 13,06
138
Vplyv NiCl2 na produkciu progesterónu
Graf 1.
6
5
4
3
2
1
0
kontrola
62,5
125
250
500
1000
Koncentrácie NiCl2
Apoptóza granulóznych buniek po podaní rôznych koncentrácií NiCl2 [%]
Tabu1ka 2.
Koncentrácie NiCl2 (µM NiCl2)
kontrola 62,5
125
250
500
1000
44,86
62,21 49,90
41,80 51,40
79,17
minimum 11,22
40,58 21,43
8,70
37,50
maximum 90,16
95,24 100,00 82,25 100,00 100,00
priemer
median
40,86
59,39 47,19
10,00
35,48 48,22
100,00
Vplyv NiCl2 na množstvo apoptických buniek [%]
Graf 2.
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
kontrola
63
125
250
500
1000
Koncentrácie NiCl2
139
Vplyv NiCl2 na ultraštruktúru granulóznych buniek
Tabulka 3.
ER
Mitochondrie
Jadro
Mikro-
Skupiny
Hladké Gran. Trubičky Prepážky Euchr. Heter. Tuky Vakuoly filamenty
Kontrola
+++
-
+++
-
++
+
+
+
+
250 µM/Ni
+++
-
+++
-
+++
-
+
++
++
500 µM/Ni
+++
-
+++
-
+++
-
++
+++
+++
-
++
-
+++
-
+++
+++
+++
1000 µM/Ni ++
Vysvetlivky: výskyt organel +++ intenzívny; ++ stredný; + nízky; - žiadny
ER – endoplazmatické retikulum
Najvyššie percento apoptických buniek (79%) sme pozorovali pri najvyššej
koncentrácii NiCl2 (1000µM). So zvyšujúcou sa koncentráciou NiCl2 sa množstvo
apoptických buniek zvyšovalo okrem koncentrácie 250 µM, kde bolo percento apoptózy
najnižšie (42%).
Pozorovaním ultraštruktúry granulóznych buniek sme zistili zvýšenie výskytu
euchromatínu v jadrách, tukových kvapôčok, mikrofilamentov a vakuolizáciu buniek po
kultivácii s NiCl2 v porovnaní s kontrolou čo naznačuje degeneratívne procesy v bunkách.
Zároveň vo všetkých experimentálnych skupinách bol znížený výskyt mitochondrií
a hladkého endoplazmatického retikula a úplné vymiznutie heterochromatínu v jadrách po
porovnaní s kontrolnou skupinou buniek.
Diskusia
Po podaní jednotlivých koncentrácií NiCl2 granulóznym bunkám sme zistili pokles
produkcie progesterónu u všetkých koncentrácií, pričom najnižšia produkcia tohto hormónu
bola pri koncentrácii 1000 µM NiCl2 (3,60 ng.ml-1 média). Najvyššia produkcia progesterónu
bola u kontroly (5,19 ng.ml-1 média). Tieto výsledky poukazujú na vplyv niklu na produkciu
sexuálnych steroidov. Ďalej sme pozorovali ultraštrukturálne zmeny v bunkách v porovnaní
s kontrolnou skupinou. Hodnotením apoptózy sa tiež potvrdil negatívny účinok NiCl2, ktorý
sa prejavil zvýšením odumieraním buniek po pridaní jednotlivých dávok tohoto kovu. Forgacs
et al. (1997) študovali účinok NiSO4 na funkciu vaječníkov potkanov. NiSO4 pri dávke 40
mg.kg-1 narušil ovariálny cyklus a zvýšenie sekrécie progesterónu po hCG stimulácii. Krvný
tlak a prúdenie krvi v ovariálnych cievach zostal nezmenený. Revesz et al. (2004) sledovali
140
účinok niklu na ľudské ovariálne granulózne bunky in vitro. Od koncentrácie závislý pokles
hCG a db-cAMP stimulovanej produkcie progesterónu bol pozorovaný pri dávke 15,625 µM
alebo vyššej koncentrácii Ni2+, ktorá nie je cytotoxická pre ľudské ovariálne granulózne
bunky. Životaschopnosť buniek bola nezmenená pri koncentrácii do 31,25 µM
a signifikantne znížená pri 62,5 µM Ni2+. Výsledky štúdie preukázali od dávky závislý pokles
stimulovanej produkcie progesterónu granulóznymi bunkami pri dávke, ktorá nespôsobovala
signifikantné cytotoxické deje. Výsledky poukazujú na to, že účinok Ni2+ na produkciu
progesteróu nieje spôsobený cytotoxicitou. Účinok Ni2+ môže byť spojený s jeho interakciami
s ďaľšími divalentnými esenciálnymi kovmi, ktoré blokujú jeho esenciálne biologické
funkcie, vytláčajú esenciálne kovy alebo modifikujú ich účinnú štruktúru biomolekúl (Coogan
et al., 1989). Mattison et al. (1983) po pokuse s niklom pozorovali zmenené metabolické
aktivity mikrozomálnych monoxygenáz, z ktorých niektoré sú esenciálne pre steroidný
metabolizmus. Revesz et al. (2004) sledovali účinok Ni2+ na ľudské granulózne bunky in
vitro. Výsledky poukazujú na to, že Ni2+ nepôsobí cytotoxicky na produkciu progesterónu,
a inhibične vo vnútri buniek pôsobí v miestach receptorov na membránach a na produkciu
cAMP.
Záver
Z prezentovaných výsledkov vyplýva, že vystavenie granulóznych buniek vyšším
koncentráciám NiCl2 pôsobí deštrukčne na gonadálne funkcie samíc. Nikel v tejto forme
spôsobuje zníženie produkcie samičieho pohlavného hormónu progesterónu granulóznymi
bunkami. Ďalej spôsobuje zvýšenie množstva apoptických granulóznych buniek, a zmeny
v ultraštruktúre týchto buniek.
Práca bola podporená projektami APVV-0299-06 a VEGA 1/2417/05.
Literatúra
1.
COOGAN, T.P., LATTA, D. M., SNOW, E. T., COSTA, M. 1989. Toxicity and carcinogenicity of
nickel compounds, In: Critical Reviews in Toxicology, Vol 19. McClellan, R. O., ed.., CRC Press, Boca Raton,
FL., 1989, s. 341-384.
2.
MASSÁNYI, P., UHRÍN, V. 1996. Histological changes in the ovaries of rabbits after an administration
of cadmium. In: Reprod Dom Anim, 1996, s. 629-632.
3.
MTTISON, D. R., GATES, A. H., LEONARD, A., WIDE, M., HEMMINKI, K., COPIUS
PEEREBOOM-STEQUEMAN, J. H. J. (1983). Reproductive and Developmental Toxicity of Metals: Female
reproductive system. In: Reproductive and Developmental Toxicity of Metals (T.W. Clarkson, G. F. Nordberg,
and P. R. Sager, eds.) Plenum Press, New York and London, pp. 43-91.
4.
FORGACS, Z., PAKSY, K., VARGA, B., LAZAR, P., TATRAI, E. 1997. Effects of NiSO4 on the
ovarian function in rats. In: Central european journal of occupational and environmental medicine, 1997, s. 4857.
141
5.
REVESZ, C., FORGACS, Z., LAZAR, P., MATYAS, S., RAJCZY, K., KRIZSA, F., BERNARD, A.,
GATI, I. 2004. Effect of nickel (Ni2+ ) on primary human ovarian granulosa cells in vitro. In: Toxicology
mechanisms and methods 14 (5), 2004, s. 287-292.
6.
WEIBEL, ER, KISTLER, GS, SCHERLE, WF. 1966. Practical stereological methods for
morpohometric cytology. In: J Cell Biol, 1966, s. 23-28.
7.
ŽITNÝ, J., MASSÁNYI, P., TRAKOVICKÁ, A., RAFAJ, J., TOMAN, R. 2004. Quantification of the
ovarian follicular growth in rabbits. In: Bull Vet Instit Pulawy, 2004, s, 37-40.
Kontaktná adresa:Ing. Jiřina Kročková, doc. MVDr. Peter Massányi, PhD., SPU v Nitre,
FBP, KFŽ, Tr. A. Hlinku 2, 94901 Nitra, [email protected], [email protected]
VPLYV MELATONÍNU NA PREJAVY ANXIETY U HYPERTENZNÝCH
POTKANOV SO ZVÝŠENOU AKTIVITOU RENÍN-ANGIOTENZÍNOVÉHO
SYSTÉMU
INFLUENCE OF MELATONIN ON ANXIETY IN HYPERTENSIVE RATS WITH UP
REGULATED RENIN-ANGIOTENSINE SYSTEM
Kršková, L., Vrabcová, M., Zeman, M.
Univerzita Komenského v Bratislave, Prírodovedecká fakulta, Katedra živočíšnej fyziológie a etológie, Mlynská dolina B-2,
842 15 Bratislava [email protected]
Abstract
The purpose of the study was to investigate effects of melatonin (MEL) on anxiety
behaviour of hypertensive rats.
Mature Sprague-Dawley control normotensive rats (N, n=20) and hypertensive rats with high
activity of renin–angiotensin system (H, n=20) were used. Half of each group was treated
with MEL in drinking water (40 µg/ml) for 3 weeks. The influence of MEL on anxiety was
measured in the elevated plus-maze test (EPM).
H rats spent more time in closed arms (P<0.05) and showed low frequency of total arm entries
(P<0.005) than N rats in EPM.
MEL treated N rats did not exhibit differences in behaviour observed in EPM. MEL treated H
rats spent less time in closed arms (P<0.05) and increased frequency of total arm entries
(P<0.05) in EPM than untreated H animals.
Our results suggest that MEL decreased anxiety related behaviours in H rats that were
induced by over-expressed renin-angiotensin-aldosteron system.
Úvod
V rozvoji hyperenzie hrá veľmi dôležitú úlohu renín-angiotenzínový systém (RAS).
Ten sa podieľa nielen na regulácii krvného tlaku, ale zároveň ovplyvňuje a moduluje aj
mnoho so správaním súvisiacich funkcii mozgu (Braszko a kol., 2003, von Bohlen a kol.
142
2006, Saavedra a kol, 2006) vrátane pocitov úzkosti a depresie, ktoré sú považované za
sprievodné znaky hypertenzie (Gard, 2004).
Hypertenzné zvieratá so zvýšenou aktivitou RAS (Bachmann, 1992) poskytujú jedinečnú
príležitosť na štúdium behaviorálnych účinkov hypertenzie. Vykazujú vyššiu hladinu anxiety
a behaviorálne zmeny podobne behaviorálnym zmenám, ktoré sa vyskytujú u hypertenzných
pacientov (Wilson a kol., 1996; Voigt a kol., 2000).
Zmeny správania u hypertenzných pacientov, ale aj hypertenzných zvierat, súvisia podľa
viacerých autorov
(Lemmer a kol., 2003; Zeman a kol., 2005) s porušením kontrolných
mechanizmov biosyntézy melatonínu. Ten moduluje vybrané formy správania (Jean-Louis
a kol., 1998) a môže sa použiť aj pri liečbe stavov úzkosti (Nava a Carta, 2001).
Cieľom nami prezentovanej práce preto bolo zistiť účinok melatonínu na anxietu u
hypertenzných zvierat so zvýšenou aktivitou RAS.
Materiál a metódy
V pokuse sme použili samce normotenzných (N, n=10) potkanov a hypertenzných (H,
n=10) potkanov so zvýšenou aktivitou renín-angiotenzínového systému kmeňa Sprague Dawley (dodávateľ: SEMED - Služby experimentální medicíny, PRAHA, Česká republika)
vo veku 12 týždňov (361 ± 9g).
Zvieratá boli chované za štandardných podmienok (teplota 21±2 °C, vlhkosťou 50-55%,
svetelný režim 12h:12h svetlo/tma) po štyri v plastových klietkach o rozmeroch 57×37×19cm
s podstielkou z drevených hoblín, s neobmedzeným prístupom ku štandardnej granulovanej
potrave a vode. N aj H zvieratá boli na začiatku testu rozdelené na dve skupiny – neliečené
(N, n=10; H, n=10) a liečené melatonínom (N MEL, n=10; H MEL, n=10). Melatonín sme
zvieratám podávali (počas 3 týždňov) vo večerných hodinách v pitnej vode (40 µg/ml).
Na meranie anxiety sme použili eleveted plus-maze test (Gurtman a kol., 2002).
Princíp testovania spočíval v tom, že sme každé zviera v čase medzi 13:00 hod. až 15:00 hod.
umiestnili na 5 min. do neznámeho prostredia - vyvýšeného bludiska v tvare znamienka plus
s dvoma otvorenými (50x10cm) a s dvoma uzavretými ramenami (50×10x40cm) v strede
s centrálnou zónou (10x10cm). Počas testovania sme do vopred pripravených protokolov
registrovali čas (sec.) strávený v otvorenom ramene, čas (sec.) strávený v uzavretom ramene,
ako aj frekvenciu vstupov do jednotlivých ramien.
Štatistika
143
Na overenie štatistickej preukaznosti rozdielov medzi kontrolnou skupinou a skupinou
ovplyvnenou melatonínom sme použili neparametrický Mann –Whitneyho testu.
Výsledky
H potkany sa v porovnaní s N potkanmi javili v elevated plus-maze teste ako viac
anxiózne. Trávili viac času v uzavretom ramene (P<0,05; obr. 1) a zaznamenali sme u nich
v porovnaní s N zvieratami aj vyššiu frekvenciu celkových vstupov do ramien (P<0,005; obr.
1). Melatonín podaný N zvieratám neovplyvnil ich správanie v elevated plus-maze teste (obr.
2 - a, b). U H zvierat spôsobil melatonín v porovnaní s kontrolou pokles času stráveného v
uzavretom ramene (P<0,05; obr. 2 - c) a nárast celkovej frekvencie vstupov do ramien
(P<0,05; obr. 2 - d).
Obr. 1 - a, b. Správanie N (n=10) a H (n=10) zvierat v elevated-plus maze teste. Hodnoty
sú udávané ako priemer za 20 min. ± S.E.M. Hviezdička označuje signifikantnosť
rozdielov medzi testovanými skupinami (* P<0,05).
*
300
a)
b)
16
14
12
200
frekv encia
trv anie v s ec .
250
150
100
10
*
8
6
4
50
2
0
čas v otvorenom ramene
čas v uzavretom ramene
0
N
N
vstupy do ramien
H
H
Obr. 2 - a, b, c, d. Správanie normotenzných (N, n=10) a hypertenzných (H, n=10) zvierat
pred a po liečbe melatonínom (N MEL, n=10; H MEL, n=10) v elevated-plus maze teste.
Hodnoty sú udávané ako priemer za 20 min. ± S.E.M. Hviezdička označuje signifikantnosť
rozdielov medzi testovanými skupinami (* P<0,05).
a)
250
b)
16
14
12
frekvencia
trvanie v sec.
200
150
100
10
8
6
4
50
2
N
0
0
čas v otvorenom ramene
čas v uzavretom ramene
N
vstupy do ramien
N MEL
N MEL
144
c)
300
d)
*
8
*
7
250
frek v enc ia
trvanie v sec.
6
200
150
100
5
4
3
2
50
1
0
čas v otvorenom ramene
čas v uzavretom ramene
H
0
vstupy do ramien
H MEL
H
H MEL
Diskusia
V súlade s výsledkami iných autorov (Voigt a kol., 1999, 2000; Wilson a kol., 1996)
sa nami testované H potkany v porovnaní s N potkanmi javili v elevated plus-maze teste ako
viac anxiózne čo môže odrážať modifikáciu mozgových neurotransmiterov zahrnutých do
mechanizmu kontroly anxiety ako je GABA a serotonín. Potkany so zvýšenou aktivitou RAS
majú totiž podľa Voigt a kol. (1999) serotonergický systém funkčne zmenený.
Model akútnej anxiety je spojený s nárastom uvoľňovania 5-hydroxytryptamínu (5HT) v hipokampe (Voigt a kol., 1999; Rodgers, 1997). Po vložení H a N potkanov do
elevated plus-maze testu vzrastá u oboch skupín uvoľňovanie intrahipokampálneho 5-HT. Po
spätnom vložení do prostredia domácej klietky je však jeho spätný pokles rýchlejší u H
zvierat so zvýšenou aktivitou RAS (Voigt a kol., 1999).
Anxiogénny profil H potkanov je charakterizovaný nárastom hladiny mozgového ANG II
(Wilson, 1996) ktorý vedie k nárastu emocionality. Neuroanatomickým miestom tohto
anxiogéneho efektu ANG II môžu byť AT1 a AT2 receptory v amygdale (Tsutsumi
a Saavedra, 1991) a tiež AT2 receptory v locus coeruleus (Okuyama, 1999). Obe štruktúry sú
totiž zahrnuté do regulácie emocionálneho správania (Tsutsumi a Saavedra, 1991).
Melatonín podaný N zvieratám neovplyvnil ich správanie vo vyvýšenom bludisku v tvare
znamienka plus. U H potkanov melatonín znižoval vprejavy anxiety, interagoval s up
regulovaným RAS systémom a normalizoval zmeny v mozgu indukované zvýšenou aktivitou
RAS. RAS má stimulačný efekt na adrenergickú neurotransmisiu (Ferrario, 1972; KLaflamme
a de Champlain, 1998; DiBona, 2004). Hypotenzívny účinok melatonínu je
asociovaný s inhibíciou bazálneho sympatoadrenálneho tónusu a môže byť sprostredkovaný
blokádou postsynaptických alpfa1-adrenergických receptorov (K-Laflamme a kol., 1998).
U H zvierat je denzita alfa1-adrenoreceptorov v porovnaní s N signifikantne vyššia (Schnabel
a kol., 1997). Preto môžu byť nami získané údaje o správaní H potkanov vysvetľované
145
špecifickým účinkom melatonínu na up reguláciu alfa1-adrenoreceptors, aj keď interakcia s
mozgovým RAS je tiež dôležitá.
Záver
Odlišný účinok MEL na správanie N a H potkanov v elevated plus-maze teste demonštruje,
že u H potkanov nejde len o dôsledok zvýšeného krvného tlaku, ale že kontrola správania je
rozrušená na komplexnejšej úrovni.
Poďakovanie
Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu vedy a techniky na základe Zmluvy č.
APVT-20-022704.
Literatúra
Bachmann S, Peters J, Engler E, Ganten D, Mullins J. Transgenic rats carrying the mouse renin gene-morphological characterization of a low-renin hypertension model. Kidney Int. 1992; 41:24-36.
Braszko JJ, Kulakowska A, Winnicka MM. Effects of angiotensin II and its receptor antagonists on motor
activity and anxiety in rats. J Physiol Pharmacol. 2003; 54:271-81.
DiBona GF. The sympathetic nervous system and hypertension: recent developments. Hypertension. 2004;
43:147-50.
Ferrario CM, Gildenberg PL, McCubbin JW. Cardiovascular effects of angiotensin mediated by the central
nervous system. Circ Res. 1972; 30:257-262.
Gard PR. Angiotensin as a target for the treatment of Alzheimer's disease, anxiety and depression. Expert Opin
Ther Targets. 2004; 8:7-14.
Gurtman CG, Morley KC, Li KM, Hunt GE, McGregor IS. Increased anxiety in rats after 3,4methylenedioxymethamphetamine: association with serotonin depletion. Eur J Pharmacol. 2002; 446:89-96.
Jean-Louis G, von Gizycki H, Zizi F. Melatonin effects on sleep, mood, and cognition in elderly with mild
cognitive impairment. J Pineal Res. 1998; 25:177-83.
K-Laflamme A, de Champlain J. Interaction between the sympathetic and renin-angiotensin system. Therapie.
1998; 53:245-52.
K-Laflamme A, Wu L, Foucart S, de Champlain, J. Impaired basal sympathetic tone and alpha1-adrenergic
responsiveness in association with the hypotensive effect of melatonin in spontaneously hypertensive rats. Am J
Hypertens. 1998; 11:219-229.
Lemmer B, Witte K, Enzminger H, Schiffer S, Hauptfleisch S. Transgenic TGR(mREN2)27 rats as a model for
disturbed circadian organization at the level of the brain, the heart, and the kidneys. Chronobiol Int. 2003;
20:711-38.
Nava F, Carta G. Melatonin reduces anxiety induced by lipopolysaccharide in the rat. Neurosci Lett. 2001;
307:57-60.
Okuyama S, Sakagawa T, Inagami T. Role of the angiotensin II type-2 receptor in the mouse central nervous
system. Jpn J Pharmacol. 1999; 81: 259-63.
Rodgers RJ, Cao BJ, Dalvi A, Holmes A. Animal models of anxiety: an ethological perspective. Braz J Med
Biol Res. 1997; 30:289-304.
Saavedra JM, Benicky J, Zhou J. Angiotensin II: multitasking in the brain. J Hypertens Suppl. 2006; 24:131-7.
Schnabel P, Nohr T, Nickenig G, Paul M, Bohm M. Alpha-adrenergic signal transduction in renin transgenic
rats. Hypertension. 1997; 30:1356-61.
Tsutsumi K, Saavedra JM. Characterization of AT2 angiotensin II receptors in rat anterior cerebral arteries. Am J
Physiol. 1991; 261:667-70.
146
Voigt JP, Rex A, Sohr R, Fink H. Hippocampal 5-HT and NE release in the transgenic rat TGR(mREN2)27
related to behavior on the elevated plus maze. Eur Neuropsychopharmacol. 1999; 9:279-85.
Voigt JP, Rex A, Bader M, Fink H. From genotype to phenotype--behavior of the transgenic rat TGR(mRen2)27
as an example. Rev Neurosci. 2000; 11:37-45.
von Bohlen O, Halbach O, Albrecht D. The CNS renin-angiotensin system. Cell Tissue Res. 2006; 326:599-616.
Wilson W, Voigt P, Bader M, Marsden CA, Fink H. Behaviour of the transgenic TGR (mREN2)27 rat. Brain
Res. 1996; 729:1-9.
Zeman M, Dulková K, Bada V, Herichová I. Plasma melatonin concetrations in hypertensive patients with the
dipping and non-dipping blood pressure profile. Life Sci. 2005; 76:1795-803.
Kontaktná adresa: RNDr. Lucia Kršková, PhD., Univerzita Komenského v Bratislave,
Prírodovedecká fakulta, Katedra živočíšnej fyziológie a etológie, Mlynská dolina B-2, 842 15
Bratislava, [email protected]
EXPRESE CD14 BĚHEM APOPTÓZY POLYMORFONUKLEÁRNÍCH
LEUKOCYTŮ V REZOLUCI ZÁNĚTU
EXPRESSION OF CD14 DURING APOPTOSIS OF POLYMORPHONUCLEAR
LEUKOCYTES IN RESOLUTION OF INFLAMMATION
Langrová, T.1,2, Sládek, Z.1,2, Ryšánek, D.2
1
2
Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat, Agronomická fakulta, MZLU v Brně
Oddělení Imunologie,Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v. v. i., Brno
Abstract
The goal of the study was to prove the effect of bacterial components (toxins of Grampositive and Gram-negative bacteria) on the expression of CD14 during an induced
inflammatory reaction of the heifers mammary gland. The experimental inflammatory
reaction was induced by the toxins from Gram-positive and Gram-negative pathogens,
muramyldipeptide (MDP) and lipopolysaccharide (LPS); phosphate buffered saline (PBS)
was used as a control. The course of the inflammatory reaction was monitored in four time
points – 24 hours and 48 hours (initiation of inflammatory reaction), 72 hours and 168 hours
(resolution of inflammatory reaction). Flow cytometry was used to determine portion of
apoptotic polymorphonuclear leukocytes (PMNs) and portion of CD14+ PMNs.
Intramammary administration of used inductors (PBS, MDP, LPS) resulted in an
inflammatory reaction. with different character in the initial phase and in resolution. The
results of this study reveal that, during an initiation, apoptosis of PMNs occurs, which shows
an increasing trend. On the other hand a decline in the portion of apoptosis of PMNs in
resolution then indicates its termination. The difference in the portion of apoptotic PMNs was
the greatest after PBS, whereas after MDP and LPS it was manifested with more gradual
increase. The higher portion of CD14+ PMNs was observed 72 hours after induction with
PBS. A statistically highly significantly lower portion was observed after induction with MDP
147
(P<0.01), and a statistically lower portion after induction with LPS (P<0.05). Decrease in the
portion of CD14+ PMNs followed. The results of this study indicate that just the bacterial
toxins prolong the duration of an acute inflammation and have shown that expression of
CD14 is controlled by the factors inducing inflammatory response as well as by the
mechanisms of resolution.
Úvod
Polymorfonukleární leukocyty (PMN) plní významnou úlohu v imunitě, jsou
odpovědné především za nespecifickou obranu těla proti pronikajícím mikroorganismům,
zejména bakteriím (Smith, 2000). Funkcí PMN je eliminace patogenních mikroorganismů
během iniciální fáze akutního zánětu, kdy dochází k migraci těchto buněk z krve do postižené
tkáně. Lipopolysacharid, složka buněčné stěny G- bakterií a muramyldipeptid, jako minimální
strukturální jednotka peptidoglykanu G+ bakterií, mají schopnost vyvolat ve tkáni zánětlivou
reakci. PMN disponují krátkou životností a neschopností reemigrovat zpět do krevního řečiště
(Hughes et al., 1997). To vytváří potencionální nebezpečí pro okolní tkáň, protože při nekróze
PMN je jejich histotoxický obsah uvolněn extracelulárně. Proto je pro zachování homeostázy
orgánu nutná rezoluce, tedy ukončení zánětu. Rezoluce je realizována funkční a fyzickou
eliminací PMN, proto podstupují PMN programovanou buněčnou smrt, apoptózu. Apoptóza
představuje fyziologický způsob zániku buňky, který je geneticky řízen, omezuje poškození
zanícené tkáně a podporuje rezoluci zánětu (Savill, 1997). Rezoluce se realizuje fagocytózou
apoptotických buněk makrofágy, tím se zabrání uvolňování histotoxického obsahu granulí
mimo buňky. Při fagocytóze apoptotických PMN neuvolňují makrofágy prozánětlivé
mediátory do extracelulárního prostoru (Meagher et al., 1992). Je tedy zřejmé, že ovlivnění
délky života PMN je důležité pro průběh infekční mastitidy a návrat postižené tkáně do
původního stavu bez trvalého poškození (Capuco et al., 1986).
Prvním krokem eliminace apoptotických PMN je jejich identifikace makrofágy. Pro
rozpoznání apoptotických PMN makrofágy jsou důležité biochemické změny realizované na
povrchu cytoplazmatické membrány buněk (Akgul et al., 2001; Savill et al., 2003).
Makrofágy jsou pak vybaveny specifickými receptory, které mají schopnost apoptotické PMN
rozpoznat (Savill et al., 1993). Při studiu role CD14 během zánětlivé reakce mléčné žlázy byl
vysloven předpoklad o aktivní účasti CD14 během rezoluce. Úloha membránového receptoru
CD14 mléčné žlázy skotu byla studována u mastitidy vyvolané LPS, S. aureus a S. uberis.
Bylo zjištěno, že zánětlivá reakce mléčné žlázy na LPS byla spojena s expresí CD14 receptorů
PMN a makrofágů (Paape et al., 1996; Sládek et al., 2002), přičemž exprese CD14 receptoru
148
výrazně závisí na stádiu zánětlivé odpovědi mléčné žlázy. Navíc bylo zjištěno, že exprese
CD14 na PMN vysoce koreluje se zastoupením apoptotických PMN (Sládek a Ryšánek,
2006). Nabízí se otázka, zda toxin G+ bakterií (MDP) rovněž ovlivňuje expresi CD14 PMN a
zda je exprese CD14 řízena mechanismy rezoluce. Cílem této studie bylo tedy potvrdit nebo
vyvrátit uvedené hypotézy. K tomuto účelu byla použita experimentální zánětlivá reakce
mléčné žlázy, která byla indukována MDP a LPS.
Materiál a metodika
Pokus byl realizován na osmi klinicky zdravých jalovicích, kříženkách holštýnského a
českého strakatého plemene ve věku 15-18 měsíců, ustájených certifikované pokusné stáji a
krmených standardní krmnou dávkou sena a krmných doplňků. Mléčné žlázy pokusných
zvířat byly před každým experimentem bakteriologicky vyšetřeny. U zvířat byla indukována
zánětlivá reakce mléčné žlázy inertním činitelem (PBS), který sloužil jako kontrola a
komponenty buněčné stěny Gram pozitivních bakterií (MDP) a Gram negativních bakterií
(LPS). Mléčné žlázy byly vypláchnuty v jednotlivých časových bodech a buněčné suspenze
byly zpracovány pro stanovení celkového počtu leukocytů a analýzu životnosti PMN ve
světelném mikroskopu. Průtokový cytometr byl použit pro analýzu exprese CD14 na povrchu
PMN a detekci apoptózy PMN. K vyvolání zánětlivé reakce byl použit: a) PBS – phosphate
buffered saline (Sigma, Saint Louis, Missouri, USA) 0,01 M, pH 7,4, o objemu 20
ml/mléčnou žlázu, b) MDP – syntetický derivát muramyldipeptidu (MurNAc-L-Abu-DIsoGln, Institut Organické chemie a biochemie České akademie věd, Praha, Česká republika)
v koncentraci 500µg ve 20 ml PBS, c) LPS – lipopolysacharid Escherichia coli, serotyp
0128:B12 (Sigma, MO, USA) v koncentraci 5 µg ve 20 ml PBS. Mléčné žlázy byly
dezinfikovány 70% ethanolem, zvláště v okolí zevního ústí strukového kanálku, a následně
podrobeny laváži. Laváž byla provedena pomocí upravených ureterálních katetrů
(AC5306CH06, Porges S. A., France). Po indukci zánětlivé reakce byly mléčné žlázy
vyplachovány podle následujícího schématu: pravá přední - 24 hod, pravá zadní - 48 hod, levá
přední - 72 hod, levá zadní - 168 hod po použití příslušného induktoru. Získané laváže byly
ihned po odběru posouzeny aspekcí a byly z nich odebrány vzorky pro bakteriologické
vyšetření, pro stanovení celkového počtu buněk a pro stanovení vitality buněk. Byly použity
pouze laváže s negativním bakteriologickým nálezem. Apoptotické PMN byly analyzovány
průtokovým cytometrem (FCM) s využitím barvení Annexinem V značeným FITC
(fluorescin isothiocyanate) a PI (propidium jodide) (Vermes et al., 1995). Pro barvení byl
použit Annexin-V-FLUOS Staining Kit (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) dle
149
instrukcí výrobce. Detekce povrchových receptorů: jako primární a sekundární protilátky byly
použity CD14 VPM65 (mouse anti-ovine, Serotec, Oxford, UK) ředěný 1:20 a fluorescein
isothiocyanate značený immunoglobulin (swine anti-mouse, SwM-FITC, Sevac, Prague,
Czech Republic), ředěný 1:500. Kontrolní vzorky byly barveny pouze sekundárními
protilátkami. K analýze byl použit FACS Calibur flow cytometer a CELLQuest™ software
(Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA). Pořízené dot ploty byly následně
vyhodnoceny za použití softwaru WinMDI 2.8 (Trotter, 2000). Analyzováno bylo vždy
20 000 PMN/dot plot. Získaná data byla statisticky zpracována programem STAT Plus
software (Matoušková et al., 1992). Rozdíly v procentuálním zastoupení apoptotických,
CD14+ PMN po indukci PBS, MDP a LPS byly statisticky vyhodnoceny analýzou variance
(ANOVA) a významnost rozdílů Sheffeho metodou vícenásobného srovnání.
Výsledky
Apoptóza PMN během zánětlivé reakce
Apoptóza byla detekována v populaci PMN během zánětlivé reakce indukované všemi
činiteli. Podíl apoptotických PMN (Annexin+/PI- PMN) dosáhl ve sledovaném období
maxima 72 h po indukci zánětlivé reakce. V tomto časovém bodě byly barvením Annexinem
V zaznamenány statisticky velmi významné (P<0,01) rozdíly mezi PBS a MDP, PBS a LPS.
AnnexinV+/PI- PMN (%)
60
50
PBS
MDP
LPS
** **
40
*
30
20
10
0
24h
48h
72h
168h
Podíl CD14+ PMN během zánětlivé reakce
Z grafu je patrné, že nejvyšší podíl CD14+ PMN byl zjištěn 72 hod po indukci PBS.
Statisticky vysoce významně nižší podíl byl zaznamenán po indukci MDP (P<0,01),
významně nižší podíl po indukci LPS (P<0,05). Následovalo snižování podílu CD14+ PMN.
150
100
PBS
90
MDP
LPS
*
80
**
CD14+ (%)
70
60
50
40
30
20
10
0
24h
48h
72h
168h
Diskuze
Cílem této studie bylo zjistit, zda je exprese CD14 PMN ovlivněna toxinem G+
bakterií (MDP), stejně jako je tomu u LPS a zda je exprese CD14 řízena mechanismy
rezoluce zánětlivé odpovědi. Zánětlivá reakce byla indukována komponenty buněčné stěny
G+ (muramyldipeptid) a G- (lipopolysacharid) bakterií. Intramammární aplikace použitých
induktorů (PBS, MDP, LPS) vyvolala zánětlivou reakci. Apoptóza PMN a následná
fagocytóza apoptotických PMN makrofágy jsou důležité pro úspěšné ukončení reakcí
akutního zánětu mléčné žlázy (Sládek a Ryšánek 2001; Van Oostveldt et al., 2002). Výsledky
této studie ukazují, že během iniciace dochází k apoptóze PMN, která vykazuje vzestupnou
tendenci, to naznačuje spuštění mechanizmů rezoluce mléčné žlázy (Sládek a Ryšánek, 2000,
2001). Pokles podílu apoptózy PMN v rezoluci pak naznačuje její terminaci. Změna podílu
apoptotických PMN byla nejvýraznější po PBS, zatímco po MDP a LPS se projevila
pozvolnějším nárůstem. V předešlých studiích bylo prokázáno, že MDP a LPS oddalují
apoptózu bovinních PMN in vitro (Ryšánek et al., 2005; Liu et al., 2005) a in vivo (Sládek a
Ryšánek, 2000; 2001). Z výsledků této studie je tedy zřejmé, že právě bakteriální toxiny
prodlužují dobu trvání akutního zánětu.
Iniciální fáze akutního zánětu vyvolaná všemi induktory (PBS, MDP, LPS) byla
charakteristická nízkými podíly CD14+ PMN. Nízký podíl CD14+ PMN může být způsoben
uvolňováním CD14 molekul z povrchu buňky (Paape et al., 1996). Důvodem této regulace v
iniciální fázi zánětlivé reakce po indukci LPS je zabránit produkci IL-1 a TNF-α tím, že dojde
k vyblokování komplexu LPS-LBP (Maliszewski, 1991). Naopak, během rezoluce podíl
CD14+ PMN stoupá, což potvrzuje roli CD14 jako tzv. eat me signálu pro makrofágy. Pro
ukončení akutního zánětu a návratu postižené tkáně do původního stavu je nutné, aby PMN
podstoupily apoptózu, a aby byly i odstraněny z tkáně. Tuto funkci zajišťují makrofágy, které
151
rozpoznávají apoptotické PMN mimo jiné receptorem CD14. Úloha receptoru CD14 pro
rozpoznání apoptotických PMN byla popsána již dříve (Gregory a Devitt, 1999; Heidenreich,
1999; Schűtt, 1999). Na mléčné žláze skotu se CD14 jeví jako kandidátní receptor pro
rozpoznání apoptotických PMN makrofágy (Sládek a Ryšánek, 2006).
Závěr
Výsledky této studie ukázaly, že mezi zastoupením CD14+ PMN po indukci MDP a
LPS nebyly zaznamenány významné rozdíly. Exprese CD14 po PBS však byla statisticky
významně odlišná. Toxin G+ bakterií tedy rovněž ovlivňuje expresi CD14. Dále, že průběh
zánětlivé reakce je obdobný po indukci MDP a LPS oproti PBS. To ukazuje, že exprese CD14
je řízena jak činiteli vyvolávajícím zánětlivou reakci, tak mechanismy rezoluce.
Tato práce vznikla za finanční podpory výzkumného záměru MZE 0002716201 a Grantové
agentury České republiky (GAČR No. 524/03/1531).
Literatura
AKGUL C, MOULDING DA, EDWARDS SW. Molecular control of neutrophil apoptosis. FEBS Letters 487:
318-322, 2001.
CAPUCO AV, PAAPE MJ, NICKERSON SC. In vitro study of polymorphonuclear leukocyte damage to
mammary tissues of lactating cows. Am J Vet Res 47(3): 663-8, 1986.
GREGORY CD, DEVITT A. CD14 and apoptosis. Apoptosis 4: 11-20, 1999.
HEIDENREICH S: Monocyte CD14: a multifunctional receptor engaged in apoptosis from both sides. Journal
of Leukocyte Biology 65: 737-743, 1999.
HUGHES JR, JOHNSON A, MOONEY C, HUGO K, GORDON J, SAVILL J. Neutrophil fate in experimental
glomerular capillary injury in the rat. Am J Pathol 150: 223-234, 1997.
LIU JJ, SONG CW, YUE Y, DUAN CG, YANG J, HE T, HE YZ. Quercetin inhibits LPS-induced delay in
spontaneous apoptosis and activation of neutrophils. IR 54: 500-507, 2005.
MALISZEWSKI CR. CD14 and immune response to LPS. Science 252: 1321-2, 1991.
MATOUŠKOVÁ O, CHALUPA J, CÍGLER M, HRUŠKA K. STAT Plus. VRI Brno, 1992.
MEAGHER LC, SAVILL J, BAKER A, FULLER RW, HASLETT CH. Phagocytosis of apoptotic neutrophils
does not induce macrophage release of thromboxan B2. JLB 52: 269-273, 1992.
PAAPE MJ, LILIUS EM, WIITANEN PA, KONTIO MP, MILLER RH. Intramammary defense against
infections induced by Escherichia coli in cows. Am J Vet Res 57: 477-82, 1996.
RYŠÁNEK D, SLÁDEK Z, VAŠÍČKOVÁ D, FALDYNA M. Effects of Certain Inducers of Leukocytes
Migration into the Bovine Mammary Gland on Neutrophil Apoptosis Manifestation in a Subsequent in Vitro
Cultivation. Physiol Res 54: 305-312, 2005.
SAVILL JS, FADOK V, HENSON P, HASLETT C. Phagocyte recognition of cells undergoing apoptosis.
Imunology Today 14: 131-136, 1993.
SAVILL JS. Recognition and phagocytosis of cell undergoing apoptosis. British Medical Bulletin 53: 491-508,
1997.
SAVILL JS, GREGORY C, HASLETT C. Cell biology. Eat me or die. Science 302: 1516-7, 2003.
SCHÜTT CH. Molecules in focus, CD14. IJBCB 31: 545-549, 1999.
SLÁDEK Z, RYŠÁNEK D. Apoptosis of polymorphonuclear leukocytes of the juvenile bovine mammary gland
during induced influx. Vet Res 31: 553-63, 2000.
SLÁDEK Z, RYŠÁNEK D. Neutrophil apoptosis during the resolution of bovine mammary gland injury. Res
Vet Sci 70: 41-46, 2001.
SLÁDEK Z, RYŠÁNEK D, FALDYNA M. Activation of phagocytes during initiation and resolution of
mammary gland injury induced by LPS in heifers. Vet Res 33: 191-204, 2002.
152
SLÁDEK Z, RYŠÁNEK D. The role of CD14 during resolution of experimentally induced S. aureus and S.
uberis mastitis. Comp Immunol Microbiol Infect Dis 29: 243-262, 2006.
SMITH GS. Neutrophils. In: Schalm´s veterinary hematology. BF Feldman, JG Zinkl, NC Jain. Philadelphia:
Lippincott Williams and Wilkins, 281-296, 2000.
TROTTER J. WinMDI 2.8 software. 2000.
VAN OOSTVELDT K, PAAPE MJ, DOSOGNE H, BURVENICH C. Effect of apoptosis on phagocytosis,
respiratory burst and CD18 adhesion receptor expression of bovine neutrophils. Domest Anim Endocrinol 22: 3750, 2002.
VERMES I, HAANEN C, STEFFENS-NAKKEN H, REUTELLINGSPERGER C. A novel assay for apoptosis.
Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled
Annexin V. J Immunol Methods 184: 39-51, 1995.
Kontaktní adresa: Ing. Tereza Langrová, MZLU v Brně, Ústav morfologie, fyziologie
a genetiky zvířat, Zemědělská 1, 613 00 Brno, [email protected]
VPLYV VYBRANÝCH MIRNA KONŠTRUKCIÍ NA FUNKCIE OVARIÁLNYCH
GRANULÓZNYCH BUNIEK ČLOVEKA
THE EFFECT OF SELECTED MIRNA CONSTRUCTS ON THE FUNCTIONS OF
HUMAN OVARIAN GRANULOSA CELLS
Lauková, M.1, Sirotkin, A.V2., Grossman, R.3, Ovcharenko D.4, Mlynček M.5
1 Fakulta biotechnológie a potravinárstva, SPU v Nitre, 2 Slovenské centrum poľnohospodárskeho výskumu, Nitra, 3
Inštitút živočíšnej výroby, Mariensee, Neustadt am Rübenberge, SRN, 4 Ambion-Asuragen, Inc., Austin, Texas, USA, 5
Fakultná nemocnica Nitra
Abstract
The aim of our experiment was to investigate the effects of several miRNA constructs,
recently discovered regulators of gene functions via RNA interference, on ovarian cell
functions. Human ovarian granulosa cells were isolated, transfected with 40 different miRNA
constructs and cultured for 2 days. Release of hormones (estradiol, testosterone and
progesterone) and apoptosis (expression of BAX) was analyzed using radioimmunoassay and
immunocytochemistry. It was observed that the majority of miRNAs decreased estradiol (mir15a, mir-29a, mir-126) and testosterone (mir-25, mir-20, mir-26a) release. Some miRNAs
were able either inhibit or stimulate progesterone release (inhibitors: mir-181a, mir-20, mir29, stimulators: mir-182, mir-122, mir-125). Several miRNAs appear to be inhibitors (mir-173p, mir-20, mir-135) or promoters (mir-136, mir-29a and mir-125a ) of ovarian cell apoptosis.
The obtained results represent the first demonstration of involvement of miRNAs in control of
ovarian cell functions.
Key words: miRNA, reproduction, hormone secretion, apoptosis, ovarian granulosa cells
153
Úvod
V súčasnosti sa hľadajú možnosti ako účinne ovplyvňovať reprodukčné procesy.
Intracelulárne mechanizmy regulácie proliferácie, apoptózy a sekrécie ovariálnych buniek ako
aj riadenie expresie génov zapojených do týchto procesov nie sú dostatočne preštudované.
Poznatky o regulácii, expresii a úlohe týchto génov umožnia lepšie spoznať mechanizmus
riadenia reprodukcie. Jedným z nástrojov ako skúmať funkciu génov a intracelulárne dráhy sú
mikroRNA (miRNA). Ide o krátke, nedávno objavené RNA molekuly, ktoré regulujú expresiu
mnohých génov na základe RNA interferencie väzbou na 3’neprekladanú oblasť mediátorovej
RNA (mRNA) (Mello a Conte, 2004). Týmto spôsobom inhibujú syntézu určitých proteínov
a tým pádom zasahujú do mnohých biologických procesov (Ambros, 2004). Existujú dôkazy
o účasti miRNA napr. v metabolizme tukov (Xu 2003), ontogenéze (Leaman et al, 2005),
diferenciácii (Dostie, 2003), v bunkovej proliferácii a apoptóze (Cimmino et al, 2005)
neovariálnych buniek. Vplyv miRNA na sekrečnú aktivitu buniek a reprodukčné funkcie
doposiaľ nebol preskúmaný. Cieľom nášho experimentu bolo preto preskúmať možnú účasť
miRNA v kontrole ovariálnych funkcií ľudí, konkrétne apoptózy a sekrečnej aktivity
granulóznych buniek.
Materiál a metodika
Ako materiál boli použité ovariálne granulózne bunky (GC) človeka získané
aspiráciou tekutiny z folikulov vaječníkov pacientiek FN Nitra pomocou injekčnej striekačky.
Následne sme bunky premyli prepipetovaním a centrifugáciou (10 min/1500 otáčok) v médiu
DMEM/F12 (BioWhittaker, Verviers, Belgium). Bunky sme resuspendovali na magnetickom
miešadle v médiu DMEM/F12 (BioWhittaker) a rozpipetovali do 96-komôrkových platničiek,
tzv. pre-mir Library plate #1 (Ambion, Texas, USA). V každej komôrke bola umiestnená
špecifická miRNA konštrukcia. Po pridaní transfekčného reagentu JetPEI (PolyPlustransfection, Illkirch, France) sme bunky transfekovali podľa návodu výrobcu transfekčného
reagentu. Platničky sme umiestnili na rocker do CO2 inkubátora pri 38,50C na dobu 4 hodín.
Z komôrok sme potom odstránili transfekčné médium a pridali čerstvé kultivačné médium DMEM/F12 (BioWhittaker) + 20% FCS (BioWhittaker) o množstve 200µl/ komôrku.
Platničky sme opäť nechali kultivovať na dobu 2 dní. Z každej komôrky sme potom odobrali
médium pre rádioimunoanalýzu (Münster, 1989) na stanovenie množstva secernovaného
testosterónu, estradioulu a progesterónu. Bunky sme zafixovali 4% paraformaldehydom.
Stanovenie percenta apoptotických buniek sme uskutočnili metódou imunocytochémie
(Osborn a Isenberg, 1994) pomocou protilátky viažúcej sa na pro-apoptotický BAX proteín
154
(Santa Cruz Inc., Santa Cruz, USA). Celkovo sme testovali 40 konštrukcií. Úspešnosť
transfekcie sme zistili pomocou analýzy expresie markerových proteínov CREB a GAPDH
bez a po transfekcii buniek siRNA konštrukciami, ktoré by mali potláčať túto expresiu.
Percento buniek obsahujúcich CREB a GAPDH sme stanovili pomocou imunocytochémie.
Výsledky boli spracované a vyhodnotené bežnými štatistickými metódami pomocou
programu Sigma Plot 9.0 (Systat Software, Inc., CA, USA).
Výsledky
Porovnaním s kontrolnou skupinou transfekcia siRNA pre markerové proteíny CREB
a GAPDH preukazne znižovala percento buniek obsahujúcich CREB (z 43,7% ± 3,8% na
30% ± 3,3%) a GADPH (z 51,5% ± 2,8% na 37,1% ± 3,3%), čo svedčí o úspešnosti
transfekcie.
Zistili sme, že väčšina miRNA znižovala sekréciu testosterónu (najmä mir-25, mir-20,
mir-26a) (Graf 1) a estradiolu (najmä mir-15a, mir-29a, mir-126) (Graf 2). Niektoré miRNA
boli schopné výrazne inhibovať (mir-181a, mir-20, mir-29) alebo stimulovať (mir-182, mir122, mir-125) sekréciu progesterónu (Graf 3). Určitý počet miRNA prejavil schopnosť značne
zvyšovať (mir-17-3p, mir-20, mir-135) alebo znižovať (mir-136, mir-29a, mir-125a) percento
apoptotických buniek (Graf 4).
30
.............................................................................................
6
Sekrécia testosterónu (pg/10 buniek/deň)
Graf 1: Vplyv transfekcie miRNA konštrukciami na sekréciu
testosterónu ľudskými granulóznymi bunkami in vitro
*
25
***
*
*
20
* *
**
**
*
*
* *
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
***
Control
Let-7a
Let-7b
Let-7c
mir-15a
mir-16
mir-17-3p
mir-24
mir-25
mir-26a
mir-95
mir-96
mir-92
mir-108
mir-122
mir-124
mir-133B
mir-134
mir-135
mir-144
mir-145
mir-146
mir-155
mir-181a
mir-182
Let-7d
Let-7g
mir-1
mir-18
mir-19a
mir-20
mir-27a
mir-28
mir-29a
mir-98
mir-99a
mir-100
mir-125a
mir-125b
mir-126
mir-136
15
155
6
30
Control
Let-7a
Let-7b
Let-7c
mir-15a
mir-16
mir-17-3p
mir-24
mir-25
mir-26a
mir-95
mir-96
mir-92
mir-108
mir-122
mir-124
mir-133B
mir-134
mir-135
mir-144
mir-145
mir-146
mir-155
mir-181a
mir-182
Let-7d
Let-7g
mir-1
mir-18
mir-19a
mir-20
mir-27a
mir-28
mir-29a
mir-98
mir-99a
mir-100
mir-125a
mir-125b
mir-126
mir-136
6
Sekrécia estradiolu (pg/10 buniek/deň)
50
45
40
35
1400
1300
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
Control
Let-7a
Let-7b
Let-7c
mir-15a
mir-16
mir-17-3p
mir-24
mir-25
mir-26a
mir-95
mir-96
mir-92
mir-108
mir-122
mir-124
mir-133B
mir-134
mir-135
mir-144
mir-145
mir-146
mir-155
mir-181a
mir-182
Let-7d
Let-7g
mir-1
mir-18
mir-19a
mir-20
mir-27a
mir-28
mir-29a
mir-98
mir-99a
mir-100
mir-125a
mir-125b
mir-126
mir-136
Sekrécia progesterónu (pg/10 buniek/deň)
Graf 2: Vplyv transfekcie miRNA konštrukciami na sekréciu
estradiolu ľudskými granulóznymi bunkami in vitro
60
55
.............................................................................................
*
*
*
**
*
* *
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
*
*
Graf 3: Vplyv transfekcie miRNA konštrukciami na sekréciu
progesterónu ľudskými granulóznymi bunkami in vitro
2000
1900
1800
*
1700
1600
1500
*
1200
*
1100
*
*
*
*
*
.............................................................................................
*
*
**
***
* **
** *
* *
**
* ***
0
156
Graf 4: Vplyv transfekcie miRNA konštrukciami na expresiu
BAX ľudskými granulóznymi bunkami in vitro
80
*
75
% buniek obsahujúcich BAX
70
65
60
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
*
*
*
*
*
*
*
...........................................................................................
*
* * *
*
*
* * *
*
*
* **
* *
*
* *
*
5
Control
Let-7a
Let-7b
Let-7c
mir-15a
mir-16
mir-17-3p
mir-24
mir-25
mir-26a
mir-95
mir-96
mir-92
mir-108
mir-122
mir-124
mir-133B
mir-134
mir-135
mir-144
mir-145
mir-146
mir-155
mir-181a
mir-182
Let-7d
Let-7g
mir-1
mir-18
mir-19a
mir-20
mir-27a
mir-28
mir-29a
mir-98
mir-99a
mir-100
mir-125a
mir-125b
mir-126
mir-136
0
Diskusia
Nami získané výsledky svedčia o tom, že niektoré miRNA majú účinok na sekrečnú
aktivitu a apoptózu granulóznych buniek. Na základe toho môžme usúdiť, že niekoľko
miRNA môže hrať úlohu v kontrole niektorých ovariálnych procesov.
Konštrukcia mir-1 znižovala množstvo vylúčeného estradiolu, progesterónu a tiež
expresiu pro-apoptotického BAX proteínu, ale neovplyvnila vylučovanie testosterónu. Je
známe, že skoré štádiá folikulogenézy sú typické tvorbou testosterónu, ktorý indukuje rozvoj
primordiálnych folikulov a slúži ako prekurzor pre tvorbu estrogénov v granulóznych
bunkách (GC) (Steckler et al, 2005). To môže svedčiť o úlohe mir-1 v tomto procese. Let-7b,
Let-7c, mir-133B a mir-134 naopak, znižovali vylučovanie testosterónu a progesterónu,
neovplyvňovali vylučovanie estradiolu a znižovali, prípadne neovplyvňovali expresiu BAX
proteínu. Je známe, že preovulačná fáza folikulogenézy je typická najmä produkciou
estradiolu proliferujúcimi GC (McNatty, 1979), čo naznačuje účasť uvedených miRNA v
raste a vývoji folikulov. Mir-16, mir-24, mir-122 a mir-182 výrazne zvyšovali vylučovanie
progesterónu a znižovali, prípadne neovplyvňovali sekréciu estradiolu, testosterónu a expresiu
BAX, čo môže byť nepriamym dôkazom o ich spolupôsobení v procesoch ovulácie,
luteinizácie GC a tvorbe corpus luteum, ktoré charakterizuje zvýšená sekrécia progesterónu
(Nussey a Whitehead, 2001). Mir-29a znižovala sekréciu všetkých stanovených hormónov,
zvyšovala expresiu BAX a týmto účinkom by mohla pôsobiť vo fáze regresie corpus luteum
ako aj v neskorom štádiu atrézie, ktoré sú typické zvýšenou apoptózou (Quirk et al, 2003).
Skorá fáze atrézie folikulov je charakteristická zvýšenou hladinou testosterónu v GC,
157
blokovaniu jeho premeny na estradiol a zvýšenou expresiou BAX proteínu, následkom čoho
všetky vyvíjajúce sa folikuly, okrem dominantného, podliehajú zániku (Billig et al,1993).
Mir-96, mir-92 a mir-15a svojim účinkom zodpovedajú uvedeným procesom a môžu v nich
zohrávať úlohu. Podľa našich meraní mir-15a zvyšovala percento buniek obsahujúcich proapoptotický BAX, čo je v súlade s údajmi Cimmino et al (2005), kedy mir-15a indukovala
apoptózu blokáciou génov pre anti-apoptotický Bcl-2 proteín v neovariálnych bunkách.
Nadobudnuté výsledky ako prvé svedčia o účasti miRNA v kontrole funkcií
ovariálnych buniek a ich možnom účinku vo folikulárnom vývoji a apoptóze. Mir-1 môže
svojím účinkom pôsobiť vo fáze rannej folikulogenézy a indukovať vývoj primordiálnych
folikulov. Následne Let-7b, Let-7c, mir-133B a mir-134 môžu nadväzovať na predchádzajúcu
fázu tým, že indukujú proliferáciu GC a tým aj rast a vývoj folikulov. Ovulácia, luteinizácia
a tvorba žltého telieska môžu byť sprostredkované mir-16, mir-24, mir-122 a mir-182
a následná luteolýza pomocou mir-29a. Atrézia folikulov môže byť v začiatku ovplyvnená
mir-96, mir-92 a mir-15a a v konečnej fáze, typickou rozsiahlou apoptózou, pomocou mir29a. miRNA možno pokladať za účinné regulátory reprodukčných procesov.
Záver
Zistili sme, že niektoré miRNA znižovali sekréciu testosterónu (najmä mir-25, mir-20,
mir-26a) a estradiolu (najmä mir-15a, mir-29a, mir-126). Niektoré miRNA boli schopné
výrazne inhibovať (mir-181a, mir-20, mir-29) alebo stimulovať (mir-182, mir-122, mir-125)
sekréciu progesterónu. Niekoľko miRNA prejavili schopnosť značne znižovať (mir-17-3p,
mir-20, mir-135) alebo zvyšovať (mir-136, mir-15a, mir-29a) apoptózu (expresiu BAX).
Naše pozorovania sú prvou demonštráciou, že miRNA konštrukcie môžu vystupovať ako
pozitívne alebo negatívne regulátory reprodukčných funkcií ľudí (ovariálnej steroidogenézy a
apoptózy).
Literatúra
Ambros, V. 2004: The functions of animal microRNAs. Nature, vol 431, September 2004.
Billig, H., Furata, I., Hsueh, A.J.W. 1993: Oestrogens inhibit and androgens enhance ovarian granulosa cell
apoptosis. Endocrinology 1993, 133:2204-2212.
Cimmino, A., Calin, G.A., Fabbri, M. et al 2005: miR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting BCL2.
Proceeding of the National Academy of Sciences of the USA 2005, 102(39):13944-13949.
Dostie J, Mourelatos Z, Yang M, Sharma A, Dreyfuss G. 2003: Numerous microRNPs in neuronal cells
containing novel microRNAs. RNA 9(2): 180-6. Erratum in: RNA 9(5): 631-2.
Leaman, D., Chen, P.Y., Fak, J. et al. 2005: Antisense-mediated depletion reveals essential and specific functions
of microRNAs in Drosophila development. Cell. 2005, 121(7):1097-1108.
McNatty KP, Makris A, DeGrazia C, Osathanondh R, Ryan KJ. 1979: The production of progesterone,
androgens, and estrogens by granulosa cells, thecal tissue, and stromal tissue from human ovaries in vitro. J
Clin Endocrinol Metab. 1979 Nov;49(5):687-99.
158
Mello, CC., Conte, D Jr. 2004: Revealing the world of RNA interference. Nature 2004, Sep 16;431(7006):33842.
Nussey, S., Whitehead, S. 2001: Endocrinology An Integrated Approach. BIOS Scientific Publishers Ltd, 2001.
ISBN 1 85996 252 1.
Quirk, S.M., Cowan, R.G., Harman, R.M., Hu, C.-L., Porter, D.A. 2004: Ovarian follicular growth and atresia:
The relationship between cell proliferation and survival. J. Anim. Sci. 2004. 82(E.Suppl.): E40-E52.
Steckler, T., Wang, J., Bartol F.F., Roy S.K., Padmanabhan V. 2005: Fetal programming: prenatal testosterone
treatment causes intrauterine growth retardation, reduces ovarian reserve and increases ovarian follicular
recruitment. Endocrinology 2005: 3185-3193.
Xu P, Vernooy SY, Guo M, Hay BA. 2003: The Drosophila microRNA Mir-14 suppresses cell death and is
required for normal fat metabolism. Curr Biol 13(9): 790-5.
Kontaktná adresa: Ing. Marcela Lauková, Katedra fzyiológie živočíchov, Fakulta
biotechnológie a potravinárstva, SPU v Nitre, email: [email protected]
h.doc.RNDr. Alexander Sirotkin, DrSc., VÚŽV SCPV, Oddelenie genetiky
a reprodukcie, Hlohovská 2, 949 92 Nitra, email: [email protected]
METABOLICKÉ PARAMETRE A ZLOŽENIE MLIEKA PRASNÍC PO PODÁVANÍ
PROBIOTÍK NA BÁZE BACILLUS
METABOLIC PARAMETERS AND COMPOSITION OF SOW´S MILK AFTER
ADMINISTRATION OF PROBIOTIC ON BASES OF GENUS BACILLUS
Link, R., Kováč, G., Húska, M., Novotný, J., Hisira, V.,
Univerzita veterinárskeho lekárstva, Košice, Komenského 73, 041 81, SR
Abstract
There were 2 x 16 hybrid sows included into the trial. Control and BioPlus 2B groups
were balanced according to the sow parity number. The trial lasted from 2 weeks before
farrowing until weaning at 4 weeks after farrowing.
Control group was fed with standard feed for lactating sows, experimental one was fed
with control feed (same as that of the control group) with 400 g BioPlus 2B/t feed which
equals 1.28x106 CFU/g feed. Probiotic preparation BioPlus 2B consisted of equal proportion
probiotic bacteria Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis, i.e. 1.6 x 109/g of preparation.
Milk-samples of all sows were collected on the 3rd and 14th day of lactation. Milksamples were analyzed for cholesterol, total lipids, protein, lactose and total solids. Blood
samples for determination of parameters of protein and lipid profile was taken on day 1 and
15 after parturition.
The experimental group had higher content of lipids and cholesterol in milk compared
with control group on day 3 and also on day 14 of lactation. The concentration of cholesterol
and total proteins had slightly decreasing tendency in both groups, e.g. cholesterol decreased
from 1.54%, 1.42% respectively, to 1.2% or 0.91%. On the other hand, concentration of
159
lactose increased on day 14 of lactation in both groups. No significant differences between
groups were observed in total solids and lactose concentration in sow’s milk.
Level of cholesterol in blood of experimental group increased. As a result, significant
higher cholesterol level was found in experimental group compared to control group on day
15 (P=0.038).
Similar to cholesterol, total lipids in blood of experimental group was significantly higher
in comparison to control group on day 15 (P=0.007).
Results of our experiment indicate that the probiotics based on representatives of the
genus Bacillus are able to affect the nutrient composition, e.g. total lipids and cholesterol, of
sow´s milk and consequently improve performance and average daily gains of suckling
piglets.
Introduction
Despite some advantages related to the use of antibiotics as stimulators of growth
some adverse effects related to such practice have also been noted, particularly development
of resistant bacterial strains and presence of antibiotic residua in the food chain of humans.
The use of antibiotic growth stimulators had been banned in Sweden and Finland before
admittance of these countries to EU and a little later Denmark also joined in this effort. The
states mentioned initiated gradual elimination of antibiotic stimulators throughout EU.
In relation to this it is clear that we should concentrate on finding other means of prevention
of the diarrhoeic syndrome of young of the farm animals and subsequent improvement in
animal growth. Great potential in this direction has been associated with probiotics. Probiotics
were characterised as microbial cellular preparations or components of microbial cells which
are beneficial to the health and well-being of the host (Salminen et al., 1999).
Recently, in addition to conventional probiotics based on genera Lactobacillus and
Bifidobacterium, preparations based on representatives of the genus Bacillus come into the
foreground. At present, we recognise 77 species belonging to the genus Bacillus, of which
the following are used most frequently: coagulans, subtilis, clausii, cereus, toyoi (Sanders et
al., 2003). In the agricultural sector, Bacillus licheniformis has also been used to improve the
health status of pigs and increase their weight gains. The advantage of spores as probiotics
was proved recently by La Ragione et al. (2001) who, after oral administration of Bacillus
subtilis to one-day-old chicks at a dose of 2.5 x 108, observed that all symptoms of infection
induced by previous inoculation of E. coli 078:K80 were suppressed. Germination of spores
of Bacillus cereus var. toyoi in the intestinal samples from broiler chicks was also confirmed
160
by other authors It seems that germination of spores in the digestive tract is a precondition of
the potential probiotic effect resulting in improvement of health and increased weight gains in
farm animals (Jadamus et al., 2001).
Material and methods
There were 2 x 16 hybrid sows - all with the same genetic background (Landrace, and
cross-bred, Landrace x Slovak White) included into the trial. Control and BioPlus 2B groups
was balanced according to the sows parity number. Both groups consisted of 8 uniparae and 8
multiparae.
From about 14 days before the anticipated farrowing date the sows were housed in
conventional farrowing crates. The trial lasted from 2 weeks before farrowing until weaning
at 4 weeks after farrowing. The weaning will take place from about 28 days.
Control group was fed with standard feed for lactating sows, experimental one was fed with
the same type of feed with 400 g BioPlus 2B/t feed, which equals 1.28x106 CFU/g feed.
In both groups the piglets received the same creep feed without additives until weaning.
Milk-samples of all sows were collected on the 3rd and 14th day of lactation from teats two
to six between 9.00 and 11.00 hrs. Milk-samples were analyzed for cholesterol, total lipids,
protein, lactose and total solids.
Blood samples for determination of selected parameters of protein and lipid profile was taken
on day 1 and day 15 after parturition. The blood was sampled from the eye sinus.
Results
In spite of the fact that no significant differences were noticed in concentration of total
lipids and cholesterol in milk, the experimental group had higher content of lipids and
cholesterol compared with control group on day 3 and also on day 14 of lactation. The
concentration of cholesterol and total proteins had slightly decreasing tendency in both
groups, e.g. cholesterol decreased from 1.54%, 1.42% resp., to 1.2% or 0.91%. On the other
hand, concentration of lactose increased on day 14 of lactation in both groups. No significant
differences between group were observed in total solids and lactose concentration in sow´s
milk (Table 1).
161
Table 1 Level of nutrients in sow´s milk
3rd day
14th day
TL - exp. group, g/100g
10.41±3.64 10.9±4.2
TL - control group, g/100g
9.14±3.80
9.31±2.31
TCh - exp. group, mmol.l-1
1.54±1.48
1.2±0.6
TCh - control group, mmol.l-1
1.42±0.85
0.91±0.35
TP - exp. group, g/100g
6.01±1.02
4.9±0.62
TP - control group, g/100g
6.16±1.55
4.69±0.49
TS - exp. group, g/100g
22.29±3.84 22.3±3.97
TS - control group, g/100g
21.26±4.32 20.54±2.09
Lactose - exp. group, g/100g
4.95±0.99
5.64±0.53
Lactose - control group, g/100g 5.06±0.99
5.77±0.35
TL – total lipids, TCh – total cholesterol, TP – total proteins, TS – total solids
Serum levels of total proteins were in physiological range and had increasing tendency in both
groups. Though no significant differences were revealed between groups, the increase was
higher in experimental group. The albumin level was relatively uniform during the experiment
and did not deflect from the reference range, but on the contrary to experimental group there
was slight decrease of albumin in control group on day 15. Serum urea level increased in
experimental and also in control group on day 15 in comparison with day 1. Level of urea in
blood ranged from 3.66 to 4.64 mmol.l-1. No significant differences were observed between
groups in individual sampling.
Level of cholesterol in blood of experimental group increased. On the contrast, cholesterol
level in control group was constant in both sampling. As a result, significant higher
cholesterol level was found in experimental group compared to control group on day 15
(P=0.038).
Similar to cholesterol, total lipids in blood of experimental group was significantly higher in
comparison to control group on day 15 (P=0.007). Total lipids in experimental group were
steady in both samplings, but serum lipids in control group decreased in second sampling, that
caused significant difference (Table 2).
162
Table 2
Level of total proteins, albumin, urea, total lipids and cholesterol in blood of swine
0th day
TP – exp. group, g.l-1
TP – contr. group, g.l
15th day
70.01±5.64 75.18±5.73
-1
70.88±4.26 72.93±8.21
Alb – exp. group, g.l-1
37.69±4.38 36.34±2.93
Alb – contr.. group, g.l-1
38.71±2.30 35.01±2.38
Urea – exp. group, mmol.l-1
3.80±1.06
4.65±0.95
Urea – contr. group, mmol.l-1 3.66±0.94
4.09±0.60
TL – exp. group, g.l-1
2.03±0.50
2.01±0.60*
TL – control group, g.l
2.30±0.50
1.47±0.43*
TCh – exp. group, mmol.l-1
2.03±0.62
2.25±0.58*
TCh – contr. group, mmol.l-1 1.84±0.36
1.83±0.47*
-1
* P < 0.05, TP – total proteins, Alb – albumin, TL – total lipids, TCh – total cholesterol
Discussion
Ahrens et al. (1992) conducted an experiment on weanlings and observed that
digestion of proteins in the small intestine of experimental pigs was significantly better (76%)
in comparison with that in the control (68%). In another experiment Ahrens et al. (1992)
recorded higher weight gains (by 13%) in the experimental group supplemented with BioPlus
2B in comparison with the control, however, the differences were insignificant. Bacillus
licheniformis and Bacillus subtilis produce proteases, amylase, and catalases, which may
explain better weight gains in the experimental group. About half of all industrially produced
proteases and amylases originate from bacteria of the genus Bacillus. These enzymes support
digestion of feed which is particularly important for the young of farm animals.
Our results are similar to Alexopoulos et al (2004), who also revealed higher serum
cholesterol concentration and serum lipids in experimental group. The increase in the values
normally occurring between the first and the 15th day postpartum was more pronounced in the
BioPlus 2B group, for both serum parameters examined.
Conclusion
Results of our experiment indicate that the probiotics based on representatives of the genus
Bacillus are able to affect the nutrient composition of sow´s milk and increase some metabolic
indices in blood.
163
References
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Ahrens F., Schmitz M., Warlies B.: Mikrobieller Zusatzstoff in der Ferkelfűtterung. Kraftfutter, 1992, 75,
418 – 420.
Alexopoulos, C., Georgoulakis, I.E., Tzivara, A., Kritas, S.K., Siochu, A., Kyriakis, S.C.: Field evaluation
of the efficacy of a probiotic containing Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis spores, on health status
and performance of sows and their litters. J. Anim. Physiol. Anim. Nutr., 2004, 88, 381 – 392.
Jadamus A., Vahjen W., Simon O.: Growth behaviour of a spore-forming probiotic in the gastrontestinal
tract of broiler chicken and piglets. Arch. Tierernahr., 2001, 54, 1 – 17.
La Ragione R.M., Casua G., Cutting S.M., Woodward M.J.: Bacillus subtilis spores competitively exclude
E. coli 078:K80 in poultry. Veterinary Microbiology, 2001, 79, 133 – 142.
Salminen S., Ouwehand A., Benno Y., Lee Y.: Probiotics: how should they be defined? Trends in Food
Science and Technology, 1999, 10, 107 – 110.
Sanders M.E., Morelli L., Tompkins T.A.: Sporeformers as human probitics: Bacillus, Sporolactobacillus,
and Brevibacillus. Comprehensive reviews in food science and food safety, 2003, 2, 101 – 110.
7.
Kontaktná adresa: MVDr. Robert Link, PhD., II. Interná klinika, UVL, Košice, 041 81
KONCENTRÁCIA STOPOVÝCH PRVKOV V INSEMINAČNÝCH DÁVKACH
LIŠIAKOV A KVALITA SPERMIÍ.
CONCENTRATION OF TRACE ELEMENTS IN INSEMINATION DOSES OF FOXES
AND SPERMATOZOA QUALITY.
Lukáč, N., Massányi, P., 1Trandžík, J., 2Slamečka, J., 2Jurčík, R.
Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre
1Štátný plemenársky ústav, Nitra,
2 Výskumný ústav živočíšnej výroby SCPV Nitra
Abstract
Development in industry and agriculture produce an infiltration of elements in the
food chain. This also promotes the distribution of essential elements in the animal body and
changes their interactions.
The purpose of this study was to determine cadmium, copper, lead, nickel, iron and
zinc concentration in fox insemination dose and to find relation between these contaminants
and the occurrence of pathological spermatozoa.
The semen samples were analyzed by atomic absorption spectrophotometry (AAS).
For analysis of pathological spermatozoa samples fixed with Hancock’s solution and stained
with Giemsa were prepared.
The concentrations of cooper, zinc and iron in insemination doses of foxes were found
to be 2.16±0.53 mg.kg-1, 13.09±5.22 mg.kg-1, and 33.16±24.36 mg.kg-1, respectively, on wet
weight basis. Concentration of cadmium was low (0.07±0.05 mg.kg-1). The levels of lead and
nickel in the insemination doses of foxes were 0.08±0.06 mg.kg-1 and 0.35±0.24 mg.kg-1
respectively. The total percentage of pathological spermatozoa was 7.76±1.33% with
164
predominance of knob twisted flagellum. In relation to trace elements the analysis shoved
significances (P<0,001) between iron level and total number of pathological spermatozoa.
These result also indicate, that concentration of trace element in insemination dose of
foxes they have direct effect to the sperm quality.
Key words: spermatozoa, insemination dose, fox, trace ellements
Úvod
Reprodukčný proces samcov závisí na komplexnom rade biologických vzťahov
zahrňujúcich mnoho orgánov, typov buniek, typov molekúl ako aj presnú časovú a
priestorovú koordináciu procesov. Nie je preto prekvapujúce, že tento zložitý biologický
systém je zraniteľný rozličnými environmentálnymi faktormi, fyzikálnymi ako aj
chemickými.
Škodlivé a deštruktívne účinky medi na gonády baranov po intoxikácii oxidom
meďnatým opísali Vrzgulová et al. 1993; Vrzgulová et al., 1995.. Šimoník et al., (1990)
zaznamenali zastavenie pohyblivosti spermií býka v koncentrácii 0,01 µg Cu po 270 - 300
minútach. Machal et al. (2002) zistili štatisticky preukaznú pozitívnu koreláciu medzi
hladinou medi v krvnej plazme a celkovým množstvom spermií v ejakuláte. Deficit zinku u
mladých samcov spôsobuje atrofiu semenotvorného epitelu, poškodzuje sa vývoj gonád, čo sa
primárne prejaví hypogonadizmom. U pohlavne dospelých samcov deficit zinku spôsobuje
poruchy v priebehu spermatogenézy. (Cigánková et al., 1994, 1997, 1998). Zinok sa
nachádza aj v spermiách. Podľa Kvista et al. (1985, 1987) a Reyesa et al. (1993) sa najviac
zinku nachádza v jadre spermií. V bičíku je viazaný na sulfhydrilové skupiny a disulfidické
väzby (Hidiroglou a Knipfel, 1984).
Neúmerné hladiny železa vplývajú toxicky na spermie a redukujú veľkosť semenníkov
mužov a potkanov (Lucesoli et al., 1999). Neúmerné hladiny železa pôsobia deštruktívne na
testikulárnu funkčnosť a spermatogenézu (Merker et al. 1996; Lucesoli et al., 1999).
Je dokázané poškodenie niekoľkých orgánov ako obličky, pečeň, pľúca, kosti,
semenníky, vaječníky vplyvom podania kadmia (Massányi a Uhrín, 1996; Gubrely et al.,
2004). Už pri nízkych dávkach kadmia semenníky stmavnú, sčervenajú a semenotvorný epitel
i intersticiálne väzivo podliehajú nekróze. Parenchým sa zmenšuje, hromadí sa v ňom
eozinofilná masa a zbytky bazofiných jadier. (Toman a Massányi, 1997). Podanie kadmia
má za následok poruchu spermiácie od štádia IX po neskoršie štádiá spermatogenézy v
semenotvornom epiteli (Scialli a Zinaman, 1993).
165
Acharya a Mishra (1995) zistili toxický účinok olova a patologické zmeny
semenníka vyvolávajúce atrofiu orgánu. Cytologickým rozborom ejakulátov intoxikovaných
zvierat olovom sa zistila aspermia, hypospermia, teratospermia a výrazné rozdielnosti v počte
spermií (Bell a Thomas, 1980). Kendall a Scanton (1981) zistili, že pridávanie olova
hrdličkám do vody počas rozmnožovacieho cyklu spôsobilo zníženie počtu spermií v ich
semenníkoch.
Das a Dasgupta (2002) dokázali negatívny vplyv niklu na enzýmy steroidogenézy
v semenníkoch čím dochádza k alteráciam formovania testosterónu. Vplyvom niklu dochádza
k poklesu hladín cholesterolu, kyseliny askorbovej a zníženiu aktivity kľúčových enzýmov
steroidogenézy. Pandey et al. (1999) zistili, že po dlhodobobom podávaní niklu myšiam sa
výrazne vyskytli abnormality spermií, ktoré sa prejavili poklesom motility a koncentrácie
spermií. ako aj alterácie testikulárnych enzýmov. Intraperitoneálna aplikácia chloridu
nikelnatého (NiCl2) myšiam vyvoláva pokles množstva a motility spermií, dochádza k
chromozomálnym aberáciam ako aj ultraštrukturálnemu poškodeniu semenníka (Li a Wang,
1989).
Materiál a metódy
Ako materiál boli vybraní siedmi lišiaci (farma Korytov, VÚŽV Nitra), ktorí boli
pripravovaní na odber niekoľko týždňov vopred. Odber bol vykonaný dvakrát do týždňa
elektroejakuláciou, v celkovej anestéze použitím zmesi kyslíka a 5% halotanu kedy boli samci
fixovaní na špeciálnom stolíku. Po odbere celej ejekcie sa dodalo potrebné množstvo riedidla
podľa získaných hodnôt. Aktivita pred zmrazením sa u všetkých lišiakov pohybovala od 50
do 70% a tepelné testy boli medzi 10 - 20 % u všetkých zvierat. Osmolarita používaných
riedidiel bola od 650 do 850 mOsm.
Pre stanovenie kovov v biologických materiáloch boli použité metódy atómovej
absorpčnej spektrofotometrie s atomizáciou v plameni (FAAS) a elektrotermickou
atomizáciou v grafitovej kyvete s pyrolytickou vrstvou (ETAAS) (Juarsovic a Telisman,
1993). Pri metóde ETAAS bol použitý atómový absorpčný spektrofotometer Varian
SpectrAA 20 BQ s elektrotermickým atomizátorom GTA 96. Pri metóde FAAS bol použitý
atómový absorpčný spektrofotometer Varian SpactrAA 300A.
Pri analýze výskytu patologických spermií sme zhotovovali z inseminačných dávok
nátery na podložné sklíčka (Gamčík et al., 1992). Mikroskopické preparáty náterov sme
hodnotili pomocou optického mikroskopu Olympus BX 51 (Tokyo, Japan). Z každej
166
inseminačnej dávky sme zhotovili dva mikroskopické preparáty na, ktorých sme hodnotili
v priemere 1000 spermií. (Gamčík et al., 1992; Massányi et al., 1996).
Zo získaných výsledkov laboratórnych analýz sme pomocou štatistického programu
GraphPad Prism 3.02 (GraphPad Software Incorporated, San Diego California USA) a MS
Excel 2003 (Microsoft Corporation, USA, ID 73408-640-0789605-57229) vypočítali
základné štatistické ukazovatele, jednofaktorovú analýzu variácií pomocou Dunettovho testu
a vypočítali korelácie.
Výsledky
Na základe výsledkov stanovenia hladín sledovaných prvkov (meď, zinok, železo,
kadmium, olovo a nikel) v inseminačných dávkach sme vyhodnotili základné štatistické
ukazovatele, ktoré sú uvedené v tabuľke 1. Hladiny sledovaných prvkov mali veľké
smerodajné odchýlky čiže samotná variabilita sledovaného ukazovateľa bola vysoká. Hladiny
stanovovaných prvkov v inseminačných dávkach boli veľmi variabilné v závislosti od
plemenníka.
Koncentrácie sledovaných ťažkých kovov(x ± SD) v inseminačných dávkach zvierat
Tabuľka 1
Prvok
Líšiaci (7)
Cu (mg.kg-1)
2,16 ± 0,53
Zn (mg.kg-1)
13,09 ± 5,22
Fe (mg.kg-1)
33,16 ± 24,36
Cd (mg.kg-1)
0,07± 0,05
Pb (mg.kg-1)
0,08 ± 0,06
Ni (mg.kg-1)
0,30 ± 0,24
Analýza sledovaných inseminačných dávok lišiakov preukázala, že obsah medi je 2,16
mg.kg-1, s minimálnou hodnotou 1,00 a maximálnou 2,50 mg.kg-1. Priemerný obsah železa je
33,16 mg.kg-1, maximálnou hodnotou 74,78 mg.kg-1 a minimálnou hodnotou 9,43 mg.kg-1.
Koncentrácia zinku v inseminačných dávkach lišiakov sa pohybuje od 7,40 do 21,12 mg.kg-1,
s priemernou koncentráciou 13,09 mg.kg-1. Pri sledovaní obsahu kadmia v inseminačných
dávkach sme zistili, že priemerná koncentrácia kadmia je 0,07 mg.kg-1 s minimálnou zistenou
hodnotou 0,03 a maximálnou 0,17 mg.kg-1. Priemerný obsah olova bol 0,08 mg.kg-1
s minimálnou hodnotou 0,03 a maximálnou 0,20 mg.kg-1. Pri sledovaní obsahu niklu bol
167
zistený obsah 0,3 mg.kg-1 v rozpätí od 0,05 do 0,83 mg.kg-1. Najviac vyrovnané hladiny
prvkov v inseminačných dávkach lišiakov sa zistili v prípade medi a zinku (v % 24,29%
a 39,91%).
Zastúpenie patologicky malformovaných spermií v jednotlivých inseminačných
dávkach plemenníkov prezentuje tabuľka 2.
Z celkového počtu sledovaných spermií u lišiakov bolo patologických len 7,76%,
pričom 3,22% boli kľučkovite stočené bičíky, 1,99% vo forme hlavičiek bez bičíkov, 0,33%
malo zlomený bičík, 0,30% malo torzo bičíka, 0,30% zvinutie bičíka (klbko), 0,29% retenciu
cytoplazmatickej kvapky, 0,21% malo akrozomálne zmeny, 0,09% veľkú hlavičku, 0,01%
malú hlavičku a 1,02% tvorili iné patologické formy spermií. V inseminačných dávkach boli
najviac zastúpené klučkovite stočené bičíky, ktoré tvorili až 41,96% s celkového počtu
patologických spermií, 25,64% tvorili zmeny zatriedené ako hlavičky bez bičíka, 4,25%
zlomené bičíky, 3,87% torzo bičíka, 3,87% zvinutie (klbko) bičíka, 3,74% retencie
cytoplazmatickej kvapky, 2,71% akrozomálne zmeny, 1,16% veľké hlavičky, 0,13% malé
hlavičky 13,14% tvoria iné formy patologických spermií.
Výskyt jednotlivých foriem patologických spermií (%) v sledovaných inseminačných
dávkach plemenníkov vo vzťahu k celkovému počtu sledovaných spermií
Tabuľka 2
Patologická zmena (%)
Lišiaci (7)
Celkový počet patologických spermií 7,76±1,33
Kľučkovité stočenie bičíka
3,22±1,01
Hlavička bez bičíka
1,99±0,82
Torzo bičíka
0,33±0,18
Zlomený bičík
0,30±0,18
Retencia cytop. kvapky
0,30±0,22
Akrozomálne zmeny
0,29±0,17
Veľká hlavička
0,21±0,25
Malá hlavička
0,09±0,11
Zvinutie (klbko) bičíka
0,01±0,03
Iné patologické spermie
1,02±0,48
V inseminačnej dávke lišiakov sme zistili vysokú preukaznosť (P<0,001) medzi
celkovým percentuálnym zastúpením patologických spermií a hladinou železa (Obr. 1)
v sledovanej matrici.
168
Obrázok 1
Korelačná analýza preukázala silnú pozitívnu koreláciu v inseminačných dávkach
lišiakov medzi:
•
hladinou medi a olovom (r=0,85);
•
prvkami a patologickými zmenami:
o meďou a inými formami patologických spermií; zinkom a zlomeným bičíkom;
železom a retenciou cytoplazmatickej kvapky; kadmiom a hlavičkou bez bičíka;
kadmiom a retenciou cytoplazmatickej kvapky;
•
patologickými zmenami:
o celkovým počtom zmenených spermií a hlavičkou bez bičíka; hlavičkou bez bičíka
a veľkou hlavičkou; torzom bičíka a malou hlavičkou; torzom bičíka a zlomeným
bičíkom; malou hlavičkou a veľkou hlavičkou; malou hlavičkou a akrozomálnymi
zmenami; malou hlavičkou a zlomeným bičíkom; akrozomálnymi zmenami a inými
formami patologických spermií.
Diskusia
Spermie v ejakuláte nie sú tak citlivé na meď i kadmium ako spermie bez semennej
plazmy (Scialli a Zinaman, 1993). Z našej práce je zrejmé, že v inseminačných dávkach sú
vysoké korelačné závislosti medzi kadmiom a meďou (r=0,74), kadmiom a olovom (r=0,77) a
meďou a olovom (r=0,71). Cigánková et al., (1994) zistili, že zinok je nepostrádateľný pre
normálny priebeh spermatogenézy. Neúmerné hladiny železa pôsobia deštruktívne na
169
testikulárnu funkčnosť a spermatogenézu (Merker et al., 1996; Lucesoli et al., 1999).
Huang et al, (2001) zistili vplyv mangánu, železa a olova na motilitu spermií a peroxidáciu
lipidov. Z našich výsledkov je zrejmé, že vysoká preukaznosť medzi hladinou železa
v inseminačnej dávke a výskytom patologických spermií je zapríčinené výrazným vplyvom
železa na peroxidáciu lipidov a tým deštrukčnosť jednotlivých komponentov spermií. Fiorini
et al., (2004) a Liao et al., (2006) dokazujú vplyv kadmia na subcelularnu inkorporáciu
albumínu a prípadnú dislokáciu v thin junction Sertoliho buniek a zonula occludens. V našom
experimente sme v inseminačných dávkach lišiakov zistili nízku hladinu kadmia. Je
pravdepodobné, že mäsožravce, potravou príjmajú nižšie koncentrácie rizikových stopových
prvkov ako bylinožravce. Massányi et al. (2007) zistili výrazný vplyv olova na semenník
potkanov. Popisujú pokles relatívneho objemu semenotvorného epitelu pri vysokej
koncentrácii olova. Signifikantné zvýšenie počtu abnormálnych spermií zistil Acharya et al.
(2003) po podaní olova pričom došlo aj k zvýšenej peroxidácii lipidov. Znížená pohyblivosť
spermií môže byť spôsobená zvýšeným výskytom spermií s morfologickými abnormalitami
(Kasker, 1994). Väčšina poznatkov sa zameriava na vplyv niklu na obličky (Gitliz et al.
1975), pečeň (Knight et al. 1991). Nikel je vysoko karcinogénny prvok (Costa et al., 2005).
Naše výsledky poukazujú na fakt, že nikel priamo ovplyvňujú výskyt patologických spermií
v inseminačných dávkach. Tieto poznatky je možné nepriamo porovnať s výsledkami prác
Danadeviho et al., (2003), ktorí zistili pozitívnu koreláciu medzi percentuálnym výskytom
defektov bičíka spermií a koncentráciou niklu v krvi zváračov.
Predložená práca jednoznačne konštatuje vysoké vzájomné závislosti medzi
sledovanými ťažkými kovmi v inseminačných dávkach ako aj závislosti s niektorými formami
patologických spermií.
Poďakovanie
Výskum bol realizovaný za finančnej podpory projektov VEGA 1/2417/05 a 1/4347/07.
Literatúra
ACHARYA U. R. – MISHRA, P.: Lead induced histopatholological changes in the testes of Swiss mice. Adv.
Biosci., 1995, 14, 37-44.
ACHARYA, U. R. – ACHARYA, S. – MISHRA, M.: Lead Acetate Induced Cytotoxicity in Male germinal Cells
of Swiss Mice. In: Industrial Health, 2003, 41, 291-294.
BELL, J. U. – THOMAS, J. A.: Effects of lead on mammalian reproduction. In: Lead toxicity. eds. SINGHAL,
R. L. – THOMAS, J. A.: Baltimore, 1980, 169-185.
CIGÁNKOVÁ, V. - MESÁROŠ, P. - BÍREŠ, J. - LEDECKÝ, V. - CIGÁNEK, J. - TOMAJKOVÁ, E.:
Morfologické zmeny semenníkov žrebcov pri deficite zinku. In: Slov. Vet. Čas., 1998, 23,. 97-100.
170
CIGÁNKOVÁ, V. - MESÁROŠ, P. - BÍREŠ, J. - RAVASOVÁ, O. - ČERNOTA, S. - TOMAJKOVÁ, E.:
Vplyv zinku na morfológiu a prežívateľnosť spermií hlbokozmrazeného semena býkov. In: Slov. Vet. Čas.,
1997, 22,. 266-269.
CIGÁNKOVÁ, V. - MESÁROŠ, P. - BÍREŠ, J. - TOMAJKOVÁ, E. - ČERNOTA, S. Morfologická štruktúra
semenníkov býkov pri deficiencii zinku a vplyv aplikácie prípravku Zindep inj. na obnovu spermatogenézy.
In: Slov. Vet. Čas., 1994, 19, 134-138.
COSTA, M. – DAVIDSON, T. L. – CHEN, H. – KE, Q. – ZHANG, P. – YAN, Y. – HUANG, CH. – KLUZ, T.:
Nickel carcinogenesis: Epigenetics and hypoxia signaling. In: Mutat. Resch. 2005, 528, 345-355
DANADEVI, K. – ROZATI, R. – REDDY, P. P. – GROVER, P.: Semen quality of Indian welders
occupationally exposed to nickel and chromium. In: Reprod Toxicol. 2003, 17, 451-456.
DAS, K. K. – DASGUPTA, S.: Effect of Nickel Sulfate on Testicular Steroidogenesis in Rats during Protein
Restriction. In: Environ. Health Perspectives, 2002, 110, 923-926.
FIORINI, C. - TILLOY-ELLUL A. – CHEVALIER, S. – CHARUEL, C. – POINTS, G.: Sertoli cell junctional
proteins as early targets for different classes of reproductive toxicants. In: Reprod. Toxicol., 2004, 18, 413421.
GUBRELAY, U. – MEHTA, A. – SINGH, M. – FLORA, S. J.: Comparative hepatic and renal toxicity of
cadmium in male and female rats. In: J. Environ. Biol. 2004, 25, 65-73
HIDIROGLOU, M. A. - KNIPFEL, J.E. Zinc in mammalian sperm. A review. In: J. Dairy Sci., 1984, 67, 11471156.
HUANG, Y. L. – TSENG, W. C. – LIN, T. H. In vitro effects of metal ions (Fe2+, Mn2+, Pb2+) on sperm
motility and lipid peroxidation in human semen. In: J. of Toxicol. Environm. Health-part A, 2001, 62, 259267.
JURASOVIC, J. – TELIŠMAN, S. Determination of Lead and Cadmium in Human Seminal Fluid by
Electrothermal Atomic Absorbtion Spectrometry. In: J. Analytic Atomic Spectrometry, 1993, 8, 419-425.
KASKER, H. T.: The relationship between morphology, motility, and Zone pellucida binding potential of human
spermatozoa. In: Andrologia, 1994, 26, 1-4.
KENDALL, R.J. - SCANLON, P.F. Effects of chronic lead ingestion on reproductive characteristics of ringed
turtle doves Streptopelia risoria and on tissue lead concentrations of adults and their protein. In: Environ.
Poll., 1981, 26, 203-213.
KNIGHT, J. A. – PLOWMAN, M. R. – HOPFER, S. M. – SUNDERMAN JR., F. W. 1991. Pathological
reactions in Lung, Liver, Thymus, amd Spleen of Rats after Subacute Parenteral Administration of Nickel
Sulfate. In: Ann.Clin. Lab. Sci., 1991, 21, 275-283.
KVIST, U. - BJÖRNDAHL, L. - KJELLBERG, S. Sperm nuclear zinc. Chromatin stability and male fertility.
In: Scanning Microscopy, 1987, 1, 1241–1247.
KVIST, U. - BJÖRNDAHL, L. - ROOMANS, G.M. - LINDHOLMER, CH. Nuclear zinc in human epididymal
and ejaculated spermatozoa. In: Acta Physiol. Scand., 1985, 125, 297-303.
LI, J. – WANG, X.: Toxic effect of nickel chloride on testis of mice. In: Weisheng Dulixue Zazhi, 1989, 3, 222224.
LIAO, X. – TERADA, N. – OHNO, N. – LI, Z. – FUJII, Y. – BABA, T. – OHNO, S.: Immunohistochemical
study of serum albumin in normal and cadmium-treated mouse testis organs by “in vivo cryotechnique”. In:
Histol. Histopathol, 2006, 21, 35-40.
LUCESOLI, F. – CALIGIURI, M. – ROBERTI, M. F. – PERAZZO, J. C. – FRAGA, C. C.: Dose dependent
increase of oxidative damage in the testes of rats subjected in acute iron overload. In: Arch. Biochem.
Biophys., 1999, 372, 37-43.
MÁCHAL, L. – CHÁLEK, G. – STRAKOVÁ, E.: Copper, phosphorus and calcium in bovine blood and seminal
plasma in relation to semen quality. In: Journal of Animal and Feed Sciences, 2002, 11, 425-435
MASSANYI, P. – LUKAC, N. – ZEMANOVA, J. – MAKAREVICH, A. – CHRENEK, P. – FORGACS, ZS. –
SOMOSY, Z. – CIGANKOVA, V. – TOMAN, R. – LAZOR, P.: Effect of nickel administration in vivo on
the testicular structure in mice. In: Acta Veterinaria (Brno), 2007, accepted.
MASSÁNYI, P. – UHRÍN, V.: Histological changes in the ovaries of rabbits after an administration of
Cadmium. In: Reprod. Dom. Anim., 1996, 31, 629-632.
MERKER, H. J. – VORMANN, J. – GUNTHER, T.: Iron-induced injury of rat testis. In: Andrologia, 1996, 28,
267-273.
PANDEY, R. – KUMAR, R. – SINGH, S. P. – SAXENA, D. K. – SRIVASTAVA, S. P.: Male reproductive
effect of nickel sulphate in mice. In: Biometals., 1999, 12, 339-346.
REYES, J. G. - ARRATE, M. P. - SANTANDER, M. - GUZMAN, L. - BENOS, D J. Zn (II) transport and
distribution in rat spermatids. In: Am. J. Physiol., 1993, 265 (Cell Physiol. 34), 893–900.
SCIALLI, R.A. – ZINAMAN, J.M. Reproductive toxicology and infertility. In: McGraw-Hill Inc., New York,
1993, 338 s.
171
ŠIMONÍK, I. - PAVELKA, J. - KUDLÁČ, E. The spermiotoxicity of selected chemical elements (Cr, Cu, Zn) in
vitro. In: Reprod. Dom. Anim., 25, 1990, 242-246.
TOMAN, R. – MASSÁNYI, P.: Štrukturálne zmeny semenníka a prísemenníka králika po podaní kadmia. In:
SPU, Nitra, 1997. 83 s. ISBN 80-7137-420-2.
VRZGULOVÁ, M. – BÍREŠ, J. – VRZGULA, L.: The effects of copper from industrial emission on the
somniferous epithelium in rams. In: Reprod. Dom. Anim., 1993, 28, 108–118.
VRZGULOVÁ, M. – BÍREŠ, J. – VRZGULA, L.: The microscopic structure of the testes in breeding rams after
experimental copper oxide intoxication form industrial emissions. In: Folia Veterinaria, 1995, 39, 101–106.
Norbert
Lukáč,
Ph.D.,
Katedra
fyziológie
živočíchov,
Fakulta
biotechnológie
a potravinárstva, SPU v Nitre, Tr. A. Hlinku 2, 949 76 Nitra, [email protected]
REPRODUKČNÉ PARAMETRE PRI CHRONICKEJ INTOXIKÁCII ŤAŽKÝMI
KOVMI U POTKANOV
REPRODUCTION PARAMETERS IN CHRONIC INTOXICATION WITH HEAVY
METALS IN RATS
Lukačínová, A1., Beňačka, R2., Lovásová, E2., Hijová, E3., Ništiar, F2.,
1Ústav
fyziológie, 2Ústav patologickej fyziológie, 3Ústav experimentálnej medicíny, Lekárska fakulta, UPJŠ Košice
Abstract
Summary: The aim of the present investigation was to evaluate the effects of chronic
intoxication with low doses of lead, mercury and cadmium dissolved in drinking water (200times above maximal permissible dosage) on reproductive potency of 80 Wistar rats (40
males; 40 females) and the physical health of their progeny. The animals were divided into 4
groups - control (C) and 3 groups intoxicated by metals (Pb, 100 µmol/l; Hg, 1 µmol/l, Cd, 20
µmol/l, respectively). Females gave births from 13th to 78th week of experiment. Parameters
of reprotoxicity such as number of litters, total number of newborns (assigned in the birth
day), number of newborns per litter and number of weanlings (raised youngs that reached
28th day of life) were measured in 13-week intervals. The data revealed that the number of
litters and number of newborns in rats exposed to either Pb and Hg were significantly higher
compared either to C or Cd group (P<0.05) and increased in the following order: Hg>Pb>Cd.
Thus, while the highest numbers of litters and total count of offsprings was observed in Hg
group (P <0.05), in Cd group they barely differed from control. From 13th to 39th week of
exposition the number of newborns per litter was higher in all intoxicated groups compared to
control (P<0.05). The burst of fertility ceased on 52nd week and later the number of newborns
per litter decreased in intoxicated animals dramatically. In contract to above, the numbers of
weanlings in intoxicated groups evolved in entirely opposite way. The numbers obtained from
intoxicated groups were always lower compared to control (p<0.05 – 0.001) and the survival
rate decreased in the order: Cd>Pb>Hg (Cd vs. Pb p <0,05, Pb vs. Hg p <0.001). The
172
exposition to mercury, thus, induced the highest reproduction rate on account of lowest
survival rate of off-springs. Similar co-relations applied to other metals, too. The results
suggest, that increase in reproduction rate early after intoxication onset may disclose certain
reactive adaptation mechanisms. Nevertheless, number of weanlings appears to be most
practical marker as to the outcome of progeny in reprotoxicity tests.
Úvod
Kontaminácia životného prostredia, vrátane zdrojov pitnej vody je stále aktuálnejší
problém. Napriek tomu ju nesmieme akceptovať ako zákonitú realitu rozvoja spoločenského
bytia. Denno denne je potrebné zaoberať sa týmto problémom a poukazovať na skutočnosti,
ktoré ju môžu doprevádzať. Rozvoj priemyslu bol nutne spojený s novým spôsobom
znečistenia vodných zdrojov (Bencko a spol., 1995). Pokiaľ sú tieto zdroje kontaminované
nadlimitnými koncentráciami sú prijímanie racionálne opatrenia na ich eliminiáciu. Vplyv
ťažkých kovov na rôzne fyziologické a biochemické parametre bol v odbornej literatúre
v celku podrobne analyzovaný pre akútne intoxikácie. Pomerne málo údajov je už k dispozícii
pre chronické, najmä celoživotné podmienky. Čo sa týka chronickej expozície veľmi nízkymi
dávkami ťažkých kovov a multigeneračných štúdií intoxikácie rôznymi kovmi sú v literatúre
len ojedinelé zmienky (Sutou a spol., 1980; Paksy a spol., 1996). Problémom je kontaminácia
nízkymi dávkami. Práve chronická expozícia takýmito nízkymi dávkami môže mať ťažko
predvídateľné následky nielen pre tie generácie, ktoré sú priamo exponované, ale najmä pre
budúce. To nás motivovalo k multigeneračnej štúdií chronickej intoxikácie subtoxickými
dávkami ťažkých kovov.
Hlavným cieľom štúdia bolo sledovanie vybraných fyziologických, reprodukčných
a biochemických parametrov vo vzťahu ku chronickej (celoživotnej) expozícii potkanov
kmeňa Wistar veľmi nízkymi dávkami vybraných ťažkých kovov (olovo, kadmium a ortuť),
za účelom výberu vhodných indikátorov chronickej intoxikácie nízkymi dávkami ťažkých
kovov. V tejto práci prezentujeme časť výsledkov z parentálnej generácie a vplyvu na
reprodukčné parametre.
Materiál a metodika
Zvieratá: Do pokusu sme zaradili 80 potkanov kmeňa Wistar (40 samičiek a 40
samcov, vo veku 4 týždňov, priemernej hmotnosti 120±19 g) a narodené mláďatá do veku 28.
dní (po 28. dni boli preradené do iného pokusu). Potkany boli držané v klietkach 1 samec a 1
samička s voľným prístupom k vode a potrave. Svetelný režim bol 12 hodín svetlo 12 hodín
173
tma. Pokus bol ukončený na 156. týždeň trvania. Experimenty boli vykonané na pracovisku
Centrálny zvieratník LF UPJŠ, ktoré má akreditáciu na chov laboratórnych zvierat a na
vykonávanie pokusov na zvieratách v súlade s príslušnými legislatívnymi ustanoveniami.
Pokusy boli schválené Etickou komisiou LF UPJŠ ako aj ŠVPS SR Č.k. Ro-7879/04-220/3.
Usporiadanie pokusu: Zvieratá boli náhodne zaradené do 4 skupín (10 samíc a 10
samcov, 1 párik v každej klietke). Prvá skupina (kontrola; n=10) prijímala čistú vodu. Druhá
skupina (Pb; n=10) vodu s obsahom octanu olovnatého zásaditého v koncentrácii 100 µmol/l
(t.j. 20,0 mg olova/l pitnej vody, čo zodpovedalo 200 násobku MPK (maximálne prípustnej
koncentrácii) vo vode. Tretia skupina (Cd; n=10) vodu s obsahom chloridu kademnatého
dvojvodého v koncentrácii 20 µmol/l (t.j. 2,0 mg kadmia/l pitnej vody, zodpovedajúcemu 200
násobku MPK vo vode. Štvrtá skupina (Hg; n=10) vodu s obsahom chloridu ortutnatého
v koncentrácii 1 µmol/l (t.j. 0,2 mg ortuti/l pitnej vody, zodpovedajúcej 200 násobku MPK vo
vode.
U všetkých skupín sme sledovali a vyhodnocovali každý týždeň nasledovné
reprodukčné parametre: počet vrhov, počet vrhnutých mláďat (stanovené v deň narodenia),
počet odchovaných mláďat (počet mláďat 28. deň po narodení) a ich dynamiky.
Štatistické metódy: Vyhodnotenie výsledkov, výpočty a štatistické spracovanie boli
vykonané s použitím Microsoft Excel a štatistické výpočty (priemerné hodnoty, smerodajné
odchýlky, párový a nepárový t-test doplnený U-testom Wilcox-Mann-Whitney) boli počítané
v programe Statgraphic. Na vyhodnotenie štatistickej významnosti zistených hodnôt bola
použitá jednocestná ANOVA s Newman-Keulsovým post-hoc testom.
Výsledky a diskusia
Obdobie vrhu mláďat trvalo od 13. do 78. týždňa pokusu. Na naše veľké prekvapenie
v skupinách exponovaných olovom a ortuťou bol počet vrhov (pôrodov) podstatne vyšší, ako
v kontrolnej skupine (Tab. 1). Mierne nižší počet vrhov bol zaznamenaný v skupine
exponovanej kadmiom. Štatistická významnosť medzi skupinami bola nasledovná: C vs Pb (P
= 0,0008); C vs Cd (P = 0,0878); C vs Pb (P = 0,0006); Pb vs Cd (P = 0,0008); Pb vs Hg (P =
0,0421) a Cd vs Hg (P = 0,0027). Pri porovnaní dynamiky vrhov sa počet vrhov v skupine so
suplementáciou ortuti a olova stúpal do 26. týždňa a potom počet vrhov vykazoval klesajúci
trend. V prípade kontrolnej skupiny stúpajúci trend pretrvával až do 39. týždňa a potom začal
klesať. Zaujímavé bolo pri kadmiu, že v priebehu prvých 52. týždňoch bol počet vrhov
vyrovnaný a potom začal klesať. Aj keď je tento ukazovateľ takto samo osebe málo
174
preukazný, v porovnaní s údajmi o počte narodených mláďat, počte novorodencov na vrh a
najmä počtu odstavených mláďat (Tab. 1). Tieto štyri parametre poskytujú dobré východisko
pre posúdenie reprotoxicity expozície ťažkými kovmi.
Tab. 1 – Vybrané reprodukčné ukazovatele v 78. týždni pokusu
Ukazovateľ
C
Pb
Cd
Hg
Počet vrhov
98
106
90
128
Počet mláďat na vrh
7,69
8,05
7,84
7,93
Celkový počet mláďat
754
853
706
1015
Celkový počet odstavených mláďat
686
599
606
574
% odstavených mláďat
91
70,2
85,8
56,6
Gonády sú považované za dôležitý terč toxických látok z prostredia (Sokol, 1997).
Kadmium pôsobí prednostne cez depriváciu vylučovania testosterónu, cez os hypotalamushypofýza-semenníky (Lafuente a spol., 2001). Aj keď väčšina prác prezentuje negatívny
účinok je potrebné si uvedomiť, že intoxikácia bola s podstatne väčšími dávkami, ako
v našich podmienkach. Predpokladáme, že nami použité nízke koncentrácie ťažkých kovov
v prvej etape aktivujú biologické mechanizmy smerujúce k zachovaniu druhu (vrátane
aktivácie reprodukčných funkcií), a negatívne pôsobenie nastupuje až po prekročení určitého
príjmu toxickej noxy.
Podobne ako počet vrhov, aj počet mláďat bol najvyšší v skupine exponovanej ortuťou,
signifikatne vyšší bol aj v skupine exponovanej olovom. V skupine exponovanej kadmiom
bol takmer zhodný s kontrolnou skupinou. V tomto ukazovateli boli medzi všetkými
skupinami štatisticky významné rozdiely. C vs Pb (P = 0,0003); C vs Cd (P = 0,0366), C vs
Hg (P = 0,0006); Pb vs Cd (P = 0,0004); Pb vs Hg (P = 0,0172) a Cd vs Hg (P = 0,0013). Pri
vyjadrení v absolútnych počtoch v skupine kontrolnej sa narodilo za celé obdobie pokusu 754
mláďat, v skupine intoxikovanej kadmiom to bolo len 706, oproti tomu v skupine s olovom to
bolo 853 a ortuťou až 1015 novorodencov. Aj to potvrdzuje nás predpoklad, že ide o
adaptačnú odpoveď na prostredie so záťažovým faktorom (zvýšené pozadie toxického
ťažkého kovu). Podobne zvýšený počet vrhnutých mláďat ale za vysokého úhynu počas
prvých dvoch týždňov zistili aj iní autori pri štúdiu s chronickou expozíciou, ale pri podstatne
vyšších dávkach ťažkého kovu (Sutou a spol., 1980; Paksy a spol., 1996).
Pri hodnotení dynamiky počtu vrhnutých mláďat počas pokusu boli výsledky veľmi
podobné počtu vrhov. V prípade ortuti a olova sa narodila väčšina mláďat do 26. týždňa
175
pokusu, oproti tomu v kontrole a pri kadmiu to bolo okolo 39. týždňa. Vo väčšine skupín bol
počet novorodencov rovnaký okolo 52. týždňa a potom postupne klesal až do konca 78.
týždňa. V tomto období bol významnejší pokles len v skupine intoxikovanej olovom.
Počet novorodencov na vrh (obr. 1) je jedným z najdôležitejších ukazovateľov
reprotoxicity vo všeobecnosti. Prekvapením bolo, že do 39. týždňa najnižší počet mláďat na
vrh bol zaznamenaný v kontrolnej skupine, zatiaľ čo vo všetkých pokusných skupinách bol
počet mláďat vyšší. Na 52. týždeň boli počty mláďat na vrh porovnateľné a potom významne
začali klesať najmä v intoxikovaných skupinách.
Snáď najdôležitejším ukazovateľom reprotoxicity je počet odstavených mláďat, t.j.
jedincov, ktorí sa dožili 28. dňa svojho života (Tab. 1) a to najmä v percentuálnom vyjadrení
z počtu narodených mláďat. Do konca pokusu bol najnižší počet odstavených mláďat
v skupine intoxikovanej ortuťou (574 mláďat), v skupinách s olovom (599 mláďat)
a kadmiom (606 mláďat) bol počet porovnateľný a najvyšší bol podľa očakávania
v kontrolnej skupine (686 mláďat). Rozdiely za celé trvanie pokusu boli štatisticky významné
pri porovnaní skupín C vs Cd (P = 0,0386); Pb vs Cd (P = 0,0444) a Pb vs Hg (P = 0,0003).
Dynamika počtu odstavených mláďat (obr. 2) sa podobala počtu narodených mláďat.
Obr. 1 - Počet mľáďat na vrh
počet mľáďat na 1 vrh
10
9
8
C
Pb
Cd
Hg
7
6
5
4
13 26 39 52 65 78
trvanie pokusu v
týždňoch
Pri porovnaní percenta prežívajúcich mláďat z počtu narodených (obr. 2) boli
významné rozdiely medzi skupinami C vs Pb (P = 0,0217); C vs Hg (P = 0,0039); Pb vs Cd (P
= 0,0022); Pb vs Hg (P = 0,0204) a Cd vs Hg (P = 0,0018).
176
Obr 2 - Percento odstavených
mľáďat
% odstavených mľáďat
100
90
80
70
C
Pb
Cd
Hg
60
50
40
30
20
10
13 26 39 52 65 78
trvanie pokusu v
týždňoch
Záver
Na základe získaných poznatkov tak fyziologických, ale najmä ukazovateľov
reprotoxicity je možné konštatovať, že získané výsledky sú do určitej miery prekvapivé.
Významne lepšie reprodukčné parametre zistené v skupinách exponovaných ťažkými kovmi
sú v protiklade s morfologickými ukazovateľmi, ktoré v prípade skupín exponovaných
ťažkými kovmi, či už ohľadom výskytu tumorov alebo morfologických zmien boli podstatne
horšie a v kontrolnej skupine neboli zistené (zaostávanie v raste, bezchvostosť, kožné zmeny,
najmä vypadávanie srsti až alopécia, krvácanie do telových dutín, hnačky a pod.). Zaujímavé
výsledky bude možné na základe našich pokusov očakávať v ďalších filiálnych generáciách.
Aby bolo možné nami získané výsledky ďalej kriticky prehodnotiť a interpretovať bude
potrebné v ďalšom štúdiu pokračovať a doplniť sortiment sledovaných parametrov
o biochemické, imunologické a genetické ukazovatele, najmä na potvrdenie a presného
mechanizmu a úlohy reaktívnych foriem kyslíka a metalotioneínu pri chronickej intoxikácii
ťažkými kovmi (Sato a Kondoh, 2002), vplyv na vrodenú ako aj adaptívnu zložku imunitných
mechanizmov (imunokompetenciu), aké ochranné mechanizmy sú aktivované v záujme
vysporiadania sa so zvýšeným pozadím subtoxických koncentrácii ťažkých kovov v prostredí
(Singh a spol., 2003; Biser a spol., 2004). Mimoriadne zaujímavou otázkou s perspektívou je
aj štúdium mechanizmov karcinogenézy pri dlhotrvajúcom príjme nízkych (netoxických)
dávok ťažkých kovov (Waalkes, 2003; Waisberg a spol., 2003).
177
Literatúra:
1. Bencko, V. - Cikrt, M. - Lener, J.: Toxické kovy v životním a pracovním prostředí člověka. Grada Publ.,
Praha, 1995: 282 s.
2. Biser, J.A. – Vogel, L.A. – Berger, J. – Hjelle, B. – Loew, S.S.: Effects of heavy metals on
immunocompetence of white-footed mice (Peromyscus leucopus). J. Wildlife Dis., 40, 2004: 173-184.
3. Lafuente, A. – Márquez, N. – Pérez-Lorenzo, M. – Pazo, D. – Esquifino, A.I.: Cadmium effects on
hypothalamic-pituitary-testicular axis in male rats. Exp.Biol.Med., 226, 2001: 605-611.
4. Paksy, K. – Varga, B. – Lazar, P.: Effect of cadmium on female fertility, pregnancy and postnatal
development in the rat. Acta Physiol.Hung., 84, 1996: 119-130.
5. Sato, M. – Kondoh, M.: Recent studies on metallothionein: protection against toxicity of heavy metals and
oxygen free radicals. Tohoku J. Exp. Med., 196, 2002: 9-22.
6. Singh, V.K. – Mishra, K.P. – Rani, R. – Yadav, V.S. – Awasthi, S.K. – Garg, S.K.: Immunomodulation
by lead. Immunol.Res., 28, 2003: 151-166.
7. Sokol, R.Z.: The hypothalamic-pituitary-gonadal axis as a target for toxicants. In: Sipes, I.C. – McQueen,
C.A. – Gandolfi, A.J. (Eds.): Comprehensive Toxicology. Vol. 10. Elsevier Science, Oxford, 1997: 87-98.
8. Sotou, S. – Yamamoto, K. – Sendota, H. – Sugiyama, M.: Toxicity, fertility, teratogenicity, and dominant
lethal tests in rats administered cadmium subchronically. II. Fertility, teratogenicity, and dominant lethal
tests. Ecotoxicol.Environ.Saf., 4, 1980: 51-56.
9. Waalkes, M.P.: Cadmium carcinogenesis. Mutat.Res., 533, 2003: 107-120.
10. Waisberg, M. – Joseph, P. – Hale, B. – Beyersmann, D.: Molecular and cellular mechanisms of cadmium
carcinogenesis. Toxicology, 192, 2003: 95-117.
Kontaktná adresa:
Prof. MVDr. František Ništiar, CSc.,
Department of Pathological Physiology
Faculty of Medicine, Šafárik University
Trieda SNP 1, 040 66 Košice, Slovak republic
Phone: +421 55 640 22 79
Fax: +421 55 642 33 50
E-mail: [email protected]
VPLYV BIOFLAVONOIDOV NA HLADINU GLYKÉMIE U ALOXÁNOVÉHO
DIABETU U POTKANOV
THE EFFECT OF BIOFLAVONOIDS ON GLYCAEMIA LEVELS IN ALLOXAN
DIABETIC RATS
1
Lukačínová, A., 2Beňačka, R., 3Mojžiš, J., 2Ništiar, F.
1Ústav fyziológie, 2Ústav patologickej fyziológie a 3Ústav farmakológie, Lekárska fakulta UPJŠ Košice
Abstract
The aim of the present study was to evaluate the possible protective effects of quercetin and
chrysin in experimental alloxan-induced diabetes in rats (n=60). Alloxan was injected at a
single dose of 60 mg/kg (to the tail vein) for diabetes induction. Flavonoids quercetin (single
dose 50 mg/kg; orally) and chrysin (single dose 50 mg/kg; orally) were administered daily for
3 days prior and 7 days after alloxan injection. Alloxan induced a significant increase of
glycaemia (p<0.001) in comparison with control animals. Both quercetin and chrysin
prevented serum glucose elevation, although, protective effect of chrysin was weaker
(p<0,001 vs. p<0.05). On the other hand, glycosuria was increased in all groups of animals
receiving alloxan. We suggest that protective effect of used flavonoids in experimental
diabetes mellitus may be related to their antioxidative/chelatory properties. Increased
178
glycosuria indicated that inhibition of renal glucose reabsorption may also play role in
hypoglycemic effect of both flavonoids.
Úvod
Za posledné roky sa zhromaždil celý rad údajov o úlohe oxidačného stresu v patogenéze
diabetes mellitus. Počas diabetu sú voľné radikály tvorené pri oxidácii glukózy, neenzýmovej
glykácii bielkovín a následnom katabolizme glykovaných proteínov (Mehta a spol., 2006).
Vysoké hladiny voľných radikálov pri súčasnom poklese antioxidačných obranných
mechanizmov môžu viesť ku poškodeniu bunkových organel a enzýmov (El Naggar a spol.,
2005), zvýšenej proxidácii lipidov a rozvoju inzulínovej rezistencie. Tieto následky
oxidačného stresu môžu spustiť rozvoj komplikácií diabetes mellitus. Na základe týchto
nových poznatkov sa upriamila pozornosť aj na kauzálnu antioxidačnú terapiu, napr. na
flavonoidy.
Flavonoidy (viac ako 6000) predstavujú veľkú a veľmi významnú skupinu folyfenolov
v rastlinách. Nachádzajú sa v mnohých bežne konzumovaných rastlinných požívatinách ako
ovocie, zelenina, víno, čaj a kakao (Ross a Kasum, 2002). Je všeobecne akceptované, že
dietetické polyfenoly môžu mať významnú úlohu v ochrane organizmu pred rôznymi
chronickými ochoreniami, ako sú napr. nádory, kardiovaskulárne ochorenia (Mojžišová
a spol., 1999; Karaca a spol., 2006), a diabetes mellitus (Knekt a spol., 2002). Flavonoidy
môžu uplatňovať svoj antioxidačný účinok rôznymi mechanizmami, napr. zhášaním alebo
lapaním voľných radikálov, chelatáciou kovových iónov alebo inhibíciou enzýmových
systémov zapojených do tvorby voľných radikálov (Dias a spol., 2005). O aloxáne je známe,
že vyvoláva nekrózu β-buniek pankreasu (Dunn a McIechie, 1943). Bolo tiež preukázané, že
aloxán indukuje tvorbu H2O2 a niektorých voľných radikálov ako O2•− a OH−, ktoré po
počiatočnom poškodení môžu viesť až ku smrti buniek (Soto a spol., 1994). Z uvedených
dôvodov sme sa rozhodli pre vyššie uvedený model štúdia patogenézy diabetes mellitus.
Cieľom nášho štúdia bolo overiť preventívny účinok flavonoidov kvercetínu a chryzínu
na aloxánom indukovaný diabetes mellitus u potkanov.
Materiál a metodika
Chemické látky: Aloxán (A), kvercetín (Q) a chryzín (Ch) boli od firmy Sigma
Chemical Company (St. Louise, MO).
Zvieratá: Do pokusu sme zaradili 60 potkanov, samcov kmeňa Wistar (150-180 g, vo
veku 8 týždňov) z vlastného chovu. Pokusy boli schválené Etickou komisiou LF UPJŚ
179
a SVPS SR. Zvieratá boli držané v celoskelených metabolických klietkach za kontrolovaných
podmienok (22±1 °C, vlhkosť 60±5 %, 12 h svetlo:12 h tma) s voľným prístupom k
štandardnej komerčnej diéte (LD) a vody ad libitum. Každé ráno boli stanovené: hmotnosť,
spotreba krmiva a vody, výdaj moča.
Indukcia a ošetrenie diabetes: Diabetes bol vyvolaný jednou i.v. injekciou aloxánu v
dávke 60 mg/kg živej hmotnosti po 16 hod hladovaní. Glykémie boli stanovené denne 3 dni
pred a 7 dní po podaní aloxánu. Za diabetické boli považované potkany u ktorých bola zistená
glykémia nad 16 mmol/l a glykozúria..
Potkany boli ošetrené flavonoidmi (kvercetín a chryzín) desať dní po sebe (od 3. dňa
pred aplikáciou po 7. deň po aplikácii aloxánu) per os žalúdkovou sondou. V deň podania
aloxánu boli flavonoidy aplikované 1 hodinu pred aloxánom.
Usporiadanie pokusu:
Potkany boli náhodne rozdelené do 6 skupín (n = 10) nasledovne:
Skupina I (C): kontrolné zvieratá, dostali vehikulum v ktorom boli flavonoidy
rozpustené (karboxymetyl celulózu, 1 % sondou) a namiesto aloxánu fyziologický roztok
(podobne aj v skupinách II-III).
Skupina II (Q50): zvieratá boli ošetrené s Q v dávke 50 mg/kg ž.hm.
Skupina III (Ch50): zvieratá boli ošetrené s Ch v dávke 50 mg/kg ž.hm.
Skupina IV (DC): zvieratá ošetrené aloxánom (60 mg/kg ž.hm., i.v.). U potkanov
prepukol diabetes po dvoch dňoch po aplikácii aloxánu reprezentovaný hyperglykémiou
a glykozúriou.
Flavonoidy aj aloxán boli aplikované v skupinách V (A+Q50) – VI (A+Ch50), kde
flavonoidy boli aplikované ako v skupinách II-III.
Biochemické vyšetrenia: Hladiny glukózy v krvi a moči boli zisťované vždy ráno
komerčným enzýmovým spektrofotometrickým (BioLaTest, Lachema,ČR).
Štatistická analýza: Údaje prezentované ako priemer±S.E.M. Štatistické porovnanie
vykonané dvocestnou variačnou analýzou (ANOVA) a Student-Neuman-Keulsovým post hoc
testom. Za signifikantnú bola považovaná hodnota p < 0,05.
180
Výsledky
Účinok kvercetínu (Q) a chryzínu (Ch) na hladinu glykémie u potkanov sú zhrnuté
v grafe 1. Údaje o prírastku hmotnosti, príjme potravy a vody, výdaja moča, glukózovom
indexe a asimilačnom koeficiente sú uvedené v Tab. 1.
30
glykémia v mmol/l
25
C
Q5O
Ch50
DC
A+Q50
A+Ch50
20
15
10
5
0
-3 -2 -1 2 3 4 5 6 7
dni pred a po aplikácii aloxánu
Obr. 1. Účinok kvercetínu (Q) a chryzínu na glykémiu. C – nediabetická kontrola (n=10);
Q50 – nediabetické ošetrené Q (n=10); Ch50 – nediabetické ošetrené Ch (n=10); DC –
diabetické kontroly bez terapie (n´10); A-Q50 – diabetické ošetrené Q (n=10); A-Ch50 –
diabetické ošetrené Ch. (n=10)
Table 1. – Vybrané charakteristiky potkanov ošetrených Q a Ch
Skupina
Prírastok
Príjem
Príjem
Výdaj
GI
AQ
hmotnosti (g)
potravy (g)
vody (ml)
moča (ml)
C
32±3
19,6±4
26,8±6
14,8±2
1,61
0,99
Q50
29±4
21,3±4
27,7±5
16,1±2
1,69
0,99
Ch50
31±5
22,3±6
28,6±8
18,4±3
1,69
0,97
A
-2±5
32,6±7
96,0±16
92,9±9
0,58
0,46
A+Q50
27±6
22,2±4
28,1±4
19,3±4
1,35
0,95
A+Ch50
18±7
26,8±6
52,2±7
38,1±5
1,15
0,78
GI = glukózový index (glukóza v potrave/glykémia); AQ = asimilačný koeficient (glukóza v
potrave/výdaj glukózy močom).
V prípade normoglykemických zvierat kvercetín oproti chryzínu mierne znížil glykémiu
(p = 0,034). U diabetických zvierat mali oba bioflavonoidy signifikantný účinok na zníženie
181
glykémie, ktorý bol výraznejší pri kvercetíne (p<0,001). Podobne mal kvercetín významne
lepší vplyv aj na ostatné sledované parametre (Tab. 1).
Glykozúria bola u všetkých diabetických skupín signifikantne zvýčená oproti
nediabetickým zvieratám (obr. 2). Ukázalo sa, že kvercetín aj u tohto ukazovateľa mal
významný pozitívny
účinok, zatiaľ čo u chryzínu tento efekt nebol výrazný, kvercetín
výrazne obmedzil nárast glykozúrie oproti diabetickej kontrolnej skupine (p<0,001) ako aj
proti skupine ošetrenej chryzínom (p<0,05). Chryzín preukazoval mierny účinok na zvýšenie
vylučovania glukózy močom aj u nediabetických zvierat. Tento výsledok naznačuje, že
v hypoglykemizujúcom efekte chryzínu môže zohrávať určitú úlohu vylučovanie glukózy
obličkami.
glukóza v moči mmol/l
600
500
400
A
B
300
200
100
0
C
Q50
Ch50
DC
A+Q50 A+Ch50
skupina (A = na začiatku pokusu; B = na konci
pokusu)
Obr. 2. Primerné hodnoty glykozúrie u potkanov po podaní kvercetínu a chryzínu. Legenda
ako pri obr. 1.
Diskusia
Oxidatívny stres ako významný činiteľ v patogenéze diabetes a diabetických
komplikácií bol v posledných rokov intenzívne študovaný tak na animálnych modeloch, ako
aj u pacientov v klinických štúdiách. Význam peroxidácie lipidov a oxidačného stresu
v patogenéze diabetu bol potvrdený aj na animálnych modeloch (Anjaneyulu a Chopra,
2004).
Účinok aloxánu pri selektívnej deštrukcii β-buniek pankreasu bol prvý krát popísaná
v roku 1943 (Dunn a McIechie; 1943). Od tej doby viacerí autori potvrdili úlohu voľných
182
radikálov pri poškodzovaní buniek aloxánom. Aloxán, ako chemický diabetogén, je
v prítomnosti glutatiónu redukovaný cez aloxánový hemiacetál na aloxantín. V priebehu
tohto redukčného cyklu sa uvoľňujú reaktívne formy kyslíka, ktoré poškodzujú β-bunky
pankreasu (Winterbourn a Munday, 1989). V toxicite aloxánu sa pripisuje významná úloha aj
prechodným kovom ako je, železo, zinok a meď (Szkudelski, 2001).
V predloženej štúdii sme potvrdili, že kvercetín, čiastočne aj chryzín, mali preventívny
účinok na rozvoj glykémie a čiastočne aj glykozúrie u aloxánového diabetu u potkanov.
Podobné výsledky boli popísané ohľadom normalizácie glykémie kvercetínom u potkanov so
streptozotocínom indukovaným diabetes (Mahesh a Manon, 2004; Coskun a spol., 2005).
O chryzíne sme literárne údaje v tomto ohľade nenašli.
Ak predpokladáme antioxidačný mechanizmus tohto antidiabetogenného efektu
vysvetlením rozličných účinkov u oboch flavonoidov v naších pokusoch môže byť ich odlišná
štruktúra. Tá môže zohrávať významný vplyv na ich antioxidačné vlastnosti (Chen a spol.,
2002), pretože pre účinné zhášanie voľných radikálov sa vyžadujú 3’,4’-dihydroxy skupiny
(katecholová štruktúra) v beta kruhu, ktoré u chryzínu, na rozdiel od kvercetínu chýbajú (obr.
3, Tab. 2).
Obr. 3. Základná štruktúra flavonoidu
Tab.2. Chemická štruktúra kvercetínu a chryzínu
Flavonoid
Substituents
3
5
7
2´
3´
4´
5´
Quercetin
OH
OH
OH
H
OH
OH
H
Chrysin
H
OH
OH
H
H
H
H
Uvedené štruktúrne rozdiely medzi oboma flavonoidmi môžu byť zodpovedné za ich
odlišný mechanizmus a efektívnosť účinku. Kvercetín okrem výrazných antioxidačných
účinkov (zhášanie voľných radikálov) disponuje aj výraznými chelatačnými účinkami
(Okamoto, 2005). Oproti tomu má chryzín len mierne antioxidačné účinky a nemá chelatačné
vlastnosti (Furusawa a spol., 2005).
183
Naše výsledky preukazujú, že denné ošetrenie 50 mg/kg ž.hm. kvercetínu per os má
preventívny účinok na nový aloxánom indukovaného diabetes mellitus a obmedzí nárast
glykémie zvierat v hornom rozsahu hodnôt euglykémie. Menej výrazný účinok chryzínu, ale
najmä významný glykozurický efekt sú pravdepodobne výsledkom ich odlišného
mechanizmu. Jedným z vysvetlení je, že mnohé flavonoidy môžu účinne inhibovať
reabsorpciu glukózy v obličkových tubuloch inhibíciou sodík-glukózových symportérov
(Hongu et al., 1998; Maghrani et al., 2005).
To, že oba flavonoidy znižujú glykémiu môže priniesť viaceré klinické aplikácie pri
prevencii komplikácií diabetes. Presné mechanizmy účinku bude potrebné ďalej študovať.
Záver
Naše výsledky naznačujú, že kvercetín a čiastočne aj chryzín vykazujú ochranný
(preventívny) účinok na aloxánom indukovaný diabetes mellitus u potkanov. Predpokladáme,
že to spočíva v ich antioxidačných, resp. chelatačných účinkoch. Navyše, na ich
hypoglykemizujúcom účinku sa môže významne podielať aj inhibícia reabsorpcie glukózy
v obličkových tubuloch.
Táto práca bola podporovaná Grantovou agentúrou Ministerstva školstva SR (VEGA
1/3494/06).
Literatúra
1.
Anjaneyulu, M. – Chopra, K.: Quercetin, an anti-oxidant bioflavonoid, attenuates diabetic nephropathy in
rats. Clin.Exp.Pharmacol.Physiol., 31, 2004: 244-248.
2. Chen, J.W. – Zhu, Z.Q. – Hu, T.X. – Zhu, D.Y.: Structure-activity relationship of natural flavonoids in
hydroxyl radical-scavenging effects. Acta Pharmaco. Sin., 3, 2002: 667-672.
3. Coskun, O. – Kanter, M. – Korkmaz, A. – Oter, S.: Quercetin, a flavonoid antioxidant, prevents and
protects streptozotocin-induced oxidative stress and β-cell damage in rat pancreas. Pharmacol.Res., 51,
2005: 117-123.
4. Dias, A.A. – Porawski, M. – Alonso, M. – Marroni, N. – Collado, P.S. – González-Gallego, J.:
Quercetin decreases oxidative stress, NF-κB activation, and iNOS overexpression in liver of streptozotocininduced diabetic rats. J.Nutr., 135, 2005: 2299-2304.
5. Dunn, J.S. – McIechie, N.G.B.: Experimental alloxan diabetes in the rat. Lancet, 245, 1943: 484-487.
6. El Naggar, E.M.B. – Bartošíková, L. – Žemlička, M. – Švajdlenka, E. - Rabišková, M. – Strnadová, V.
– Nečas, J.: Antidiabetic effect of Cleome droserifolia aerial parts: Lipid peroxidation-induced oxidative
stress in diabetic rats. Acta Vet.Brno, 74, 2005: 347-352.
7. Karaca, T. – Cemek, M. – Kanter, M.: Lipid peroxidation and antioxidant levels, and alpha naphtyl
acetate esterase activity of peripheral blood lymphocytes in mallard, muscovy and pekin ducks. Acta
Vet.Brno, 75, 2006: 33-38.
8. Knekt, P. - Kumpulainen, J. - Järvinen, R. – Rissanen, H. – Heliövaara, A. – Hakulinen, T. – Aromaa,
A.: Flavonoid intake and risk of chronic diseases. Am.J.Clin.Nutr., 76, 2002: 560-568.
9. Maghrani, M. – Michel, J.-B. – Eddouks, M.: Hypoglycaemic activity of Retama raetam in rats.
Phytother.Res., 19, 2005: 125-128.
10. Mahesh, T. – Menon, V.P.: Quercetin allievates oxidative stress in streptozotocin-induced diabetic rats.
Phytother. Res., 18, 2004: 123-127.
184
11. Mehta, J.L. – Rasouli, N. – Sinha, A.K. – Molavi, B.: Oxidative stress in diabetes: A mechanistic
overview of its effects on atherogenesis and myocardial dysfunction. Int.J.Biochem.Cell.Biol., 38, 2006:
794-803.
12. Mojžišová, G. – Petrášová, D. – Koprovičová, J.: Flavonoids with antioxidant action and their effect on
human health. Slovakofarma Rev., 9, 1999: 35-37.
13. Okamoto, T.: Safety of quercetin for clinical application (Review). Int.J.Mol.Med., 16, 2005: 275-278
14. Ross, J.A. – Kasum, C.M.: Dietary flavonoids: bioavailability, metabolic effects, and safety.
Ann.Rev.Nutr., 21, 2002: 19-34.
15. Soto, C. – Muriel, P. – Reyes, J.L.: Pancreatic lipid peroxidation in alloxan-induced diabetes mellitus.
Arch.Med. Res., 25, 1994: 377-380.
16. Szkudelski, T.: The mechanism of alloxan and streptozotocin action in B cells of the rat pancreas.
Physiol.Res., 50, 2001: 536-546.
17. Winterbourn, C.C. – Munday, R.: Glutathione-mediated redox cycling of alloxan. Mechanisms of
superoxide dismutase inhibition and of metal-catalyzed OH formation. Biochem.Pharmacol., 38, 1989: 271277.
Kontaktná adresa:
Prof. MVDr. František Ništiar, CSc.,
Department of Pathological Physiology
Faculty of Medicine, Šafárik University
Trieda SNP 1, 040 66 Košice, Slovak republic
Phone: +421 55 640 22 79
Fax: +421 55 642 33 50
E-mail: [email protected]
VPLYV POSTAVENIA CECKOV A TYPU TOKU MLIEKA NA JEDNOTLIVÉ
PARAMETRE TOKU MLIEKA
EFFECT OF TEAT PLACEMENT AND MILK FLOW PATTERN ON MILK FLOW
PARAMETERS
Mačuhová L., Uhrinčať M., Margetín M., Mačuhová J., Tančin V.
Výskumný ústav živočíšnej výroby, SCPV, Hlohovská 2, Nitra, [email protected]
Abstract
Milk flow is influenced by anatomy of udder, teat (size, shape, placement teat) and neuro –
humoral reaction ewes on milking. Mainly traits of teat and cistern are considered very good
parameters of milkability ewes by machine milking. The trial was performed with 70 ewes. We
evaluated milk flow, cisternal depth and teat placement. Cisternal depth and teat placement were
evaluated by a linear evaluation system (cisternal depth /HC/: 1 point – shallow, 9 points – deep;
teat placement /PC/: 1 point – vertical, 9 points - horizontal). From 165 measured milk flow were
27 % unimodal (1V), 48 % bimodal (2V), 22 % plateau I (PI ) and 3 % plateau II (PII). Ewes with
more horizontally positioned teats had higher the volume of milk yield 0.233 ± 0.041 l /≤ 3 points/,
0.343 ± 0.031 l /4 points/, 0.394 ± 0.028 l /5 points/, 0.411 ± 0.023 l /≥6 points/; P < 0,0004) and
machine milk yield (0.180 ± 0.038 l /≤3 points/, 0.279 ± 0.028 l /4 points/, 0.296 ± 0.026 l /5
points/, 0.303 ± 0.022 l /≥6 points/; P < 0,0183). The traits of milkability were 63 ± 2 s, 15 ± 1 s,
0.946 ± 0.046 l/min, 0.217 ± 0.012 l by the time of machine milking, latency, maximal milk flow
and milk yield of the first emission at bimodality. There were observed positive and significant
185
correlations (P < 0,0001) between these traits (maximal flow, yield in 30s, yield in 60 s, yield after
the first peak of milk flow from machine milking, except latency) and milk yield, machine milk
yield. Positive and significant correlations were between yield (milk yield, machine milk yield) and
PC, HC.
Úvod
Charakteristiky dojenia a morfológia vemena patria medzi faktory, ktoré ovplyvňujú dojiteľnosť
oviec. Znalosti o úžitkovosti, čase dojenia a stavbe vemena sú nevyhnutné pre optimálne
prispôsobenie prostredia dojenia pre potreby bahnice.
Veľkosť, tvar a utváranie vemena sú dané geneticky (Fernández a kol., 1997) a hrajú dôležitú
úlohu v uložený mlieka medzi dojeniami a uvoľňovaní mlieka v čase dojenia (Labussière, 1988).
Preto sa v poslednej dobe kladie dôraz na lineárny systém hodnotenia vlastností vemena. Tieto
údaje sa využívajú hlavne pre budúce genetické selekčné programy (de la Fuente a kol., 1996;
Margetín a kol., 2005).
Dojiteľnosť môže byť hodnotená pomocou analýz kriviek tokov mlieka, charakteristík dojenia
a meraní, hodnotení morfologických vlastností vemena (Dzidic a kol., 2004). Vzťahy medzi
morfologickými a produkčnými vlastnosťami u dojných oviec sú analyzované ako výsledok
anatomických a fyziologických charakteristík (Caja a kol., 2000).
Preto sme sa v tejto práci zamerali na vplyv typu toku mlieka a postavenia ceckov na jednotlivé
parametre toku mlieka.
Materiál a metóda
Experiment sa uskutočnil v mesiaci máj na účelovom hospodárstve Slovenského centra
poľnohospodárskeho výskumu Nitra v Trenčianskej Teplej. Do pokusu bolo zaradených 70 bahníc
plemien cigája, zošľachtená valaška, lacaune. Ovce boli dojené dvakrát denne v dojárni 1 x 24.
Parametre dojacieho zariadenia boli: frekvencia pulzácie 180 cyklov za minútu, pulzačný pomer
50:50 a podtlak 40 kPa. Merania sme uskutočnili počas troch po sebe nasledujúcich večerných
a troch raňajších dojení. Z ukazovateľov lineárneho popisu vemena sa podľa metodiky Margetína
(2002) hodnotila hĺbka cisterny a postavenie ceckov deň pred začatím pokusu. Meranie parametrov
intenzity toku mlieka sme robili podľa metodiky Marneta a Negraoa (2000). Klasifikácia dynamiky
toku mlieka sa hodnotila podľa metodiky Bruckmaiera a kol. (1997) a Rovai a kol. (2002).
Celkovo sme hodnotili 165 priebehov toku mlieka. K štatistickému hodnoteniu sme použili Proc
Mixed Model štatistického programu SAS/ 8.2 (2002). Sledovali sme vplyv typu toku mlieka
(jednovrcholový – nebimodálny (1V), dvojvrcholový – bimodálny (2V), vyrovná fáza toku mlieka
dlhšia ako 20 s a maximálnym tokom mlieka nad 0,4 l/min (PI) a pod 0,4 l/min (PII)) a postavenia
186
ceckov (1.skupina ≤ 3 body, 2. skupina = 4 body, 3. skupina = 5 bodov, 4. skupina > 6 bodov
lineárnej škály). Štatistická významnosť vplyvu jednotlivých faktorov zahrnutých do modelu bola
stanovená použitím Fisherovho F-testu. Pre pozorované vlastnosti sme k stanoveniu rozdielností
v rámci jednotlivých efektov použili Scheffeho multiple range test.
Výsledky
Základné ukazovatele dojiteľnosti oviec zaradených do pokusu sú uvedené v tabuľke 1. Zistili
sme pomerne veľkú variabilitu nameraných parametrov úžitkovosti a charakteristík toku mlieka.
Celkový výdojok bol 0,400 ± 0,013 l, pričom množstvo mlieka získaného dodájaním tvorilo 24,30
± 1,32 %. Čas dojenia sa pohyboval od 19 do 150 s. Bimodalita bola zaznamenaná pri 80 tich
tokoch mlieka. Čas začiatku toku druhého vrcholu toku mlieka bol 42 ± 1 s. Z celkového počtu
nameraných tokov mlieka bolo 44 tokov mlieka typu 1V (27 %), 80 tokov typu 2V (48 %), 36
tokov typu PI (22 %) a 5 tokov typu PII (3 %). Celkový výdojok sa pohyboval pri toku 1V 0,321 ±
0,023 l, 2V 0,380 ± 0,018 %, PI 0,450 ± 0,029 l a pri PII 0,229 ± 0,069 l (tabuľka 2). Najvyšší
strojový dodojok bol nameraný pri 1V 40,27 ± 2,23 % a najnižší pri PI (17,07 ± 2,78 %).
Vplyv postavenia ceckov na niektoré parametre dojiteľnosti sa nachádzajú v tabuľke 3. Skupina
1 mala celkový výdojok 0,233 ± 0,041 l a skupina 4 0,411 ± 0,023 l. Najvyšší dodojok bol
zaznamenaní pri postavení ceckov v skupine 4. (0,108 ± 0,011 l) a najnižší v skupine 1 (0,053 ±
0,019 l).
Preukazné a pozitívne korelácie boli pozorované medzi celkovým výdojkom a ostatnými
sledovanými charakteristikami dojenia okrem množstva mlieka získaného dodájaním, latentnej
doby a času dosiahnutia bimodality. Preukazné a pozitívne korelácie boli tiež zistené medzi
celkovým výdojkom a postavením ceckov (r = 0,3445; P < 0,0035), hĺbkou cisterny (r = 0,4656; P
< 0,0001) (tabuľka 4).
Diskusia
Tok mlieka 2V bol zaznamenaný v 48 % a PI v 22 %. Pri týchto typoch kriviek toku mlieka sa
predpokladá, že došlo k ejekcii mlieka, a teda počas dojenia by sme mali získať mlieko cisternové
aj alveolárne. Množstvo mlieka získané dodájaním by malo byť nižšie ako pri toku mlieka 1V, PII
keďže v týchto prípadoch sa nepredpokladá vznik ejekcie mlieka (Marnet a kol., 1998). Čo nám
potvrdili aj nami namerané hodnoty. Čas začiatku druhého vrcholu toku mlieka sa pohyboval okolo
42 s. Podobné výsledky zaznamenal aj Margetín a kol. (2005).
Počas pokusu sme pozorovali, že čím sú horizontálnejšie postavené cecky tým viac mlieka
sme získali prostredníctvom strojového dojenia. Negatívom je však zvyšovanie objemu mlieka
získaného pomocou dodájania. Horizontálne postavené cecky môžu mať vplyv na znižovanie
účinnosti dojenia a to hlavne kvôli predlžovaniu času dojenia, či už kvôli dodájaniu alebo padaniu
187
ceckových nástrčiek (Labussiere, 1988). V našom prípade preukazné výsledky sa prejavili iba
medzi postavením ceckov 2 - 3 a 6 pri množstve mlieka získaného pomocou dodájania. Tento
aspekt je často pozorovaný pri bahniciach, kde prebehla selekcia zameraná len na produkciu
mlieka, čo viedlo k zhoršeniu morfológie vemena (Caja a kol., 2000). Vysoké dodojky sú
spôsobené tým, že časť cisternového mlieka sa nachádza pod ústím ceckového kanálika
(Bruckmaier a kol., 1997), čo sa ale v našom prípade nepotvrdilo, nakoľko iba málo bahníc
prekročilo v lineárnej deväť bodovej škále 6 bodov. Ďalším aspektom je, že postavenie ceckov sa
s poradím laktácie zhoršuje (Margetín, 2005).
Preukazné a pozitívne výsledky sme zaznamenali medzi hĺbkou cisterny a množstvom
mlieka získaného za 60 s dojenia. Z tohto nám teda vyplýva, že čím je cisterna hlbšia je väčší
priestor nielen na uskladňovanie mlieka medzi dojeniami, ale aj možnosť kontinuálneho presunu
mlieka z alveol do cisterny počas dojenia (Dzidic a kol., 2004). Príkladom toho je tok mlieka PI,
kde počas dojenia je získané najprv cisternové a potom hneď kontinuálne alveolárne mlieko. Za
60 s pri tomto type toku mlieka sme získali najväčší objem mlieka počas strojového dojenia
a najnižšie percentuálne množstvo mlieka získané pomocou dodájania v porovnaní s ostatnými
tokmi mlieka.
Postavenie ceckov a hĺbka cisterny preukazne ovplyvňovali celkový aj strojový výdojok.
Za najvhodnejšie bahnice na strojové dojenia môžeme považovať bahnice s veľkou kapacitou
cisterny a vertikálne postavenými ceckami. Veľký dôraz sa musí klásť hlavne na postavenie
ceckov, pretože zvieratá s horizontálne postavenými ceckami dosahujú vyššiu produkciu, avšak
majú vyššie dodojky ako zvieratá s vertikálne postavenými ceckami, čo je však z pohľadu
účinnosti strojového dojenia nežiaduce.
Literatúra
Bruckmaier R.M, Paul G., Mayer H. and Schams D., 1997a. Machine milking of Ostfriesian and Lacaune dairy
sheep: udder anatomy, milk ejection and milking characteristics. J. Dairy Res. 64:163-72.
Caja G., Such X. and Rovai M., 2000. Udder morphology and machine milking ability in dairy sheep. In:
Proceedings of the 6th Great Lakes Dairy Sheep Symposium November 2-4, 2000. Guelph, Ontario,
Canada. str. 17-40.
De la Fuente L. F., Fernández G. and San Primitivo F., 1996. A linear evaluation system for udder traits of dairy
ewes. Livest. Prod. Sci. 45: 171-178.
Dzidic A., Kaps M. and Bruckmaier R. M., 2004. Machine milking of Istrian dairy crossbreed ewes: udder
morphology and milking characteristics. Small. Rum. Res. 55: 183-189.
Fernández G., Baro J. A., de la Fuente L. F. and San Primitivo F., 1997. Genetic parameters for linear udder
traits of dairy ewes. J. Dairy Sci. 80: 601-605.
Labussière J., 1988. Review of physiological and anatomical factors influencing the milking ability of ewes and
the organization of milking. Livest. Prod. Sci. 18: 253-274.
188
Margetín, M., Apolen, D., Čapistrák, A., Špánik, J. and Margetínová, J., 2002. Cielené vylepšovanie tvarových
a funkčných vlastností vemena oviec plemena cigája a zošľachtená valaška pre strojové dojenie.
Výskumná správa za účelovú činnosť, Trenčianská Teplá, str. 57
Margetín M., Milerski M., Apolen D., Čapistrák A. and Špánik J., 2005. Spúšťanie mlieka bahníc v prvých 60
sekundách strojového dojenia. J. Farm. Anim. Sci. 38: 201 – 210.
Marnet P. G. and Negrao J.A., 2000. The effect of a mixed-management system on the release of oxytocin,
prolactin, and cortisol in ewes during suckling and machine milking. Reprod. Nutr. Dev. 40: 271-281.
Tabuľka 1: Základná charakteristika súboru.
The basic characteristic of data.
1
Ukazovateľ
17
2
Celkový výdojok (CV), l
0,400
0,013
0,050
0,980
3
Strojový výdojok (SV), l
0,310
0,012
0,030
0,970
4
Strojový dodojok (SD), l
0,090
0,006
0
0,550
5
SD z CV, %
24,30
1,32
0
92,11
6
Čas dojenia, s
63
2
19
150
7
Latentná doba, s
15
1
6
82
8
Maximálny tok, l/min
0,946
0,046
0,180
3,230
9
Výdojok za 30 s, l
0,173
0,008
0
0,550
Priemer
18
Str.chyba
Minimum
Maximum
10
Výdojok za 60 s, l
0,279
0,011
0,010
0,960
11
Výdojok za 30 s zo SV, %
58,59
1,94
0
100
12
Výdojok za 60 s zo SV, %
87,50
1,42
0
100
13
Bimodalita bola pri 80
14
Čas dosiahnutia bimodality, s
42
1
22
80
15
Výdojok prvého toku, l
Výdojok prvého toku k SV, %
0,217
65,74
0,012
2,24
0,030
7,69
0,560
94,12
16
1
Trait, 2Milk yield, 3Machine milk yield, 4Stripping, 5Stripping from milk yield,
6
Milking time, 7Latency, 8Maximal flow, 9Milk yield in 30 s, 10Milk yield in 60 s,
11
Milk yield in 30 s from machine yield, 12Milk yield in 60 s from machine yield,
13
Bimodality was by 90 milkings, 14Begining of bimodality,
15
Milk yield of the first emission at bimodality,
16
Milk yield of the first flow from machnine milking, 17Average, 18Median error,
189
Tabuľka 2 Vplyv doby dojenia a typu toku mlieka na sledované parametre dojiteľnosti.
The effect of the evening and morning milking and the type of milk flow on milkability
1
14
Ukazovateľ
15
2
Celkový výdojok (CV), l
3
Strojový výdojok (SV), l
16
Bimodálny
Nebimodálny
0,0001
5
20,94 ± 1,77a
40,27 ± 2,23b
6
66 ± 2
a
7
14 ± 1a
a
Latentná doba, s
1,033 ± 0,082
Výdojok za 60 s, l
11
Výdojok za 30 s zo SV, %
12
Výdojok za 60 s zo SV, %
a,b,c
a,b,c
1-12
ab
0,061 ± 0,032
0,0012
26,58 ± 6,64ab < 0,0001
a
85 ± 8
< 0,0001
a
71 ± 3
18 ± 2a
a
0,983 ± 0,098
a
0,172 ± 0,016
ab
0,169 ± 0,064c
a
17,07 ± 2,78a
17 ± 1a
0,177 ± 0,014
10
0,069 ± 0,013
b
9
Výdojok za 30 s, l
b
44 ± 3
8
Maximálny tok, l/min
P
0,310 ± 0,017ac 0,198 ± 0,021bc 0,381 ± 0,027a
0,123 ± 0,011
Čas dojenia, s
Plateau II
F-test
0,0009
0,070 ± 0,008
SD z CV, %
17
0,380 ± 0,018abc 0,321 ± 0,023ac 0,450 ± 0,029b 0,229 ± 0,069ac
4
Strojový dodojok (SD), l
13
Tok mlieka
17
Plateau I
31 ± 4b
ab
0,754 ± 0,120
a
0,133 ± 0,019
ab
< 0,0001
ab
0,220 ± 0,269
ab
0,050 ± 0,041
a
0,140 ±0,058
b
0,0109
b
0,0066
b
0,277 ± 0,020
0,225 ± 0,023
0,309 ± 0,027
61,34 ± 2,53a
77,98 ± 3,05b
42,27 ± 3,71c
28, 08 ± 8,33d
< 0,0001
88,57 ± 2,37
87, 36 ± 2,96
83,97 ± 3,67
66,35 ± 8,49
0,0737
0,0027
Priemery v tom istom riadku a pri rovnakom faktore s nerovnakými písmenami sa od seba odlišujú na úrovni P< 0.05.
Averages in the same line and by the identical factor with different letter are different
13
14
15
16
17
18
See tab.1, F- test, Milk flow, Bimidality, Unbimodality, Plateau I, Plateau II
Tabuľka 3: Vplyv postavenia ceckov na sledované parametre dojiteľnosti
The effect of the teat placement on milkability
1
Postavenie ceckov
4
≤3
2
Celkový výdojok
18
17
Ukazovateľ
5
≥6
F-test
P
0,233 ± 0,041a
0,343 ± 0,031ab
0,394 ± 0,028b
0,411 ± 0,023b
0,0004
a
ab
ab
b
0,0183
3
Strojový výdojok (SV), l
0,180 ± 0,038
4
Strojový dodojok (SD), l
0,053 ± 0,019ab
0,064 ± 0,014a
0,097 ± 0,013ab
0,108 ± 0,011b
0,0064
5
SD k CV
29,90 ± 3,98
21,08 ± 2,96
27,03 ± 2,70
26,85 ± 2,25
0,1213
6
Čas dojenia, s
62 ± 5
67 ± 4
66 ± 4
71 ± 3
0,369
7
Latentná doba, s
25 ± 2a
18 ± 2ab
19 ± 2ab
18 ± 1b
0,0246
8
Maximálny tok, l/min
0,850 ± 0,192
0,548 ± 0,147
0,777 ± 0,130
0,816 ± 0,106
0,3517
9
Výdojok za 30 s, l
0,110 ± 0,034
0,124 ± 0,026
0,135 ± 0,023
0,163 ± 0,019
0,3801
0,279 ± 0,028
0,296 ± 0,026
0,303 ± 0,022
10
0,185 ± 0,048
0,233 ± 0,037
0,263 ± 0,033
0,270 ± 0,026
0,3905
11
59,015 ± 5,924
47,574 ± 4,579
50,259 ± 4,029
52,817 ± 3,287
0,3686
12
73,126 ± 5,408
86,343 ± 4,090
84,700 ± 3,660
82,081 ± 3,030
0,1452
35 ± 4
40 ± 3
43 ± 3
45 ± 2
0,1293
0,182 ± 0,043
0,196 ± 0,037
0,189 ± 0,034
0,237 ± 0,023
0,5501
Výdojok za 60 s, l
Výdojok za 30 s zo SV, %
Výdojok za 60 s zo SV, %
13
Bimodalita
14
Čas dosiahnutia bimodality, s
Výdojok prvého toku, l
15
1-16
See tab.1, 17 teat placement, 18 F - test
a,b,c
Priemery v tom istom riadku a pri rovnakom faktore s nerovnakými písmenami
sa od seba odlišujú na úrovni P< 0.05.
a,b,c
Averages in the same line and by the identical factor with different letter are different
190
Tabuľka 4: Vplyv postavenia ceckov na sledované parametre dojiteľnosti
The effect of the teat placement on milkability
Ukazovateľ
2
CV
3
4
DO
6
9
14
15
0,1851
0,3681**
-0,1059 0,5159*** 0,6222*** 0,8824***
-0,2310
0,3958**
-0,1782 0,5453*** 0,6416*** 0,9791*** -0,0309 0,7457*** 0,2631*
0,3517**
-0,0745
0,1799
-0,0849
-0,0641 -0,2708*
0,4503
-0,0741
0,1887
0,2653*
0,4149**
-0,1233
-0,1079
0,2254
0,0175
-0,0025
0,2861*
0,1838
-0,3939
-0,5784
-0,2810
0,3691
-0,4524
0,0784
0,0169
0,7846*** 0,5856*** -0,1396
0,5624**
-0,0767
0,0459
0,6962*** -0,1285 0,8407***
0,0458
0,1924
-0,0775 0,7443***
0,2349
0,3012*
0,2763
0,3534*
0,0007
0,1367
V30
10
V60
CDBI
V60
CDBI
0,1278
VPRT
HC
0,9134***
MT
V30
17
CD
LD
MT
PC
DO
CD
7
8
SV
LD
16
SV
0,6779*** 0,3445** 0,4656***
0,1449
VPRT
1-15
See tab.1, 16 teat placement, 17cisternal depth
* P< 0,05
**P<0,01
***P<0,001
DVOJETAPOVÁ INDUKCIA A SYNCHRONIZÁCIA ESTRU V STÁDE OVIEC
DETERMINOVANÁ POČTOM A ZDRAVOTNÝM STAVOM PLEMENNÝCH
BARANOV
TWO STAGE INDUCTION AND SYNCHRONISATION OF OESTRUS IN FLOCK OF
SHEEP DETERMINATE BY NUMBER AND HEALTH CONDITION OF RAMS.
Maraček, I., Vlčková, R., Jankurová, J., Klapáčová, K., *Horňáková, Ľ., *Pošivák.J.
Ústav fyziológie, Katedra normálnej anatómie, histológie a fyziológie, *Klinika pôrodníctva, gynekológie a andrológie UVL
Košice
Abstract
This work was focused on oestrus induction and synchronisation of Tsigai sheep that occurred
from physiology anoestrus period in spring. Implementation of rational biotechnical
reproduction control program to be properly „tailored“ for the individual flock of ewes proves
to be an assumption how to obtain high fertility, higher yields of slaughter milk lambs
production for Christmas markets. Oestrus induction and synchronisation by means of the
combination of gestagen- and eCG-based preparation consisted in (1) application of vaginal
sponge impregnated with gestagen, (2) i.m. injection of eCG based preparation at the time of
gestagen discontinuing, and (3) observation and making records on fertilization. This
biotechnical control of oestrus was carried out during two stages in the experimental flock
sheep which was determinate by limited number rams in the breeding period.
191
Úvod
Indukcia a synchronizácia ruje oviec v mimosezónnom období je významnou biotechnickou
metódou riadenej reprodukcie v stádach s produkčným zameraním na jatočné jahňatá na
vianočný trh. Racionálne uplatnenie týchto biotechnických metód intenzifikácie reprodukcie
nie je možné bez využitia a zohľadnenia poznatkov o biologických zákonitostiach dejov
reprodukčného cyklu a fyziologického priebehu jeho jednotlivých fáz a štádií regulovaných
neurohumorálne (Goodman, 1994; Goodman a i, 2002; Maraček, 1993, 1995, 1997; Maraček
a i. 1993, 2002; 2004 Vlčková a i., 2006).
Výsledky plodnosti oviec limitujú zvyšovanie stavov, determinujú produkciu jatočných
jahniat a zároveň sú významným ukazovateľom nielen chovateľskej úrovne, zdravotného
stavu bahníc v príslušnom chove, ale aj vzdelanostnej, odbornej a kultúrnej úrovne
manažmentu i personálu chovateľa (Maraček, 2002).
V súčasnom období nezriedka je limitujúcim činiteľom dosahovanej úrovne reprodukcie stáda
nedostatočný počet plemenných baranov na pripúšťanie a málo využívaná inseminácia oviec.
V práci sme sa zamerali na riešenie problému menšieho počtu držaných plemenných baranov
než ako by bolo potrebné pre jarnú mimosezónnu indukciu a synchronizáciu estru a overili
sme postup dvojetapovej metódy rozvrhnutej podľa dostupného počtu baranov a tak sme
zabezpečili plánovanú produkciu jatočných mliečnych jahniat na vianočný trh.
Materiál a metódy
Pokusné stádo. Overovací pokus sme vykonali v jednom chove zvolenského typu cigáje.
Stádo bolo držané v podmienkach bežného úžitkového chovu. Stádo oviec sa v období
sledovania
chovalo
tradičným
pastevným
spôsobom,
salašnícky,
s extenzívnou
a polointenzívnou pastvou.
Indukciu a synchronizáciu ruje i prípravy baranov na pripúšťanie sme začali v poslednej
dekáde apríla a trvali do konca druhej dekády mája s ukončením pripúšťania 20. – 25. mája
v roku sledovania. V rámci prípravy experimentálnych sledovaní bolo celé stádo vrátane
baranov odčervené a upravili sa im paznechty. Ovce a barany zaradené na ošetrenie pre
mimosezónne pripúšťanie dostali kŕmny prídavok (flushing) jadrového krmiva (0,40 – 0,50
kg na zviera a deň) od 15. apríla do ukončenia pripúšťania.
Indukcia a synchronizácia estru. Na indukciu a synchronizáciu ruje boli ovce ošetrené
s fluorogestónacetátom (FGA) v dávke 40 mg v pošvovom polyuretánovom tampóne
prípravku Chrono-gest (Intervet), ktorý bol podávačom inštalovaný do pošvy na dobu 12 dní.
V čase vysadenia tampónu sme i.m. injikovali 500 I.U. eCG (sérový ekvinný choriový
192
gonadotropín) v prípravku Sergon inj. a. u. v. (Bioveta a.s.). Na druhý deň po vybratí
tampónov a podaní eCG sa začalo pripúšťanie.
V prvej etape bolo ošetrených na indukciu estru (27. 04. 2006) 197 klinicky zdravých oviec
v druhej etape (09. 05. 2006) sa ošetrilo 207 klinicky zdravých zvierat spolu celkom 404
oviec stáda. Dve etapy boli zvolené limitovaným počtom 30 baranov, ktorí boli k dispozícii
na pripúšťanie v aktuálnom mimosezónnom období. Týmto postupom sa zabezpečilo, že na
jedného plemenného barana pripadlo 6,6 – 6, 9 oviec s indukovaným estrom na pripustenie.
Štatistická analýza dosiahnutých výsledkov. Rozdiely vo výsledkoch medzi dvoma etapami
sme štatisticky hodnotili χ2 – testom (chí-kvadrátový test).
Výsledky a diskusia
Z ošetrených 404 oviec sa obahnilo 330 bahníc a to predstavuje 81,7 % a z nich porodilo
dvojičky 82 bahníc t.j. 24,8% a jedna bahnica porodila štyri jahňatá. Neobahnilo sa 74
ošetrených oviec a to predstavuje 18,3 %-nú jalovosť. Spolu sa narodilo 418 jahniat
a odchovalo sa 411 jahniat pripravených ako mliečne jatočné jahňatá na vianočný trh..
Zistili sme pritom, že v období od 2. do 15. októbra sa obahnilo 125 bahníc a narodilo sa 189
jahniat a to znamená, že 64 (51.2%) obahnených oviec porodilo dvojičky, čo predstavuje
v reprodukčných parametroch natalitu 151,2 jahniat na 100 obahnených bahníc. Kým
v období od 18. októbra do 12. novembra sa obahnilo 205 bahníc a narodilo sa 229 jahniat,
pričom 24 (11,7%) porodilo dvojičky a to v reprodukčných ukazovateľoch predstavuje
natalitu 111,7 narodených jahniat na 100 obahnených zvierat. Celkom z dvoch etáp spolu
vychádza natalita v hodnote 126,7 jahniat na 100 obahnených bahníc v rámci celého stáda
zaradeného na mimosezónne pripúšťanie.
Pri štatistickom hodnotení týchto výsledkov sme zistili signifikantne vyšší ovulačný pomer
(OR) a následne viac pôrodov dvojičiek rezultujúci vo vyššej natalite po prvej etape ošetrenia
P<0.001. Výsledky štatistickej analýzy poukazujú aj nato, že prvá etapa ošetrenia sa vyššou
mierov podieľa na celkovom dosiahnutom výsledku.
Z porovnania dosiahnutých výsledkov po uplatnení biotechniky riadenej reprodukcie s údajmi
o plemennom štandarde a chovnom cieli oviec plemena slovenské merino (SM), slovenská
cigája (SC) a zošľachtená valaška (ZV) s úžitkovým typom zameraným na mäso a mlieko
(Margetín, 1996; Margetín a i., 1996) vyplýva možnosť dosiahnutia plodnosti na obahnenú
ovcu (natalita) podľa plemien SM 120 až 127 %, SC 117 až 123 % a ZV 113 až 118 %
v úžitkových chovoch, ktorú sme dosiahli v sledovaných chovoch v rámci kontroly
úžitkovosti v rokoch 2000 až 2001 (Žatkovič, 2001) a podľa kontroly úžitkovosti
193
v šľachtiteľských a rozmnožovacích chovoch v kontrolnom roku 2001/2002 bol dosiahnutý
v SR priemerný výsledok podľa plemien: SM-šľach.-131,6 %, SM-rozm.-128,1 %; SC-šľach.129,6 %, SC-rozm.-115,4 %; ZV-šľach.-122,3 %, ZV-rozm.-119,1 % (Štefanková,
Machynová, Matta, 2003), prirodzene bez biotechnických postupov.
Podľa novších literárnych údajov treba pri rozhodovaní o počte bahníc pripadajúcich na
jedného plemenného barana vychádzať z veku barana, jeho vyvinutosti, kondície
a sexuálneho libida, dĺžky trvania obdobia a spôsobu pripúšťania (Vahid, Kóbori, 2002). Pri
voľnom pripúšťaní (zaradením baranov do stáda na 4 – 5 týždňov) treba na jedného barana
v strednom veku počítať s 40 – 50, na starého barana 30 – 40 a na mladého barana 15 – 20
bahnicami. Pri synchronizácii ruje je treba počítať s trikrát väčším počtom baranov. Na
jedného barana by nemalo pripadať viac ako desať bahníc.
Výsledky sledovania vplyvu synchronizácie ruje na výskyt počtu bahníc s pôrodom dvojičiek
z overovacieho experimentu dokladajú priebežné výsledky analýzy plodnosti úžitkového
stáda oviec plemena cigája u realizátora, ktoré boli realizované v programe prípravy
mliečnych jatočných jahniat na vianočný trh s indukciou estru v dvoch etapách v poslednom
týždni apríla 2006 a v prvej dekáde mája 2006 s cieľom bahnenia v októbri a v prípade
prebiehaviek až v prvej dekáde novembra.
Pri prirodzenom pripúšťaní po synchronizácii ruje oviec prípravkami na báze gestagénov
a sérového ekvinného chóriového gonadotropného hormónu (eCG) je potrebný taký počet
plemenných baranov, aby na jedného pripadlo menej ako 19 ošetrených oviec. V prípade
indukcie a synchronizovaní estru len časti oviec v stáde treba zabezpečiť barany v takom
počte, aby na jedného pripadlo do desať ošetrených oviec.
Záver
V overovacom experimente priamo v úžitkovom stáde na farme oviec úžitkového chovu sa
získali cenné poznatky o význame chovateľských manažmentských opatrení pri zabezpečení
využívania biotechnických metód riadenej reprodukcie v systéme mimosezónnej reprodukcie
v stáde chovu oviec. Bola overená metóda etapového postupu uplatnenia indukcie fertilnej
ruje v anestrickom jarnom období v príprave stáda na produkciu jatočných mliečnych jahniat
na vianočný trh. Limitujúcim faktorom pre dvojetapový postup bol počet baranov ako aj
príprava jatočného produktu vo vyššej aj nižšej hmotnostnej kategórii. Zaujímavé je pritom
zistenie, že po prvej etape bol vyšší výskyt pôrodov dvojičiek. Z tohto úspešne overeného
výsledku bol vypracovaný návrh priebežného realizačného výstupu z riešenia projektu.
194
Literatúra
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
GOODMAN, R. L.: Neuroendocrine control of the ovine estrous cycle. In: The physiology of reproduction.
Ed.: E. Knobil and J. Neil et al., Raven Press. New York, 1994, 659 – 709.
KOSTECKÝ, M., KRAJNIČÁKOVÁ, M., VALOCKÝ, I., POŠIVÁK, J., ŠUTIAKOVÁ, I., MARAČEK,
I.: Selekcia negravidných oviec pomocou ultrasonografie. Agriculture (Poľnohospodárstvo), 49, 2003, 69 –
74.
MARAČEK, I.: Využiteľnosť biotechnických metód v riadení reprodukcie oviec v súčasných podmienkach
hospodárskej transformácie. Veterinářství, 43, 1993, 62 – 65.
MARAČEK, I.: Riadená reprodukcia v chove oviec. In: Využitie vedeckých poznatkov pre efektívny chov
oviec v trhových podmienkach. Ed.: D. Ochodnický. VÚŽV – Stanica chovu a šľachtenia oviec a kôz,
Trenčín, 1995, 85 – 89.
MARAČEK, I.: In: Moderný chov oviec a kôz. Ed.: D. Ochodnický. VÚŽV – Stanica chovu a šľachtenia
oviec a kôz, Trenčín, 1997, 67 – 77.
MARAČEK, I.: Prevention and treatment of reproductive diseases in sheep. In: Proceedings from 13th
Congress of Hungarian Association for Buiatrics „The effect of herd health of cattle, sheep and goat on the
profitable production“. Ed.: Szenci, O. and Brydl, E., Hajdúszoboszló, 10 – 12 October 2002, 147 – 154.
MARAČEK, I., HENDRICHOVSKÝ, V., MALECKÝ, E., LABAJ, J.: Hodnotenie plodnosti
a objektivizácia intenzity reprodukcie v chove oviec. Veterinářství, 35, 1985, 461 – 464.
MARAČEK, I., HENDRICHOVSKÝ, V., KRAJNIČÁKOVÁ, M., LAZÁR, L.: Dominant follicle selection
in sheep after cloprostenol administration. Slov. vet. čas., 18, 1993, 9 – 14.
MARAČEK,I., HENDRICHOVSKÝ, V., KRAJNIČÁKOVÁ, M.: Súčasné problémy
reprodukcie oviec v podmienkach Slovenska. Slov. vet. čas., 20, 1995, 60 – 66.
MARAČEK, I., KRAJNIČÁKOVÁ, M., KOSTECKÝ, M., GRÉSEROVÁ, G.,
VALOCKÝ, I.: Tertiary follicular growth wave dynamics after oestrus synchronization and superovulation
in ewes and goats. Acta vet. Brno, 71, 2002, 481 – 486.
MARAČEK, I., KRAJNIČÁKOVÁ, M., KOSTECKÝ, M.: Aktuálnosť monitoringu plodnosti a kvality
ejakulátu baranov. Chov oviec a kôz, 23, 2003, (2), 20 – 22.
MARGETÍN, M.: Plemenný štandard a chovný cieľ merinských oviec. Chov oviec a kôz, 17, 1996, (4), 11
– 12.
MARGETÍN, M., ČAPISTRÁK, A., KALIŠ, M.: Plemenný štandard a chovný cieľ oviec plemena cigája
a zošľachtená valaška. Chov oviec a kôz, 17, 1996, (2 – 3), 4 – 7.
ŠTEFANKOVÁ, M., MACHYNOVÁ, A., MATTA, M.: Kontrola úžitkovosti oviec a kôz 2001/2002.
Štátny plemenársky ústav SR, Vydavateľstvo Slovenský Chov, 2003.
VAHID, Y., KÓBORI, J.: Juhtenyésztők kézikönyve. Szaktudás Kiadó Ház, Budapest, 2002.
VLČKOVÁ, R., KOSTECKÁ, Z., FAIGL, V., MARTON, A., KERESZTES, M., ÁRNYASI, M.,
KULCSÁR, M., DANKÓ, G., ŠVANTNER, R., NAGY, S., CSATÁRI, G., CSEH, S., SOLTI, L.,
HUSZENICZA, G., MARAČEK, I.: Recent progress in endocrine, nutritional and genetic aspects of the
ovine reproduction (A Review), Folia veterinaria, 50, 2006, (3), 157–166.
ŽADKOVIČ, J.: Vybrané ukazovatele úžitkovosti a reprodukčných vlastností. In: Správa
o poľnohospodárstve a potravinárstve v Slovenskej republike 2001 (ZELENÁ SPRÁVA). Vydalo
Ministerstvo pôdohospodárstva Slovenskej republiky, Bratislava, november 2001.
Práca bola vytvorená pri riešení projektu AV 4/1113/06
Kontaktná adresa
Prof. MVDr. Imrich Maraček, DrSc., Ústav fyziológie KNAHF, Univerzita veterinárskeho
lekárstva, Komenského 73, 041 81 Košice
195
FYZIOLOGICKÉ MONITOROVANIE PROCESOV NÁBORU, VÝBERU A
DOMINANCIE TERCIÁRNYCH FOLIKULOV VAJEČNÍKOV OVIEC
PHYSIOLOGICAL MONITORING OF PROCESSES RECRUITMENT, SELECTION
AND DOMINANCE OF TERTIARY FOLLICLES IN OVARIES OF SHEEP
Maraček, I., Vlčková, R., Halagan, J.
Ústav fyziológie, Katedra normálnej anatómie, histológie a fyziológie, UVL Košice
Abstract
Presented paper is focused on physiological monitoring of the tertiary antral follicles during
growth and development in processes: (1) recruitment, (2) selection, (3) dominance, (4)
ovulation and luteinisation (corpus luteum – developing and growing) based on simultaneous
use of laparothomy with digital photo documentary evidence, ultrasound investigation,
histological evaluation and determination of the oestradiol-17β and progesterone in the blood
serum and the follicular fluid of the largest follicles from the ovaries of the Improved
Wallachian ewes. It can be concluded from performed observations that the results suggest on
possibility of monitoring of ewes ovarian folliculogenesis and its phases in vivo conditions
during experiments and investigations.
Úvod
V súčasnosti je všeobecne známe, že rast a vývoj terciárnych, dutinku (antrum) obsahujúcich,
folikulov vaječníka prežúvavcov prebieha v rastových vlnách po prekonaní puberty,
adolescencie a dosiahnutí dospelosti (adultus). Proces rastu a vývoja dutinkových folikulov
vaječníkov oviec prebieha v štádiách: (1) nábor (recruitment), (2) výber (selection), (3) vláda
(dominatio), či dominancia a (4) ovulácia (ovulatio) s nadväznou tvorbou žltého telieska
(corpus luteum). Tieto štádiá je možné monitorovať v určitej kohorte (cohohors), či družine
dutinkových folikulov na trajektórii rastových vĺn týchto folikulov vo vaječníkoch
(Driancourt et al., 1985, 1985a; Murdoch, 1985,1988; Dickie et al., 1999;Bartlewski et al.,
1999; Gither et al., 2001). Význam a potreba zdokonaľovania a sústavného systematického
monitorovania procesov rastu a vývoja dutinkových folikulov spočíva po prvé v prehlbovaní
a rozširovaní poznatkov o regulácii a modulovaní týchto dejov uvedených štádiách intra
vitam tak, aby po druhé tieto poznatky boli racionálne aplikovateľné v chovateľskej
a veterinársko-lekárskej praxi pri profitujúcej produkcii s trvalo udržateľným zdravím stáda,
kvality produktu ako aj produkčného environmentu a ekológie (Faigl et al., 2005; Maraček et
al., 2005; Vlčková et al., 2006).
196
V práci sme sa sústredili na súčasné možnosti monitorovania rastu a vývoja dutinkových
folikulov vaječníkov so zameraním na jednotlivé štádiá tohto funkčného procesu
zabezpečujúceho ovuláciu a ovulačný pomer (ovulation rate) determinujúci reprodukčnú
i produkčnú úroveň.
Materiál a metódy
Získanie ultrasonogramov. Ultrasonografické (USG) vyšetrenie vaječníkov sme uskutočnili
počas laparotómie prístrojom Sono ACE – 600V (Medison Co., Korea) s 5 MHz lineárnou
sondou PB – 06LV50/65AD (Medison Co., Kórea) so získaním USG snímok pomocou
tlačiarne (Video Graphic Printer) SONY UP – 880/890 CE/ 890 MD (Sony Co., Japonsko).
Niektoré snímky boli zaznamenané na disketu použitím 7,5 MHz sondy, napojenej na USG
prístroj ESAOTE Falco (ESAOTE S.p.A, Taliansko). Vaječníky sme ultrasonograficky
vyšetrovali priamo na ich povrchu.
Fotografie vaječníkov sme získali počas laparotómie digitálnym fotoaparátom Pentax Optio
S 30 (Pentax Co., Japonsko) a upravovali sme ich v programe pre úpravu fotografií Adobe
Photoshop
7.0.
Získané
fotografie
a ultrasonogramy
sme
vyhodnotili
kvalitatívne
a kvantitatívne podľa metód uvádzaných v literatúre (Dickie et al., 1999; Bartlewski et al.,
2000). Pri vyhodnocovaní ultrasonogramov sme sledovali echogenické a anechogenické
štruktúry vo vaječníku podľa literatúry (Grygar, Kudláč 1997; Battocchio et al., 1999).
Odber krvi. Od sledovaných experimentálnych oviec sme odobrali krv z vena jugularis
klasickým spôsobom. Získané séra sme uskladnili v mrazničke pri teplote –18 až –20 ºC do
stanovenia koncentrácií hormónov – 17β-estradiolu (E2), progesterónu (P4) a inzulínu
podobného rastového faktora I (IGF-I).
Odber tekutiny folikulu sme vykonali z dutinkových folikulov > 5 mm punkciou pritom sme
získaný objem riedili a spracovali pre stanovenie koncentrácie E2 i P4 tak ako sme to opísali
prv (Maraček et al., 2002).
Ovariektómiu
sme uskutočnili v terénnych podmienkach laparotomicky. Zvieratá sme
podrobili celkovej anestézii pentobarbitalom sodným (Lazar et al., 2005). Ovce sme položili
a fixovali na špeciálne upravené nosidlá. Po príprave operačného poľa vrátane zarúškovania
sme brušnú dutinu otvorili rezom v linea alba, 5 cm kraniálne od mliečnej žľazy. Vaječníky
sme opatrne vtiahli do operačnej rany a ultrasonograficky vyšetrili. Zároveň sme získali
fotografické snímky a následne sme vaječníky odobrali pre histologické spracovanie.
Histologické spracovanie. Vaječníky sme fixovali v 10 % formole. Tento sme neutralizovali
práškovým uhličitanom vápenatým. Ďalšie spracovanie bločkov tkanív s cieľom zhotoviť
197
histologické preparáty sme vykonali štandardným spôsobom, ako uvádzajú príručky
histologickej techniky (Vacek, 1990).
Mikroskopické hodnotenie. Hotové preparáty sme prezerali a vyhodnocovali mikroskopom
ZEISS Axiolab (Nemecko). Mikrofotografie sme získali prostredníctvom programu pre
analýzu obrazu LUCIA G Verzia 4,60 – System for Image Processing, prepojením svetelného
mikroskopu s PC pomocou kamery PAL GKB CCD camera CC-8603. Histologické preparáty
boli aj skenované pomocou Scanner hp scanjet 5550c metódou modifikovanou podľa
Halagana a Maračeka (nepublikované dáta). Vyhodnocovali sme každý dvadsiaty rez.
Jednotlivé rezy vaječníkov sme vyhodnocovali kvantitatívne (počet povrchových terciárnych
folikulov) a kvalitatívne (typ folikulu). Všímali sme si kategórie neatretických a atretických
dutinkových folikulov na povrchu vaječníka. Ich atréziu sme posudzovali podľa kritérií
opísaných inde (Maraček et al., 1977, 1983).
Stanovenie progesterónu, 17β-estradiolu a IGF-I. Koncentrácia progesterónu v krvnom
sére bola stanovená RIA metódou súpravou RIA PROGESTERON REF IM1188
(IMMUNOTECH, A Beckman Coulter Co. ISO 9001, U.S.A.). Analytická citlivosť 0,03
ng.ml-1. Presnosť intra-assay bola ≤ 5,4 % pre vzorky séra a inter-assay ≤ 9,1 %. Výsledky sú
vyjadrené v ng.ml-1.
Koncentrácia 17β-estradiolu v krvnom sére bola stanovená súpravou RIA ESTRADIOL REF
IM1663 (IMMUNOTECH, A Beckman Coulter Co. ISO 9001, U.S.A.). Analytická citlivosť
4 pg.ml-1 pri presnosti intra-assay ≤15,1 % a inter-assay ≤14,4 %. Výsledky sú uvedené v
pg.ml-1.
Koncentrácia IGF-I sa stanovila IGF-I 600 ELISA súpravou (DRG Instruments GmbH,
Germany). Absorbancia sa zmerala ELISA readerom pri vlnovej dĺžke 450 nm. Výsledky sú
vyjadrené v ng.ml-1.
Štatistické spracovanie výsledkov. Zistené hodnoty biometrického, ultrasonografického
a fotografického merania vaječníkov a histologických preparátov vaječníkov sme vyhodnotili
štatisticky udaním priemernej hodnoty a jej smerodajnej odchýlky. Na štatistické zhodnotenie
rozdielov medzi dvomi aritmetickými priemermi sme použili Studentov t-test.
Výsledky a diskusia
Na prezentovaných obrázkoch v prednáške dokumentujeme ultrasonogramy (a) a digitálne
fotografie (b) tých istých vaječníkov bahnice v období laktácie tri dni po odstavení jahniat.
Z obrázkov je jasne vidieť nami sledované povrchové terciárne folikuly. Prítomnosť folikulov
je jednoznačným potvrdením toho, že folikulogenéza prebieha aj po pôrode, počas dojčenia
198
jahniat a pokračuje aj v priebehu galaktopoézy po odstavení jahniat. K ovulácii nedochádza
z dôvodu popôrodného laktačného a sezónneho fotoperiodického bloku, ktorý zabraňuje
cyklickému uvoľňovaniu GnRH z hypotalamu, a preto chýba preovulačné vrcholné uvoľnenie
lutropínu (LH) z adenohypofýzy (Goodman, 1994).
Pozoruhodný je nález žltého telieska na ľavom vaječníku v období 3 dni po odstavení jahniat.
Pravdepodobnou príčinou bola blízka prítomnosť baranov v jednej ovčiarni s bahnicami, ktorí
boli oddelení len drevenými lesovými zábranami, ktoré nezabránili účinku feromónov.
Hodnoty získané pri zhodnotení USG záznamov sú oproti hodnotám získaných zhodnotením
digitálnych fotografií s menšími rozdielmi v rámci jednotlivých skupín a taktiež s nižšími
smerodajnými odchýlkami.
Signifikantné rozdiely sa získali pri porovnaní skupiny zvierat po ošetrení prípravkom
Chrono-gest so skupinami zvierat 17, 25 a 35 dní po pôrode, a to na rôznych hladinách
významnosti. Týka sa to rozdielu veľkosti folikulov menších ako 3 mm, pri porovnaní so 17.
(P<0,01) a s 35. dňom p.p. (P<0,001), ako aj pri priemernej veľkosti folikulov väčších ako 3
mm v porovnaní s 25. (P<0,01) a 35. dňom p.p (P<0,01). Významné sú rozdiely medzi
skupinou zvierat po ošetrení prípravkom Chrono-gest a skupinou zvierat po odstavení jahniat.
Ide o celkový počet folikulov, ako aj počet folikulov menších ako 3 mm.
Pri analýze folikulov pri skupine gravidných oviec sme získali signifikantné rozdiely
v celkovom počte folikulov (P<0,05) a v počte folikulov väčších ako 3 mm (P<0,05).
Rozdiely v jednotlivých skupinách folikulov pri ovciach v jednotlivých dňoch po pôrode sú
málo významné, až na rozdiel v počte folikulov menších ako 3 mm pri skupinách zvierat 17
a 35 dní p.p. (P<0,01). V porovnaní so skupinou po odstavení sú zreteľné signifikantné
rozdiely v porovnaní so 17. dňom p.p. pri celkovom počte folikulov (P<0,001), ako aj pri
počte folikulov menších ako 3 mm (P<0,05). Pri ovciach po odstavení je signifikantne väčší
priemer maximálneho folikulu v porovnaní s 25. (P<0,05) aj 35. dňom p.p. (P<0,05).
Z USG záznamov sme získali rozmery najväčších folikulov u jednotlivých pokusných skupín
zvierat. Zistili sme výrazné rozdiely medzi jednotlivými skupinami zvierat ošetrených na
indukciu ruje a stimuláciu OR, ako aj medzi skupinami gravidných zvierat. Pri skupinách
zvierat po pôrode sú rozdiely medzi veľkosťami minimálne. U oviec po odstavení je veľkosť
najväčšieho folikulu dvojnásobná oproti ovciam po pôrode.
Pri gravidných ovciach sú málo významné rozdiely v celkovom počte folikulov, v počte
folikulov menších ako 3 mm a priemere maximálneho folikulu. Významný rozdiel je len
v počte folikulov väčších ako 3 mm (P<0,01).
199
Naša identifikácia jednotlivých veľkostných a funkčných kategórií sledovaných terciárnych
folikulov a výsledok ich kvantitatívneho hodnotenia s prítomnosťou folikulovej tekutiny ako
anechogénneho útvaru resp. útvarov je porovnateľný s údajmi Dickieho et al. (1999)
a Bartlewskiho et al. (2000). Rôzni autori opisujú folikuly väčšie ako 5 mm ako preovulačné
pri ovciach s monoovuláciami (Bartlewski et al., 1999; Evans et al., 2000). Po ošetrení
gravidných bahníc nižšou dávkou eCG sme na 50. deň gravidity zaznamenali vysoký počet
folikulov s veľkým diametrom. Zaznamenali sme podobné výsledky v počte a veľkosti
veľkých dutinových folikulov ako Driancourt et ali. (2001), ktorí opisujú postupný pokles
počtu týchto folikulov s postupujúcou graviditou. Z našich výsledkov v tomto smere pre
budúcnosť vyplýva možnosť podsledovania a otestovania aj u gravidných bahníc odber
kumulo-oocytárnych komplexov transvaginálnou aspiráciou OPU (ovum pick-up) technikou
po príprave s ošetrením vyššími dávkami eCG pre in vitro produkciu raných embryí a pre
asistovanú reprodukciu s uplatnením moderných biotechnologických metód na základe
molekulovo-genetických postupov.
Záver
Z výsledkov vyplýva možnosť využitia overovaných metód pri hodnotení povrchových
terciárnych folikulov na vaječníkoch oviec. Poukazuje sa na možnosť monitoringu
folikulogenézy po pôrode v období dojčenia jahniat, po odstavení jahniat a počas
galaktopoézy v období dojenia bahníc, ako i v experimentálnych podmienkach aj u kôz. Po
použití dvojfrekvenčnej USG sondy s možnosťou prepnutia na 7,5 – 8 MHz a viac bude
možné v budúcnosti uplatniť hodnotenie terciárnych folikulov v štádiu výberu aj klinicky pri
vyšetrovaní zvierat ultrasonografom.
Literatúra
1. Bartlewski, P.M., Beard, A.P., Rawlings, N.C, 2000.: An ultrasoun-aided study of temporal relationships
between the patterns of LH/FSH secretion, development of ovulatory sized antral follicles and formation of
corpora lutea in ewes. Theriogenology, 54, 229-245.
2. Cahill, L.P., Mariana, J.C., Mauléon, F. 1979: Total follicular populations in ewes of high and low ovulation
rates. J. Reprod. Fert., 55, 27-36.
3. Dickie, A.M., Paterson, C., Anderson, J.L.M., Boyd,J.S. 1999: Determination of corpora lutea numbers in
booroola – texel ewes using transrectal ultrasound, Theriogenology, 51, 1209-1224.
4. Driancourt, M.A., Gibson, W.R., Cahill, L.P. 1985: Follicular dynamics throughout the oestrus cycle in sheep.
Reprod. Nutr. Dev., 25, 1-15.
5. Driancourt, M.A. 1994,: Lack of between-follicle interactions in the sheep ovary Reprod. Nutr. Dev., 34, 249260.
6. Lazar, G.,Pošivák, J., Kačmárik,.J., Valocký, I., Karahutová, Ľ., Čurlík, J., 2005: Laparoskopické
monitorovanie ovariálnej aktivity oviec. In: Zborník z vedeckej konferencie s medzinárodnou účasťou
„Reprodukčná medicína“ Ed.: Hredzák, R. Ostró, A., Kačmátrik, J, organizovaná pri príležitosti 10. vbýročia
založenia Centra asistovanej reprodukcie pri II. gynekologicko-pôrodníckej klinike. LF UPJŠ a FN L. Pasteura,
Košice, Dom techniky ZSVTS Košice 25. február 2005, 85-86.
200
7.Maraček, I., Tokoš, M., Halagan, J., 1977: Tertiary follicles in heifers treated with melengestrol acetate.
Endocrinologia Experimentalis. 11. 249-262.
8. Maraček, I., Elečko, J., Choma, J., Bekeová, E., 1983: Filikulárny systém vaječníkov kráv po synchronizácii
ruje luteolytickým pôsobením cloprostenolu. Veter. Med. (Praha), 28: 705-716.
9. Maraček, I., Krajničáková, M., Kostecký, M., Gréserová, G., Valocký, I. 2002: Tertiary follicular growth
wave dynamics after oestrus synchronization and superovulation. Acta Vet. Brno, 71, 481-486.
10. Mc Natty, K.P., Gibb, M., Dobson, C., Ball, K., Coster, J.,Heath, D., Thurley, D.C. 1982: Preovulatory
follicular development in sheep treated with PMSG and/or prostaglandin. J. Reprod. Fert., 65, 111-123.
11. Vacek, Z., 1990: Histológia a histologická technika. Vydavateľstvo Osveta, Martin, 1990, 503 s., ISBN 80217-0084-X
12. Vlčková, R., Lacková, Z., Antal, J., Maraček, I. 2005: Povrchové terciárne folikuly ovárií bahníc po odstave
jahniat a ich zmeny počas indukovaného estru v riadenej reprodukcii. In: Zborník prác a abstraktov
prezentovaných na 81. Fyziologických dňoch konaných 2.– 4. februára 2005 v Košiciach, Ed,. P Švorc, Vydal:
ZZ design studio – Ing, Zvonimír Záviš, 221 – 223.
13. Vlčková, R., Kostecká, Z., Faigl, V., Marton, A., Keresztes, M., Árnyasi, M., Kulcsár, M., Dankó, G.,
Švantner, R., Nagy, S., Csatári, G., Cseh, S., Solti, L., Huszenicza, G., Maraček, I., 2006: Recent progress in
endocrine, nutritional and genetic aspects of the ovine reproduction (A Review), Folia veterinaria, 50, 3: 157–
166.
Práca bola vytvorená pri riešení grantu VEGA 1/0612/03 a projektu AV 4/1113/06
Kontaktná adresa
Prof. MVDr. Imrich Maraček, DrSc., Ústav fyziológie KNAHF, Univerzita veterinárskeho
lekárstva, Komenského 73, 041 81 Košice
VPLYV HYPERTERMIE NA BIOCHEMICKÉ PARAMETRE KRVI KRÁLIKOV
A VYBRANÉ VÝKRMOVÉ UKAZOVATELE
INFLUENCE OF HYPERTHERMIA TO THE BIOCHEMICAL PARAMETERS OF
BLOOD IN RABBIT AND SELECTED FEEDER INDICES
Marcinková, M.,1 Pivko, J.,1,2 Lukáč, N.,1 Parkányi, V.,2 Rafay, J.,2 Massányi, P.,1
Capcarová, M.,1
1
2
Slovenská poľnohospodárska univerzita Nitra,
Slovenské centrum poľnohospodárskeho výskumu Nitra
Abstrakt
Thermal stress is the main constraint in farm animal production in warm season. It
starts to manifest by enviromental temperature above 32 °C. As a result the parameters of
growth and reproduction utility decrease due to alterations of biological functions.
The biochemical parameters of blood and feeding parameters were monitored. In our study,
we used flesch- lines of rabitts. The blood of rabitts was taken from auricular marginal vein
every morning. Physiological parameters from blood serum were defined by automatical
biochemical analyser Microlab 300. We anaysed the following parameters: glucose (energy
profile), level of total protein, cholesterol (lipid profile) and calcium (mineral profile). All of
201
these observed parameters of experimental young rabbits were lower as compared to the
control group (from – 10.04%).
Total growth of live weight (g/ks) of experimental young rabbits was found to decrease by
about 235.2 g as compared with control group. Quantity of total protein in experimental
group was from 50,60,04±3,78 to 60.93±4.39 g.l-1. It decreased as compared with control
group (49,02±4,62–60,13,63±3,51 g.l-1). Quantity of glucose was found to be increase almost
in all experimental groups (5.15±0.50 – 6.24±0.67 mmol.l-1) as compared with control group
(5.05±0.52 – 5.56±1.14 mmol.l-1). Level of protein profile and level of calcium profile also
decreased. Level of cholesterol was increased (expect for the first intake) in experimental
group (3.02±0.1.02-3.34±1.17 mmol.l-1) as compared with control group (1.74±0.272.25±3.34 mmol.l-1).
In our study we found that biochemical parameters of blood were affected by higher
temperature of feeding environment.
Úvod
Biologický princíp vzťahu organizmu a prostredia je významným fenoménom, ktorý
určuje využitie produkčných a reprodukčných schopností zvierat.
Optimalizácia mikroklímy v modernom chove hospodárskych zvierat má viacero aspektov.
Významnými faktormi, ktoré nie sú vždy docenené sú mikroklimatické podmienky chovu
zvierat. Vo výrazne diferencovanom vonkajšom prostredí je celý rad vplyvov, ktoré menia
svoje funkčné závislosti odvodené od priebehu klimatickej a sezónnej periodicity. V súvislosti
s meniacimi klimatickými podmienkami sa sústreďuje pozornosť na definovanie vzťahov
medzi vyššou teplotou chovného prostredia a úžitkovosťou, reprodukciou ako aj zdravotným
stavom. Z mnohých klimatických faktorov má na zvierací organizmus najväčší vplyv teplota
vzduchu, v našom prípade teplota nad horným okrajom termicky neutrálnej zóny. Teplotný
stres je hlavným obmedzením produkcie z chovu hospodárskych zvierat v horúcich obdobiach
roka. Začína sa prejavovať pri teplote prostredia nad 32 °C. V dôsledku drastických zmien
v biologických funkciách sa znižujú ukazovatele rastovej a reprodukčnej úžitkovosti. Práca je
zameraná na prehodnotenie zdravotného stavu zvierat s negatívnymi dôsledkami na jednotlivé
parametre vnútorného stavu prostredia vo vzťahu ku klimatickým zmenám chovného
prostredia.
202
Cieľ práce
•
vyhodnotiť stav medzi definovaným hypertermickým stresom a vybranými
výkrmovými ukazovateľmi
•
hodnotenie vplyvu vysokej teploty chovného prostredia (36 °C) na biochemické
parametre a celkovú homeostázu organizmu
•
vytvorenie
vedeckých
základov
pre
adekvátne
hodnotenia
a pochopenie
mechanizmov vplyvu teplotných zmien na fyziologické procesy a úžitkovosť
hospodárskych zvierat
Materiál a metodika
Do experimentu boli zaradené
mäsové línie králikov M91 a P91. Počty zvierat
zaradených do experimentu: (p- pokus, k- kontrola) 20 samíc (k) 20 (p), 4 samce (k) a 4 (p),
32 mláďat (16 P + 16 k) vo veku od 35 dní (odstav) do 75 dní (porážková hmotnosť).
V uzavretom chovnom priestore, s nainštalovaným termoagregátorom a senzorom boli
simulované experimentálne podmienky s definovanou vyššou teplotou (36 ± 3 °C). Zvieratá
boli vystavené hypertermickej záťaži od 6.00 hod. do 18.00 hodiny, od 18.00 do 6.00 hod.
neboli zvieratá vystavované pôsobeniu hypertermickej záťaže. Simulované podmienky boli
kontinuálne monitorované.
Experimentálne zvieratá boli ustajnené v štyroch samostatných sektoroch chovných klietok so
systémom kŕmenia a napájania ad libitum.
Kontrolné zvieratá boli chované v čiastočne klimatizovanej hale pre produkciu brojlerových
králikov v priestoroch SCPV Nitra.
Na preskúmanie úlohy vplyvu teplotného faktora bolo potrebné vytvoriť dve základné
skupiny zvierat (k) kontrolná (fyziologicky optimálna teplota, cca. 18-22 °C v priebehu 20-30
dní) a (p) pokusná (teplota nad fyziologické optimum, cca. 34-40 °C).
Zvieratám sa odobrala krv z ušnej marginálnej žily makrometódou, odbery sa realizovali
v ranných hodinách ( medzi 8 a 10 hodinou) 4x počas celého obdobia. Po odobratí sa
separovalo krvné sérum centrifugáciou pri otáčkach 3000 min-1po dobu 30 minút. V krvnom
sére boli stanovené jednotlivé fyziologické ukazovatele použitím automatického analyzátora
Microlab 300 (Merck®, Germany). Pre analýzu parametrov boli použité sety radu Ecoline,
určené pre uvedené zariadenie. Stanovoval sa dusíkový, energetický, lipidický a minerálny
profil.
203
Všetky experimenty boli schválené Štátnou veterinárnou a potravinovou správou Č.k. RO
ŠVPS 2058/06-221/3a pokusné zariadenia, farma králikov OMHZ SKP 28 004 v Bratislave
31. júla 2006.
Výsledky a diskusia
Z analýzy celosvetových literárnych prameňov v tejto oblasti vyplýva, že krátkodobý mierny
teplotný šok ( 39-40 °C) môže naštartovať adaptačný mechanizmus organizmu voči stresu.
Avšak nie sú údaje o vplyve teplotného stresu v podmienkach dlhodobého vystavovania
(jeden až niekoľko týždňov) vysokým teplotám. Nie je jasné, za akých okolností môže byť
naštartovaný
adaptačný
mechanizmus
pri
dlhodobejšom
strese.
Poznatky
získané
s nasledujúcich zámerov môžu dať odpoveď na tieto otázky a môžu byť využité pri znižovaní
mortality resp. morbidity hospodárskych zvierat vyvolanej hypertermickým šokom.
Z výsledkov vyplýva, že hypertermický stres ovplyvnil sledované biochemické parametre.
V skupine dospelých jedincov bol zistený pokles hodnôt vápnika v pokusných skupinách
zvierat (3,43±0,31 – 3,53±0,23 mmol.l-1) vo všetkých sledovaných obdobiach v porovnaní
s kontrolnou skupinou (3,62±0,32 – 3,87±0,29 mmol.l-1). Množstvo glukózy bolo vyššie
v pokusnej skupine (5,15±0,50 - 6,24±0,67 mmol.l-1) vo väčšine odberov v porovnaní
s kontrolnou skupinou (5,05±0,52 - 5,56±1,14 mmol.l-1). Podobne ako pri vápniku, aj hladina
celkových bielkovín mala tendenciu znižovať sa.. Pri porovnaní kontrolnej a pokusnej
skupiny, boli hodnoty tohto ukazovateľa v pokusnej skupine vždy nižšie a pohybovali sa
v rozmedzí od 56,57±4,86 do 63,88±3,93 mmol.l-1. Hodnoty v kontrolnej skupine jedincov
boli v intervale 63,48±6,39 – 68,12±4,41 mmol.l-1. Hodnoty
hladiny cholesterolu sa
pohybovali v kontrolnej skupine od 1,88±0,62 do 2,10±0,49 mmol.l-1. V pokusnej skupine
boli jeho hodnoty vyššie a kolísali v rozpätí od 2,41±0,73 do 3,37±0,72 mmol.l-1.
Tab. 1 Zmeny biochemických parametrov dospelých jedincov králika pri 36 °C
1. odber
2. odber
Kontrola
Pokus
X
Sd
X
Ca
3,62
0,32
CB
63,76
Glu
Chol
3.odber
Kontrola
Pokus
Kontrola
Pokus
Sd
X
Sd
X
Sd
X
Sd
X
Sd
3,43
0,31
3,68
0,30
3,53
0,47
3,87
0,29
3,50
0,23
4,88
60,99
4,13
67,58
4,09
63,88
3,93
68,12
4,41
62,5
4,54
6,80
0,64
6,77
0,48
5,31
0,49
6,24
0,67
5,05
0,52
5,15
0,50
2,10
0,5
3,37
0,73
1,94
0,60
3,27
0,91
1,93
0,53
3,28
1,40
204
4. odber
Kontrola
Pokus
X
Sd
X
Sd
Ca
3,55
0,29
3,63
0,51
CB
57,50
3,16
56,73
2,80
Glu
7,46
0,82
5,81
0,89
Chol
1,74
0,27
3,02
1,02
Tab. 2 Zmeny biochemických parametrov mláďat králika pri 36 °C
1. odber
2. odber
Kontrola
Pokus
X
Sd
X
Ca
3,54
0,21
CB
57,97
Glu
Chol
3.odber
Kontrola
Pokus
Kontrola
Pokus
Sd
X
Sd
X
Sd
X
Sd
X
Sd
3,02
0,44
3,38
0,28
3,41
0,29
3,76
0,42
3,64
0,34
4,12
60,93
4,39
49,02
4,62
50,6
3,77
60,13
3,58
58,37
4,08
8,58
0,83
10,07
0,94
6,25
0,70
6,66
0,72
5,14
0,49
6,18
0,52
2,55
0,73
4,82
1,26
2,25
0,93
3,34
1,17
1,96
0,95
3,27
1,40
4. odber
Kontrola
Pokus
X
Sd
X
Sd
Ca
3,82
0,23
3,53
0,23
CB
63,48
6,39
56,57
4,86
Glu
5,56
1,14
5,69
0,92
Chol
1,88
0,62
2,41
0,73
V skupine mláďat sa obsah vápnika v kontrolnej skupine pohyboval od 3,38±0,28 do
3,76±0,42 mmol.l-1. V pokusnej skupine boli zistené hodnoty daného ukazovateľa (3,02±0,44
– 3,64±0,34 mmol.l-1). Zaznamenali sme striedavé kolísanie hodnôt, v dvoch odberoch bol
obsah vápnika vyšší v pokusnej skupine a v dvoch v kontrolnej skupine.
Hodnoty koncentrácie glukózy boli vo väčšine prípadov vyššie v pokusnej skupine na rozdiel
od kontrolnej skupiny. Najnižšia zistená hodnota v kontrolnej skupine bola 5,14±0,49 mmol.-1
a najvyššia 8,58±0,83 mmol.l-1. V pokusnej skupine sa hodnoty pohybovali v rozmedzí
5,81±0,89 – 10,07±0,94 mmol.l-1. V poslednom odbere koncentrácia glukózy kontrolnej
skupiny prevýšila jej množstvo v pokusnej skupine.
Množstvo celkových bielkovín bolo pri porovnaní pokusnej skupiny (50,60,04±3,78 –
60,93±4,39 g.l-1) s kontrolnou (49,02±4,62–60,13,63±3,51 g.l-1) bolo na začiatku sledovaného
obdobia v prvých dvoch odberoch nižšie v kontrolnej skupine. V posledných dvoch odberoch
sme zaznamenali opačný jav.
205
Hodnoty cholesterolu boli vyššie (okrem prvého odberu) v pokusnej skupine (3,02±0,1,023,34±1,17 mmol.l-1) v porovnaní s kontrolnou skupinou (1,74±0,27-2,25±3,34 mmol.l-1).
Z výsledkov vyplýva, že biochemické parametre krvi sú ovplyvnené zvýšenou teplotou
chovného prostredia. Signifikantnejšie rozdiely sledovaných parametrov boli zistené u vekovo
mladších
skupín
jedincov,
čo
naznačuje
nestabilitu
regulačných
mechanizmov
intermediárneho metabolizmu (viď. Graf 1 a 2).
Graf 1
Graf 2
Tab. 3 Výsledky výkrmových pokusov počas hypertermickej záťaže králikov
Pokusná skupina
Ukazovateľ
Spotreba krmiva na 1 kg prírastku
medzi 56. až 77. dňom veku v kg
Priemerný prírastok živej hmotnosti
medzi 56. až 77. dňom veku v g/deň/ks
Celková spotreba krmiva v g/ks
Celkový prírastok živej hmotnosti
v g/ks
x ± S.D.
Kontrolná
skupina
Rozdiel ku kontrole
x ± S.D.
4,093
4,55
-10,04%
23,62
34,82
-32,16%
1412,88
3337,32
-1924,44 g
496,02
731,22
-235,2 g
Všetky sledované parametre u experimentálnych mláďat králikov počas výkrmového
pokusu
boli výrazne nižšie v porovnaní s kontrolnou skupinou mláďat (od -10,04% pri
spotrebe krmiva na 1 kg prírastku až po -57,66% pri spotreba krmiva do 77. dňa veku v g /
deň). Celkový prírastok živej hmotnosti v g/ks bol u mláďat vystavených hypertermii o 235,2
206
g nižší voči kontrolnej skupine. To svedčí o negatívnom vplyve vysokej teploty chovného
prostredia na živú hmotnosť a tým aj na celkový zdravotný stav sledovaných zvierat.
Záver
Počas stresovej záťaže v organizme dochádza k narušeniu homeostázy. Aktivujú sa
mechanizmy, ktoré zabezpečujú energiu pre zdolanie záťaže a následne mechanizmy, ktoré
zabezpečia obnovu vlastných energetických zdrojov organizmu. V literatúre nie sú doteraz
jednotné názory na jednoduché hodnotenie a interpretáciu stresových reakcií podľa
eventuálnych ukazovateľov v krvi a tkanivách. Literatúra zaoberajúca sa tematikou stresu sa
zhoduje v tom, že od vnútorného prostredia významne závisia adaptačné schopnosti zvieraťa
a jeho stresové reakcie. Expozícia mláďat a dospelých samcov a samíc hypertermickému
prostrediu (36 ± 3° C) pôsobí negatívne na ich fyziologické procesy a narúša ich vnútornú
homeostázu.
Prejavuje sa to negatívne v narušení metabolizmu bielkovín, glukózy,
cholesterolu, vápnika a na príjme a konverzii krmiva, na intenzite rastu, na prírastkoch živej
hmotnosti, ovplyvňuje zdravotný stav a vitalitu experimentálnych zvierat.
POĎAKOVANIE: Touto cestou by som chcela poďakovať Ing. M. Schneidgenovej a Ing. P.
Čupkovi za vykonanie biochemických analýz.
ZMENY V ŠTRUKTÚRE STEHNOVEJ KOSTI RYŠAVKY ŽLTOHRDLEJ
(APODEMUS FLAVICOLLIS) A RYŠAVKY KROVINNEJ (APODEMUS
SYLVATICUS)
DIFFERENCES IN FEMORAL BONE STRUCTURE OF YELLOW-NECKED MOUSE
(APODEMUS FLAVICOLLIS) AND WOOD MOUSE (APODEMUS SYLVATICUS)
Martiniaková, M.1, Omelka, R.2, Grosskopf, B.3, Jančová, A.1
1Department
of Zoology and Anthropology,
of Botany and Genetics, Constantine the Philosopher University, Nitra, Slovak Republic
3Institute of Zoology and Anthropology, Georg – August University, Göttingen, Germany
2Department
Abstract
Femoral bone structure of yellow-necked mouse (Apodemus flavicollis) and wood mouse
(Apodemus sylvaticus) was investigated in this study. Altogether 40 bones were analysed. We
compared bone length, bone weight and histological structure of the femora between
examined animals. Our results indicate the measured values for bone length were higher in
yellow-necked mouse (P<0.01). On the other hand, wood mouse disposed higher values of
207
bone weight (P<0.01). Statistically significant differences for bone length and bone weight
between females and males of both species were identified. Histological observation of thin
sections through a shaft of femora of both species revealed an outer and inner essentially nonvascular lamellar layer around a poorly developed reticular layer, containing unorganized
vascular canals. We did not identify differences in qualitative histological characteristics of
examined bones between Apodemus flavicollis and Apodemus sylvaticus.
Introduction
Although generally larger in size, the yellow-necked mouse (Apodemus flavicollis) is
very similar in appearance to the wood mouse (Apodmeus sylvaticus) and the two are often
difficult to distinguish. Both species have brown fur with paler, white bellies, although the
yellow-necked mouse may often be somewhat lighter in colour. The main difference between
these mice is that, as the name suggests, the yellow-necked mouse has a collar of yellowish
fur, which forms a bib on the chest. This collar is often fairly difficult to see, however (Leach,
1990).
In general, compact bone tissue forms the shafts of long bones, the surfaces of their
extremities, short bones, and the outer and inner layer (lamina externa et interna) of the skull
vault in rodents. Basic constituents of its structural organization are primary osteons and
secondary osteons. While primary osteons are not surrounded by a reversal (cement) line and
lamellae round them merge smoothly with the surrounding bone, the secondary osteons
consist of a central (Haversian) channel, which is surrounded by concentric rings (lamellae) of
matrix (Currey, 2002; Martiniaková et al., 2007).
According to Enlow and Brown (1958) the outer compacta of rodents is made of
circumferencial lamellae containing a few vessels, but it is essentially non-vascular in
structure. In the middle of reticular compacta, secondary activity is evident, but Haversian
bone tissue is not always formed. An absence of Haversian bone tissue was also identified in
the study by Martiniaková et al. (2005) for adult rats. On the other hand, Rajtová and
Globočník (1978) mention an occurrence of secondary osteons in compact bone tissue of
adult mice.
In the present study a femoral bone structure of yellow-necked mouse (Apodemus
flavicollis) and wood mouse (Apodemus sylvaticus) was investigated.
Material and Methods
208
Our research focused on 40 femora (20 from females and 20 from males) from adult
animals of the species Apodemus flavicollis and Apodemus sylvaticus living in the area of
Nitra region. We compared bone length, bone weight and histological structure of the femora
between investigated animals. Values for macroscopic analysis were expressed as mean ±
standard deviation. The T-test was used to distinguish possible changes in bone length and
bone weight between examined species and also between females and males of the same
species.
For histological analysis, each of the bones was sectioned at the mid-shaft of its
diaphysis. In total, 40 transversal sections of the femur diaphysis were cut. The obtained
segments were macerated and degreased (Martiniaková et al., 2005). Later the samples were
embedded in epoxy resin Biodur (Herrmann et al., 1990). Transverse thin sections (70-100
µm) were prepared with a sawing microtome (Leitz 1600) and mounted on glass slides with
Eukitt (Merck). The qualitative characteristics of analysed microstructure were determined
according to Enlow and Brown's (1956) classification systems in anterior, posterior, medial,
and lateral views of thin sections.
Results and Discussion
According to our results the measured values for bone length were higher in yellownecked mouse (P<0.01). On the other hand, wood mouse disposed higher values of bone
weight. This difference was also significant (Table 1). Our findings related to bone length of
both species are in complete agreement with those published by Leach (1990). However, a
higher value of bone weight identified in wood mouse was observed only in our study.
In addition, statistically significant differences for bone length and bone weight
between females and males of both species were found (Table 2). We identified higher values
of bone weight in females of Apodemus sylvaticus (P<0.05), whereas males disposed higher
values of bone length (P<0.01). Opposite results in macroscopic analysis of examined bones
were observed between females and males of wood mouse.
Table 1 Results of macroscopic analysis of investigated femora in Apodemus flavicollis and
Apodemus sylvaticus.
species
n
bone weight (g) bone length (cm)
Apodemus flavicollis 20 0.078±0.019
1.881±0.106++
Apodemus sylvaticus 20 0.086±0.020++
1.767±0.079
P<0.01 (++)
209
Table 2 Sex-related differences in macroscopic analysis of examined bones in yellow-necked
mouse and wood mouse.
species
sex
n
bone weight (g) bone length (cm)
yellow-necked mouse females 10 0.081±0.025+
1.841±0.095
yellow-necked mouse males
1.920±0,106++
10 0.075±0.012
wood mouse
females 10 0.078±0.024
wood mouse
males
10 0.094±0.011++
1.786±0.099+
1.747±0.051
P<0.05 (+), P<0.01 (++)
Histological observation of thin sections through a shaft of femora from the
investigated rodents revealed an outer and inner essentially non-vascular lamellar layer
around a poorly developed reticular layer, containing unorganized vascular channels (Figures
1 and 2, magnification x 200). No secondary osteons were found in the microstructure,
showing that the remodeling process is absent in the investigated bones. Similar results were
also found in the studies by Enlow and Brown (1958) and Martiniaková et al. (2005) for long
bones of rodents.
Figure 1 Bone microstructure of Apodemus sylvaticus.
Figure 2 Bone microstructure of Apodemus
flavicollis.
In conclusion, differences in macroscopic analysis of femora from yellow-necked
mouse (Apodemus flavicollis) and wood mouse (Apodemus sylvaticus) were identified in our
study. On the contrary, no changes in qualitative histological characteristics of the femur were
observed between both species. In order to obtain more reliable results in this direction,
quantitative histological analysis should also be assessed. It is a subject of current research.
210
Moreover, further research in this area will need to extend the number of analysed skeletal
elements and to verify the results that were obtained from our skeletal samples.
Acknowledgment
This study was supported by the grants VEGA 1/2364/05 (Ministry of Education, Slovak
Republic) and CGA: Study of morphologic changes in skeleton microstructure of various
mammalian species.
References
Currey J.D.: Bones: Structure and mechanics. Princeton University Press: New Jersey, 2002, 14-21.
Enlow D.H. and Brown S.O.: The Texas Journal of Science, 1956, 8, 405-412.
Enlow D.H. and Brown S.O.: The Texas Journal of Science, 1958, 10, 187-230.
Herrmann B., Grupe G., Hummel S., Piepenbrink H. and Schutkowski H.: Prähistorische Anthropologie.
Leitfaden der Feld- und Labormethoden. Springer Verlag: Heidelberg, 1990.
Leach, M.: Mice of the British Isles. Shire Publications Ltd: Shire Natural History, Aylesbury, 1990.
Martiniaková M., Grosskopf B., Vondráková M., Omelka R. and Fabiš M.: Scripta Medica (Brno), 2005, 78, 4550.
Martiniaková M., Grosskopf B., Omelka R., Dammers K., Vondráková M. and Bauerová M.: Int. J.
Osteoarchaeol, 2007, 82-90.
Rajtová V. and Globočník E.: Gegenbaurs. Morphol. Jahb. 1978, 124, 649-662.
Contact address: RNDr. Monika Martiniaková, PhD., Katedra zoológie a antropológie,
Nábrežie mládeže 91, 949 74 Nitra, e-mail: [email protected]
HEPATODYSTROFIE - STEATÓZA
HEPATODYSTROFIA – STEATOSIS
Massányi P., Kováčik, J. Žoldoš, E.,Fabiš, M., Lukáč, N., Kolesárová, A.
Slovenská poľnohospodárska univerzita, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Katedra fyziológie živočíchov, Tr. A.
Hlinku 2, 949 76 Nitra
Abstact
In this study occurence of hepatal steatosis is described, where optical empty vaccuoles in
hepatocytes were observed. In developing steatosis in the biggining small adipose droplets in
hepatocytes cytoplasm later bleding to big droplets with increasing size were found. Finally
a large adipose droplet fill the cell and replace cytoplasm to the marginal zone. Steatosis
affected at central, intermedium and peripheral zone of lobe, perspectively all lobe. The
finding of pathological changes of liver is also supported by metabolic profile where
alteration in energy and hepatal profile were detected. Results of metabolic profile correlate
with pathohistological finding and represent the disease development.
Úvod
211
Pečeň je najväčšou žľazou v organizme a jedným z najdôležitejších orgánov vôbec.
Patogeneticky sa na vzniku steatózy pečene uplatňujú kvantitatívne a kvalitatívne odchýlky v
prísune tukov, v ich syntéze, odbúravaní a odsune. Ide o poruchu vzájomnej rovnováhy
uvedených pochodov. Zjavné patologické hromadenie tuku v pečeňovom tkanive po určitú
dobu organizmus znáša (Cihelek et al., 2006; Lubojacka et al., 2005; Schouvert, 2000). Za
normálnych okolností pečeň obsahuje menej ako päť percent tuku. Pri ťažkej steatóze stúpa
obsah tuku na 50% i viac (Cuvelier et al., 2005; Varga et al., 2005; Chavatte-Palmer et al.,
2004)
Na vzniku sa môže spolupodieľať aj nedostatok tzv. lipotropných látok, ako sú cholín
a metionín, poprípade vitamíny a iné nutritívne faktory. Ak sa odstráni včas vyvolávajúca
príčina, tukové zmeny pečene v pomerne krátkej dobe a bez následkov vymiznú.
V predloženej práci popisujeme štrukturálne zmeny pečene v súvislosti s problémami
v chove, ktoré si vyžiadali analýzu tohto orgánu a dôkaz predpokladaných zmien. Cieľom
práce bola aj analýza vybraných parametrov metabolického profilu zvierat v sledovanom
chove, ktoré indukovali zistené patologické zmeny pečene.
Materiál a metodika
Vzorky pečene sme získali od vysokoteľných jalovíc a dojníc s predpokladom
metabolických porúch z poľnohospodárskeho družstva v okrese Nitra.
Vzorky sa fixovali v 10% formalíne, odvodnili vo vzostupnom rade alkoholu a zaliali do
parafínu. Sériové rezy o hrúbke približne 10 µm sme ukladali na odmastené a označené
podložné sklíčka. Po narezaní sa rezy farbili prehľadným farbením hematoxylín – eozínom
podľa platných metodík. Po zafarbení sa vzorky zamontovali do solakrylu a výsledkom sú
trvalé histologické preparáty vhodné na hodnotenie svetelným mikroskopom.
V danom chove sme sledovali aj parametre klinickej biochémie krvi. Zvieratá (n=5)
boli rozdelené do troch skupín – zasušené, 4 týždne post partum a 4 mesiace post partum. Krv
sa získavala z hrdelnicovej žily (vena jugularis) do pripravených skúmaviek. Následne sa krv
centrifugovala 15 minút pri 3000 otáčkach, aby sme získali krvné sérum. Z krvého séra sa
spektrofotometricky stanovili parametre metabolického profilu – minerálny (Ca, P, Ca:P, Mg,
Na, K), energetický (glukóza, cholesterol, triglyceridy, celkové lipidy), enzymatický (ALT,
AST) a dusíkový (močovina, celkové bielkoviny) profil. Od sledovaných zvierat sa
v rovnakých intervaloch odoberal aj moč s sledovali sa nasledovné parametre – Ca, P, Mg,
Na, K, močovina, pH, merná hmotnosť (Mh) a čistý acidobázický výťažok (ČABV).
212
Jednotlivé
získané
hodnoty
sme
porovnávali
s normami,
ktoré
sú
využívané
v poľnohospodárskej a veterinárnej praxi.
Výsledky a diskusia
Základnou stavebnou jednotkou pečene sú pečeňové lalôčiky, tvorené pečeňovými
bunkami (hepatocyty) a krvnými sinusoidami, medzi ktorými sa nachádza väzivo (Obrázok 1,
3, 5). Pri steatóze pečene (n=12) sa zistili v parenchýmových bunkách pečene väčšie alebo
menšie opticky prázdne vakuoly. Pri rozvíjajúcej sa steatóze sa najprv v cytoplazme
parenchýmových buniek objaví množstvo drobných tukových kvapôčok (drobnokvapkové
stukovatenie), ktoré neskôr splynú vo veľké kvapky, alebo sa zjaví jedna kvapka, ktorá sa
zväčšuje. Nakoniec veľká tuková kvapka vypĺňa celú bunku a zatláča cytoplazmu a jadro na
okraj (veľkokvapkové stukovatenie). Stukovatenie môže postihnúť ojedinelé bunky, alebo
skupiny pečeňových buniek v ktorejkoľvek časti lalôčikov. Stukovatenie postihlo selektívne
centrálnu (Obrázok 2), intermediárnu, alebo len periférnu zónu lalôčikov, prípadne vzniklo
stukovatenie celého lalôčika (Obrázok 4). Veľmi často sa ukladá tuk v pečeňových bunkách
centrálnej zóny lalôčika, stukovatenie periférnej zóny lalôčikov je pomerne zriedkavé
a nachádza sa hlavne pri toxémiách a pri niektorých poruchách výživy. Dokiaľ stukovatenie
pečene postihuje menšiu časť pečeňových buniek, zostáva štruktúra pečene dobre zreteľná.
Ak stukovatenie pokročí tak, že všetky bunky celého lalôčika sa vyplnia tukom, tkanivo
prestáva mať podobu pečene, ale podobá sa skôr tukovému tkanivu (Obrázok 6). Len podľa
portobiliárnych priestorov a podľa centrálnych vén poznať, že ide o pečeň.
Tuková degenerácia je tiež príčinou poklesu leukocytov (hlavne eozinofilov a neutrofilov)
a lymfocytov. Tým sa znižuje imunitná aktivita dojníc. Kravy sú náchylnejšie na rôzne
bakteriálne a polyfaktoriálne ochorenia (mastitídy, metritídy, puerperálne atónie, peritonitídy,
ochorenia končatín, laminitídy atď.), kde základnou príčinou ich vzniku sú hepatodystrofie
(Griffin et al., 2007; Brouwers et al., 2007).
Biochemický
nález
v
krvom
sére
bol
nasledovaný:
hyperfosfatémia,
hypermagneziémia, hypomagneziémia, hyperprotinémia, hypoproteinémia, zvýšené hodnoty
AST, zvýšené hodnoty ALT, zvýšené hodnoty GGT, zvýšené hodnoty ALP, hyperlipidémia,
hypercholesterolémia, hyperbilirubinémia a hypertriglyceridémia. V moči (Tabuľka 15) sa
zistila hypokalciúria, hypomagneziúria, hyponatriúria, zvýšená hladina močoviny v moči,
znížená hladina močoviny v moči, znížené pH a znížený ČABV.
Problémy v minerálnom profile, hoci na prvý pohľad v sére veľmi mierne a nepatrné plne
odhaľujú a dokumentujú hladiny minerálií v moči. Zatiaľ čo priemerná hladina Ca v moči
213
zasušených zvierat je v referenčnom rozpätí, u zvierat post partum a najmä v strede laktácie
jeho dolnú hranicu nedosahuje (1,158 resp. 0,597). Hladiny fosforu sú v moči v rozpätí, ale
tiež majú svoju tendenciu (najnižšia u zasušených a najvyššia u dojníc v strede laktácie).
Sodík je výrazne znížený u zasušených a ešte viac u zvierat v strede laktácie. Draslík je
v moči v referenčnom rozpätí u všetkých skupín zvierat.
Minerálny profil
Ca
P
Ca:P
Mg
Na
K
-1
Jednotka
mmol.l
zasušené
2,48
1,86
1,30
0,71
147
4,68
4 TPP
2,44
2,00
1,20
0,94
147
4,56
4 MPP
2,42
2,36
1,00
1,12
146
4,40
priemer
2,44
2,07
1,20
0,92
146,9
4,55
norma*
2,25 – 3,00
1,60 – 2,26
1,2 – 1,6
0,80 – 1,07
136 – 150
4,0 – 5,8
214
1
2
3
4
5
6
Steatóza pečene –
ƒ
normálna stavba pečene (1 – zväčšenie 4x, 3 – 10x, 5 – 20x) [dojnica, vek 64 mes.,
úžitkovosť – 1. laktácia 8008 l/446 dní. lakt. – 8637 l/297 dní, 3. lakt. – 10057 l/291
dní];
ƒ
abnormálna stavba (2 – zv. 4x) [vysokoteľná jalovica, prvoteľka, vek 26 mes.]
ƒ
abnormálna stavba (4 – zv. 10x) [dojnica, vek 63 mes., úžitkovosť – 1. lakt. 7544
l/399 dní, 2. lakt. – 8212/314 dní l,3. lakt. – 10384 l/293 dní]
ƒ
abnormálna stavba (6 – zv. 20x [vysokoteľná jalovica, prvoteľka, vek 26 mes.]
215
Hodnoty ukazovateľov bielkovinového profilu v sére (močovina) naznačujú vzostupnú
dotáciu bielkovín v KD smerom od zvierat zasušených, cez skupinu otelených až po zvieratá
v strede laktácie. O nedostatku ľahko dostupnej (glycidovej) energie u zvierat v strede
laktácie svedčí aj stúpajúca hladina celkových lipidov (hoci stále v referenčnom rozpätí)
sprevádzaná tiež zvýšením hladiny celkového cholesterolu a triglyceridov ako dôsledku
zintenzívňujúcej sa lipomobilizácie v snahe vykryť nedostatok ľahko dostupnej energie
chýbajúcej v KD. Tento stav (značne vysoký príjem bielkovín a tomu neprimerane nízky
príjem energie krmivom sprevádzaný lipomobilizáciou) zaťažuje pečeňové bunky, o čom
svedčia aj zvýšené hodnoty AST a ALT v skupine 4 mesiace v laktácii, resp. AST post
partum. ALP je zvýšený u všetkých jedincov. Môže to byť reakcia na prebiehajúce
hepatopatie, ale aj cholestázu (ktorej výskyt by mohla naznačovať zvýšená hladina bilirubínu
v sére). Hodnoty ALP ale súvisia aj s vekom jedinca (u mladších sú hodnoty vyššie než
u starších). Zvýšená hladina celkového bilirubínu môže mať pôvod prehepatálny (hemolýza),
hepatálny (hepatopatie) alebo posthepatálny (cholestáza). Hyperbilirubinémia však môže
vzniknúť aj ako dôsledok nedostatočného príjmu energie krmivom. Po zvýšenej
lipomobilizácii stúpajúce množstvo VMK súperí v hepatocytoch s bilirubínom o rovnaké
transportné proteíny, v dôsledku čoho sa hladiny bilirubínu v plazme zvyšujú a prekračujú
horné hranice referenčného rozpätia (Deckers-Kocken et al., 2006; Mourot et al., 2006).
Zvýšenie hladín celkového cholesterolu a triglyceridu spôsobí poškodenie pečeňového
parenchýmu, následne nastupuje ťažká steatóza pečene (syndróm stučnenia kráv), cirhóza
pečene. Zvýšenie hladín celkových lipidov a voľných mastných kyselín je spôsobené
prekrmovaním ľahko stráviteľných sacharidov (najmä pri dojniciach v období státia nasucho),
zvýšeným ukladaním tukov v depotných tkanivách a následná zvýšená lipomobilizácia (po
pôrode), steatóza pečene, ketóza, zmeny v enzymatickom, dusíkovom, bachorovom profile.
Hyperglykémia sa prejaví pri prekŕmení ľahko stráviteľných
sacharidov, pri stresových
stavoch – pôrod, transport, cukrovka (Degrace et al., 2006; Negro, 2006).
Energetický profil
GL
CH
TG
CL
Jednotka
mmol.l-1
mmol.l-1
mmol.l-1
g.l-1
Zasušené
4,63
2,83
0,54
2,75
4 TPP
3,85
3,46
0,60
3,54
4 MPP
4,11
6,49
0,70
4,98
Priemer
4,20
4,26
0,61
3,76
norma*
2,20 – 3,90
2,60 – 5,20
0,20 – 0,80
2,00 – 5,20
GL – glukóza; CH – cholesterol; TG – triglyceridy; CL – celkové lipidy
216
Enzymatický profil
AST
ALT
GMT
ALP
BI
µkat.l-1
Jednotka
Zasušené
0,53
0,25
0,39
2,21
10,16
4 TPP
0,73
0,29
0,50
3,18
12,50
4 MPP
0,73
0,39
0,49
1,63
9,32
Priemer
0,66
0,28
0,46
2,34
10,66
norma*
0,22 – 0,50
0,16 – 0,38
0,20 – 0,50
0,28 – 0,84
0,17 – 5,13
CK – celkový keratín; BI – bilirubín
Dusíkový profil
močovina
celkové bielkoviny
Jednotka
mmol.l-1
g.l-1
Zasušené
3,87
73,84
4 TPP
4,42
72,81
4 MPP
5,72
84,89
priemer
4,67
77,18
norma*
3,0 – 5,0
68 – 84
Tabuľka 15 – Močový profil – odber III.
Ca
P
Mg
Na
K
MO
pH
Mh
logmolc
g.ml-1
jednotka
mmol.l-1
zasušené
0,60
2,90
7,9
9,5
217,4
408,0
8,1
1,036
4 TPP
1,16
3,03
6,8
37,5
222,3
280,8
7,7
1,033
4 MPP
1,24
1,42
7,3
14,0
213,7
183,8
8,1
1,024
priemer
1,00
2,45
7,3
20,3
217,8
290,9
8,0
1,031
norma*
0,12 – 0,32 – 6,17 – 20
1,50
5,17
16,46
80
– 140 – 130 – 7,8 – 8,4
320
300
1,030 –
1,045
Zvýšenie enzýmu AST sa prejaví vo vzniku akútnej hepatitídy, dystrofie, steatózy pečene,
myokarditídy, nutričnej svalovej dystrofii, nefróze. Zvýšenie enzýmu ALP naznačuje
intrahepatálnu a extrahepatálnu obštrukciu. Zvýšenie bilirubínu sa prejaví pri puerperálnej
pečeňovej kóme, puerperálnej hemoglobinúrii, akútnej hepatopatii, intrahepatálnom
217
a posthepatálnom iktere. Nadbytok ALT sa prejaví v akútnej hepatocelulárnej nekróze,
hepatitíde, cirhóze (Ota et al., 2007).
Hypoproteinémia – nedostatok SNL v kŕmnej dávke, dlhodobá negatívna dusíková bilancia,
dysfunkcie bachorového trávenia (nedostatočná tvorba bielkovín v predžalúdku), hepatopatie,
nekrotický syndróm (degeneratívne a zápalové ochorenie obličiek), endoparazitózy.
Hyperproteinémia sa prejaví u starších zvierat ako dehydratácia (zvýšená hemokoncentrácia),
infekčné ochorenia (zvýšenie najmä globulínovej frakcie), ako aj chronické zápalové procesy.
Nadmerný prívod tukov sa uskutočňuje lipémiou, alebo zvýšenou koncentráciou lipidov
v bezprostrednom okolí postihnutej bunky. Takto je to u steatózy saginatívnej,
transportatívnej, dyskratickej a resorptivnej (Hussein et al., 2007; Wisniewska-Ligier et al.,
2006).
Literatúra
BROUWERS, M.C.G.J., BILDERBEEK-BECKERS, M.A.L., GEORGIEVA, A.M., et al.: Fatty liver is an
integral feature of familial combined hyperlipidaemia: relationship with fat distribution and plasma lipids. Clin.
Sci., 112, 2007, 123-130.
CIHELEK, T., SEVINC, M., BOYDAK, M., et al.: Serum apolipoprotein B100 concentrations in dairy cows
with left sided displaced abomasum. Rev. Med. Vet., 157, 2006, 361-365.
CUVELIER, C., CABARAUX, J.F., DUFRASNE, I., et al.: Blood transport and hepatic metabolism of fatty
acids in ruminants. Ann. Med. Vet., 149, 2005, 117-131.
DECKERS-KOCKEN, J.M., NIKKELS, P.G.J., VERHEEM, A., et al.:Atypical findings in a rat model for
parenteral nutrition-induced cholestasis. Nutr. Res., 26, 2006, 664-669.
DEGRACE, P., MOINDROT, B., MOHAMED, I., et al.: Upregulation of liver VLDL receptor and FAT/CD36
expression in LDLR-/- apoB(100/100) mice fed trans-10,cis-12 conjugated linoleic acid. J. Lipid Res., 47, 2006,
2647-2655.
GRIFFIN, J.L., SCOTT, J., NICHOLSON, J.K.: The influence of pharmacogenetics on fatty liver disease in the
Wistar and Kyoto rats: A combined transcriptomic and metabonomic study. J. Proteome Res., 6, 2007, 54-61.
HUSSAIN, G., NAKAGAWA, T., GOTO, H., et al.: Astaxanthin ameliorates features of metabolic syndrome in
SHR/NDmcr-cp. Life Sci., 80, 2007, 522-529.
CHAVATTE-PALMER, P., REMY, D., CORDONNIER, N., et al.: Health status of cloned cattle at different
agens. Cloning Stem Cells, 6, 2004, 94-100.
LUBOJACKA, V., PECHOVA, A., DVORAK, R., et al.: Liver steatosis following supplementation with fat in
dairy cow diets. Acta Vet. Brno, 74, 2005, 217-222.
MOUROT, J., GUY, G., PEINIAU, P., et al.: Effects of overfeeding on lipid synthesis, transport and storage in
two breeds of geese differing in their capacity for fatty liver production. Anim. Res., 55, 2006, 427-442.
NEGRO, F.: Mechanisms and significance of liver steatosis in hepatitis C virus infection. World J.
Gastroenterol., 12, 2006, 6756-6765.
OTA, T., TAKAMURA, T., KURITA, S., et al.: Insulin resistance accelerates a dietary rat model of
nonalcoholic steatohepatitis. Gastroenterol., 132, 2007, 282-293.
SCHOUVERT, F.: Fatty liver disease in the dairy cow. Point Vet., 31, 2000, 7-13.
VARGA, I., SZEBENI, A., SZOBOSZLAI, N., et al.: Determination of trace elements in human liver biopsy
samples by ICP-MS and TXRF: hepatic steatosis and nickel accumulation. Anal. Bioanal. Chem., 383, 2005,
476-482.
WISNIEWSKA-LIGIER, M., WOZNIAKOWSKA-GESICKA, T., KUPS, J., et al.: Lipid metabolism in
children with chronic hepatitis C, a preliminary report. Hepato-Gastroenterol., 53, 2006, 887-891.
218
PROTEKTÍVNY ÚČINOK ZINKU VOČI PÔSOBENIU KADMIA U HYDINY
PROTECTIVE EFFECT OF ZINC AGAIN CADMIUM ACTIVITY IN POULTRY
Naď, P., Skalická, M., Koréneková, B., Pistl, J., Massanyi, P.*, Cigánková, V.
Univerzita veterinárskeho lekárstva Košice, SR
*Slovenská poľnohospodárska univerzita Nitra, SR
Abstract
In the 2 experiments on Japanese quails and turkeys
was investigate
markedly
important depressive effect of cadmium on the level of cellular immunity after long-term
exposition, however after short-time exposition, it was not manifested. Feeding of higher Zn
amounts together with
Cd assigned protective effect. Statistically important (p<0.05)
protected effect of Zn against
immunodepresive
effects of Cd was
found at cellular
immunity. Accumulation of Cd was 36 multiple lower in muscle in comparison to kidney and
26 multiple lower in comparison to liver. Per os zinc application statistically important
(p<0.05) decreased Cd accumulation in kidneys and livers of birds.
Key words: cadmium, zinc, immunity, health, food quality, poultry
Úvod
V životnom prostredí migrujú polutanty vstupujúce do potravového reťazca a následne
negatívne pôsobiace na rôznych úrovniach organizmu a jeho jednotlivé systémy (Toman a
kol., 2002, Uyanik a kol., 2001). Medzi najdôležitejšie toxické prvky patria olovo, kadmium,
ortuť a arzén. Pravidelný, aj keď nie vysoký, príjem kadmia potravou môžeme považovať za
rizikový, pre jeho kumulačnú vlastnosť v cieľových orgánoch a tkanivách. Z tohto pohľadu je
nevyhnutné hľadať spôsoby a postupy pre spomaľovanie migrácie kadmia v prostredí a
metódy ovplyvňovania neho negatívneho účinku na živý organizmus. Ľahko sa vstrebáva a
koncentruje v črevnej stene, najmä v duodene, menej v jejune a ileu. Podľa Duizera (1999)
kadmium narúša spojenie buniek sliznice čreva a tým sa prestup kadmia cez stenu tráviaceho
aparátu zvyšuje. Primárnym miestom pôsobenia kadmia sú biologické membrány, pretože
katión kadmia ľahko reaguje s membránovými fosfolipidmi (Sokol a kol.,1998). Je schopné
preniknúť do vnútra bunky a narušiť syntézu nukleových kyselín, čo je podstatou jeho
mutagénneho účinku, chromozomálnych aberácií, karcinogénnych a teratogénnych účinkov a
nekróz. Jedným z významných antagonistov kadmia je zinok. Je súčasťou mnohých
metaloenzýmov a ovplyvňuje viaceré systémy organizmu, predovšetkým reprodukčný aparát
a imunitný obranný systém (Bíreš, 1985).
219
Materiál a metodika
V dvoch experimentoch boli použité japonské prepelice (vo veku 3 týždňov) a morky
plemena BIG-6 (vo veku 5 týždňov). Po aklimatizácií v experimentálnych priestoroch boli
zvieratá rozdelené do skupín. Kontrolná skupina (K), kŕmená klasickou kŕmnou zmesou (KZ)
bez prídavkov; skupina s prídavkom kadmia v dávke predstavujúcej 6 násobok prípustného
limitu
v kŕmnej zmesi (Cd1); skupina s prídavkom kadmia v dávke predstavujúcej 12
násobok prípustného limitu v KZ (Cd2); skupina s prídavkom zinku v dávke rovnajúcej sa 2
násobku doporučeného obsahu v KZ (Zn) a skupina s prídavkom kadmium v kombinácií so
zinkom (CdZn). Odber vzoriek krvi, tkanív a orgánov u prepelíc bol vykonaný na 37., 58. a
118. deň od začiatku podávania prípravkov. V experimente na morkách boli vzorky tkanív
odoberané po 71 dňovej expozícií. Kadmium ako chlorid kademnatý (CdCl2) a zinok ako
síran zinočnatý (ZnSO4) boli prepeliciam podávané v malom objeme pitnej vody pri rannom
napájaní a morkám vo vodnom roztoku individuálne aplikáciou do zobáka.
Vzorky tkanív a orgánov boli spracované mikrovlnným rozkladom na zariadení
MILESTONE 1 200 MEGA. Zmineralizované vzorky boli analyzované
na atómovom
absorpčnom spektrometri SOLAR 939 UNICAM podľa metodiky, ktorú uvádza Kocourek,
(1992). Boli sledované obsahy kadmia (Cd), zinku (Zn), železa (Fe) a medi (Cu).
Pre analýzu imunologických parametrov boli zvolené testy hodnotiace funkčnú aktivitu
fagocytárnych buniek (metabolická aktivita fagocytov) a lymfocytov (polyklónová aktivácia
lymfocytov). Metabolická aktivita fagocytov bola hodnotená na základe tetrazolium–
reduktázovej aktivity buniek počas fagocytózy (Goldová a kol., 2001). Agarózový MIT bol
vykonaný podľa Bendixena a kol. (1976) a bol použitý na hodnotenie polyklónovej aktivácie
lymfocytov.
Celkové imunoglobulíny boli stanovované Zinksulfátovým testom, založeným na
princípe zrážania globulínov v sére síranom zinočnatým za vzniku zákalovej reakcie. Intenzita
zákalu je meraná spektrofotometricky pri 623nm.
Výsledky a diskusia
V krvi prepelíc na konci experimentu (po 118 dňoch) boli najvyššie priemerné hodnoty
metabolickej aktivity fagocytov (IMAF) zistené v skupine prijímajúcej zinok (3,02) a
v kontrolnej skupine (2,99). Najnižšia hodnota (2,23) bola v skupine s prídavkom kadmia vo
vyššej koncentrácií (tab. 1.). Štatisticky významne rozdiely na hladine významnosti P>0,001
boli medzi kontrolnou skupinou a skupinami Cd1, Cd2, medzi skupinou Cd1 a skupinami Zn
a CdZn, medzi Cd2 a Zn. Z týchto zistení je výrazne preukázaný negatívny účinok kadmia na
220
aktivitu leukocytov. Štatistický významne rozdiely, ale rádovo na nižšej hladine, boli medzi
uvedenými skupinami zaregistrované aj pri vzorkách krvi odobratých po 58 dňoch od
začiatku aplikácie prípravkov a na hladine významnosti P>0,05 sme zistili rozdiel medzi
skupinou kontrolnou (K) a skupinou s vyšším prídavkom kadmia (Cd2) už po 37. dni od
začiatku experimentu.
Tabuľka č. 1 Metabolická aktivita fagocytov a mobilita leukocytov v krvi prepelíc
IMAF
IML
K
Cd1
Cd2
Zn
Cd+Zn
Min.
2,56
2,08
2,05
2,57
2,67
max.
3,36
2,63
2,55
3,33
3,13
X
2,99
2,32
2,23
3,02
2,79
SD
0,239
0,127
0,135
0,246
0,178
Min.
0,39
0,63
0,55
0,42
0,61
max.
0,84
0,88
0,85
0,75
0,75
X
0,62
0,76
0,71
0,58
0,69
SD
0,122
0,068
0,085
0,075
0,066
IMAF – index metabolickej aktivity fagocytov, IML – index migrácie leukocytov
Index migrácie leukocytov, na konci experimentu, bol štatistický významne nižší
(P>0,01) medzi skupinami Zn:Cd1 a na hladine významnosti P>0,05 medzi skupinami K:Cd1
a Zn:Cd2. Medzi ostatnými skupinami neboli zistené štatisticky významné rozdiely. Pri
odbere krvi na 58. deň experimentu boli zistené významne rozdiely (P>0,01) iba medzi
skupinami Zn:Cd1 a na hladine významnosti P>0,05 medzi K:Cd1. Vo vzorkách séra
z odberu na 37. deň od začiatku experimentu nebol zistený žiadny významný rozdiel medzi
skupinami.
Obsah imunoglobulínov bol najvyšší v kontrolnej skupine (3,13 uZST). Najnižšie
hodnoty sme namerali v skupine CdZn (1,87 uZST). V ostatných skupinách sa hodnoty
pohybovali v rozpätí 1,97 – 2,56 uZST. Medzi jednotlivými skupinami nebol zistený
štatisticky významný rozdiel. Sledovaním vplyvu kadmia na imunitný systém a
ovplyvňovanie jeho účinku zinkom, sa zaoberali Vasilyeva a kol.(2001). Zistili, že v nízkych
dávkach Cd stimuluje imunitný systém, vyššie koncentrácie pôsobia imunodepresívne.
Ujamik a kol. (2001) sledovali vplyv rôznych dávok kadmia na vybrané biochemické
221
parametre, hmotnosť a kumuláciu v orgánoch, pričom negatívny účinok zisťovali pri dávkach
50, 75 a 100mg Cd/kg krmiva.
V experimente na morkách bol sledovaný obsah jednotlivých prvkov v tkanivách (tab.
2.). Obsah kadmia v stehnovom svale bol významne vyšší (P>0,001) v skupinách s prídavkom
kadmia a kadmia+zinok (0,029 mg/kg, resp. 0,028 mg/kg) oproti kontrolnej skupine a skupine
s prídavkom zinku ( 0,014 mg/kg, resp. 0,015 mg/kg). Medzi skupinou s prídavkom kadmia
a skupinou prijímajúcou kadmium a zinok neboli zistené rozdiely v obsahu kadmia.
Antagonistický účinok zinku oproti kadmiu sa v tomto prípade neprejavil. Vo vzorkách
pečene a obličiek sa zinok prejavil ako významný faktor blokovania transportu a ukladania
kadmia v týchto orgánoch. Priemerný obsah kadmia v pečeni moriek prijímajúcich kadmium
bol 0,78 mg/kg, naproti tomu skupina s príjmom kadmia a zinku mala priemerný obsah iba
0,41 mg/kg, štatisticky významný rozdiel na hladine P>0,001. Významný rozdiel obsahu
kadmia na tej istej hladine sme zistili aj v obličkách. Skupina s prídavkom samotného kadmia
mala priemerný obsah 1,09 mg/kg, pričom v skupine s kombinovaným podávaním kadmia
a zinku iba 0,63 mg/kg. V týchto dvoch orgánoch sa ochranný účinok zinku oproti kadmiu
prejavil významne v znížení hladín kadmia takmer o polovicu.
Tabuľka č.2: Obsah kadmia a zinku v svalovine a orgánoch moriek
Vzorka prvok
sval
Cd
pečeň
skup. K skup. Cd skup. Zn skup. Cd+Zn
x
0,0295
0,0155
0,0283
SD 0,001
0,001
0,004
0,007
x
0,070
0,780
0,072
0,409
SD 0,026
0,062
0,018
0,031
0,072
1,091
0,094
0,627
SD 0,018
0,057
0,016
0,044
x
15,93
31,55
19,04
SD 2,09
3,05
5,60
1,56
x
20,81
29,22
19,92
0,99
2,96
2,34
19,44
25,08
20,41
1,99
2,85
1,12
obličky x
sval
Zn
pečeň
0,0143
19,46
25,66
SD 6,29
obličky x
23,02
SD 5,98
Záver
V experimentoch na japonských prepeliciach a morkách bol zistený preukazne významný
depresívny účinok kadmia na úrovni bunkovej imunity pri dlhodobejšej expozícií, ktorý sa pri
222
krátkodobom pôsobení
(do 50 dní) neprejavil. Podanie vyšších dávok zinku s kadmiom
preukazuje protektívny účinok. Významný ochranný efekt zinku voči imunodepresívnym
účinkom kadmia bol zistený pri bunkovej imunite. Podávanie zinku v skupine exponovanej
kadmiom významne eliminovalo nepriaznivé účinky kadmia. Ukladanie kadmia v svalovine
bolo 36 násobne nižšie oproti obličkám a 26 násobne nižšie oproti pečení. Per orálna aplikácia
zinku významne znižovala kumulovanie kadmia v obličkách i pečení.
Literatúra
Bíreš J., Vrzgula L.: Veterinářství, 35, 1985:62-64Golian, J., Sokol, J., Bohunická, T.“ Risk factor of the food
change, Proceeding book, Nitra, 2002.
Bendixen, G., Bentzen, K., Clausen, J. E., et al. (1976): Inhibition of human leucocyte migration. In Natvig, J.
B., Permann, P., Wigzel, H.: Lymphocytes. Isolation, Fractionation and Characterization. Scand. I. Immunol.,
Suppl. 5, Universitetsforlaget, Nyegaard, Oslo, pp. 244 – 267.
Duizer, E., Gilde, A. J., Versantvoort, Ch.: Toxicol. Appl. Pharmacol., 155, 2, 1999, 117-126.
Goldová M., Revajová V., Pistl J., Letková V., Levkut M., Wagshal G., Csizsmárová G., Loószová A.: Eimeria
colchici and immunocompetent cells in specific and nonspecific hosts. Acta Parasitologica 46, 2001, 39-44
Sokol, J., Uhrín, V., Massányi, P.:Kadmium a jeho výskyt v organizmoch živočíchov. Bratislava, ŠVS SR, ISBN
80-7148-022-3, 1998, s.116.
Toman, R., Massanyi, P., Uhrín, V.: Trace elements and electrolytes, 19,3,2002: 114-117
Uyanik, F., Eren, M., Atasever, A., Tunsoku, G., Kolsuz, A.H.: J. of Israel Veterinary Medical Association, 2001
Vasilyeva, C. – Berzina, H. – Remez, I.: Complex of methods for the estimation of cadmium and zinc action on
chicken immunity methods of estimation of chicken immunity. Baltic J. Lab. Anim. Sci., 11, 2001: 149-159
Kontaktná adresa: MVDr. Naď Pavel, PhD., Univerzita veterinárskeho lekárstva, Katedra výživy,
dietetiky a chovu zvierat, Komenského 73, 041 81 Košice, e-mail: [email protected], mobil: 0907
923235
QUO VADIS POKUSY NA ZVIERATÁCH VO VYSOKOŠKOLSKEJ EDUKÁCII A
VÝSKUME?
QUO VADIS OF ANIMAL EXPERIMENTS IN UNIVERSITY TEACHING AND
RESEARCH?
1
Ništiar, F., 1Beňačka, R., 2Lukačínová, A., 1Lovásová, E., 3Ništiarová, A.,
1Ústav
patologickej fyziológie, 2Ústav fyziológie a 3Centrálny zvieratník, Lekárska fakulta, Univerzita P.J. Šafárika,
Trieda SNP 1, 040 66 Košice
Summary: There are few areas of animal use that arise so many emotions and questions as
that of their use in education. The physical presence of an animal (whether alive or dead) is
a dramatic event experience for most students, and their effects it has will depend heavily on
their previous experience with that species, their moral values and the perceived necessity of
the practical. Most of the current literature on this subject is highly emotive, based on relative
little data and provide few conclusions. This paper attempts to clarify the issues raised and
present an overview of the alternatives available with their strengths and weakness. Finally, it
223
offers guidelines for humane education that take into consideration both the practical issues
and the feelings of all those involved.
1. Pokusy na zvieratách ako súčasť didaktickej a vedeckej reality a hľadanie alternatív
Uplynulo už viac ako 40 rokov odkedy Russell a Burch (1959) publikovali svoje
pohľady na pokusy na zvieratách a predložili návrhy pre humánnejšie využívanie zvierat pre
účely vedecké, testovacie i edukačné. Legislatívne opatrenia, najmä Nariadenie 86/609/EEC
(Directive for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific
Purposes), zamerané na ochranu a reguláciu použitia laboratórnych zvierat pre vedecké ako aj
edukačné účely (Louhimies, 2002) upriamili pozornosť na využívanie alternatívnych metód
(Worth a Balls, 2002). Otáznym zostáva čo je možné účelne nahradiť, do akej miery treba
nahradiť a v akej forme je možné nahradiť. Pokiaľ v pedagogickom procese sa rysujú vcelku
využiteľné alternatívne postupy (Smith a Smith, 2004), podstatne zložitejším sa to javí
v testovaní liekov, resp. toxických látok v životnom prostredí, ale najmä v oblasti vedeckého
výskumu.
Výučba a jej metodológia v biomedicínskych oblastiach je realizovaná okrem
prednášok, seminárov, praktických cvičení, konzultácií aj, ale nie v poslednom rade formou
študentskej vedeckej odbornej činnosti. V rámci mnohých predmetov, ako sú patologická
fyziológia a fyziológia, anatómia, farmakológia je ťažké, a často nie je ani z etických
aspektov účelné vylúčiť praktické zamestnania za využitia laboratórnych zvierat alebo
zvieracích orgánov a tkanív. Problém je v správnej voľbe zámeru takéhoto zamestnania a v
zdôvodnení, že okrem získania poznatkov a zručnosti majú aj etický rozmer. Práve tento
etický rozmer môže byť v budúcnosti osožný pri ochrane experimentálnych zvierat,
z hľadiska správnej manipulácie efektívnemu použitia, resp. zváženia použitia alternatívnych
metód. Pre praktické cvičenia často neobstojí len samotné zdôvodnenie získania zručnosti pre
manipuláciu so zvieratami. Iný rozmer však môže takéto zamestnanie dostať ak je do
popredia postavený etický rozmer správnej manipulácie so živým materiálom (teraz zviera,
neskôr pacient – človek). Tento rozmer si musí uvedomiť aj pedagóg pri zaradení praktického
zamestnania za využitia živých zvierat. Počet zvierat používaných pri praktických
zamestnaniach v pedagogickom procese na univerzítách
predstavuje len zanedbateľný
zlomok z počtu zvierat používaných na výskum alebo testovanie chemických látok. Podobne,
tento počet, napr. hlodavcov, je absolútne neporovnateľný s počtami, ktoré sú vyhubené napr.
pri deratizácii. Ďalšia otázka, ktorá vyvoláva určitý problém v tejto oblasti je nejednotná
interpretácia platnej legislatívy týkajúcej sa tejto oblasti (Zákon NR SR č. 488/2002 Z.z. o
224
veterinárnej starostlivosti a o zmene niektorých zákonov, a Nariadenie vlády SR č. 289/2003
Z.z. ktorým sa ustanovujú požiadavky na ochranu zvierat používaných na pokusné účely
alebo iné vedecké účely). Uvedená legislatíva je reštriktívna, ale v žiadnom prípade nemá za
cieľ „zakázať“ alebo „znemožniť“ využitie zvierat pre vedecké alebo pedagogické účely.
Nebola tvorená so zámerom likvidovať pokusy na zvieratách, ale na to, aby tieto boli riešené
v určitom definovanom a kontrolovateľnom rámci a zodpovedali aj etickému duchu zákona
a čo najviac sa približovali Európskym legislatívnym normám. Preto by pokusy alebo
praktické zamestnania mali byť profesionálne zdôvodnené (potreba demonštrácie javu na
zvierati, počty použitých zvierat, experimentálne algoritmy a etický rozmer) a schválené.
Profesionálny a etický rozmer by mali posúdiť a schváliť príslušné etické komisie ustanovené
v intenciách uvedených legislatívnych noriem, a schvaľujúci orgán (t.j. ŠVPS; Štátna
veterinárna a potravinová správa) by mal v konečnom dôsledku preveriť splnenie zákonných
podmienok pre žiadaný pokus na zvierati, a po splnení zákonných požiadaviek vydať
povolenie. Kontrolu nad dodržaním pokusných podmienok vykonávajú tak príslušné etické
komisie ako aj schvaľujúci orgán v rámci svojich pôsobností. V prípade, že by táto
legislatívna úprava bola nesprávne interpretovaná, v zmysle neopodstatnených obštrukcií
pokusoch na zvieratách, mohlo by to mať, tak pre edukačný proces, ako aj pre vedecký
výskum negatívne dopady. Ako ukázali skúsenosti z iných krajín správna pedagogická prax (s
použitím zvierat tam kde to je nenahraditeľné a zdôvodnené) znížilo v rozumnej miere aj
využívanie zvierat v profesionálnej vedeckej práci (van der Valk a spol., 1999).
Za výučbu a demonštráciu sa považuje odovzdávanie poznatkov a techník (technických
úkonov, napr. operačné, manipulačné a pod.) potrebných pre pochopenie fyziológie,
patologickej fyziológie alebo farmakológie živých systémov. Oproti tomu za cvičenie sa
považuje získanie zručnosti. Je potrebné jednoznačne už tu podotknúť, že pri výučbe
a demonštrácii je použitie zvierat pre určité prípady jednoznačne zdôvodnené. Diskutabilné
zostávajú cvičenia, t.j. získanie zručnosti. V oboch prípadoch je ale potrebné zvážiť možnosť
využitia alternatívnych postupov, ktoré je možné zaradiť do nasledovných skupín (Zinko
a spol., 1997): modely, fantómy a mechanické simulátory, filmy a interaktívne video,
počítačová simulácia a virtuálne systémy, pokus na sebe a na ľuďoch, pokusy na rastlinách,
pozorovanie a štúdiá v prírodných podmienkach, odpadové materiály z bitúnkov a ryby
spracujúceho priemyslu, in vitro štúdiá na bunkových kultúrach (na jednobunkovcoch,
červoch a nestavovcoch), mŕtve zvieratá (prirodzený úhyn, humánne utratené) a klinická prax
(veterinárne fakulty). Samozrejme pre pedagogické účely je možné vyvíjať rôzne modely
a modelové systémy.
225
2. Súčasný stav používania zvierat problémy v edukácii a výskume, možné alternatívy
Udáva sa, že na výučbu sa používa asi 1 % zvierat využívaných pre vedecké účely.
U nás je to rádovo nižšie číslo, aj keď zďaleka nie pre etické uváženie, ale z prozaického
dôvodu nedostatku finančných prostriedkov. Pokiaľ sme na začiatku 90-tých rokov minulého
storočia v rámci praktických cvičení (28 cvičení po 2 hodín z predmetu patologická
fyziológia) mali 18 na zvieratách (potkany, myši, morčatá a králiky), po prvej legislatívnej
úprave po roku 1998 (na základe Zákona č. 115/1995 Z.z. a Vyhlášky 231/1998 Z.z.) nám už
vtedajšia Štátna veterinárna správa povolila jedno 2 hodinové cvičenie (demonštrácia
základných manipulačných úkonov, fixácia, handling, rôzne spôsoby aplikácie liekov a pod.)
po 1 potkanovi pre 1 krúžok (cca. 16 študentov všeobecného lekárstva) a to isté cvičenie už
nepovolila pre zubné lekárstvo. Podobný pokles animálnych pokusov je zaznamenaný aj vo
výskume, kde v súčasnosti poklesol počet zvierat za poslednú dekádu až na tretinu.
Opakovane musím použiť paralelu deratizácie a etických úvah ochrany laboratórnych zvierat
a nájdenie racionálneho kompromisu a uvedomenia, že duch zákona „nie je proti“ pokusom
na zvieratách, nemá za účel obštrukciu animálnych experimentov, ale ich racionalizáciu,
účelnosť, evidenciu a ich kontrolu. Práve preto zopakujeme, že sa žiada jednoznačne
vymedzenie právomoci pri ich posudzovaní, a to, čo je kompetenciou vedeckých agentúr
(vedecká
oponentúra),
etických
komisií
(etické
posúdenie
a
kontrola)
a ŠVPS
(administratívna centralizácia evidencie pokusov na zvieratách, po preverení dodržania
zákonom stanovených podmienok, predloženie žiadosti v intenciách legislatívy s vyjadrením
príslušnej etickej komisie, kontrola ich dodržania, zamedzenie duplicitných štúdií,
zabezpečenie prístupu k databázam resp. ich propagácia, spracovanie a vydávanie rukovätí
pre správne zaobchádzanie s laboratórnymi zvieratami, popr. o možných alternatívach).
Hlavné možnosti racionálneho zníženia počtu zvierat pre pokusné účely spočívajú práve
v dobrých vedomostiach o možných alternatívnych postupoch, o existencii databáz
(zabránenie duplicitným pokusom). Momentálne o týchto možnostiach je možné seriózne
informácie získať na mnohých dostupných databázach. V prípade že ani po racionálnom
zvážení riešeného projektu nie je možné použiť alternatívne metódy je potrebné veľmi
jednoznačne zhodnotiť potrebu zvierat pre pokus (za maximálnej možnej redukcie počtov,
bez toho aby to znížilo validitu výsledkov), zabezpečiť minimalizáciu distresu zvierat
(použitie šetrných postupov, bolestivé úkony robiť za znecitlivenia zvierat a profesionálna
manipulácia počas celého experimentu za dodržania maximálneho komfortu pokusných
zvierat).
226
3. Použitie alternatívnych postupov vo výučbe
Pri použití zvierat vo výučbe je rozhodujúce zadefinovať do akej miery sú pre splnenie
cieľov výučby potrebné zamestnania za využitia zvierat ako aj to, koľko študentov bude
potrebovať zručnosť získanú pri týchto cvičeniach pre výkon svojho povolania. Tu existuje
zjavná paralela, či je potrebné aby študenti medicíny mali praktické cvičenia na zvieratách
intervenčného typu (aplikácia liekov, operačné výkony a pod.) alebo ich stačí len ukázať na
videu. Odpoveď sa núka sama od seba. Dali by ste si operovať slepé črevo chirurgovi, ktorý
ešte v živote neoperoval, ale videl stovky videozáznamov takýchto operácií? Prirodzene na
druhej strane takéto cvičenia by mali byť výberové, to znamená to, že by sa na ne mohli
prihlásiť študenti, ktorí sa chcú orientovať takým smerom, že tieto cvičenia pre nich môžu
znamenať z hľadiska budúcej profesie veľký prínos. V prípade študentov veterinárnej
medicíny to je výučba na pacientovi. U študentov medicíny je to vzťah k živej bytosti,
uvedomenie si bolestivosti, resp. dopadov chybných úkonov (napr. operačné cvičenia). Pri
selektívnom prístupe je možné do značnej miery redukovať potrebu živých zvierat, nakoľko
to nebudú vykonávať študenti, ktorí sa takýmto smerom neorientujú a nemajú k tomu náležitý
vzťah a cit. Inými slovami dostať výučbu na zvieratách do oblasti vypísaných výberových
zamestnaní, popr. do oblasti študentskej vedeckej odbornej činnosti, pri dôslednom dodržaní
zásad 3 R (reduction, refinement, replacement). Posúdenie potrebnosti a schválenia týchto
zamestnaní by mala byť jednoznačne v pôsobnosti príslušných etických komisií, za dodržania
legislatívneho rámca v zmysle NV SR č. 289/2003 Z.z. Akémukoľvek využitiu živých zvierat
pre výučbu, má predchádzať podrobné poučenie a inštruktáž študentov o manipulácii, welfare
a etike práce so zvieratami. Napriek tomu vo výučbe nie sú veľké problémy s využitím
alternatív, najmä videa alebo počítačovej simulácie. Na lekárskych fakultách je možnosť
najmä vo výučbe fyziológie demonštrovať niektoré problémy za využitia dobrovoľníkov
z radov samotných študentov. Ďalšie možnosti sú trojdimenzionálne modely potkana alebo
králika, s ktorými sú dobre skúsenosti na veterinárnych univerzitách vo svete (Martinsen a
Jukes, 2005). Problémy pri zavádzaní alternatív do výučby spočívajú najmä v ich finančnej
náročnosti, čo pri súčasnom financovaní vysokých škôl je takmer nerealizovateľné. Práve pre
tieto, hlavne finančné bariéry, zostáva často jedinou alternatívou výučba klasickým spôsobom
na (laboratórnych) zvieratách, ale s maximálnou snahou o humanizáciu tohoto spôsobu
výučby (zníženie počtu zvierat a zabezpečenie maximálneho možného komfortu).
227
4. Alternatívy vo vedecko-výskumnej činnosti
V oblasti vedecko-výskumnej činnosti je situácia s využitím alternatívnych postupov
ešte zložitejšia, ako v pedagogickej praxi. Tu nahradenie pokusu na zvieratách musí
predchádzať rozsiahla vedecko-výskumná činnosť a majú sa hľadať, validifikovať a
štandardizovať alternatívne postupy. V tejto oblasti má významné postavenie ECVAM
(European Centre for the Validation of Alternative Methods), v ktorom Slovenskú republiku
zastupuje Prof. Ing. Ján Šajbidor, DrSc., z Fakulty chemickej a potravinárskej technológie
Slovenskej TTU v Bratislave. Základom pre úspešnosť alternatívnych postupov je najmä
porovnateľnosť výsledkov a možnosť ich extrapolácie pre modelované objekty in vivo (Höfer
a spol., 2004). V súčasnosti je k dispozícii veľké množstvo alternatívnych modelov od in vitro
techník (tkanivové a bunkové kultúry) cez jednobunkové organizmy (baktérie, kvasinky,
prvoky), bezstavovce (červy, hmyz), alebo nové šetrnejšie prístupy in vivo (počty,
manipulácia, welfare; Ništiar a spol., 2003).
5. Závery a východiská
Je možné záverom povedať, že čo sa týka využívania zvierat na výučbu, predstavuje to
asi 1% zo všetkých zvierat využívaných na vedecké účely (Smith a Smith, 2004). Pre
Slovensko je tento údaj rádovo nižší. Zavedenie alternatívnych postupov do výučby na
vysokých školách je finančne náročné. Preto nie je možné v tejto oblasti v dohľadnej dobe
očakávať výrazné zmeny. Jedinou zchodnou cestou zostáva posunúť edukáciu za využitia
zvierat (pokiaľ sa dá) do oblasti špecializovanej (výberovej) výučby, popr. do oblasti
študentskej vedeckej činnosti. Ďalšou možnosťou pre zaradenie alternatívnych metód do
výučby je možnosť získania prostriedkov pre tento proces z Eurofondov, resp.
prostredníctvom Európskych alebo aj domácich grantov (KEGA).
Zásadne iná je situácia v oblasti vedeckého výskumu, kde zatiaľ využívanie alternatív je
len zbožným želaním, napriek tomu, že celý rad alternatívnych postupov sa vcelku úspešne
ujal v bežnej praxi. Ide najmä o monitorovanie znečistenia prostredia (testy na
jednobunkovcoch, prokaryotoch), pri skúšaní toxicity látok a liečiv. V tejto oblasti máme ešte
veľa rezerv, ktoré je možné a bude potrebné prednostne riešiť v rámci vedecko-výskumnej
činnosti najmä na báze grantových úloh VEGA a APVV.
Osobitnú úlohu pri riešení tejto problematiky môže zohrať aj Slovenská spoločnosť pre
vedu o laboratórnych zvieratách, ktorá by mala podchytiť čo najširšiu bázu odborníkov,
zaoberajúcich sa problematikou edukácie na zvieratách, resp. aj zaujímajúcich sa
228
o alternatívne metódy pre vedecký výskum alebo rutinnú expertízu (toxicitné testy a ich
validácia).
Záverom je možné povedať, že najlepšou ochranou zvierat zďaleka nie sú legislatívne
opatrenia, ale dobré vedomosti o nich, o zaobchádzaní s nimi a starostlivosti o ne. A to je
možné získať a vypestovať len v kontakte s nimi, v úzkej väzbe profesionálnych, etických,
morálnych aj náboženských prístupov (Capaldo, 2004).
Táto práca vznikla v rámci riešenia vedeckého projektu podporovaného Vedeckou grantovou
agentúrou MŠ SR VEGA číslo 1/3494/06.
Literatúra:
1.
Capaldo, T.: The psychological effects on students of using animals in ways that they see as ethically,
morally or religiously wrong. Altern. Lab. Anim., 32, 2004: 525-531.
2. Höfer, T. – Gerner, I. – Gundert-Remy, U. – Liebsch, M. – Schulte, A. – Spielmann, H. – Vogel, R. –
Wettig, K.: Animal testing and alternative approaches for the human health risk assessment under the
proposed new European chemicals regulation. Arch. Toxicol., 78, 2004: 549-564.
3. Louhimies, S.: Directive 86/609/EEC on the protection of animals used for experimental and other sientific
purposes. Altern. Lab. Anim., 30, 2002: 217-219.
4. Martinsen, S. – Jukes, N.: Towards a humane veterinary education. J. Vet. Med. Educ., 32, 2005: 454-460.
5. Ništiar, F. – Lukačínová, A. – Ništiarová, A.: Rapid bioassay that uses protozoan Tetrahymena pyriformis
to asses the toxicity of various xenobiotics. Labor. Diagnostika. 8, 2003: 85-86.
6. Russell, W.M.S. – Burch, R.L.: (1959). The Principles of Humane Experimental Technique, 238 pp.
London, UK: Methuen. 1959.
7. Smith, A.J. – Smith, K.: Guidelines for humane education: alternatives to the use of animals in teaching
and training. Altern. Lab. Anim., 32, 2004: 29-39.
8. van der Valk, J. – Dewhurst, D. – Hughes, I. – Atkinson, J. – Balcombe, J. – Braun, H. – Gabrielson,
K. – Gruber, F. – Miles, J. – Nab, J. – Nardi, J. – van Wilgenburg, H. – Zinko, U. – Zurlo, J.:
Alternatives to the use of animals in higher education. Altern. Lab. Anim., 27, 1999: 39-52.
9. Worth, A.P. – Balls, M.: Alternative (non-animal) methods for chemicals testing: current status and future
prospects. Alter. Lab. Anim., 30, 2002: 1-125.
10. Zinko, U. – Jukes, N. – Gericke, C.: From Guinea-pig to Computer Mouse: Alternative Methods for
a Humane Education. 229 pp., Leicester, UK: EuroNICHE, 1997.
Kontaktná adresa:
Prof. MVDr. František Ništiar, CSc.,
Department of Pathological Physiology
Faculty of Medicine, Šafárik University
Trieda SNP 1, 040 66 Košice, Slovak republic
Phone: +421 55 640 22 79
Fax: +421 55 642 33 50
E-mail: [email protected]edic.upjs.sk
229
POUŽITIE PARACETAMOLU V TERAPII RESPIRAČNÝCH OCHORENÍ
OŠÍPANÝCH
USING OF PARACETAMOL IN THERAPY OF RESPIRATORY DISEASES OF PIGS
Novotný, J., Kováč, G., Link, R., Hisira, V.
II. interná klinika, UVL Košice
Abstract
The work presented was aimed at evaluation of therapeutic using of paracetamol and its
effects on haematological profile, as well as body weight and concentration of total
immunoglobulins in blood serum of pigs with respiratory diseases symptoms. Fifteen piglets
were divided to 3 groups (1st experimental group – treatment with paracetamol; 2nd
experimental group – paracetamol + inj. marbofloxacin; and control group). A four days
supplementation of paracetamol resulted in a positive effect on concentration of leukocytes
and body weight of pigs (in the 1st and the 2nd experimental group).
Úvod
Intenzívny spôsob chovu ošípaných v podmienkach veľkokochovov so sebou prináša aj
mnohé negatíva, ku ktorým patrí extrémne vysoká koncentrácia zvierat. Vysoká hustota
ustajnenia v uzavretom prostredí a priame zavlečenie infekčných zárodkov (nákup nových
zvierat, prichádzajúce a odchádzajúce vozidlá, vtáky, osoby) uľahčuje prenos aerogénnych
patogénov v rámci chovu a tiež medzi jednotlivými farmami. V súvislosti s tým sú
v súčasnosti respiračné ochorenia a systémové aerogénne infekcie považované za
najzávažnejšie ochorenia v modernej produkcii ošípaných (Christensen a kol., 2003).
Paracetamol, alebo acetaminophen je para amino-fenolový derivát s analgetickými a
antipyretickými vlastnosťami. Vo veterinárnej medicíne sa môže využiť predovšetkým pri
symptomatickej liečbe – na redukciu horúčky v priebehu akútnych respiračných ochorení
ošípaných v kombinácii s vhodnou anti-infekčnou terapiou.
Cieľom predloženej práce bolo posúdenie vplyvu podávania paracetamolu na hematologické
parametre, koncentrácie celkových imunoglobulínov a hmotnosť odstavčiat s postihom
respiračného aparátu.
Materiál a metodika
Použité zvieratá: Zo skupiny 240 kusov odstavčiat sme vyselektovali 15 kusov zvierat
s postihom respiračného aparátu a klinicky zjavnými respiračnými problémami (s postihom
230
horných dýchacích ciest – rinitída, výtok z nosa, s postihom dolných dýchacích ciest –
kýchanie, kašeľ, výskyt respiračných šelestov; dyspnoe). Experiment sa zrealizoval
v praktických podmienkach na farme ošípaných PDP – Seleška. Ošípané boli ustajnené
v sekcii pre kategóriu ošípaných do 15 kg v kotercoch s identickými štandardnými
podmienkami. Zvieratá boli kŕmené adlibitným typom kŕmenia suchou kŕmnou zmesou,
prislúchajúcej tejto kategórii zvierat OŠ-02
Experimentálny dizajn:
ƒ
1. skupina: 5 odstavčiat liečba len paracetamol
ƒ
2. skupina: 5 odstavčiat liečba paracetamol + injekčné ATB ( marbofloxacin)
ƒ
3. skupina: 5 odstavčiat neliečené
Paracetamol (Pracetam 10% premix, Vétoquinol) bol primiešaný do KZ v koncentrácii 5 g
Pracetamu / kilogram krmiva. Injekčné antibiotikum – marbofloxacín (Marbocyl 10% inj.
a.u.v., Vétoquinol) bolo aplikované v dávke 0,25 ml/ 12,5 kg živej hmotnosti raz denne –
počas 4 dní.
Odber krvi z očného splavu ošípaných (Kováč a kol., 1990) sa zrealizoval na začiatku
experimentu 0. odber, a na konci experimentu 4. deň. Na začiatku a na konci experimentu sa
zisťovala aj hmotnosť ošípaných.
Stanovenie hematologického profilu: koncentrácie Er, Le, Hb, Htk, MCV sa zisťovali na
prístroji animal blood counter (abc TM Vet.).
Diferenciálny krvný obraz: mikroskopicky v laboratóriu II. internej kliniky.
Stanovenie celkových imunoglobulínov: spektrofotometricky na prístroji SPEKOL 211.
Kultivácia mikroorganizmov: z dýchacích ciest postihnutých zvierat boli urobené výtery –
zaslané do mikrobiologických laboratórií UVL a ŠVU v Košiciach.
Serologické vyšetrenie krvi: za účelom detekcie vírusov – ŠVU Košice.
Analýza plynov maštale: koncentrácia CO2 v ovzduší – prístroj ANAGAS CD 98,
koncentrácia NH3, H2S, O2, a CO – TETRAGAS detektor
Koprologická analýza: ovoskopické vyšetrenie – flotačná a sedimentačná metóda
Štastistické zhodnotenie experimentu: namerané parametre boli zhodnotené 1 cestnou
A novou.
Výsledky
Vo všetkých sledovaných skupinách sa koncentrácia Le pohybovala nad referenčnou normou
(tabuľka 1). Na 4. deň po začatí terapie sa v 1. a 2. skupine zaznamenalo nesignifikantné
231
zníženie koncentrácie Le. Koncentrácia Le v krvnom sére 3. skupiny sa nesignifikantne
zvýšila.
Tabuľka 1. Koncentrácia leukocytov v krvi ošípaných (x ± sd; fyziologická norma 11 – 18 G/l)
0. deň
4. deň
1. skupina – paracetamol
23,16 ± 6,77
20,96 ± 6,85
2. skupina – paracetamol + marbocyl inj.
23,46 ± 6,07
20,98 ± 9,51
3. skupina – kontrola
22,40 ± 7,66
24,46 ± 4,93
Koncentrácia Er sa vo všetkých odberoch a vo všetkých 3 skupinách pohybovala v medziach
fyziologického rozpätia (tabuľka 2). Medzi skupinami sa nezaznamenali signifikantné
rozdiely.
Tabuľka 2. Koncentrácia erytrocytov v krvi ošípaných (x ± sd; fyziologická norma 5 – 8 T/l)
0. deň
4. deň
1. skupina – paracetamol
6,52 ± 0,63
5,79 ± 0,63
2. skupina – paracetamol + marbocyl inj.
6,54 ± 0,49
5,66 ± 0,18
3. skupina – kontrola
6,07 ± 0,59
5,93 ± 0,62
Koncentrácia Hb sa pohybovala v medziach fyziologickej normy, nedošlo tu k štatisticky
významným rozdielom (tabuľka 3).
Tabuľka 3. Koncentrácia hemoglobínu v krvi ošípaných (x ± sd; fyziologická norma 10 – 14
g/dl)
0. deň
4. deň
1. skupina – paracetamol
10,80 ± 0,95
10,14 ± 0,61
2. skupina – paracetamol + marbocyl inj.
11,54 ± 1,06
10,38 ± 0,47
3. skupina – kontrola
10,12 ± 0,94
10,12 ± 1,13
Hematokrit sledovaných skupín ošípaných sa okrem 2. skupiny (0. deň) pohyboval pod
fyziologickou normou. Medzi skupinami sa nezaznamenali signifikantné rozdiely (tabuľka
4.).
232
Tabuľka 4. Hematokritová hodnota krvi ošípaných (x ± sd; fyziologická norma 0,32 – 0,42
l/l)
0. deň
4. deň
1. skupina – paracetamol
0,31 ± 0,03
0,28 ± 0,02
2. skupina – paracetamol + marbocyl inj.
0,32 ± 0,04
0,28 ± 0,01
3. skupina – kontrola
0,28 ± 0,03
0,28 ± 0,03
Stredný objem erytrocytov sa vo všetkých odberoch nachádzal pod referenčným rozpätím
(tabuľka 5.). Štatistickou analýzou sa nezistili žiadne signifikantné rozdiely.
Tabuľka 5. MCV krvi ošípaných (x ± sd; fyziologická norma 50 – 68 f/l)
0. deň
4. deň
1. skupina – paracetamol
47,2 ± 2,17
48 ± 1,73
2. skupina – paracetamol + marbocyl inj.
49,20 ± 1,79
49,8 ± 1,79
3. skupina – kontrola
46,80 ± 3,27
47,6 ± 3,13
Pri stanovení percentuálneho zastúpenia jednotlivých druhov bielych krviniek (tabuľka 6.) sa
v 0. dni nezistili žiadne patologické odchýlky. Naopak v 4. dni experimentu sme zachytili
zvýšenú úroveň neutrofilov a zníženú úroveň lymfocytov.
Tabuľka 6. Diferenciálny krvný obraz ošípaných – priemerné hodnoty
Deň
Ly
Mo
Ba
Ty
Se
Eo
pokusu
40 – 55
2–8
1–3
2–5
30 – 50
1–3
1.
0. deň
44
4
48,67
3
skupina
4. deň
39,33
2,67
56
3
2.
0. deň
50,8
2
46,4
3
skupina
4. deň
39
2
59
2
3.
0. deň
48,67
4
45,33
3
skupina
4. deň
39,20
4
56,60
2,60
Koncentrácia celkových imunoglobulínov sa pohybovala v medziach fyziologického rozpätia
(tabuľka 7.). Rovnako sa tu nezistili žiadne štatisticky preukázateľné rozdiely.
233
Tabuľka 7. Koncentrácia C Ig v krvnom sére ošípaných (x ± sd; fyziol. norma 20 – 35 UZST)
0. deň
4. deň
1. skupina – paracetamol
25,78 ± 2,38
24,88 ± 2,72
2. skupina – paracetamol + marbocyl inj.
24,99 ± 2,76
25,18 ± 3,16
3. skupina – kontrola
25,58 ± 4,28
27,24 ± 5,39
V 1. skupine odstavčiat sme za sledované obdobie zaznamenali nárast priemernej hmotnosti
o 1, 06 kg, v 2. skupine o 1,00 kg a v 3. skupine o 0,90 kg (tabuľka 8). Medzi sledovanými
skupinami sa nezaznamenali signifikantné rozdiely.
Tabuľka 8. Telesná hmotnosť ošípaných (x ± sd; kg)
0. deň
4.deň
1. skupina – paracetamol
13,60 ± 3,07
14,66 ± 3,12
2. skupina – paracetamol + marbocyl inj.
11,70 ± 1,68
12,70 ± 2,22
3. skupina – kontrola
11,50 ± 3,00
12,40 ± 3,31
Kultiváciou výterov z rypákov postihnutých ošípaných sme zistili prítomnosť: Proteus
mirabilis, virid. Streptokoky, Enterobacter agglomerans, E. coli. Sérologicke vyšetrenie na
prítomnosť respiračných vírusov bolo negatívne.
Koprologické vyšetrenie zamerané na detekciu a identifikáciu vajíčok endoparazitov
(gastrointestinálnych oblých červov, pečeňových červov a pásomníc) bolo negatívne.
Analýzou plynov maštale sa zistila chyba v cirkulácii vzduchu (neprítomnosť ventilačného
systému) a s tým spojené relatívne vyššie koncentrácie NH3 (0,0015 %) a CO2 (0,25 %).
Diskusia
Analýzou hematologického profilu krvi ošípaných sa zistili odchýlky od fyziologickej normy
(Vrzgula a Sokol 1990). Vyplýva to však z toho, že do experimentu sme zámerne
vyselektovali choré zvieratá – s postihom respiračného aparátu. Zvýšené hodnoty boli zistené
pri koncentrácii leukocytov (leukocytóza; tabuľka 1.) – čo poukazuje na to, že v organizme
zvierat prebiehali infekčné, alebo zápalové ochorenia pri ktorých sa stupňovala tvorba bielych
krviniek a zvyšoval sa ich počet. Do úvahy by mohli prichádzať aj parazitárne ochorenia – tie
sme však vylúčili koprologickým vyšetrením a leukogramom. V skupinách ošípaných pri
ktorých sa zrealizovala terapia (1. a 2. skupina) došlo k nesignifikantnému zníženiu
234
koncentrácie Le – čo poukazuje na efektivitu terapie. Naopak u neliečených zvierat (3.
skupina) došlo k zvýšeniu koncentrácie Le – čo zrejme vyplýva z rozvoja patologického
procesu na dýchacích cestách. Znížená hodnota hematokritu (vyšetrenie krvi pri ktorom sa
určuje pomer medzi objemom krviniek a krvnej plazmy; tabuľka 4.) u všetkých skupín zvierat
sa môže spájať so zníženou hodnotou stredného objemu erytrocytov – MCV (mikrocytóza =
malé formy erytrocytov; tabuľka 5.), pretože hodnota hematokritu predovšetkým závisí od
množstva a veľkosti erytrocytov (Bartko a Hofírek., 1993). Koncentrácie erytrocytov
a hemoglobínu (tabuľky 2., 3.) sa u všetkých 3 skupín pohybovali vo fyziologickom rozpätí –
nebola tam anémia (súvis s parenterálnou aplikáciou Fe v perinatálnom období života
prasiatok).
Z pohľadu diferenciálneho krvného obrazu (leukogramu) sa zistili patologické
odchýlky len v 4. dni experimentu (tabuľka 6.) a to u všetkých 3 skupín:
•
neutrofília s posunom jadra doprava – indikuje bakteriálnu infekciu (akútne zápalové
procesy, akútne infekcie; Vrzgula a Sokol 1990), pretože neutrofily sú obyčajne prvou
odozvou k výskytu bakteriálnych patogénov (neutrofily – pohlcujú baktérie a tvoria
chemické látky, ktoré ich ničia).
•
mierna lymfopénia – u všetkých 3. skupín na obdobnej úrovni – čo vylučuje nejaký
imunosupresívny účinok liekov (ako majú napr. kortikoidy, steroidy)
Z hľadiska detekcie infekčných zárodkov, neboli zachytené žiadne primárne respiračné
patogénny (ako sú napr. vírusy – PRRS, Aujeskyho choroby, influenzy ošípaných; baktérií –
ako napr. Actinobacillus pleuropneumonie, A. suis, Haemophilus parasuis atď.). Vzhľadom
na nedostatočné vetranie maštalí (prirodzené vetranie oknami – nestačilo zabezpečiť
dostatočnú cirkuláciu vzduchu) a prašnosť spojenú so suchým typom kŕmenia predpokladáme
– že u odstavčiat dochádzalo k dráždeniu slizníc respiračného traktu, k poklesu lokálnej
slizničnej imunity a tým aj k patogénnemu vplyvu nami zachytených baktérií (Proteus
mirabilis, virid. Streptokoky, Enterobacter agglomerans, E. coli).
Záver
Podávanie paracetamolu priaznivo ovplyvnilo koncentrácie Le v krvnom sére postihnutých
odstavčiat. Priemerný denný prírastok liečených ošípaných dosahoval vyššiu úroveň ako
u kontrolnej skupiny. Použitie paracetamolu môže byť vhodným doplnkom pri terapii
respiračných ochorení ošípaných.
235
Literatúra
1.
2.
3.
4.
Bartko P., Hofírek B. 1993. Krv a krvotvorné orgány. In: Veterinárna klinická diagnostika vnútorných
chorôb (Slanina Ľ, Dvořák R. a kol.). 300.
Christensen G, Sorensen V., Mousing J. 2003. Choroby dýchacieho systému. In: Choroby ošípaných (Straw
E. B., D´Allaire, Mengeling W. L., Taylor D. J.), 659.
Kováč G, Martinček M, Mudroň P, Cilk D, Demonovič T, Paštek J, Stanislavský V, Ružička S, 1990. Odber
krvi u ošípaných – Porovnanie doteraz zaužívaných metód a popis novšej metódy.., Veterinářství, 40.
Vrzgula L., Sokol J. 1990. Interpretácia hematologického profilu. In: Poruchy látkového metabolizmu
hospodárskych zvierat a ich prevencia (Vrzgula a kol.), II., prepracované vydanie, 472.
Kontaktná adresa: MVDr. Jaroslav Novotný, PhD., II. Interná klinika, UVL Košice,
Komenského 73
PÔSOBENIE HYPERTERMIE NA PREIMPLANTAČNÉ EMBRYÁ KRÁLIKOV IN
VITRO A ÚLOHA PROTEÍNOV HSP70
HYPERTHERMIA EFFECTS OM PREIMPLANTATION RABBIT EMBRYOS IN VITRO
AND THE ROLE OF PROTEINS HSP70
Olexikova L. 1, Makarevič A.V.2, Chrenek P.2, Kubovičova E.2, Pivko J.1,2
1 Slovenská
poľnohospodárska univerzita, Nitra, Slovensko; 2Slovenské centrum poľnohospodárskeho výskumu, Nitra
Abstract
The aim of our study was to test the influence of short exposure (6 h) of preimplantation
rabbit embryos to elevated temperatures (41.5 ºC and 42.5 ºC) in vitro on their developmental
capacity and evaluate a role of Hsp70 in response of rabbit preimplantation embryos to
hyperthermia. Fertilized rabbit eggs isolated from oviducts of slaughtered females 19 hpc
were cultured in k-DMEM medium + 10% FCS at standard temperature (37.5 ºC) until 72
hpc. Afterwards, the embryos which reached morula stage were divided into two groups hyperthermic (HT, 41.5 ºC or 42.5 ºC) and control (C, 37.5 ºC). In a half of embryos from
both groups an Hsp70 was blocked by the adding anti-Hsp70 to the medium. The embryos
were cultured during 6 h. Then the embryos from HT group were transferred to 37.5 ºC and
post-incubated overnight (16-20h) along with control group. Following incubation the
embryos were evaluated for developmental stages and processed for apoptosis (TUNEL),
actin cytoskeleton and presence of heat-shock-specific proteins Hsp70. Embryo samples were
analyzed using Leica fluorescent microscope. It was observed that hyperethermic conditions
at 41.5 ºC did not alter advancement of embryos to higher preimplantation stages (expanded
and hatching/hatched blastocysts. There were no damages in actin filament structure
compared to control embryos. Western-blotting revealed the presence of heat-stress-induced
72 kDa fraction of Hsp70 proteins in lyzates of embryos exposed to 41.5 ºC. Following
elevation of temperature to 42.5 ºC the embryo development was dramatically compromised.
The embryos were arrested at early blastocyst stage and did not advance in development. The
236
structure of actin filaments in blastomeres was damaged and such blastomeres often contained
apoptotic nuclei. In this group Western-blotting did not reveal a presence of heat-stressinduced fraction of Hsp70. Blocking of Hsp70 before developmental block resulted in no
embryos (0%) at blastocyst stage. From Hsp70-blocked embryos after developmental block,
27.6% (C+anti-Hsp) and 22.6% (HT+anti-Hsp) of blastocyst were formed, versus 71.4% (C)
and 69.7% (HT) in non-Hsp70-blocked embryos. These results demonstrate a threshold of
thermotolerance of preimplantation rabbit embryos to short hyperthermic exposure in vitro.
The embryos before genome activation (GA) are more sensitive to HT. The resistance of
embryos before GA to HT is related to Hsp70, whilst after GA, Hsp70 is not probably a major
factor of thermotolerance and the existence of additional protective mechanism is
hypothesized.
Úvod
Poškodenia vznikajúce vystavovaním teplotnému stresu počas preimplantačného vývoja
môžu negatívne ovplyvňovať vývojový program znížením proteosyntézy a prežívateľnosti
embryí (Putney a kol., 1988, Ealy a kol., 1993). K takým poškodeniam môžu patriť aj
poruchy cytoskeletu buniek. Následky teplotného stresu závisia od teploty, dĺžky expozície
a vývojového štádia embrya. Napríklad, poruchy vývoja embryí ošípaných nastali po
krátkodobej (10-60 min) inkubácii pri 43 až 45,5 ºC, zatiaľ čo pri 42 ºC mali embryá dokonca
väčší počet buniek a priemer, než pri kontrolnej teplote (Kojima a kol., 1996). U hovädzieho
dobytka bola vývojová kapacita embryí znížená až pri 43 ºC (Ju a kol., 1999). U viacerých
druhov sa škodlivé vplyvy teplotného šoku znižujú v procese vývoja embryí. Sakatani a kol.
(2004) uvádzajú, že vývoj do štádia blastocysty a proliferácia sa znižovali, ak boli teplotnému
stresu vystavené embryá v raných štádiách.
Podľa Ju a kol. (1999) zvyšovanie
termotolerancie je spojené s prechodom z materskej na vlastnú genomovú expresiu génov. To
znamená, že embryo počas vývoja nadobúda jednu, alebo viac obranných (termoprotekčných)
reakcií adaptácie. Tento adaptačný jav bol pozorovaný in vivo u oviec (Dutt, 1963), ošípaných
(Tompkins a kol., 1967), hovädzieho dobytka (Putney a kol., 1988) a králikov (Wolfenson
a Blum, 1988), a in vitro u hovädzieho dobytka (Edwards a Hansen, 1997, Ealy a kol., 1995).
Na ovciach a hovädzom dobytku bolo dokázané, že teplota vyššia ako 37 °C spôsobuje
produkciu bielkoviny známej ako heat-shock proteín 70 (Hsp70) bunkami embrya. Mirkes
a kol. (1999) popísal, že Hsp70 indukuje termotoleranciu u post-implantačných embryí myší
a jej úroveň závisí od úrovne expresie samotnej Hsp70. Hsp sú produkované medzi prvými
proteínmi počas embryonálneho vývoja. Konštitutívne produkované Hsp bielkoviny pritom
237
zohrávajú dôležité úlohy v tvorbe a transporte proteínov aj za nestresových podmienok
(Hendrick a Hartl,1995). Pri strese umožňujú tieto proteíny bunkám prežívať a eliminovať
škodlivé vonkajšie vplyvy tým, že zabraňujú denaturácii bunkových proteínov. Hsp proteíny
sú pravdepodobne jedným z faktorov rezistencie voči teplotnému, ako aj iným formám stresu.
Blokovanie tvorby Hsp 70 proteínov pridaním protilátky do kultivačného média na 3. až 9.
deň kultivácie zvyšovalo výskyt apoptóz a preukazne redukovalo percento blastocyst
(Matwee a kol., 2001). Napriek stále pribúdajúcim údajom o vplyve teplotného stresu na
embryá je mechanizmus vzniku termotolerancie u embryí stále nejasný. Rovnako odpoveď
embryí na zvýšené teploty je druhovo špecifická a kritická teplota pre každý druh embryí je
odlišná.
Cieľom tejto práce bolo otestovať vplyv krátkej dĺžky expozície (6 h) pri zvýšených
teplotách (41,5 ºC a 42,5 ºC) v podmienkach in vitro na vývojovú kapacitu embryí králikov
a skúmať úlohu Hsp 70 vo vzniku adaptačnej reakcie na hypertermiu.
Materiál a metódy
Tri dni pred párením, samice králikov plemena Novozélandské biele boli superovulované
i.m. injekciou PMSG (Werfaser, 80 IU). Následne po 72 h od PMSG, im bol aplikovaný HCG
(Werfachor, 150 IU) a boli pripustené samcom. Zygoty v štádiu 2 prvojadier boli vyplavené
z vajcovodov samíc 19 hodín post-coitum (hpc) a boli kultivované pri štandardnej teplote 37.5
ºC po dobu 72 hpc. Po tejto dobe embryá, ktoré dosiahli štádium moruly boli prenesením do
čerstvého média rozdelené do dvoch skupín: 1. štandardné prostredie (37,5 ºC) – kontrola (K)
a 2. hypertermické prostredie (41,5 ºC resp. 42,5 °C , HT). V niekoľkých pokusoch sme
u polovice embryí z obidvoch skupín zablokovali tvorbu Hsp70 bielkoviny pridaním
protilátky anti-Hsp70 (4µg/ml) do kultivačného média a to buď pred alebo po aktivácii
embryonálneho genómu. Embryá boli inkubované v hypertermických podmienkach po dobu 6
hodín. Potom boli embryá prenesené do normálnej teploty a inkubované cez noc (16-20h).
Po inkubácii bolo u embryí analyzované: vývojové štádium (percento blastocýst),
apoptóza (TUNEL-metóda) a proliferácia (celkový počet jadier), štruktúra cytoskeletových
filamentov aktínu (Phalloidin-TRITC), prítomnosť Hsp70 proteínov (imunocytochémia,
Western-blotting).
Analýzu prítomnosti apoptotických buniek sme robili metódou TUNEL použitím
Mebstain Apoptosis Direct kit od firmy Coulter-Immunotech (Marseille, Francúzsko).
Detekcia heat-shock proteínov (Hsp70) bola vykonaná buď imunocytochemicky na
238
intaktných embryách, alebo pomocou Western-blottingu embryonálnych lyzátov použitím
protilátky MAB 3516 (Chemicon) reagujúcej ako na
konštitučnú (72 kDa) tak aj na
indukovanú (73 kDa) frakciu Hsp70. Pre analýzu celkového počtu buniek sme použili jadrový
fluorochrom DAPI (Vector Laboratories). Stav cytoskeletu sme analyzovali na základe
prítomnosti a štruktúry filamentov aktínu farbením Phalloidinom-TRITC (Chemicon).
Embryá boli súčasne spracované pre TUNEL, celkový počet buniek a aktínový
cytoskelet. Detekcia heat-shock proteínov (Hsp70) bola uskutočnená v rozdielnych pokusoch.
Preparáty embryí sme analyzovali pomocou fluorescenčného mikroskopu LEICA použitím
špecifických filtrov pre zelenú (TUNEL, Hsp70), červenú (aktín) a modrú (DAPI)
fluorescenciu.
Výsledky
Hypertermické podmienky pri teplote 41,5 ºC neovplyvnili vývoj embryí do vyšších
štádií (expandovaná blastocysta a blastocysta uvolňujúca sa zo zona pelucida). Percento
embryí dosahujúcich vyšších štádií (57,7 %) v hypertermickej skupine sa preukazne
neodlišovalo od kontrolnej skupiny (53,3 %). Naopak pri zvýšení teploty na 42,5 ºC sme
zaznamenali úplné zastavenie vývoja na nižších vývojových štádiách. Ani jedno embryo sa
nevyvýjalo do štádií expandovanej blastocysty a blastocysty uvolňujúcej sa zo zona pelucida.
Vývoj embryí po vystavení teplote 42,5 ºC bol prevažne zastavený v štádiu včasnej
blastocysty.
Tab. 1.
Vplyv hypertermie in vitro na vývoj preimplantačných embryí králika
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Skupina
Počet
embryí
Vývojové štádiá, n (%)
Pozastavené
Moruly
Bl
XBl
HBl
XBl+HBl
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Control (37,5 ºC)
221
15 (6,8)
26 (11,8)
62 (28,1) 51 (23,1)
67 (30,2)
118 (53,3)
HT (41,5 ºC)
196
14 (7,1)
27 (13,8)
42 (21,4) 42 (21,4)
71 (36,3)
113 (57,7)
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
HT (42,5 ºC)
52
0 (0)
4 (7,7)
48 (92,3)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Bl - blastocysta, XBl – expandovaná blastocysta, HBl – hatching, blastocysta uvolňujúca sa zo zona
pelucida.
Analýzou embryonálnych lyzátov metódou Western-blottingu sme potvrdili
prítomnosť inducibilnej frakcie proteínov HSP 70 v preimplantačných embryách vystavených
239
teplote 41,5 ºC ako aj konštitutívnej frakcie HSP 70 v embryách kultivovaných za
normálnych podmienok (kontrola). Nepodarilo sa dokázať prítomnosť inducibilnej frakcie
HSP 70 u embryí vystavených teplotnému stresu pri 42,5 ºC. V štruktúre aktinových
filamentov pri 41,5 ºC neboli pozorované rozsiahle poruchy. Ireverzibilné zmeny vývoja boli
v skupine vystavenej teplote 42,5 ºC sprevádzané poruchami štruktúry cytoskeletu (rozpad
aktínu, porušenie normálnej štruktúry, tvorba zhlukov) buniek. Blastoméry s poruchami
aktínových filamentov obsahovali apoptotické jadrá.
Za prítomnosti protilátky anti-Hsp70 počas kultivácie embryí v štádiu pred
aktiváciou genómu neboli dosiahnuté vyššie vývojové štádiá, väčšina embryí bola
pozastavená vo vývoji v štádiu moruly (Tab.2.). Pri blokovaní Hsp70 u embryí po aktivácii
genómu, sa z nich vyvinulo 27,6% (K+anti-Hsp) a 22,6% (HT+anti-Hsp) expandovaných
a uvolňujúcich sa blastocýst, oproti 71,4% (K) a 69,7% (HT) u neblokovaných embryí
(Tab.3.).
Tab.2. Preimplantačný vývoj embryí s blokovaním proteínu Hsp70 pred aktiváciou embryonálneho
genómu, n (%)
_____________________________________________________________________________
Skupiny
Počet embryí
Pozastavené
Mo
Bl
XBl
HBl
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------K
23
0
K+anti-Hsp
25
7 (28)
HT
22
0
HT+anti-Hsp
26
15 (57,7)
2 (8,7)
17 (68)
3 (13,6)
11 (42,3)
3 (13)
4 (17,4)
1 (4)
0 (0)
2 (9,1)
2 (9,1)
0 (0)
0 (0)
14 (60,9)
0 (0)
15 (68,2)
0 (0)
_______________________________________________________________________________
Tab. 3. Preimplantačný vývoj embryí s blokovaním proteínu Hsp70 po aktivácii embryonálneho
genómu, n (%)
______________________________________________________________________________
Skupiny
Počet embryí
Pozastavené
Mo
Bl
XBl
HBl
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------K
28
0 (0)
4 (14,3)
4 (14,3)
2 (7,1)
18 (64,3)
K+anti-Hsp
29
0 (0)
12 (41,4)
9 (31,0)
2 (6,9)
6 (20,7)
HT
33
0 (0)
5 (15,2)
5 (15,2)
6 (18,2)
17 (51,5)
HT+anti-Hsp
31
0 (0)
18 (58,1)
6 (19,4)
5 (16,1)
2 (6,5)
_______________________________________________________________________________
240
Diskusia
V našich experimentoch sme testovali vplyv dvoch zvýšených teplôt v priebehu 6 h
inkubácie na vývojové charakteristiky králičích embryí. Z výsledkov pokusov vyplýva, že
embryá vystavené hypertermickým podmienkam v štádiu moruly až včasnej blastocysty sú
odolné voči teplote 41.5ºC, ale pri 42,5 ºC nastali značné zmeny v životaschopnosti embryí.
Termotolerancia embryí je všeobecne ovplyvnená niekoľkými faktormi, ako sú dĺžka trvania
teplotného šoku, intenzita teploty, vývojové štádium embrya a jeho živočíšny druh.
U hovädzieho dobytka bolo zistené (Ryan a kol. 1992), že krátke impulzy vyššej teploty (43
ºC) dokonca stimulovali vývoj embryí do „hatchingu“ v porovnaní so skupinou bez
teplotného šoku (38 ºC). Pravdepodobne krátkodobé expozície (10 – 30 min) teplu nad 40 ºC
sú menej škodlivé, ako chronický šok pri nižších teplotách. V našich kultivačných
podmienkach teplota 41,5 ºC neovplyvňovala kvalitu embryí, zatiaľ čo u bovinných embryí v
štádiu ≤ 16 blastomér Jousan a Hansen (2004) pozorovali rast počtu apoptotických buniek
a redukciu počtu buniek už pri 41 ºC. Je známe, že včasné preimplantačné embryá sú veľmi
citlivé na následky
teplotného šoku (Sakatani a kol., 2004), a rezistenciu voči nemu
nadobúdajú v procese vývoja. Napríklad hypertermia pri 41 ºC počas 12 h expozície 2bunkových a 4-8-bunkových embryí znižovala počet následných blastocýst, zatiaľ čo teplotný
šok v štádiu morula sa nepotvrdil (Edwards a Hansen, 1997). K podobným záverom prišli aj
Ealy a kol. (1995) na embryách hovädzieho dobytka. Tieto fakty vysvetľujú termotoleranciu
embryí v našich podmienkach voči hypertermii pri 41,5 ºC. Predpokladá sa že odolnosť
embryí voči teplotnému šoku vzniká v dôsledku de novo produkcie proteínu Hsp70, avšak
mechanizmus termotolerancie je stále nejasný. V súlade s Matwee a kol. (2001) nastali pri
kultivácii s blokovaním proteínov Hsp70 výrazné zmeny. Vývoj bol narušený, avšak
preukazne výraznejšie bolo blokovanie vývoja u embryí pred aktiváciou embryonálneho
genómu, oproti rovnakému pôsobeniu až po jeho aktivácii. Toto zistenie podporuje teóriu
postupného zvyšovania termorezistencie embryí a existenciu súvislosti medzi aktiváciou
embryonálneho genómu a zlepšením schopnosti reagovať na stresový podnet.
Záver
Expozícia embryí (6h) pri teplote 41,5 ºC neovplyvňovala embryonálny vývoj a bola
spojená s tvorbou Hsp-proteínov. Pri teplote 42,5 ºC dochádzalo k ireverzibilným
poškodeniam embryí, čo malo za následok pozastavenie preimplantačného vývoja embryí ako
aj poruchy
v štruktúre
aktínového
cytoskeletu.
Tieto
výsledky
demonštrujú
prah
241
termotolerancie preimplantačných embryí králikov k hypertermickým podmienkam in vitro.
Negatívny efekt hypertermie pri 42,5 ºC môže súvisieť s narušením proteosyntézy.
Embryá králikov pred aktiváciou embryonálneho genomu (GA) sú citlivejšie na
zvýšené teploty, a blokovanie tvorby Hsp70 vyvoláva u nich poruchy vo vývoji.
Termorezistencia embryí u ktorých došlo k aktivácii embryonálneho genómu nebola úplne
narušená blokovaním Hsp70. Tieto výsledky naznačujú že odolnosť embryí pred aktiváciou
genómu voči hypertermii je úzko spojená s proteínom Hsp70, zatiaľ čo po aktivácii genómu
táto bielkovina pravdepodobne už nie je jediným faktorom termotolerancie a predpokladá sa
aj existencia iného (alebo iných) protekčných mechanizmov.
Literatúra
Dutt R. H., 1963. J Anim Sci 1963; 22: 713 -719.
Ealy A. D. a kol., 1993. J Dairy Sci 1993; 76: 2899 – 2905.
Ealy A. D. a kol., 1995. J Anim Sci 1995; 73: 1401 -1407.
Edwards J. L. - Hansen P.J. 1997. Mol Reprod Dev 1997; 46: 138 -145.
Hendrick J.P. – Hartl F.U. 1995. FASEB J 1995; 9: 1559- 1569
Jousan F. D. - Hansen P.J. 2004. Biol Reprod 2004; 71: 1665 – 1670.
Ju J-C. a kol., 1999. Mol Reprod Dev 1999; 53: 336 – 340.
Kojima T. a kol., 1996. Mol Reprod Dev 1996; 43: 452 – 457.
Matwee C. a kol., 2001. Mol Hum Reprod. 2001; 9: 829-837.
McMillan D. R. a kol., 1998. J Biol Chem 1998; 273: 7523 – 7528.
Mirkes P. E. a kol., 1999. Dev Dyn 1999; 214: 159 – 170.
Mosser D. D. a kol., 1997. Mol Cell Biol 1997; 17: 5317 – 5327.
Paula-Lopes F. F. - Hansen P. J., 2002. Biol Reprod 2002; 66: 1169 – 1177.
Putney D. J. a kol., 1988. J Reprod Biol 1988; 39: 717 – 728.
Ryan D. P. a kol., 1992. J Anim Sci 1992; 70: 3490 – 3497.
Sakatani M. a kol., 2004. Mol Reprod Dev 2004; 67: 77 – 82.
Tompkins E. C. a kol., 1967. J Anim Sci 1967; 26: 377 – 380.
Wolfenson D. - Blum O., 1988. Anim Reprod Sci 1988; 17: 259 – 270.
Táto práca bola financovaná z projektu Ministerstva pôdohospodárstva SR RÚVV
06:“Ochrana zdravotného stavu zvierat v jednotlivých fázach reprodukčného cyklu pri
narušení stability prírodných systémov“.
242
CHEMOPREVENTÍVNY ÚČINOK DIKLOFENAKU U MAMÁRNEJ
KARCINOGENÉZY SAMÍC POTKANOV KMEŇA SPRAGUE-DAWLEY.
CHEMOPROTECTIVE EFFECT OF DICLEFENAC IN MAMMARY CARCINOGENESIS
IN FEMALE SPRAGUE-DAWLEY RATS
Orendáš, P., Kassayová, M., Ahlers, I., Ahlersová, E., Friedmanová, L., Starostová, M.,
Bojková, B.
Katedra fyziológie živočíchov, Ústav biologických a ekologických vied, Prírodovedecká fakulta, Univerzita P. J. Šafárika,
Košice,
Abstrakt
The chemopreventive effect of non-steroidal anti-inflammatory drugs in mammary
carcinogenesis was frequently reported. In this work we evaluated the tumosupressive effect
of non-selective cyclooxygenase (COX) inhibitor diclofenac in N-methyl-N-nitrosoureainduced (NMU) mammary carcinogenesis in female Sprague-Dawley rats. Diclofenac was
administered in drinking water in the concentration of 0,01 mg/ml (0,001%). In the last (22nd)
week of experiment we recordet incidence decrease by 11,54%. Tumor frequency per group
decreased by 39,45% a tumor frequency per animal decreased by 31,58% when compared to
control group. Latency period (time span from first carcinogen administration till the first
palpable tumor development) was lengthened by 16%. Diclofenac as a preventive
substabstance (non-selective COX inhibitor with predominantly COX-1 inhibition) altered
basic NMU-induced mammary carcinogenesis parameters in female rats.
Keywords: Mammary carcinogenesis; Rat; Chemoprevention; Diclofenac; Cyclooxygenase
Úvod
Rakovina mliečnej žľazy u žien predstavuje závažný celosvetový problém.
Chemoprevencia je prísľubom úspešného boja proti rakovinotvornému procesu. Nesteroidné
antiflogistiká (NSAIDS) sú dôležité farmaká potláčajúce zápal. Sú často aplikované pri
reumatických ochoreniach, pri zmierňovaní bolesti a funkčných obtiaží. V nedávnej dobe boli
zaznamenané ich preventívne účinky pri karcinogenéze. Klinické štúdie zistili pri dlhodobom
podávaní rôznych NSAIDs výrazný pokles rizika rakoviny hrubého čreva (Thun, 1991),
mliečnej žľazy (Harris, 1999), prostaty (Nelson, 2000) a pľúc (Harris, 2002). Experimentálne
štúdie na laboratórnych zvieratách dokázali chemopreventívny efekt
NSAIDs u rôznych
typov neoplázií, vrátane rakoviny mliečnej žľazy.
Naša skupina preukázala chemopreventívny efekt indometacínu podávanáho v pitnej vode
(Môciková-Kalická, 2001), nimesulidu podávaného subkutánne (Kubatka, 2002) a rofekoxibu
243
aplikovaného v laboratórnej potrave (Kubatka, 2003) pri mamárnej karcinogenéze u samíc
potkana kmeňa Sprague-Dawley.
Hlavný účinok NSAIDs spočíva v potláčaní syntézy prostanoidov inhibíciou aktivity
kľúčového enzýmu ich syntézy, cyklooxygenázy (COX). Sú známe dve izoformy COX:
konštitutívna COX-1 a inducibilná COX-2 izoforma nachádzajúca sa viac pri chorobných
stavoch. COX-2 môže ovplyvňovať proces karcinogenézy prostredníctvom viacerých
mechanizmov: peroxidázová aktivita COX-2 podporuje transformáciu prokarcinogénov na
karcinogény (Fosslien, 2000), bol zistený inhibičný efekt formovaných prostaglandínov
v imunitných reakciách (Rita, 1994), tiež angiogénny (Tsujii, 1998), a antiapoptotický účinok
(Fosslien, 2000). Na druhej strane bol pozorovaný súvis zvýšenej invázie nádorových buniek
so zvýšenou expresiou COX-2. Brueggemeier at.al (1999) poukazuje na lineárnu závislosť
medzi expresiou génu aromatázy (CYP 19) a expresiou COX-2. Predchádzajúce fakty
predpokladajú využitie NSAIDs v prevencii mamárnej karcinogenézy.
Z farmakodynamického hľadiska majú inhibítory COX-1 (kys. acetylsalicylová,
indometacin, ibuprofen) pri dlhodobom užívaní vedľajšie účinky na tráviaci systém. Riziko
týchto nepriaznivých účinkov je nižšie pri užívaní inhibítorov COX-2, čo umožňuje ich
dlhodobejšiu aplikáciu. Diklofenak patrí do skupiny NSAIDs, ktorá neselektívne inhibuje
aktivitu COX (prevažná inhibícia COX-1, čiastočná inhibícia COX-2).
Cieľom tejto práce bolo skúmať chemopreventívny účinok diklofenaku u mamárnej
karcinogenézy samíc potkana Sprague-Dawley.
Materiál a metódy
V experimente boli použité samice potkana kmeňa Sprague-Dawley, získané z chovnej
stanice Charles River Laboratories (Sulzfeld, Nemecko) vo veku 30-35 dní, s hmotnosťou
101-125g. Zvieratá boli adaptované na štandardné podmienky zverinca s teplotou 23±2 °C,
relativnou vlhkosťou 60-70%, držané pri umelom svetelnom režime svetlo : tma = 12:12 h so
začiatkom svetla od 7.00 hod. (intenzita svetla 150 luxov/klietku, zdroj svetla: fluorescenčné
lampy Tesla - 40W). Počas experimentu boli zvieratá krmené peletovanou diétou (Top Dovo,
Dobrá Voda) a napájané pitnou vodou ad libitum. Diklofenak /Diclofenac sodium/, (výrobca:
Ningbo Smart Chemical & Pharmaceutical Co., LTD, Ningbo, Zhejiang, China, poskytol:
Zentiva a.s., Hlohovec, Slovensko) bol aplikovaný v pitnej vode v koncentrácii 0,01mg/1ml
pitnej vody po dobu trvania celého experimentu. Mamárna karcinogenéza bola indukovaná
pomocou N-metyl-N-nitrózourey (NMU) (Sigma, Deisenhofen, Germany), ktorá bola podaná
244
vo forme dvoch intraperitoneálnych dávok (50 mg/kg) v 6 dňovom intervale medzi 42.-48.
postnatálnym dňom všetkým zvieratám. NMU bola pripravená tesne pred použitím,
rozpustená vo fyziologickom roztoku (objem roztoku 0,5 ml/zviera). Chemoprevencia
diklofenakom začala 7 dní pred podaním karcinogénu a trvala až do konca experimentu (20
týždňov po podaní NMU). Zvieratá boli rozdelené do 2 experimentálnych skupín : 1.
kontrolná skupina bez chemoprevencie (20 zvierat); 2. chemoprevencia s diklofenakom o
koncentrácii 0,01mg/1ml pitnej vody (24 zvierat). Zvieratá boli každý týždeň vážené a
palpované. Palpáciou sme zistili a zaznamenali výskyt, počet, lokalizáciu a veľkosť tumorov.
V 22. týždni experimentu (počítané od podania 1. dávky NMU) boli zvieratá usmrtené
rýchlou dekapitáciou. Mamárne nádory boli vypitvané, zvážené a ich rozmery zaznamenané.
V jednotlivých experimentálnych skupinách boli hodnotené základné parametre mamárnej
karcinogenézy: 1. incidencia nádorov ako percentuálne zastúpenie zvierat s nádorom, 2.
frekvencia nádorov na skupinu vyjadrená ako priemerný počet nádorov na všetky zvieratá
v skupine, 3. frekvencia nádorov na zviera vyjadrená ako priemerný počet nádorov na
nádorové zvieratá, 4. priemerný objem nádorov, 5. latenčná perióda určená obdobím od
podania karcinogénu až do objavenia sa prvého nádoru u zvieraťa. Bol sledovaný vplyv
chemopreventíva na prírastok telesnej hmotnosti (hodnotený od začiatku až do konca
experimentu), na príjem potravy a vody. Spotrebu potravy a vody za 24 hodín sme zisťovali
v 6., 11. a 20. týždni po podaní karcinogénu v 6 meraniach (2x v danom týždni). Incidencia
nádorov bola vyhodnotená Mann-Whitney U–testom, ďalšie parametre pomocou jednocestnej
analýzy variancie alebo Kruskal-Wallis–ovým testom na hladine významnosti P<0.05.
Objemy nádorov boli vypočítané podľa vzorca: V (mm3) = π x S12 x S2 / 12, pričom (S1<S2),
S1 je šírka a S2 dĺžka nádoru v mm, S1 a S2 boli merané kolmo na seba. Experiment prebiehal
od augusta 2006 do januára 2007.
Výsledky
Preventívny účinok diklofenaku u mamárnej karcinogenézy samíc potkanov kmeňa
Sprague-Dawley je znázornený v Tab.1. Diklofenak v experimentálnej skupine DIKLO 10
zmenil sledované hodnoty základných parametrov mamárnej karcinogenézy (incidencia,
frekvencia, objem nádorov, latencia), ale zaznamenali sme pokles frekvencie nádorov na
skupinu o 39,45%, frekvencie nádorov na zviera o 31,58%. Latencia vzrástla o 14 dní (16%).
Bol zistený signifikantý pokles hmotnosti potkanov s DIKLO 10 oproti KONT o 5.58% čo
245
môže súvisieť s vedľajšími účinkami diklofenaku na gastrointestinálny trakt. Bol
signifikantne nižší príjem vody v 6. týždni pokusu v skupine príjímajúcej diklofenak.
Experimentálne skupiny
•
KONT – kontrolná skupina zvierat s podaným karcinogénom bez chemoprevencie
•
DIKLO 10 (0,001%) - skupina zvierat s podaným karcinogénom + chemoprevencia
diklofenakom obsiahnutom v pitnej vode s koncentráciou 0.01mg/1ml (0.001%)
Tabuľka č. 1:
Chemopreventívne účinky diklofenaku u NMU-indukovanej mamárnej
karcinogenézy u samíc potkanov kmeňa Sprague-Dawley v záverečnom 22.
týždni experimentu.
Skupina
KONT n=20
DIKLO 10 (0,001%), n=24
Počet nádorových zvierat
16
17
Incidencia nádorov (%)
80,00±0,09
70,83 ±0,09 (-11,54%)
Frekvencia nádorov na skupinu
3,65±0,67
2,21±0,41(-39,45%)
Frekvencia nádorov na zviera
4,56±0,66
3,12±0,40 (-31,58%)
Prírastok objemu nádorov (mm3) 1649,53±215,57 2614,54±992,09 (+58.5%)
Latencia nádorov (dni)
90,60±4,80
105,06±7,37 (+14,46%)
Prírastky telesnej hmotnosti (g)
265,00±5,94
* 250,21±4,08
Hodnoty sú uvedené ako aritmetické priemery±SEM.
Hodnoty v zátvorkách vyjadrujú %-uálnu odchýlku voči KONT (predstavuje 100%).
Štatistická signifikancia rozdielov medzi kontrolnou skupinou a skupinou s chemoprevenciou
je vyjadrená ako * pre P<0,05.
Tabuľka č. 2: Účinky diklofenaku na príjem potravy
Týždne po podaní NMU KONT
DIKLO 10 (0,001%)
6
20,00±0,45 24,13±1,37
11
18,05±0,59 18,39±0,30
16
19,08±0,49 20,72±1,11
21
18,28±1,90 21,83±2,11
Hodnoty príjmu potravy (g) sú uvedené ako priemery ±SEM.
246
Tabuľka č. 3: Účinky diklofenaku na príjem vody
KONT
DIKLO 10 (0,001%)
6
34,58±0,45
a
11
27,50±1,05
25,56±0,47
16
26,50±1,45
25,26±1,13
21
26,25±3,33
21,81±1,80
Týždne po podaní
NMU
25,62±2,18 *(25,91%)
Hodnoty príjmu vody (ml) sú uvedené ako priemery ±SEM.
* Hodnota v zátvorke predstavuje %-álnu odchýlku DIKLO10 vs KONT (predstavuje
100%). Signifikantný rozdiel, a P<0.05 vs KONT
Celkový prehľad parametrov mamárnej karcinogenézy počas pokusu.
LATENCIA
INCIDENCIA
90%
130
80%
70%
NMU
120
DIKLO
110
60%
NMU
DIKLO
100
Deň
50%
40%
90
80
30%
70
20%
60
10%
50
0%
9.
10.
11.
12. 13.
14.
15.
16.
17.
18.
19. 20.
21.
9.
22.
10.
11.
12.
13.
4
NMU
DIKLO
3
cm 3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
OBJEM NÁDOROV
FREKVENCIA NA SKUPINU
4,5
3,5
14.
Týždeň po 1. podaní NMU
Týždeň po 1. podaní NMU
18.
Týždeň po 1. podaní NMU
19.
20.
21.
22.
20
19
18
17
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
NMU
DIKLO
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
Týždeň po 1. podaní NMU
247
Diskusia
V tejto práci sú prvý krát prezentované údaje o účinkoch nesteroidného antiflogistika
diklofenaku v chemoprevencii experimentálnej mamárnej karcinogenéze.
Ako nesteroidné antiflogistiká (NSAIDs) sa označuje veľká skupina chemicky
odlišných látok blokujúcich kaskádu kyseliny arachidonovej. Sú vo veľkej miere používané
pri zmierňovaní chronickej bolesti u reumatických ochorení (reumatoidná artritída,
spondylartritídy), osteoartrózy.
Hlavná podstata ich účinku spočíva v inhibícii aktivity
cyklooxygenázy (COX) vedúcej k poklesu produkcie prostaglandínov (PG), ktorých zvýšená
tvorba a hladiny najmä prostaglandínu E2 (PGE2), bola zistená u rôznych druhov tumorov.
Biosyntéza prostaglandínov hrá zásadnú úlohu v karcinogenéze u viacerých typov neoplázií
vrátane karcinómu mliečnej žľazy a blokáda tohto procesu prostredníctvom NSAIDs má
výrazný chemopreventívny efekt. Mechanizmus protinádorového účinku NSAIDs je založený
na antiproliferačných a antioxidačných vlastnostiach látok. Dôležitá je inhibícia formovania
a aktivácie karcinogénu (Kelloff et al., 1999), vlastnosti antiangiogénne, proapoptotické
a antimetastatické (Anderson, 2002; Moore, 2000).
Bežné alebo neselektívne NSAIDs sú inhibítory oboch izoforiem cyklooxygenázy v rôznom
pomere. Do tejto skupiny patrí aj ibuprofen . Robertson et al. (1998) pozorovali zníženie
objemu DMBA- indukovaných mamárnych karcinómov u samíc potkanov kmeňa SD
podávaním ibuprofenu v diéte počas obdobia 35 dní, pričom ibuprofen sa začal podávať až od
100 dňa po aplikácii karcinogénu. Regresia vzniknutých tumorov bola spojená s inhibíciou
expresie oboch izoforiem COX enzýmu.
Pokusy vykonané našou skupinou u DMBA- indukovanej mamárnej karcinogenézy
u samíc potkanov kmeňa SD, ukázali pri aplikácii indometacínu v pitnej vode zníženie
incidencie mamárnych nádorov o 63%, zníženie frekvencie nádorov na skupinu o 88%
a predĺženie latencie o 59 dní oproti kontrole (Môciková-Kalická et. al., 2001).
V tejto prezentovanej práci nami sledovaný chemopreventívny efekt diklofenaku
(neselektívny inhibítor COX s prevažnou inhbíciou COX-1) u NMU-indukovanej mamárnej
karcinogenézy samíc potkanov kmeňa SD podávaný v pitnej vode sa prejavil v poslednom 22.
týždni experimentu miernym poklesom frekvencie nádorov na skupinu o 39,45%, frekvencia
nádorov na zviera klesla o 31,58%. Latenčná doba sa predĺžila o 14 dní (16%). V priebehu
experimentu sme zaznamenali signifikantný pokles incidencie nádorov v 17., 18., 19. a 20.
týždni pokusu. Signifikantný pokles frekvencie na skupinu sme zistili iba v 21. týždni
experimetu. V 19., 20. a 21. týždni sme pozorovali aj signifikantné zníženie objemu nádorov.
248
V pilotnom experimente
s diklofenakom trvajúcom 19 týždňov, v ktorom naša
skupina analyzovala chemopreventívny účinok tejto látky aplikovanej po dobu 2 týždňov
intramuskulárne (dávka 0,005 mg/1 g b.w.) u NMU-indukovanej mamárnej karcinogenézy
samíc potkanov SD, sme zaznamenali zníženie frekvencie nádorov na skupinu i na zviera,
ostatné parametre mamárnej karcinogenézy neboli výrazne ovplyvnené (Orendáš et al.,
nepublikované údaje).
Možným vysvetlením nižšieho chemopreventívneho účinku diklofenaku môže byť
zistenie Hamida et. al. (1999), že u NMU-indukovaných mamárnych tumorov sú hladiny
COX-2 proteínov v bunkách tumoru asi 3-násobne vyššie ako hladiny COX-1, čo mohlo mať
vplyv na účinnosť diklofenaku ako preventíva s prevažnou inhibíciou COX-1. Ďalším
faktorom majúcim vplyv na preventívny účinok diklofenaku je pravdepodobne aj zvolená
dávka tejto látky.
Naša skupina tiež zaznamenala tumor supresívny efekt nimesulidu (prevažný inhibítor
COX-2) u NMU-indukovanej mamárnej karcinogenézy samíc potkanov kmeňa SD
aplikovaného subkutánne 2x týždenne. U DMBA-indukovanej mamárnej karcinogenézy
v tom istom experimente nebol zistený onkostatický efekt nimesulidu (Kubatka et al., 2002).
Dokázali sme preventívny efekt rofekoxibu (selektívneho inhibítora COX-2) u NMUindukovanej mamárnej karcinogenézy samíc potkanov kmeňa SD aplikovanom v potrave bol
potvrdený zreteľným znížením incidencie nádorov, frekvencie u oboch podávaných dávok (
0,01 mg/1 g potravy, 0,05 mg/1 g potravy). Latenčná doba bola predĺžená o 8 dní (Kubatka et.
al., 2003).
V štúdii, v ktorej sa naša skupina zamerala na prevenciu NMU-indukovanej mamárnej
karcinogenézy etorikoxibom (selektívny inhibítor COX-2) podávaným v potrave samiciam
potkana kmeňa SD, bol zistený nesignifikantný tumorsupresívny účinok u vyššej dávky
(0,025 mg/1 g potravy), ktorý sa prejavil miernym poklesom incidencie nádorov, poklesom
frekvencie nádorov na skupinu a bolo zaznamenané predĺženie latencie o 7 dní (Orendáš et
al., nepublikované údaje).
Z našich výsledkov vyplýva, že chemopreventívny účinok diklofenaku výrazne znížil
incidenciu nádorov medzi 15. a 20. týždňom, ich frekvenciu na skupinu v 16. až 22. týždni
a objem nádorov v 19. až 21. týždni pokusu. Táto štúdia prináša prvú zmienku o prevencii
mamárnej karcinogenézy u samíc potkanov diklofenakom.
V ďalšom výskume bude potrebné analyzovať možný efekt ďalších druhov NSAIDs,
hlavne so zreteľom na ich terapeutické využitie u človeka.
249
Litratúra
Anderson, W.A., Umar, A., Viner, J.L., Hawk, E.T.: The role of cyclooxygenase inhibitors in cancer prevention,
Curr. Pharm. Des. 8: 1035– 062, 2002
Brueggemeier, R.W., Quinn, A.L., Parrett, M.L., Joarder, F.S., Harris, R.E., Robertson, F.M.: Correlation of
aromatase and cyclooxygenase gene expression in human breast cancor specimens, Cancer Lett. 140: 27–35,
1999
Fosslien, E.: Molecular pathology of cyclooxygenase-2 in neoplasia, Ann. Clin. Lab. Sci. 30: 3 21,2000
Hamid R., Singh J., Reddy B.S., Cohen L.A.: Inhibition by dietary menhaden oil of cyclooxygenase-1 and 2 in
N- nitrosomethylurea – induced rat mammary tumors. Int. J. Oncol. 14, 523-528, 1999
Harris R.E., Kasbari S., Farrar W.B. : Prospective study of nonsteroidal anti-inflammatory drugs and breast
cancer. Oncol. Rep. 6, 71-73, 1999
Harris R.E., Beebe_Donk J.,. Schuller H.M: Chemoprevention of lung cancer by non-steroidal anti-inflammatory
druha among cigarette smokers, Oncol. Rep. 9 693–695, 2002
Kelloff GJ., Sigman CC., Greenwald P.: Cancer chemoprevention: Progress and promise. Eur. J.Cancer 35:17551762, 1999
Kubatka, P., Kalická, K., Chamilová, M., Ahlersová, E., Ahlers, I., Bojková, B.,. Adámeková, E.: Nimesulide
and melatonin in mammary carcinogenesis prevention in female Sprague–Dawley rats, Neoplasma 49: 255–
259, 2002
Kubatka, P., Ahlers, I., Ahlersová, E., Adámeková, E., Luk, P., Bojková, B., Marková, M.: Chemoprevention of
mammary carcinogenesis in female rats by rofecoxib, Cancer Lett. 202: 131-136, 2003
B.C. Moore, D.L. Simmons, COX-2 inhibition, apoptosis, and chemoprevention by non-steroidal
antiinflammatory drugs, Curr. Med. Chem. 7, 1131–1134, 2000.
Môciková-Kalická, K., Bojková, B., Adámeková, E., Mníchová-Chamilová, M., Kubatka, P., Ahlersová, E.,
Ahlers, I.: Preventive effect of indomethacin and melatonin on 7,12- dimethylbenz(a)anthracene-induced
mammary carcinogenesis in female Sprague–Dawley rats. A preliminary report, Folia Biol. (Praha) 47: 75–79,
2001
Nelson J.E., Harris R.E.: Inverse association of prostate cancor and non-steroidal anti-inflammatory drugs
(NSAIDs): results of a case-control study, Oncol. Rep. 7 169–170, 2000
Rita, M., Young, I.: Eicosanoids and the immunology of cancer, Cancer Met. Rev. 13: 337–348, 1994
Robertson F.M., Parrett M.L., Joarder F.S., Ross M., Abou-Issa H.M, Alshafie G., Harris R.E. : Ibuprofeninduced inhibition of cyclooxygenase isoform gene expression and regression of rat mammary carcinomas.
Cancer Lett. 122, 165-175, 1998
Thun M.J., Namboodiri M.M., Heath C.W.J.: Aspirin use and reduced risk of fatal colon cancer. N. Engl. J.
Med. 325, 1593-1596, 1991
Tsujii, M., Kawano, S., Tsuji, S., Sawaoka, H., Hori, M., DuBois, R.N.: Cyclooxygenase regulates angiogenesis
induced by colon cancer cells, Cell 93: 705–716, 1998
Táto práca vznikla v súlade s plnením úloh VEGA 1/2355/05
Ďakujeme reprezentantom Zentiva a.s. (Hlohovec, SR) za poskytnutie substancie.
LEUKOPÉNIA BROJLEROVÝCH KRÁLIKOV VPLYVOM HYPERTERMIE
LEUCOPENIA OF THE BROILER RABBITS UNDER THE INFLUENCE
HYPERTHERMY
Parkányi, V.1, Ondruška, Ľ.1, Rafay, J.1, Chrastinová, Ľ.1, Pivko, J.1, Massányi, P.2, Lukáč,
N.2, Capcarová, M.2
1
2
Slovenské centrum poľnohospodárskeho výskumu Nitra
Slovenská poľnohospodárska univerzita Nitra
Abstract
Exposure of the young and adult rabbit´s males and females to hyperthermic conditions (36 ±
3° C) negatively affects on their physiological processes and interferes with them internal
homeostasis. The changes are demonstrated on all observed biological levels : fodder intake
250
and conversion, growth intensity, haematological characteristics and viability. There is
a significant leucopenia (7.380 x 109/ L) , together with a significant lymphopenia (3.700x
109/L) of young rabbits (p<0,05*), typical accompanying effect of the stress reaction to
hyperthermy. The hyperthermic collapse is attended by increased of mortality (young rabbits:
25 – 44%, adult rabbits: 20 – 50%).
Úvod
Špecializované populácie hospodárskych zvierat šľachtené na komplex ukazovateľov
mäsovej úžitkovosti majú malú mieru tolerancie voči výkyvom podmienok chovateľského
prostredia, vrátane mikroklimatických faktorov. Králiky sú veľmi citlivé na tepelný stres,
pretože majú minimálne množstvo potných žliaz a ťažko eliminujú extrémnu telesnú teplotu,
ako dôsledok vysokej teploty prostredia, tzv. hypertermie. Tepelný stres je definovaný ako
stav fyziologickej záťaže, v ktorej už zvieratá nie sú dlhšie schopné pasívne regulovať ich
teplotnú homeostázu organizmu. Z tohto hľadiska sa králik javí ako vhodné experimentálne
zviera pri sledovaní vplyvu klimatickej zmeny na komplex biologických ukazovateľov.
Vhodné biokinetické rozpätie teplôt pre králika je 15 - 20° C, pričom termoneutrálna zóna sa
uvádza 5 - 30° C (Harris, 1994 . Marai a kol. (2002) uskutočnili experimenty na dospelých
králikoch a na mláďatách oboch pohlaví pri vysokých teplotách počas leta v Egypte. Zistili
nepriaznivé účinky hypertermie na rast mláďat, reprodukciu dospelých zvierat a zníženie
rezistencie voči chorobám. Burnett a kol. (2006) uvádzajú komplexné údaje o štandardizácii
biochemických a hematologických ukazovateľov u králikov. Králik je z pohľadu testovania
vysokých teplôt na organizmus vhodným modelovým a zároveň produkčným hospodárskym
zvieraťom.
Materiál a metodika
Cieľom predloženej
práce bolo hodnotenie
vzťahu
medzi
definovaným
hypertermickým stresom a fyziologickou reakciou králikov línií M91 a P91. Sledovali sme
vplyv hypertermického stresu na:
1. vybrané zverozdravotné a produkčné ukazovatele ( mortalita dospelých samíc, mortalita
dospelých samcov a mortalita králikov od odstavu (35 dní veku) do veku
77 dní
(dosiahnutie porážkovej hmotnosti králikov)
2. prírastky živej hmotnosti odstavených králikov
3. hematologické ukazovatele (leukocyty, lymfocyty, neutrofily, eozinofily a bazofily)
251
Experimentálne podmienky s definovanou vysokou teplotou (36 ± 3°C) boli simulované
v uzavretom chovnom priestore, s nainštalovaným termoagregátom a tepelným senzorom.
Experimentálne zvieratá (20 dospelých ♀♀, 4 dospelí ♂♂, 16 mláďat ♀♀, 16 mláďat ♂♂)
boli ustajnené v samostatných sektoroch chovných klietok s ad libitným systémom kŕmenia
a napájania.
Kontrolná skupina zvierat (20 dospelých ♀♀, 4 dospelí ♂♂, 16 mláďat ♀♀, 16 mláďat ♂♂)
bola ustajnená v čiastočne klimatizovanej
hale pre produkciu brojlerových králikov
v priestoroch VÚŽV-SCPV Nitra.
Graf 1 Teplotný profil v experimentálnych priestoroch ( hypertermická záťaž králikov)
6,00-18,00 hod.=hypertermická záťaž: 36° C ± 3° C.
18,00 -6,00 hod.=bez hypertermickej záťaže.
Ventilátor bol nastavený na 2 hodinový interval po 15 minút činnosti.
Výsledky boli spracované štatistickými metódami v programe MS Excel 2000 s použitím
programového systému SAS. Signifikantnosť rozdielov medzi jednotlivými skupinami bola
hodnotená Duncanovým testom viacnásobného rozsahu a Scheffesovým testom.
Výsledky a diskusia
I. Vplyv hypertermického stresu na prírastky živej hmotnosti, mortalitu odstavených
a dospelých králikov:
Všetky sledované parametre u experimentálnych mláďat králikov počas výkrmového
pokusu
boli výrazne nižšie v porovnaní s kontrolnou skupinou mláďat (od -10,04% pri
spotrebe krmiva na 1 kg prírastku až po -57,66% pri spotreba krmiva do 77. dňa veku v g /
deň). Celkový prírastok živej hmotnosti v g/ks bol u mláďat vystavených hypertermii o 235,2
g nižší voči kontrolnej skupine. To svedčí o negatívnom vplyve vysokej teploty chovného
prostredia na živú hmotnosť a tým aj na celkový zdravotný stav sledovaných zvierat.
252
Tabuľka 1 Výsledky výkrmových pokusov počas hypertermickej záťaže králikov
Pokusná
Kontrolná
skupina
skupina
x ± S.D.
x ± S.D.
Počet zvierat pri zahájení pokusu
32
32
Živá hmotnosť na 56.deň veku v g
1645,91±151,30 1888,13±234,155 -12,82%
Živá hmotnosť na 77.deň veku v g
2173,81±158,91 2 637,33±244,35
-17,57%
4,093
4,55
-10,04%
23,62
34,82
-32,16%
Spotreba krmiva do 77. dňa veku v g / deň
67,28
158,92
-57,66%
Celková spotreba krmiva v g/ks
1412,88
3337,32
-1924,44 g
Celkový prírastok živej hmotnosti v g/ks
496,02
731,22
-235,2 g
Ukazovateľ
Spotreba krmiva na 1 kg prírastku medzi 56. až
77. dňom veku v kg
Priemerný prírastok živej hmotnosti medzi 56.
až 77. dňom veku v g/deň/ks
Rozdiel
ku
kontrole
Graf 2
Priemerné denné prírastky rastúcich králikov v (g)
45
40
35
30
25
p.d.p. (g)
20
15
10
5
0
kontrola
pokus
56.-63.
63.-70
70.-77.
vek (v dňoch)
Tabuľka 2 Mortalita zvierat
–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
KRÁLIKY
HYPERTERMIA
KONTROLA
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
♀♀ DOSPELÉ
MORTALITA
20 ks
20 ks
20% (4/20)
10% (2/20)
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––♂♂ DOSPELÉ
MORTALITA
♀♀ MLÁĎATÁ
MORTALITA
4 ks
4 ks
50% (2/4)
-
16 ks
16 ks
25% (4/16)
12,5% (2/16)
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
♂♂ MLÁĎATÁ
MORTALITA
16 ks
16 ks
44% (7/16)
-
253
Tabuľka 3 Mortalita dospelých králikov počas hypertermického pokusu
Skupina/dátum
6.6.-13.6.
13.6.-20.6.
20.6.-27.6.
kontrola
-
-
2
pokus
6
-
-
Tabuľka 4 Mortalita mladých - rastúcich králikov počas hypertermického pokusu
Skupina/dátum
6.6.-13.6.
13.6.-20.6.
20.6.-27.6.
kontrola
1
1
-
pokus
11
-
-
Hypertermické chovné prostredie malo nepriaznivý
dopad na zníženie vitality
experimentálnych zvierat, čoho dôkazom je ich výrazne zvýšená mortalita. U pokusnej
skupiny dospelých samíc bola 20%, u pokusnej skupiny dospelých samcov
bola 50%.
Mortalita mláďat dosahovala hodnoty u pokusných samičiek 25% a u pokusných samčekov
44%. V kontrolnej skupine uhynuli len samice (dospelé 10 % a mláďatá 12,5%). Prevažná
väčšina zvierat uhynula v prvom týždni
hypertermického experimentu, kedy bola
zaznamenaná najvyššia stresová záťaž na organizmus rastúcich mláďat, ale aj dospelých
králikov.
II. Vplyv hypertermického stresu na hematologické ukazovatele krvi králikov:
Graf 3
Graf 4
LEUKOCYTY
*)
*88
14
12
10
8
LEUKOCYTY
15
SAMCI -K-MLAĎATÁ
SAMCI -K-DOSPEL
10
SAMCI-P-MLÁĎATÁ
SAMICE-K-MLÁĎATÁ
6
4
SAMICE-P-MLÁĎATÁ
2
SAMCI-P-DOSPEL
SAMICE-K-DOSPEL
5
SAMICE-P-DOSPEL
0
0
1
1
Tabuľka 5 LEUKOCYTY
SAMCI-KONTROLA-MLÁĎATÁ
11.620 x 109/L
SAMCI-KONTROLA-DOSPELÍ
14.500 x 109/ L
SAMCI-POKUS-MLÁĎATÁ
9.700 x 109/ L
SAMCI-POKUS- DOSPELÍ
12.150 x 109/ L
SAMICE-KONTROLA-MLÁĎATÁ 12.420 x 109/L
SAMICE-POKUS-MLÁĎATÁ
p<0,05
*
7.380 x 109/ L
SAMICE-KONTROLA-DOSPELÉ 14.780 x 109/ L
*
SAMICE-POKUS-DOSPELÉ
12.720 x 109/ L
Scheffesov test
254
U oboch vekových kategórií, tak u samíc ako aj u samcov, sme zaznamenali leukopéniu
(Tabuľka 5, Grafy 3–4). Leukopénia-pokles leukocytov – je charakteristická reakcia na
stresové podmienky hypertermického prostredia (36° C ± 3° C). Mláďatá králikov reagovali
na vysokú teplotu prostredia senzitívnejšie. V periférnej krvi mláďat bol pokles leukocytov
výraznejší (signifikantná leukopénia u mladých samíc), v porovnaní s dospelými králikmi.
Graf 5
Graf 6
LYMFOCYTY
LYMFOCYTY
7
10
6
8
5
SAMCI -K-MLAĎATÁ
4
SAMCI-P-MLÁĎATÁ
6
3
SAMICE-K-MLÁĎATÁ
4
2
SAMCI -K-DOSPEL
SAMICE-P-MLÁĎATÁ
1
SAMCI-P-DOSPEL
SAMICE-K-DOSPEL
SAMICE-P-DOSPEL
2
0
0
1
1
Tabuľka 6 LYMFOCYTY
SAMCI-KONTROLA-MLÁĎATÁ
6.360x 109/L SAMCI-KONTROLA- DOSPELÍ
SAMCI-POKUS-MLÁĎATÁ
3.700x 109/L
*
SAMICE-KONTROLA-MLÁĎATÁ 6.140x 109/L
p<0,05
*
8.100x 109/L
SAMCI-POKUS- DOSPELÍ
SAMICE-KONTROLA-DOSPELÉ 7.780x 109/L
4.060x 109/L SAMICE-POKUS-DOSPELÉ
SAMICE-POKUS-MLÁĎATÁ
8.625x 109/L
6.980x 109/L
Scheffesov test
Pokles bielych krviniek-leukocytov je zapríčinený hlavne poklesom lymfocytov – lymfopénia
(Tabuľka 6, Grafy 5, 6). Týmto je vysvetlená zvýšená senzitivita mláďat na hypertermické
chovné prostredie, v porovnaní s dospelými zvieratami. Signifikantne znížená koncentrácia
lymfocytov u mláďat (samcov)
je predispozíciou aj k narušeniu obranných reakcií ich
organizmu.
Graf 7
Graf 8
MONOCYTY
MONOCYTY
8*)
1,2
0,8
1
SAMCI -K-MLAĎATÁ
0,8
SAMCI-P-MLÁĎATÁ
0,6
0,6
SAMCI -K-DOSPEL
SAMCI-P-DOSPEL
0,4
SAMICE-K-DOSPEL
SAMICE-K-MLÁĎATÁ
0,4
SAMICE-P-MLÁĎATÁ
0,2
0,2
SAMICE-P-DOSPEL
0
0
1
1
255
Tabuľka 7 MONOCYTY
SAMCI-KONTROLA-MLÁĎATÁ
0.762x 109/L
SAMCI-KONTROLA- DOSPELÍ
0.553x 109/L
SAMCI-POKUS-MLÁĎATÁ
0.576x 109/L
SAMCI-POKUS- DOSPELÍ
0.400x 109/L
SAMICE-KONTROLA-MLÁĎATÁ 1.002x 109/L
*
0.426x 109/L
SAMICE-POKUS-MLÁĎATÁ
p<0,05
*
SAMICE-KONTROLA-DOSPELÉ 0.720x 109/L
0.628x 109/L
SAMICE-POKUS-DOSPELÉ
Scheffesov test
Graf 9
Graf 10
NEUTROFILY
NEUTROFILY
5
6
5
4
3
SAMCI -K-MLAĎATÁ
4
SAMCI -K-DOSPEL
SAMCI-P-MLÁĎATÁ
3
SAMCI-P-DOSPEL
2
SAMICE-K-MLÁĎATÁ
1
SAMICE-P-MLÁĎATÁ
0
SAMICE-K-DOSPEL
2
SAMICE-P-DOSPEL
1
0
1
1
Tabuľka 8 NEUTROFILY
SAMCI-KONTROLA-MLÁĎATÁ
2.760x 109/L SAMCI-KONTROLA- DOSPELÍ
4.425x 109/L
SAMCI-POKUS-MLÁĎATÁ
4.580x 109/L SAMCI-POKUS- DOSPELÍ
3.200x 109/L
SAMICE-KONTROLA-MLÁĎATÁ 4.740x 109/L SAMICE-KONTROLA-DOSPELÉ 5.360x 109/L
2.600x 109/L SAMICE-POKUS-DOSPELÉ
SAMICE-POKUS-MLÁĎATÁ
Graf 11
Graf 12
EOZINOFILY
EOZINOFILY
0,2
0,2
0,15
0,15
SAMCI -K-MLAĎATÁ
SAMCI-P-MLÁĎATÁ
SAMICE-K-MLÁĎATÁ
SAMICE-P-MLÁĎATÁ
0,1
0,05
0
4.420x 109/L
SAMCI -K-DOSPEL
SAMCI-P-DOSPEL
0,1
SAMICE-K-DOSPEL
0,05
SAMICE-P-DOSPEL
0
1
1
Tabuľka 9 EOZINOFILY
SAMCI-KONTROLA-MLÁĎATÁ
0.116x 109/L SAMCI-KONTROLA- DOSPELÍ
0.06x 109/L
SAMCI-POKUS-MLÁĎATÁ
0.180x 109/L SAMCI-POKUS- DOSPELÍ
0.085x 109/L
SAMICE-KONTROLA-MLÁĎATÁ 0.037x 109/L SAMICE-KONTROLA-DOSPELÉ 0.160x 109/L
SAMICE-POKUS-MLÁĎATÁ
0.052x 109/L SAMICE-POKUS-DOSPELÉ
0.050x 109/L
256
Graf 13
Graf 14
BAZOFILY
BAZOFILY
0,8
0,8
0,6
SAMCI -K-MLAĎATÁ
SAMCI-P-MLÁĎATÁ
SAMICE-K-MLÁĎATÁ
SAMICE-P-MLÁĎATÁ
0,4
0,2
0
0,6
SAMCI -K-DOSPEL
SAMCI-P-DOSPEL
0,4
SAMICE-K-DOSPEL
0,2
SAMICE-P-DOSPEL
0
1
1
Tabuľka 10 BAZOFILY
SAMCI-KONTROLA-MLÁĎATÁ
0.618x 109/L SAMCI-KONTROLA- DOSPELÍ
0.538x 109/L
SAMCI-POKUS-MLÁĎATÁ
0.368x 109/L SAMCI-POKUS- DOSPELÍ
0.420x 109/L
SAMICE-KONTROLA-MLÁĎATÁ 0.506x 109/L SAMICE-KONTROLA-DOSPELÉ 0.762x 109/L
SAMICE-POKUS-MLÁĎATÁ
0.216x 109/L SAMICE-POKUS- DOSPELÉ
0.658x 109/L
Vzhľadom ku zisteným koncentráciám ostatných typov bielych krviniek môžeme
konštatovať, že iba u neutrofilov v kategórii dospelých zvierat a u monocytov a tiež bazofilov
pre obe kategórie zvierat sme zaznamenali pokles týchto typov bielych krviniek u pokusných
králikov vystavených hypertermickému chovnému prostrediu.
Signifikantné zníženie sme zaznamenali len u monocytov mladých samíc.
Záver
Expozícia králikov (mláďat a dospelých samcov a samíc) hypertermickému prostrediu (36 ±
3° C) pôsobí negatívne na ich fyziologické procesy a narúša ich vnútornú homeostázu.
Zmeny sa manifestujú na všetkých biologických úrovniach. Prejavuje sa to negatívne na
príjme a konverzii krmiva, intenzite rastu, ale aj v narušení hematologických ukazovateľov.
Zaznamenaná signifikantná leukopénia (7.380 x 109/ L), so sprievodnou signifikantnou
lymfopéniou
(3.700x
109/L)
u mladých
experimentálnych
zvierat
(p<0,05*),
je
charakteristickým sprievodným javom stresovej reakcie na hypertermické chovné prostredie.
Keď sú králiky vystavené dlhšie trvajúcemu tepelnému stresu, senzitívnejšie zvieratá
nedokážu regulovať svoje vnútorné prostredie a dostavuje sa hypertermický kolaps,
sprevádzaný zvýšenou mortalitou (u mláďat:25–44 %, u dospelých zvierat:20–50 %).
Literatúra
Burnett N., Mathura K., Metivier K. S., Holder R. B., Brown G. and Campbell M. (2006) An investigation into
haematological and serum chemistry parameters of rabbits in Trinidad. World Rabbit Science 14, s. 175 – 187.
Harris I. (1994) The laboratory rabbit. ANZCCART Facts Sheet, News, vol.7, No. 4, s. 1 – 8.
Marai I. F. M., Habeeb A. A. M. and Gad A. E. (2002) Rabbit´s productive, reproductive and physiological
performance traits as affected by heat stress: a review. Livestock Production Science 78, s. 71 – 90.
257
Kontaktná adresa: RNDr. Vladimír Parkányi, CSc., Slovenské centrum poľnohospodárskeho
výskumu, Hlohovská 2, 949 92 Nitra, e-mail: [email protected]
ANALÝZA VNITŘNÍHO PROSTŘEDÍ MASNÉHO SKOTU
THE ANALYSIS OF BEEF CATTLE INTERNAL ENVIRONMENT
Pavlík, A. 1, Bartuňková, H. 1, Bjelka, M. 2, 1Jelínek P. 1
1Ústav
morfologie, fyziologie a genetiky zvířat, Agronomická fakulta, MZLU v Brně
ústav pro chov skotu, Rapotín
2Výzkumný
Abstract
The aim of the study was to compare some biochemical parameters of blood plasma of
different beef cattle category (bulls, heifers and steers) during the fattening. In each group,
there have been 11 beef cattle crossbreeds observed during the period from day 26 to 618 of
age. Animals live weight measurement and blood samples collecting were provided during
this period in day 26, 310, 403, 448, 479, 512, 554 and 618. Blood plasma samples were
analyzed for total protein, glucose, urea, calcium and phosphorus concentration. The values of
blood plasma metabolic and mineral profile parameters in all monitored groups during
experimental period ranged in intervals stated for healthy animals. Significantly highest body
weight gain during experimental period was found in the group of bulls. There were found
significant differences in blood plasma total protein concentration between the groups.
Sporadic differences in other objected internal environment parameters between the groups
were noted.
Úvod
S postupným nárůstem užitkovosti dojnic a omezením produkce mléka kvótami se
neustále snižuje počet skotu dojených plemen. Otevírá se tak prostor pro chov masného skotu,
především v systému chovu krav bez tržní produkce mléka, který není určen pro zpeněžení
mléka, ale k výživě telat a v konečném důsledku pro výrobu kvalitního hovězího masa.
Důležitým aspektem je zde využití masných plemen skotu v podmínkách podhorských a
horských oblastí, kde zemědělská produkce dosahuje nižších výnosů, čímž klesá i
ekonomická efektivita zdejší výroby. Chov masného skotu v systému bez tržní produkce
mléka tak podporuje zemědělské hospodaření na venkově, především využitím trvalých
travních porostů, podílí se na ochraně životního prostředí, tvorbě krajiny a přispívá k řešení
zaměstnanosti.
258
Při rozšiřování tohoto způsobu chovu skotu je potřeba nezanedbat vliv působení
chovatelských podmínek na organismus zvířat, tak aby byl zabezpečen především dobrý
zdravotní stav, optimální užitkovost vyjádřená růstovou schopností zvířat a tím i výroba
kvalitních živočišných produktů. Pro vytvoření optimálních podmínek, které by odpovídaly
aktuálním potřebám jednotlivých zvířat je však nutné znát co nejvíce ukazatelů vnitřního
prostředí, které tyto vlivy odrážejí a zejména signalizují stupeň dotace organismu živinami,
minerálními látkami, vitaminy a současně jsou projevem určitého funkčního stavu jedince.
Mnoho vědeckých publikací popisuje změny hematologických a biochemických parametrů
krve u různých kategorií skotu (Dubreuil a Lapierre, 1997; PARRA et al., 1999; Whitaker et
al., 1999; Knowles et al., 2000; Jorritsma et al., 2003; Kumar a Pachauri, 2003; Accorsi et al.,
2005; Cavestany et al., 2005; Fontaneli et al., 2005). Většina z nich se však zaměřuje pouze
na mléčný skot, případně na některé kategorie skotu zastaveného ve výkrmu. Navíc většina
těchto sledování je ve vztahu k aplikací různých léčiv nebo suplementací krmné dávky
minerálními a vitaminovými doplňky. Komplexním studie, zabývající se sledováním
parametrů vnitřního prostředí jednotlivých kategorií masného skotu chovaného v systému bez
tržní produkce mléka, tedy extenzivně, nebyla do dnešní doby na národní úrovní vypracována.
Existují ojedinělé práce zahraničních autorů, kteří popisují biochemické a hematologické
parametry masného skotu (Grunwaldt et al., 2005). Je však nutné brát v potaz skutečnost, že
klimatické podmínky v těchto studiích jsou odlišné od klimatických podmínek ČR a tím těžko
srovnatelné.
Cílem této práce bylo stanovit vybrané ukazatele vnitřního prostředí v průběhu
výkrmu u kategorií býků, jalovic a volů chovaných v podhorské oblasti Jeseníků.
Materiál a metodika
Řešený projekt byl realizován v provozní stáji Výzkumného ústavu pro chov skotu
v Rapotíně. Do pokusu bylo zařazeno 22 ks telat býků a 11 telat jalovic kříženců masných
plemen. Telata byla vybírána do sledování na základě data narození, tak aby rozdíl mezi
jednotlivými zvířaty byl co nejmenší. První odběr krve byl proveden v průměrném věku telat
26 ± 10 dní z vena jugularis, v době, kdy byla telata s matkou na pastvě. Zde také probíhal
odchov telat systémem bez tržní produkce mléka.
Ve věku 290 dnů bylo 11 býků vykastrováno a všechna sledovaná zvířata byla
zařazena do výkrmu. V odchovně mladého dobytka byla rozdělena do kotců dle pohlaví.
V průběhu sledování byla tato zvířata krmena směsnou krmnou dávkou na bázi kukuřičné
259
siláže, jetelotravní senáže, sena a jadrné směsi (NL -170,28g; Suš.- 86,88%; vlák. – 71,02g;
PDIN – 109,74g; PDIE – 92,69g; NEV - 6,84 MJ,ME - 12,03MJ) TMR – sušina 391,4 g; NL
– 106,6g; vláknina – 223,3g, NEV - 6,18 MJ.
Ve věku 26, 310, 403, 448, 479, 512, 554 a 618 dnů byla u zvířat zjišťována živá
hmotnost a současně byla z podocasní žíly odebrána pomocí odběrového systému Hemos
krev. Krev byla stabilizována heparinem a bezprostředně po odběru všech zvířat zařazených
do sledování odstředěna při 2 500 ot/min-1 po dobu 15 minut. Krevní plazma byla uchována
při teplotě -20oC až do analýzy. Z krevní plazmy byly stanoveny hladiny následujících
parametrů vnitřního prostředí: celkové bílkoviny, glukóza, močovina, vápník, fosfor.
Z rozdílu hmotností při prvním odběru a hmotností zvířat po zařazení do výkrmu byl
stanoven průměrný přírůstek za období odchovu. Růstová intenzita v průběhu výkrmu byla
hodnocena výpočtem průměrných přírůstků v časových intervalech mezi jednotlivými odběry.
Statistické vyhodnocení získaných dat bylo provedeno dvoufaktorovou analýzou
variance při opakovaných měřeních a rozdíly mezi jednotlivými skupinami následným
testováním pomocí Fisherova LSD testu.
Výsledky
Nejvyšší hmotnostní přírůstek za období odchovu byl zjištěn u býků a volů (Tab 1).
Tyto hodnoty byly statisticky průkazně vyšší (p < 0.05) oproti průměrnému přírůstku
zjištěnému u jalovic ve stejném období. V období výkrmu od 310 do 618 dnů věku dosahovali
nejvyšších přírůstku býci. V průběhu výkrmu byly rozdíly mezi skupinami stanoveny ve
většině případů jako statisticky průkazné (p < 0.05). Nejnižší hodnoty hmotnostních přírůstku
v průběhu výkrmu byly zjištěny většinou u skupiny jalovic.
Hodnoty hladiny celkových bílkovin v krevní plazmě se v průběhu odchovu a výkrmu
výrazně neměnily (Tab 2). Nárůst koncentrace byl zaznamenán na počátku výkrmu ve 310.
dni a na konci ve 618. dni. Statisticky průkazně vyšší (p < 0.05) byly stanoveny průměrné
hodnoty u skupiny jalovic v 310., 479. a 554. dni věku.
260
Tab 1: Přírůstek živé hmotnosti (kg.den-1)
Přírůstek
Odběr období
1.
26-310
3102.
403
4033.
448
4484.
479
4795.
512
5126.
554
5547.
618
Tab 2: Obsah celkových bílkovin (g.l-1)
býci
jalovice
p
p
x
x
1,063 a 0,887 b
a
b
1,466
1,066
a
b
1,149
0,846
a
b
1,460
1,016
voli
p
x
1,043 a
b
1,244
b
0,733
b
1,082
0,912
0,909
0,810
a
1,281
ab
1,079
a
0,759
CB
Odběr
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
věk
26
310
403
448
479
512
554
618
býci
x
64,5
74,0
70,7
70,6
69,1
68,7
64,2
73,6
jalovice
x
p
66,9
ab 72,0 b
70,9
72,9
a 72,3 b
70,3
a 68,0 b
71,7
p
voli
x
67,3
75,8
70,8
70,1
69,8
68,7
66,3
72,1
p
a
ab
ab
b
0,991
b
0,413
a
0,629
Koncentrace plazmatické glukózy se ve všech skupinách s mírným kolísáním
v průběhu sledování snižovala do 512. dne (Tab 3). Nejvyšší hodnoty byly stanoveny ve věku
26 dnů. Nižší koncentrace, především v druhé polovině sledování byly zjištěny u skupiny
býků. Tyto rozdíly mezi skupinami v průběhu sledovaného období nebyly statisticky
průkazné. Zvýšení koncentrace glukózy bylo zaznamenáno na konci výkrmu u jalovic a volů.
Nebyl zaznamenán jednoznačný trend vyšších nebo nižších hodnot hladiny močoviny
v krevní plazmě u některé ze sledovaných skupin. Hladina močoviny vykazovala ve všech
skupinách v průběhu sledovaného období kolísavou tendenci (Tab 4). Statisticky průkazně
nižší (p < 0.05) byla hodnota zjištěná u skupiny býků oproti skupině volů v 403. dnu věku.
Tab 3: Koncentrace glukózy (mmol.l-1)
Glukóza
Odběr věk
1.
26
2.
310
3.
403
4.
448
5.
479
6.
512
7.
554
8.
618
býci
jalovice
x
p x
p
5,70
6,37
5,15
5,28
5,19
4,81
4,79
4,73
4,60
4,59
4,70
4,93
4,70
4,78
4,81 a 5,20 b
voli
x
p
6,37
5,15
4,75
4,77
4,60
5,05
4,53
5,11 ab
Tab 4: Koncentrace močoviny (mmol.l-1)
Urea
Odběr
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
věk
26
310
403
448
479
512
554
618
býci
jalovice voli
x
p x
p x
p
1,81
2,57
2,35
2,42
2,54
2,65
2,98 a 3,24 ab 3,46 b
1,79
2,29
1,77
3,23
3,66
2,72
3,06
3,01
2,94
3,65
4,25
3,69
2,31
1,97
1,93
Po mírném kolísání koncentrace plazmatického vápníku na počátku sledovaného období
došlo k postupnému snižování hodnot do 479. dne (Tab 5). Do konce experimentu se hladina
261
vápníku ve všech skupinách výrazně neměnila. Statisticky průkazně vyšší byla průměrná hodnota
ve skupině jalovic ve 310. dnu věku oproti ostatním kategoriím.
Nejvyšší průměrné hodnoty fosforu v krevní plazmě byly zjištěny ve věku 26 dnů (Tab 6).
V ojedinělých případech byl zaznamenán statisticky průkazný rozdíl mezi jednotlivými
kategoriemi, avšak nebyl patrný trvalý trend vyšší nebo nižší koncentrace u některé z kategorií.
Tab 5: Obsah vápníku (mmol.l-1)
Ca
býci
jalovice
Odběr věk x
p x
p
1.
26 2,61
2,64
2.
310 2,34 a 2,61 b
3.
403 2,63
2,81
4.
448 2,46
2,52
5.
479 2,25
2,31
6.
512 2,42
2,44
7.
554 2,33
2,36
8.
618 2,44
2,48
voli
x
p
2,72
2,44 a
2,65
2,56
2,33
2,43
2,34
2,49
Tab 6: Obsah fosforu (mmol.l-1)
P
býci
jalovice
Odběr věk x
p x
p
1.
26 2,85 a 3,16 b
2.
310 2,53 ab 2,44 b
3.
403 2,44
2,32
4.
448 2,75
2,57
5.
479 2,44 ab 2,38 b
6.
512 2,49
2,47
7.
554 2,49
2,34
8.
618 2,40
2,38
voli
x
2,99
2,60
2,45
2,64
2,57
2,51
2,43
2,39
p
ab
a
a
Diskuse
Hodnoty sledovaných parametrů vnitřního prostředí stanovené u jednotlivých kategorií
se v průběhu sledovaného období pohybovaly ve fyziologickém rozmezí. Vzhledem
k nevelkému počtu studií zabývající se touto problematikou, není možné dostatečně
diskutovat dosažené výsledky. Grunwaldt et al. (2005) sledovali změny metabolického profilu
jalovic plemene Aberdeen Angus a uvádějí oproti našim výsledků nižší hodnoty plazmatické
glukózy, vápníku a fosforu. Nižší hodnoty koncentrace plazmatické glukózy, oproti našim
zjištěním, u extenzivně chovaného skotu stanovili i Otto et al. (2000). Také Whitaker et al.
(1999) zaznamenali nižší koncentraci fosforu v krevní plazmě ve srovnání s výsledky našeho
pokusu. Underwood (1969) uvádí, že kritická hranice koncentrace plazmatického vápníku pro
skot je 2 mmol.l-1. V našem experimentu se hodnoty u všech kategorií pohybovaly nad touto
mezní hodnotou. Grunwaldt et al. (2005) stanovili podstatně vyšší koncentraci močoviny
v krevní plazmě jalovic. Průměrná koncentrace močoviny stanovená v našem experimentu se
nachází v rozmezí hodnot, které uvádějí Whitaker et al. (1999).
Závěr
Problematika řešené práce se v širším pojetí zabývá chovem masných plemen skotu a
jejich kříženců systémem bez tržní produkce mléka s cílem dosažení maximálního využití
pastvy v podhorských podmínkách a ekonomicky výhodné produkce kvalitního hovězího
masa. V České Republice jde dosud o rozšiřování tohoto systému chovu a plemen skotu, a
proto informace o parametrech vnitřního prostředí, jež byly v rámci řešení získány u různých
262
kategorií skotu v průběhu výkrmu jsou určitým přínosem pro hodnocení jejich funkčního a
zdravotního stavu a jejich produkční kapacity. Perspektivou řešené problematiky je rozšíření a
doplnění stávajících poznatků pořízených jednak v jiných oblastech a u jiných plemen skotu.
Rovněž mohou tyto poznatky přispět na základě sledované intenzity růstu, spotřeby krmiva a
výsledků zpeněžování k orientaci chovatele na zaměření výkrmu z hlediska výživy, věku a
příslušné kategorie skotu (jalovice, býci, voli).
Tato studie byla vypracována za podpory grantového projektu IGA MZLU 25/2006 a
NAZV QF3020.
Literatura
1.
ACCORSI PA, GOVONI N, GAIANI R, PEZZI C, SEREN E, TAMANINI C. Leptin, GH, PRL,
insulin and metabolic parameters throughout the dry period and lactation in dairy cows. Reprod Domest
Anim. 40:217-23, 2005
2. CAVESTANY D, BLANC JE, KULCSAR M, URIARTE G, CHILIBROSTE P, MEIKLE A, FEBEL
H, FERRARIS A, KRALL E. Studies of the transition cow under a pasture-based milk production
system: metabolic profiles. J Vet Med A Physiol Pathol Clin Med. 52:1-7, 2005
3. DUBREUIL P, LAPIERRE H. Biochemistry reference values for Quebec lactating dairy cows, nursing
sows, growing pigs and calves. Can J Vet Res. 61:235-9, 1997
4. FONTANELI RS, SOLLENBERGER LE, LITTELL RC, STAPLES CR. Performance of lactating
dairy cows managed on pasture-based or in freestall barn-feeding systems. J Dairy Sci. 88:1264-76,
2005
5. GRUNWALDT EG, GUEVARA JC, ESTEVEZ OR, VICENTE A, ROUSSELLE H, ALCUTEN N,
AGUERREGARAY D, STASI CR. Biochemical and haematological measurements in beef cattle in
Mendoza plain rangelands (Argentina). Trop Anim Health Prod. 37:527-40, 2005
6. JORRITSMA R, WENSING T, KRUIP TA, VOS PL, NOORDHUIZEN JP. Metabolic changes in early
lactation and impaired reproductive performance in dairy cows. Vet Res. 34:11-26, 2003 Review.
7. KNOWLES TG, EDWARDS JE, BAZELEY KJ, BROWN SN, BUTTERWORTH A, WARRISS PD.
Changes in the blood biochemical and haematological profile of neonatal calves with age. Vet Rec.
147:593-8, 2000
8. KUMAR B, PACHAURI SP. Haematological profile of crossbred dairy cattle to monitor herd health
status at medium elevation in Central Himalayas. Res Vet Sci. 2000 69:141-5.
9. OTTO F, VILELA F, HARUN M, TAYLOR G, BAGGASSE P, BOGIN E. Biochemical blood profile
of angoni cattle in Mozambique. Israel J Vet Med. 55, 2000 dostupné na:
http://www.isrvma.org/article/55_3_4.htm
10. PARRA O, OJEDA A, COMBELLAS J, GABALDON L, ESCOBAR A, MARTINEZ N, BENEZRA
M. Blood metabolites and their relationship with production variables in dual-purpose cows in
Venezuela. Prev Vet Med. 38:133-45, 1999
11. UNDERWOOD EJ. Mineral metabolism. Annu Rev Biochem. 1969 28: 499-526.
12. WHITAKER DA, GOODGER WJ, GARCIA M, PERERA BM, WITTWER F. Use of metabolic
profiles in dairy cattle in tropical and subtropical countries on smallholder dairy farms. Prev Vet Med.
38:119-31, 1999
Kontaktní adresa:
Ing. Aleš Pavlík, Ph.D., Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat, Agronomická fakulta,
Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, e-mail:
[email protected]
263
ZMENY NEUROMEDIÁTOROV V HYPOTALAMO – HYPOFYZÁRNYCH
OBLASTIACH PO HORMONÁLNOM OVPLYVNENÍ
CATECHOLAMINE LEVELS IN THE HYPOTHALAMO – PITUITARY STRUCTURES
AFTER HORMONAL STIMULATION
Pástorová,B., Staníková, A., Halagan, J.
Ústav fyziológie Katedry normálnej anatómie, histológie a fyziológie, UVL, Košice
Abstract
The effect of hormonal stimulation on catecholamine levels in the eminentia mediana, area
preoptica, corpus mamillare and pituitary gland of ewes in the estric period by the
radioenzymatic method. The estrus of ewes was synchronized with Agelin sponges (Agelin,
Spofa) containing 20 mg chlorsuperlutine. After complete synchronization we induced
superovulation in the experimental groups by means of 2000 IU serum gonadotropin (PMSG).
Catecholamine were determined radioenzymatically using the Catechola test. The results
indicate that hormonal serum gonadotropin stimulation decreases significantly (p< 0.05) the
levels of dopamine, norepinephrine and epinephrine in the eminentia mediana of sheeps
hypothalamus. An increase of norepinephrine levels (p< 0.001) following 2000 IU PMSG in
the corpus mamillare was pronouced. Its administration is associated with increase dopamine
and epinephrine levels in the pituitary gland. We suspect that given changes in catecholamine
levels can be associated in relationship to steroid alteration after administration of
gonadotropic hormone PMSG.
Úvod
Napriek veľkému množstvu vedeckých poznatkov (2, 3) vzťah jednotlivých neuromediátorov
k produkcii gonadotropných hormónov nie je dostatočne objasnený. Katecholamíny (CA)
hypotalamu zasahujú do sekrécie gonadotropných hormónov hypofýzy tak, že sa podieľajú na
regulácii sekrécie hypotalamických releasing hormónov do hypofyzárneho portálneho
krvného obehu (4). Norepinefrín (NE) je mediátor na nervových zakončeniach ventrálnej časti
hypotalamu a stimuluje sekréciu FSH, LH z hypofýzy. Dopamín (DA) je považovaný za
prolaktostatín a do hypofýzy sa dostáva portálnym systémom, kde priamo inhibuje
hypofyzárne bunky sekretujúce prolaktín. Súčasne dopamín stimuluje alebo inhibuje sekréciu
LH v závislosti od koncentrácie ovariálnych steroidov, ktoré senzibilizujú receptory
neurotransmiterov, čím ovplyvňujú syntézu regulačných hormónov (1). Sekrécia LH a FSH je
pod kontrolou α-adrenergných receptorov hypotalamu, pričom koncentrácia 17β-estradiolu
264
v krvi moduluje α-adrenergický účinok na sekréciu gonadotropných hormónov. Naopak
zmeny v hladinách gonadotropných hormónov v krvnej plazme spätne pôsobia na hladiny a
funkciu katecholamínov v hypotalame (8). Katecholamíny hypotalamu sa podieľajú aj na
regulácii sekrécie hormónov neurohypofýzy – oxytocínu a vazopresínu. V súčasnosti sa
predpokladá, že norepinefrín pôsobí ako inhibítor neurosekrécie.
Materiál a metodika
Pozorovania
sme vykonali na 30 ovciach plemena valaška, vo veku 3-4 roky,
s priemernou ž. h. 40 kg v estrickom období. Všetky ovce, aj kontrolné, boli synchronizované
20 mg chlorsuperlutínu
v pošvových tampónoch Agelín Spofa. Ovce boli po vybratí
agelínových tampónov ihneď stimulované 2000 IU Serového gonadotropínu - PMSG
(Bioveta, Ivanovice na Hané). Zvieratá sme zabíjali 99-149 hodín po vybratí hubiek.
Bezprostredne po vykrvení a vybratí z lebečnej dutiny sme mozgy rozdelili segmentovou
analýzou a podľa stereotaxickej konfigurácie hypotalamu oviec (15) odobrali vzorky z oblasti
eminentia mediana, area preoptica a corpus mamillare. Tkanivo sme po odobraní ihneď
ponorili do kvapalného dusíka, v ktorom sme ho udržiavali v zmrazenom stave až do ďalšieho
spracovania. Koncentrácia katecholamínov bola stanovená u 12 oviec plemena valaška, (6
oviec kontrolných a 6 pokusných). Vzorky sme homogenizovali vo vychladenej HClO4
(c=0,4 mol.l-1), s pridaním redukovaného glutatiónu (c=0,05 mol.l-1) a centrifugovali po dobu
15 minút pri g 10000 / min.
Katecholamíny v tkanivových supernatantoch sme stanovili radioenzymatickou
metódou za pomoci testu Catechola (Adico, Praha). Aktivitu derivátov katecholamínov sme
stanovili 3H značeným donorom metylových skupín (S-adenosyl–l–metyl) – 3H metionín.
Produkty
reakcie
o-metylderiváty
katecholamínov
sme
rozdelili
tenkovrstvovou
chromatografiou na chromatografických doskách SILUFOL UV 254. Aktivitu vzoriek sme
zmerali na scintilačnom spektrometri PACKARD TRI
CARB v 3H kanáli. Výsledky
uvádzame v ng katecholamínov/1 mg bielkovín tkanivových homogenátov. Bielkoviny sme
stanovili metódou podľa LOWRYHO a i. (11).
265
Výsledky
Koncentrácia katecholamínov je u kontrolnej intaktnej skupiny oviec v analyzovaných
oblastiach hypotalamu oviec rozdielna. Najvyššie zastúpenie norepinefrínu sme stanovili
v preoptickej oblasti hypotalamu (4,2±0,350 ng/mg). V oblasti corpus mamillare a
v eminentia mediana (obr.2,3) sú hladiny norepenifrínu vyrovnané. Dopamín sa nachádza
v hypotalame kontrolnej skupiny oviec v nižších koncentráciách než norepinefrín ( 0,4900,900 ng/mg). Hladiny hypotalamického epinefrínu sú veľmi nízke (0,051-0,270 ng/mg). Po
podaní 2000 IU PMSG v porovnaní s kontrolnou intaktnou skupinou sme zaznamenali zmeny
koncentrácie katecholamínov študovaných oblastiach CNS podieľajúcich sa na regulácii
reprodukčných funkcií oviec. V preoptickej oblasti (obr.4) hypotalamu oviec sme pozorovali
signifikantné zníženie (p<0,05) hladín epinefrínu (o 36,4 %). Dopamín a norepinefrín
nevykazujú v preoptickej oblasti hypotalamu v porovnaní s kontrolnou skupinou štatisticky
významné zmeny. Signifikantné zníženie hladín norepinefrínu (p<0.001) sme pozorovali po
podaní serového gonadotropínu (o 52,8 %) v oblasti corpus mamillare (obr.3). Koncentrácie
dopamínu a epinefrínu sa v corpus mamillare v porovnaní s kontrolnou skupinou
signifikantne nemenili. Podanie 2000 IU SG najvýraznejšie mení hladiny katecholamínov
v oblasti eminentia mediana (obr.2), kde sme zaznamenali štatistický významný pokles
koncentrácii norepinefrínu (p<0.001). Hladiny dopamínu sa znížili v eminentia mediana o
40,9 % v porovnaní s kontrolnou skupinou oviec a tento pokles je štatisticky významný
(p<0.05). V hypofýze sme zaznamenali (obr.1) signifikantné zmeny.
P IT U IT A R Y G L A N D
D O P A M IN E
N O R E P IN E P H R IN E
n g /m g p r o t
n g /m g p ro t
2 ,5
*
2
E P IN E P H R IN E
n g /m g p ro t
8
10
7
9
*
8
6
7
5
1 ,5
1
6
4
5
3
4
3
2
0 ,5
2
1
0
1
0
C o n tr o l, A g e lin
A g e lin ,2 0 0 0 IU P M S G
C o n tr o l, A g e lin
A g e lin ,2 0 0 0 IU P M S G
0
C o n t r o l, A g e lin
A g e lin ,2 0 0 0 IU P M S G
* -p < 0 ,0 5
Obr. 1
266
E M IN E N T IA M E D IA N A
N O R E P IN E P H R IN E
D O P A M IN E
n g /m g p r o t
0 ,5
1 ,6
0 ,1 4
1 ,4
0 ,1 2
1 ,2
0 ,4
0 ,1
1
**
0 ,3
0 ,0 8
0 ,8
*
0 ,6
0 ,2
E P IN E P H R IN E
n g /m g p r o t
n g /m g p rp t
0 ,6
**
0 ,0 6
0 ,0 4
0 ,4
0 ,0 2
0 ,1
0 ,2
0
0
0
C o n t r o l, A g e lin
C o n t r o l , A g e l in
A g e lin ,2 0 0 0 IU
PM SG
C o n t r o l, A g e li n
A g e l in , 2 0 0 0 I U P M S G
* - p < 0 ,0 5
A g e li n ,2 0 0 0 IU
PMSG
* * p < 0 ,0 1
Obr. 2
C O R P U S M A M IL L A R E
n g /m g
p ro t
N O R E P IN E P H R IN E
D O P A M IN E
n g /m g p ro t
1
0 ,9
1 ,6
0 ,8
1 ,4
0 ,7
1 ,2
0 ,6
**
1
0 ,5
0 ,4
0 ,8
0 ,3
0 ,6
0 ,2
0 ,4
0 ,1
0 ,2
0
C o n tro l, A g e lin
A g e lin ,2 0 0 0 IU
PM SG
E P IN E P H R IN E
n g /m g p ro t
1 ,8
0 ,5
0 ,4 5
0 ,4
0 ,3 5
0 ,3
0 ,2 5
0 ,2
0 ,1 5
0 ,1
0 ,0 5
0
*
C o n tro l, A g e lin
0
C o n tro l, A g e lin
A g e lin ,2 0 0 0 IU P M S G
A g e lin ,2 0 0 0 IU
PM SG
* p < 0 ,0 5 ; ** p < 0 ,0 1
Obr. 3
267
A R E A P R E O P T IC A
D O P A M IN E
n g /m g p r o t
1 ,4
n g /m g p r o t
6
0 ,0 7
5
0 ,0 6
1 ,2
0 ,0 5
4
1
0 ,8
3
0 ,6
2
0 ,4
1
0 ,2
0 ,0 4
0 ,0 3
0 ,0 2
0 ,0 1
0
0
0
C o n tr o l, A g e lin
C o n tr o l, A g e lin
A g e lin ,2 0 0 0 IU
PMSG
E P IN E P H R IN E
N O R E P IN E P H R IN E
n g /m g p r o t
1 ,6
A g e lin ,2 0 0 0 IU
PM SG
C o n tr o l, A g e lin
A g e lin ,2 0 0 0 IU
PMSG
Obr. 4
Diskusia
Pomer a zastúpenie katecholamínov v nami skúmaných oblastiach mozgu kontrolnej
intaktnej skupiny oviec študovaných rádioenzymatickou metódou zodpovedá údajom iných
autorov získaných na laboratórnych zvieratách (5. Extrahypofyzárny hormón sérový
gonadotropín, ktorý vykazuje FSH a LH aktivitu, má dlhý polčas biologického rozpadu
v organizme a jeho podanie je spojené s výrazným dlhodobým zvýšením estrogénov v krvnej
plazme. Vysoké koncentrácie estrogénov pôsobia na adrenergické receptory hypotalamu a
ako uvádzajú
DAVIES a i. (6), dochádza pri týchto stavoch k poklesu zastúpenia
hypotalamického norepinefrínu. V súlade s uvedenými údajmi sme v našom pokuse
pozorovali štatisticky významný pokles (p<0.001) koncentrácie norepinefrínu v oblasti
eminentia mediana a corpus mamillare po aplikácii hormonálneho preparátu serového
gonadotropínu. Do rostrálneho hypotalamu patrí preoptická oblasť, ktorá je súčasťou vyššieho
regulačného mechanizmu riadenia gonadotropných funkcií adenohypofýzy (9). V tejto oblasti
sa nachádzajú adrenergické nervové terminály podieľajúce sa na sekrécii gonadotropínov.
Podľa súčsných vedeckých poznatkov sa predpokladá, že zvýšenie turnoveru norepinefrínu
v mediálnej preoptickej oblasti počas proestru spôsobuje adrenergnú blokádu, ktorá
predchádza výraznému vrcholu LH. Katecholamíny v preoptickej oblasti pôsobia na
uvoľňovanie LH-RH tónickou inhibíciou cez GABA – ergické interneurózy, ktoré potencujú
uvoľňovanie LH-RH. LOFSTROM a i. (10) zistili, že exogénne hormóny PMSG a HCG
pôsobia na adrenergné receptory hypotalamu potkanov, najvýraznejšie na neuróny
268
v rostrálnej oblasti hypotalamu. V našom pokuse sme pozorovali signifikantné zníženie
koncentrácie epinefrínu (p<0,05) v preoptickej oblsati hypotalamu oviec. SAAVEDRA (14)
uvádza, že neuróny obsahujúce epinefrín v preoptickej oblasti hypotalamu sa podieľajú i na
regulácii integrácie periférnej adrenergickej odozvy. Výraznú funkciu v hypotalame má
dopamín,
nachádzajúci
sa
v tuberoinfundibulárnych
dopaminergických
neurónoch
hypotalamu, ktoré vykazujú cyklické zmeny aktivity v priebehu estrálnych cyklov. Tieto
neuróny sa podieľajú na koordinácii hypotalamickej kontroly sekrécie 3 gonadotropných
hormónov: prolaktínu, FSH a LH. Dopamín je uvoľňovaný z neurónov eminentia mediana do
portálnych ciev a je dôležitým faktorom v regulácii sekrécie prolaktínu v hypofýze (17).
Z našich výsledkov vyplýva, že najvýraznejšie zmeny dopamínu sme pozorovali po podaní
2000 IU SG najmä v oblasti eminentia mediana, kde sme zaznamenali signifikantné zníženie
hladín dopamínu (o 46,94 %).
Pri porovnaní
výsledkov z tohoto pokusu s našimi predchádzajúcimi (12, 13) je
možné konštatovať, že i napriek tomu, že exogénny hormón serový gonadotropín spôsobuje
štatisticky významné zníženie hypotalamických katecholamínov u oviec plemena valaška,
ešte výraznejší vplyv má na zmeny katecholamínov oviec plemena slovenské merino.
V hypofýze dochádza po hormonálnom ovplyvnení k signifikantnému vzostupu
dopamínu a epinefrínu (p<0,05). O funkcii hypofyzárnych katecholamínov sú známe vedecké
poznatky iba niekoľko rokov (7). Významnú úlohu v hypofýze má najmä dopamín prítomný
v neurálnej a intermediálnej časti hypofýzy, ktorý má význam najmä v priebehu laktácie a pri
sekrécii oxytocínu a vazopresínu.
Mechanizmus účinku vplyvu exogénnych hormonálnych prípravkov (15, 16) na
koncentrácie katecholamínov v hypotalame a hypofýze je bez štúdia ich obratu ťažko
definovať. Je pravdepodobné, že dochádza k spätnoväzobnému pôsobeniu estrogénov na
adrenergické receptory hypotalamu a tým k zmenenému uvoľňovaniu katecholamínov
v adrenergických neurónoch. Obrat a aktuálne hladiny katecholamínov závisia od mnohých
faktorov, akými sú syntéza a degradácia, uskladnenie a extracelulárne vychytávanie, od
transneurálneho toku a interakcie s aitoreceptormi. Porušenie niektorého z uvedených
faktorov vedie k zmene koncentrácií a funkcie katecholamínov v nervovom tkanive.
Literatúra
1.
2.
3.
4.
AKEMA,T., KIMURA,F.: Neuroendocrinology, 50, 1989, 688-692.
BAHR,J.M., BEN JONATHAN,N.N.: Endocrinology, 108,1981,1818-1819.
BEKEOVÁ,E, HENDRICHOVSKÝ,V., KRAJNIČÁKOVÁ,M.: Slov.vet.čas., 23, 1998, 5:264-268.
CROWLEY,W.R., DOHUL,T.L., JACOBOWITZ,D.A.: Brain. Res., 147, 1978, 315-326.
269
5. ČULMAN,J.,
KVETŇANSKÝ,R., KISS,A., MEZEY,E., MURGAŠ,K.: In: USDIN,E.KVETŇANSKÝ,R.-KOPIN,J. (eds): Catecholamine and stress. Elsevier North Holland, 1981, 31-32.
6. DAVIES,J.J., NAFTOLINI,F.K.,RYAN,J., FISCHMANN,A., SINN,J.: Endocrinilogy, 997,1975,554558.
7. HOLZBAUER,M., SHARMAN,D.F., STEPHENS,D.B.: In: USDIN,E., KVETŇANSKÝ,R.-KOPIN,J.
(eds.): Catecholamine and stress. Recent Advances. Elsevier North Holland, New York, Amsterdam,
Oxford, 1981, 137-143.
8. KULJIS,R.O., ADVIS,J.P.: Endocrinology, 124, 1989, 1579-1581.
9. LERANTH,C., MacLUSKY,N.J., SHANABROUGH,M., NAFTOLINI,F.K.: Neuroendocrinology, 48,
1988, 591-602.
10. LOFSTROM,J.E.R., ENEROTH,J., GUSTAFSON,J.A., SKETT,P.: Endocrinology, 101,1977,15591567.
11. LOWRY,O.,ROSENBROUGH,N., FARR,A., RANDALL,R.: J. biol. Chem., 194,1951,265-275.
12. PÁSTOROVÁ,B., ARENDARČIK,J., MOLNÁROVÁ,M.: Vet.Med., 33,1988,281-292.
13. PÁSTOROVÁ,B., ARENDARČIK,J.: Vet.Med., 33,1989,171-180.
14. SAAVEDRA,J.M.: Cell. Mol. Neurobiol., 4,1984,397-402.
15. SOPKOVÁ, D.: In: Proceedings of lecture and posters, September 2004, 310 – 313.
16. SOPKOVÁ, D., VÁRADY, J., ELIÁŠ, V., MAKOVÁ, Z.: Phys. Res., 3, 48, 1999, 21.
17. WELENTO,J., SZTEYN,S., MILART,Z.: Antropool. Anz., 124,1968,1-27.
Kontaktná adresa: doc. RNDr. Bernadetta Pástorová, PhD., Ústav fyziológie KNAHF,
Univerzita veterinárskeho lekárstva, Komenského 73, 041 81 Košice
Práca bola podporená grantom VEGA 1/2446/05 .
VPLYV DIÉTY OBOHATENEJ SELENIČITANOM SODNÝM NA
ANTIOXIDAČNÝ A SELÉNOVÝ STATUS OVIEC.
EFFECT OF SODIUM SELENITE SUPPELMENTATION INTO THE DIET FOR SHEEP
ON SELENIUM AND ANTIOXIDANT STATUS.
Petrovič, V., Leng, L.1, Pisarčíková, J., Farkašová, Z., Tóthová, Cs., Kováč, G.
Univerzita veterinárskeho lekárstva, Komenského 73, Košice
1Ústav fyziológie hospodárskych zvierat, Slovenská Akadémia Vied, Košice
Abstract
In experiment on sheep, the effect of supplementation of sodium selenite on
superoxide dismutase (SOD) in erytrocytes, glutathione peroxidaze (GPx) in blood, tissues
and fractions of rumen fluid, malondialdehyde (MDA) and Se concentration in plasma, blood
and tissues was investigated. Ten animals were randomly divided into two groups and were
fed experimental diets for 2 months. Control group of sheep received BD providing a daily
intake of Se 42.35 µg only. The diet for second group consisted of BD enriched with Se 0.3
mg.kg-1 in the form of Na2SeO3 and provided total daily intake 270.4 µg of Se per head.
Increases in Se concentrations in whole blood and tissues as well as increases in the activities
of blood and tissues GPx were highly significant in group of sheep fed diet supplemented with
selenite. Interestingly, the concentration of Se in muscle was significantly increased in this
270
group of animals too. Activity of SOD in erythrocytes as well as the contents of MDA in
tissues were significantly reduced in animals fed diet supplemented with Se. The cumulation
of Se in rumen microflora resulted in its significant increased in the bacterial and protozoal
fractions of rumen fluid. The results suggest on the important role of rumen microflora in the
creation of selenomethionine from selenite which is the only form of selenium able to build
significant body deposits. The benefit of Se supplementation on the maintainance of
antioxidant and selenium status of sheep was demonstrated.
Key words: sheep, selen, GPx, SOD, MAD
Úvod
Antioxidačná ochrana je aktívne odstraňovanie kyslíkových voľných radikálov
pomocou antioxidantov „vitamínov, kys. močovej, superoxid dismutázy (SOD), zložiek
zahrnutých do glutatiónového a tioredoxínového systému a iných“. Antioxidanty zabezpečujú
ochranu biologicky dôležitých molekúl pred oxidačným poškodením vyvolaným pôsobením
voľných
radikálov.
Sú
lokalizované
v organelách,
subcelulárnych
kompartmentoch
a extracelulárnom priestore (Surai a kol., 1999). Enzýmy ako superoxid dismutáza
a selénoenzýmy „glutatión peroxidáza (GPx), tioredoxín reduktáza“ sú považované za hlavné
zložky antioxidačnej ochrany organizmu.
Selén vo forme selénocysteínu zabudovaný do aktívneho centra selénoenzýmov
zodpovedá za ich enzymatickú aktivitu (Behne a Kyriakopoulos, 2001), i preto je sledovanie
selénového a antioxidačného statusu zvierat a ľudí stredobodom záujmu.
Našu prácu sme preto zamerali na hodnotenie antioxidačného a selénového statusu
vnútorného prostredia oviec, pomocou merania vybraných antioxidačných parametrov, pri
skrmovaní bazálnej diéty a diéty obohatenej o seleničitan sodný.
Materiál a metodiky
Ovce s priemernou ž. hmotnosťou 36 kg boli náhodne rozdelené do dvoch skupín po
päť zvierat. Boli ustajnené v individuálnych boxoch s volným prístupom k vode. Počas dvoch
mesiacov boli ovce kontrolnej skupiny kŕmené bazálnou diétou (BD) zabezpečujúcou denný
príjem Se 42,35 µg na zviera, kým ovce seleničitanovej skupiny dostávali rovnakú BD
obohatenú o 228 µg Se vo forme seleničitanu sodného. Ovciam boli po eutanázii odobraté
vzoriek orgánov na analýzy, ktoré sme uložili pod –60 ˚C do ich analyzovania. Aktivita SOD
bola meraná hneď po odbere krvi kitom RANSOD od firmy Randox, UK. Aktivita GPx v krvi
bola meraná kitom RANSEL od firmy Randox, UK. Aktivitu GPx v tkanive pečene, obličky a
271
duodéna sme merali ako zmenu absorbancie vzorky spôsobenú vznikajúcim oxidovaným
NADP+ pri 340 nm metódou (Paglia and Valentine, 1967)
modifikovanou podľa
Zagrodzkého a kol. (1998). Hemoglobín bol analyzovaný kitom od firmy Randox, UK.
Koncentrácia selénu v krmive, krvi a orgánoch bola hodnotená v duplikátoch použitím
fluorometrickej metódy (Rodriguez a kol., 1994). Koncentrácie MDA v plazme, tkanive
pečene, obličky a duodéna boli merané modifikovanou fluorimetrickou metódou (Jo a Ahn,
1997). Bielkoviny sme stanovili metódou podľa Bradforda (1976). Bakteriálnu a protozoálnu
frakciu sme z bachorového obsahu oviec získali metódou podľa Czerkawského (1976).
Na štatistické vyhodnotenie významností výsledkov sme použili Studentov t-test
nepárový. Výsledky sú uvedené ako priemerné hodnoty ± SEM.
Výsledky a diskusia
Koncentrácie Se v krvi, tkanive pečene, kôry obličky, drene obličky, duodéna,
chrbtovej svaloviny a srdca oviec sú prezentovaná v Tabuľke 1. Skrmovanie diéty obohatenej
o seleničitan sodný ovciam viedlo k významnému zvýšeniu koncentrácie Se v krvi, ako
i všetkých sledovaných tkanivách v porovnaní s koncentráciami selénu stanovenými v krvi a
orgánoch oviec s bazálnym príjmom Se.
Je známe, že koncentrácia Se v telových tekutinách a tkanivách je v úzkej lineárnej
korelácii s aktivitou GPx v krvi (Pavlata a kol., 2001). Rovnako ako koncentrácia Se i aktivita
GPx v krvi a všetkých sledovaných orgánoch bola významne zvýšená v seleničitanovej
skupine v našich oviec. Tieto výsledky sú v zhode s pozorovaniami uvedenými v mnohých
prácach, v ktorých sledovali vplyv skrmovania diét doplnených o Na2SeO3 u rôznych druhov
zvierat (Kuricová a kol., 2003; Zuberbuehler a kol., 2006).
Tabuľka 1. Koncentrácie Se v krvi, tkanive pečene, kôry obličky, drene obličky, slezine, epiteli,
chrbtovej svalovine a srdci oviec kŕmených bazálnou diétou a diétou obohatenou Na2SeO3.
parameter
krv µmol.l-1
-1
pečeň µmol.kg sušiny
-1
kôra obličky µmol.kg sušiny
kontrolná skupina
Na2SeO3 skupina
0,43 ± 0,03
3,62 ± 0,26
p < 0,001
4,06 ± 0,11
23,04± 2,58
p < 0,001
45,85 ± 3,03
66,86 ± 2,37
p < 0,001
-1
dreň obličky µmol.kg sušiny
8,77 ± 1,13
14,61 ± 1,15
p < 0,01
-1
epitel µmol.kg sušiny
5,86 ± 0,67
14,07 ± 0,59
p < 0,001
chrbtový sval µmol.kg sušiny
0,89 ± 0,08
3,43 ± 0,14
p < 0,001
-1
3,88 ± 0,23
14,88 ± 0,49
p < 0,001
-1
srdce µmol.kg sušiny
Hodnoty sú priemery ± SEM, n=5 v každej skupine.
272
Tabuľka 2. Aktivity GPx v krvi, tkanive pečene, kôry obličky, drene obličky, duodéna, koncentrácie
MDA v plazme, tkanive pečene, obličky, duodéna a koncentrácia –SH skupín v plazme oviec
kŕmených bazálnou diétou a BD obohatenou Na2SeO3.
parameter
kontrolná skupina
Na2SeO3 skupina
-1
GPx v krvi U.g Hb
265,9 ± 53,2
993 ± 66,04
p < 0,001
-1
18,06 ± 2,36
88,25 ± 4,77
p < 0,001
-1
47,19 ± 8,21
88,52 ± 15,39
p < 0,01
-1
GPx v dreni obličky U.g bielkovín
26,95 ± 4,53
44,43 ± 3,34
p < 0,05
GPx v duodéne U.g-1 bielkovín
36,17 ± 4,66
114,8 ± 17,38
p < 0,01
-1
0,28 ± 0,04
0,29 ± 0,02
NS
MDA v pečeni nmol.g-1 bielkovín
GPx v pečeni U.g bielkovín
GPx v kôre obličky U.g bielkovín
MDA v plazme µmol.l
22,53 ± 1,15
16,76 ± 0,87
p < 0,01
-1
31,9 ± 3,53
19,51 ± 3,42
p < 0,05
-1
26,09 ± 1,84
20,04 ± 1,52
p < 0,05
MDA v duodéne nmol.g bielkovín
47,59 ± 2,80
38,42 ± 1,17
p < 0,05
-1
0,54 ± 0,01
0,46 ± 0,02
p < 0,01
MDA v kôre obličky nmol.g bielkovín
MDA v dreni obličky nmol.g bielkovín
-1
–SH skupín v plazme mmol.l
Hodnoty sú priemery ± SEM, n=5 v každej skupine.
Koncentrácia MDA v tkanive pečene, kôry obličky, drene obličky a duodéna bola
významne znížená v seleničitanovej skupine v porovnaní s kontrolnou skupinou oviec.
Balogh a kol., (2004) zistili, že pokles hladín GPx v tkanivách je sprevádzaný vzostupom
koncentrácie MDA v sledovaných tkanivách.
Koncentrácia –SH skupín v plazme oviec bola významne znížená v seleničitanovej
skupine oproti kontrolnej skupine. Tiolové skupiny sú významnou ochrannou bariérou plazmy
pred oxidačným pôsobením voľných radikálov. Ich pokles poukazuje na zníženie tvorby
alkoxylového a hydroxylového radikálu v organizme.
Aktivita krvnej SOD bola v seleničitanovej skupine významne znížená v porovnaní
s kontrolnou skupinou oviec (Graf 1). K rovnakému záveru sme dospeli i v našom predošlom
experimente na sliepkach, v ktorom skrmovanie diéty obohatenej o Na2SeO3 resp.
selenizované kvasnice, spôsobilo významný pokles aktivity SOD v porovnaní s hydinou
kŕmenou iba BD (Petrovič a kol., 2006). Predpokladáme, že zvýšenou aktivitou
selénoenzýmov (GPx, TRxR a iných)
v seleničitanovej skupine oviec sa zabezpečilo
zlepšenie recyklácie vitamínu C a vitamínu E, ktoré slúžia ako scavenger superoxidového
radikálu (Surai, 2002), ktorý je špecifickým substrátom pre superoxid dismutázu.
273
7000
6000
U.g-1 Hb
5000
**
4000
3000
2000
1000
0
Kontrola
Na2SeO3
Graf 1. Efekt obohatenia bazálnej diéty pre ovce seleničitanom sodným na aktivitu krvnej superoxid
dizmutázy. Hodnoty sú priemery ± SEM, n=5 v každej skupine.
Porovnanie koncentrácie Se prijímaného diétou s koncentráciou selénu v bakteriálnej a
protozoálnej frakcii bachorovej tekutiny potvrdzuje schopnosť bachorovej mikroflóry
kumulovať
Se
do
mikrobiálnych
proteínov
(tabuľka
3).
V telách
bachorových
mikroorganizmov sa selén nachádza hlavne vo forme selénoaminokyselín. Van Ryssen a kol.,
(1989) zistili, že selénocysteín bol predominantnou selénoaminokyselinou prítomnou
v bachorových mikroorganizmoch kultivovaných v médiu obsahujúcom Na2SeO3. Preto
môžeme predpokladať, že nami zaznamenané zvýšenie v koncentrácii Se v oboch frakciách
bachorového obsahu oviec seleničitanovej skupiny v porovnaní s kontrolou je zapríčinené
hlavne prítomnosťou selénoaminokyselín zabudovaných do mikrobiálnych proteínoch.
Tabuľka 3. Koncentrácie Se v bakteriálnej a protozoálnej frakcii bachorového obsahu oviec
kŕmených bazálnou diétou a BD obohatenou Na2SeO3.
parameter
kontrolná skupina
Na2SeO3 skupina
3,08 ± 0,28
9,72 ± 1,73
p < 0,01
5,06 ± 0,54
12,21± 0,1
p < 0,001
Se v bakteriálnej frakcii
µmol.kg-1 sušiny
Se v protozoálnej frakcii
µmol.kg-1 sušiny
Hodnoty sú priemery ± SEM, n=5 v každej skupine.
Záver
Obohatenie diéty oviec seleničitanom sodným spôsobilo zlepšenie sledovaných
parametrov antioxidačného i selénového statusu vnútorného prostredia oviec.
274
POĎAKOVANIE: Táto práca bola podporovaná agentúrou na podporu vedy a techniky na
základe zmluvy č. APVT-51-004804.
Literatúra
ARTHUR J.R., BOYNE R., 1985. Superoxide-dismutase and glutathione-peroxidase activities in neutrophils
from selenium deficient and copper deficient cattle. Life Sci. 36, 1569-1575
BALOGH K., WEBER M., ERDÉLYI M., MÉZES M., 2004. Effect of excess selenium supplementation on the
glutathione redox system in broiler chicken. Acta Vet. Hung. 52, 403-411
BEHNE D., KYRIAKOPOULOS A., 2001. Selenium-containing proteins in mammals and other forms of life.
Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 145, 1-46
BRADFORD M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein
utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254
CZERKAWSKI J.W., 1976. Chemical composition of microbial matter in the rumen. J. Sci. Food Agric. 27,
621-632
ELLMAN G.L., 1958. Tissue sulfhydryl groups. Arch. Biochem. Biophys. 82, 70-77
Jo C., Ahn D.U., 1998. Fluorometric analysis of 2-thiobarbituric acid reactive substances in turkey. Poultry Sci.
77, 475-480
HOLOVSKÁ K., LENÁRTOVÁ V.,HOLOVSKÁ K., PRISTAŠ P., JAVORSKÝ P. 2002. Are ruminal bacteria
protected against environmental stress by plant antioxidants ? Lett. App. Microbiol. 35, 303-304
KIM H.S., CHAE H.S., JEONG S.C., HAM J.S., IM S.K., AHN C.N., LEE J.M. 2006. In vitro antioxidative
properties of lactobacilli, J Anim. Sci. 19 (2): 262-265
KURICOVÁ S., BOLDIŽÁROVÁ K., GREŠÁKOVÁ Ľ., LEVKUT M., LENG Ľ., 2003. Chicken selenium
status when fed a diet supplemented with Se-yeast. Acta Vet. Brno 72, 339-346
PAGLIA D.E., VALENTINE W.N., 1967. Studies on quantitative and qualitative characterization of erythrocyte
glutathione peroxidase. J. Lab. Med. 70, 158-169
PAVLATA L., ILLEK J., PECHOVÁ A., 2001. Blood and tissue selenium concentration in calves treated with
inorganic or organic selenium compounds - A comparison. Acta Vet. Brno 70, 19-26
PETROVIČ V., BOLDIŽÁROVÁ K., FAIX Š., MELLEN M., ARPAŠOVÁ H., LENG Ľ., 2006. Antioxidant
and selenium status of laying hens fed with diets supplemented with selenita or Se-yeast. Anim. Feed Sci. 15,
435-445
RODRIGUEZ E.M., SANZ M.T., ROMERO C.D., 1994. Critical study of fluorometric determination of
selenium in urine. Talanta 12, 2025-2031
Kontaktná adresa: Petrovic Vladimir, MVDr., University of Veterinary Medicine, II.
Internal Clinic, Komenskeho 73, Kosice 041 81, Slovakia, [email protected]
VLIV GRAVIDITY NA POČET LEUKOCYTŮ A T - LYMFOCYTŮ U OVCÍ
SUPLEMENTOVANÝCH SELENEM.
EFFECTS OF GRAVIDITY ON NUMBER OF LEUKOCYTES AND T CELLS SUBSETS
IN SELENIUM SUPPLEMENTED EWES.
*Písek, L., Trávníček, J., Kroupová, V., Rodinová, H.
Katedra anatomie a fyziologie hospodářských zvířat, Zemědělská fakulta, Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích
Department of Anatomy and Physiology of Farm Animals, Faculty of Agriculture, University of South Bohemia in Ceske
Budejovice
Abstrakt:
Cílem práce bylo posoudit vliv reprodukčního cyklu na dynamiku počtu leukocytů a na
zastoupení subpopulací T – lymfocytů u ovcí suplementovaných selenem. Do pokusu bylo
zařazeno 15 jedinců plemene ovce Šumavská ve věku 18 měsíců. V průběhu pokusu byla krev
275
odebírána jalovým, gravidním (0-50; 51-100 a 101-150 dnů) a obahněným (0-30 a 31-60 dnů)
ovcím. Počty leukocytů a lymfocytů byly stanovovány mikroskopicky z krevních nátěrů dle
platných norem (č. 84 3206 a 84 3209). Pro stanovení zastoupení subpopulací T-lymfocytů
byla použita průtoková cytometrie. Počty leukocytů i relativní zastoupení lymfocytů
nevykazovaly statisticky významné rozdíly a pohybovaly se v rozmezí fyziologické normy. V
dynamice CD4+ a CD8+ T-lymfocytů byl zjištěn statisticky významný rozdíl (P < 0,001)
mezi obdobím gravidity a obdobím po porodu, kdy byl zaznamenán strmý nárůst v zastoupení
obou subpopulací až na dvojnásobek.
Klíčová slova: ovce; krev; FACS; subpopulace
Abstract:
The aim of the work was assessed influence of reproduction cycle at the dynamics of
leukocytes and T cells subsets in selenium supplemented ewes. The experiment was
conducted on fifteen ewes of the Sumava sheep breed at 18 months of age. The ewes were in
the stage of non-pregnancy, pregnancy and lactation during the experiment. Blood for
analysis were collected in monthly intervals. After parturition blood samples were taken from
lambing ewes on day 30 and 60. Number of leukocytes in blood smear was detected by
microscopically analysis by the norm no. 84 3206, and the CD4+ and CD8+ T cells subsets in
blood were detected by flow cytometery. The number of leukocytes was in physiological
norm without statistically significant differences during the experiment. In the dynamics of
the T cells subsets was founded statistically significant difference between stadium of
gravidity and stadium after lambing (P < 0,001).
Key words: sheep; blood; FACS; subsets
Poděkování
Tento projekt byl podporován MSM 6007665806 a GAČR 523/03/H076.
*Kontaktní osoba: Lukáš Písek, ZF JU v Č. Budějovicích, Studentská 13., 370 05 České
Budějovice, e-mail: [email protected], tel.: +420387772620
276
VPLYV PRÍDAVKU TREHALÓZY NA FERTILIZAČNÚ KAPACITU
ZMRAZENÉHO SEMENA BARANOV.
THE EFFECT OF TREHALOSIS ADDITION ON FERTILIZATION CAPACITY OF
FROZEN RAM SEMEN
Riha, Ľ., Apolen, D., Pivko, J., Kubovičová, E., Grafenau, P., *Lukáč, N.
Research Institute Of Animal Produktion Nitra
*Slovak Agricultural University, Nitra, Slovak Republic
Abstrakt
V našich experimentoch
sme sa zamerali na otestovanie vplyvu prídavku rôznych
koncentrácií trehalózy ( 0, 25, 50, 75 a 100 % ) na úkor glukózy, do žĺtkovo – citrátového
riedidla na fertilizačnú kapacitu zmrazeného – rozmrazeného semena baranov. Rozmrazené
inseminačné dávky sme analyzovali pomocou CASA metódy, kde sme hodnotili spermie
rýchle s lineárnym progresívnym pohybom, spermie pomalé s nelineárnym progresívnym
pohybom, spermie neprogresívne s lokálnou pohyblivosťou a nepohyblivé spermie. Výsledky
našich experimentov ukázali, že pre zmrazovanie semena baranov sa javí ako optimálna
kombinácia 50 % glukózy a 50 % trehalózy, kedy sme zaznamenali vysoko preukazný ( P <
0,001 ) rozdiel ako v celkovej motilite, tak aj v progresívnej motilite (64,67 % resp. 45,01 %).
Výsledky našich experimentov poukázali tiež na to, že úspešnosť zmrazovania je závislá tiež
na prídavku 4 % - glycerolu do riedidla po uplynutí ekvilibračnej doby tesne pred mrazením.
Kľúčové slová: fertilizačná kapacita semena, ekvilibračná doba, motilita spermií, trehalóza
Úvod
Inseminácia oviec sa nezaobíde bez konzervácie baranieho semena. Jednou
z konzervačných metód je zmrazovanie za účelom dlhodobého uchovávania. V súčasnej dobe
zmrazovanie baranieho semena spôsobuje závažné poškodenie spermií, čo zhoršuje jeho
fertilizačnú schopnosť. Viacerí autori popísali poškodenia spermií barana po zmrazenírozmrazení, ktoré znižujú motilitu a fertilizačnú schopnosť semena po umelej inseminácii
(AI). U oviec je vo všeobecnosti úspešnosť gravidity po cervikálnej inseminácii zmrazenýmrozmrazeným semenom nízka (20-40%). Je to spôsobené zložitou anatomickou stavbou
cervixu oviec. Pre úspešný transport spermií na miesto oplodnenia je potrebná dobrá
počiatočná motilita spermií po rozmrazení. Z tohto dôvodu, za účelom ovplyvnenia fertility
po cervikálnej inseminácii,
je potrebné redukovať poškodenia spôsobené zmrazovaním.
Riedidlá semena pre rôzne živočíšne druhy, vrátane morských cicavcov, obsahujú zvyčajne
glukózu alebo fruktózu, vajcový žĺtok a glycerol. Trehalóza je disacharid glukózy, ktorý sa
277
pridáva do riedidiel semena a bolo zistené, že chráni spermie rôznych druhov počas procesu
zmrazovania a ovplyvňuje motilitu spermií po rozmrazení u capov, baranov a býkov. Cieľom
našej práce bolo laboratórnymi testami overiť vplyv prídavku rôznych koncentráciií trehalózy
na fertilizačnú kapacitu zmrazeného semena baranov.
Materiál a metodika
Semeno sme odoberali od plemenných baranov na Ústave chovu oviec v Trenčianskej
Teplej. Odobraté semeno sme posúdili dodržiavajúc zásady STN 466219 a vytvorili sme
heterospermiu, aby sme vylúčili (minimalizovali) vplyv barana. Riedenie odobratého semena
sme vykonávali žĺtkovo – citrátovým riedidlom v pomere 1 : 4, kde sme vytvorili kontrolnú
skupinu bez prídavku trehalózy ( 0 % ) a pokusné skupiny s prídavkom trehalózy (25, 50, 75 a
100%) na úkor glukózy obsiahnutej v žĺtkocitrátovom riedidle. Odobraté semeno sme posúdili
zmyslovo (farba, pach, atď.) a mikroskopicky v zmysle ON 466219. Posúdené semeno sme
riedili žĺtkovo-citrátovým riedidlom tak, aby sme dosiali 100 miliónov aktívnych spermií
v inseminačnej dávke. Nariedené semeno sme následne ekvilibrovali pri teplote 5 0C po
dobu 90 minút. Po uplynutí ekvilibračnej doby sme doplnili do nariedeného semena 4%
glycerolu a magnetickou miešačkou premiešali. Inseminečné dávky sme pripravili
z nariedeného a ekvilibrovaného semena do 0,25 ml pejetiek pomocou automatickej pipety.
Semeno sme zmrazovali v parách tekutého dusíka v zariadení „Plávajúci závesný zmrazovač
„ (f. Minitüb, SRN) po dobu 20 minút a následne uskladnili v tekutom dusíku. Laboratórne
analýzy zmrazených inseminačných dávok sme robili metódou CASA
v „Laboratóriu
kvantifikácie motility a charakteristiky celulárnych a subcelulárnych štruktúr“ na SPU
v Nitre. Z rozmrazenej inseminačnej dávky sme pripravili preparát a na mikroskope Olympus
prepojenom s počítačom sme pomocou počítačového softwéru sme vyhodnotili nasledovné
parametre:
spermie
rýchle
s lineárnym
progresívnym
pohybom,
spermie
pomalé
s nelineárnym progresívnym pohybom, spermie neprogresívne s lokálnou pohyblivosťou a
nepohyblivé spermie (Obrázok 1).
278
Obr. 1 Schématické znázornenie pohybu spermií hodnotené CASA metódou
VCL (curvilinear velocity, µm/s) – krivočiarová rýchlosť; VSL (straight line velocity, µm/s)
– priama rýchlosť, VAP (average path velocity, µm/s) – priemerná dráhová rýchlosť; ALH
(amplitude of lateral head displacement, µm/s) – aplitúda latarálneho prenesenia hlavičky
spermie okolo priemernej dráhy; LIN
(linearity) – priamočiarosť krivočiarovej dráhy,
vyjadená jako VSL:VCL; WOB (wobble) - miera pre kmitanie (osciláciu) aktuálnej dráhy
okolo priemernej dáhy vyjadrená ako VAP:VCL.
Výsledky
Testovanie vplyvu prídavku rôznych koncentrácií trehalózy (25, 50, 75 a 100%) pri
zmrazovaní semena baranov prinieslo zaujímavé výsledky. Výsledky naších experimentov
poukázali na skutočnosť, že motilita, ako aj progresívna motilita spermií baranov po zmrazení
- rozmrazení bola ovplyvnená prídavkom trehalózy.
Aplikácia žĺtkovo-citrátového riedidla s rôznymi koncentráciami trehalózy (25, 50, 75
a 100% pridaná na úkor glukózy) a pridávanie 4% glycerolu po ekvilibrácii semena tesne
pred zmrazovaním (Tab. 1) ukázala, že ako najoptimálnejšia sa javí kombinácia 50%
trehalózy + 50% glukózy, kedy sme zaznamenali vysoko preukazný (P<0,001) rozdiel ako v
celkovej motilite, tak aj v progresívnej motilite.
Pri testovaní prídavku 4% glycerolu pred ekvilibráciou semena (Tab. 2) vo všetkých
skupinách bola v porovnaní s kontrolou, ako celková, tak aj progresívna motilita v skupinách
s prídavkom trehalózy preukazne nižšia (P<0,05 - 0,0001).
279
Tab. 1 Výsledky CASA laboratórnej analýzy zmrazeného – rozmrazeného semena
baranov po pridaní 4% glycerulu po ekvilibrácii semena
Konc.
Motilita Progresívna VAP
trehalózy
%
Motilita %
VCL
VSL
LIN
WOB
ALH
Kontrola
x
36,95
13,34
30,10
55,62
22,63
0,40
0,54
3,16
(0 %)
sd
5,63
2,83
5,16
9,81
4,59
0,06
0,05
0,44
25 %
x
32,92
14,38
42,75
69,88
35,59
0,51
0,61
3,69
sd
5,09
3,57
4,09
7,75
4,02
0,05
0,04
0,39
x
64,67
45,01
53,22
83,83
43,95
0,52
0,63
3,71
sd
3,76
4,46
3,03
4,19
3,73
0,03
0,02
0,33
x
42,69
19,39
58,93
89,10
52,65
0,59
0,66
3,35
sd
5,35
3,42
5,10
9,11
4,79
0,04
0,04
0,33
x
26,24
9,36
51,0
76,75
45,45
0,59
0,66
3,09
sd
5,34
3,27
5,71
6,59
6,01
0,05
0,04
0,64
50 %
75 %
100%
Tab. 2 Výsledky CASA laboratórnej analýzy zmrazeného – rozmrazeného semena
baranov po pridaní 4% glycerulu pred ekvilibráciou semena
Konc.
Motilita Progresívna VAP
trehalózy
%
motilita %
VCL
VSL
LIN
WOB
ALH
Kontrola
x
35,66
20,00
55,08
74,33
45,82
0,61
0,74
7,68
(0 %)
sd
10,73
8,35
5,16
8,52
3,88
0,02
0,03
0,38
25 %
x
27,62
12,39
54,34
69,13
45,36
0,67
0,80
7,34
sd
6,51
4,57
6,50
16,67
4,41
0,13
0,10
0,89
x
20,60
11,92
55,22
77,90
46,44
0,62
0,73
7,63
sd
3,19
3,49
3,08
21,56
3,35
0,14
0,14
1,36
x
18,15
10,92
55,32
68,99
46,26
0,66
0,79
7,29
sd
2,07
1,02
4,27
6,09
5,66
0,03
0,02
0,28
X
25,57
11,54
50,37
65,21
43,81
0,67
0,77
7,02
sd
3,46
2,72
3,13
8,05
2,15
0,09
0,08
0,49
50 %
75 %
100%
Diskusia
Prospešný efekt vplyvu pridania trehalózy do riedidla na životaschopnosť cicavčích
spermií po rozmrazení bola popísaná v mnohých štúdiách (Aisen a kol., 2000; Foote a kol.,
280
1993; Molinia a kol., 1994; Yildiz a kol., 2000; An a kol., 2000; Sztein a kol., 2001) a
štúdie Israeli a kol. (1993) a Conrad a kol. (2000) ukázali, že trehalóza je efektívna aj pri
ochrane vysušených buniek a lipozómov. Ako sa ukazuje, mechanizmy, ktorými trehalóza
chráni bunky pri dehydratácii alebo zmrazení, zahŕňajú jej stabilizujúci účinok na bunkové
proteíny aj tiež na membrány. Podstata mechanizmov však zostáva neznáma a tiež je
popisované aj kolísanie účinkov trehalózy v jednotlivých prácach (Molinia a kol., 1994;
Yildiz a kol., 2000). Storey a kol..(1998) zistili, že trehalóza preukazne ovplyvňujer spermie
myší. Aisen a kol. (2000) popisujú preukazne pozitívny efekt vplyvu trehalózy na
životaschopnosť spermií barana a
zmrazených-rozmrazených
Molinia a kol. (1994) prišli k záveru, že motilita
spermií barana je vyššia v
prítomnosti
sacharózy alebo
trehalózy, v porovnaní s glukózou ak nie je súčasťou riedidla glycerol; zatiaľ čo v prípade, ak
bol glycerol súčasťou riedidla, nepozorovali rozdiely medzi rôznymi typmi cukrov.
K podobnému záveru prišli aj Meszároš a kol. (1992), ktorí zistili, že semeno baranov možno
zmraziť aj bez glycerolu v riedidle s obsahom hlavných komponentov vajcového žĺtka.
Prežívateľnosť a aktivita spermií sa síce znížila, avšak preukazne sa znížil aj výskyt
morfologických zmien Prospešný ochranný efekt prídavku trehalózy do riedidla bol popísaný
tiež pri zmrazených-rozmrazených spermiách psov.(An a kol., 2000).Aj napriek dôkazom o
prospešnom efekte trehalózy, nie všetky štúdie sú vo svojich záveroch zhodné. Chen a
kol..(1993) nezistili preukazný efekt vplyvu trehalózy na prežívanie býčich spermií a Liu a
kol. (1998) zistili, že náhrada časti TCG zmrazovacieho média obsahujúceho vajcový žĺtok
trehalózou alebo sacharózou až do 25% (v:v), nemalo pozitívny efekt v procese zmrazovania
býčich spermií. Uvedená skutočnosť môže byť však spôsobená aj tým, že v týchto prácach
boli použité nízke koncentrácie trehalózy (0,05 a 0,1 M), pretože ako popísali niektorí vyššie
uvedení autori, vysoké koncentrácie trehalózy
mali preukazne ochranný efekt
proti
poškodeniam chladom (An a kol., 2000). Aj napriek kontroverzným názorom viacerých
autorov môžeme záverom, vychádzajúc z našich dosiahnutých výsledkov konštatovať, že
trehalóza má pozitívny a prospešný efet pri zmrazovaní semena baranov, v prípade ak je
pridávaná na úkor glukózy, ktorá je bežne používaná pri príprave riedidiel. Na základe
dosiahnutých výsledkov môžeme tiež konštatovať, že dôležitú úlohu zohráva pridanie
kryoprotektíva (glycerolu) po ekvilibrácii semena, tesne pred samotným zmrazovaním.
Treba však povedať, že nielen prídavok aditíva, ale tiež teplota pri rozmrazovaní
zohrávajú veľmi dôležitú úlohu pri zachovaní životaschopnosti baraních spermií. Ako
uvádzajú Nur a kol. (2003) percento defektov akrozómov a iných morfologických defektov sa
281
preukazne znížilo, ak boli pejetky rozmrazované pri 70 0C 5 sekúnd v porovnaní s 37 0C 30
sekúnd.
Záver
Záverom, na základe výsledkov našich experimentov
môžeme konštatovať, že celková
motilita, ako aj progresívna motilita spermií baranov po zmrazení-rozmrazení bola
ovplyvnená prídavkom trehalózy. Pri aplikácii žĺtkovo-citrátového riedidla sme najlepšie
výsledky zaznamenali pri kombinácii 50% trehalózy + 50%
glukózy a pridávaní 4%
glycerolu po ekvilibrácii semena tesne pred zmrazovaním.
Literatúra
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Aisen EG, Alvarez HL, Venturino A, Garde JJ. Effect of trehalose and EDTA on cryoprotective action
of ram semen diluents. Theriogenology 2000 53:1053-1061.
An TZ, Iwakiri M, Edashige K, Sakurai T, Kasai M. Factors affecting the survival of frozen-thawed
mouse spermatozoa. Cryobiology 2000 40:237-249.
Conrad PB, Miller DP, Cielenski PR, de Pablo JJ. Stabilization and preservation of Lactobacillus
acidophilus in saccharide matrices. Cryobiology 2000 41:17-24. .
Foote RH, Chen Y, Brockett CC, Kaproth MT. Fertility of bull spermatozoa frozen in whole milk
extender with trehalose, taurine, or blood serum. DJ Dairy Sci 1993 76:1908-1913.
Chen Y, Foote RH, Brockett CC. Effect of sucrose, trehalose, hypotaurine, taurine, and blood serum on
survival of frozen bull sperm. Cryobiology 1993 30:23-31
Israeli E, Shaffer BT, Lighthart B. Protection of freeze-dried Escherichia coli by trehalose upon
exposure to environmental conditions. Cryobiology 1993 30:519-523.
Liu Z, Foote RH, Brockett CC. Survival of bull sperm frozen at different rates in media varying in
osmolarity. Cryobiology 1998 37:219-230.
Meszároš, P., Gamčík, P.: Štúdium možnosti zmrazovania semena baranov v riedidle bez glycerínu.
Veterinářství, 1992, 62 (10), s. 377-378.
Molinia FC, Evans G, Maxwell WMC. Effects of monosaccharides and disaccharides in Tris-based
diluents on motility, acrosome integrity and fertility of pellet frozen ram spermatozoa. Anim Rep Sci
1994 36:113-122.
Nur, Z., Dogan, I., Squilu, M.K., Ak, K.: Effect of different thawing procedures on the quality of bull
semen. Rev. Méd. Vet., 2003, 154, 7, s. 487-490.
Storey BT, Noiles EE, Thompson KA. Comparison of glycerol, other polyols, trehalose, and raffinose
to provide a defined cryoprotectant medium for mouse sperm cryopreservation. Cryobiology 1998
37:46-58.
Sztein JM, Noble K, Farley JS, Mobraaten LE. Comparison of permeating and nonpermeating
cryoprotectants for mouse sperm cryopreservation. Cryobiology 2001 42:28-39.
Yildiz C, Kaya A, Aksoy M, Tekeli T. Influence of sugar supplementation of the extender on motility,
viability and acrosomal integrity of dog spermatozoa during freezing. Theriogenology 2000 54:579585.
282
VÝZNAM METABOLICKÉHO PROFILOVÉHO TESTU VO VZŤAHU K ZDRAVIU
A PRODUKCII
THE ROLE OF METABOLIC PROFILE TEST IN RELATION TO HEALTH AND
PRODUCTION
Schneidgenová, M., Kováčik, J.
Katedra fyziológie živočíchov, Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre
Abstract
Good health status of animal is important condition for achievement and keeping of
high utility. The aim of our experiments was to analyze some metabolic parameters dairy
cattle´s blood in agricultural enterprises Žiar, Mariková a Naháč.
It was observed that
metabolic parameters of mineral profile (Na, K) which we analyzed respond to physiological
interval in all farms. At the some time we determined that concentration of glukose in blood
serum was in the physiological interval, too. The higher concentration of cholesterol in dairy
cattle´s blood was observed in agricultural enterprises Mariková a Naháč but in the middle
lactation.
Úvod
Premena látok (metabolizmus) je základným prejavom života vôbec. Prijaté látky
organizmus využíva na výstavbu svojho tela, na zabezpečenie vnútorného prostredia,
energetické deje, rozmnožovanie, výmenu informácií s vonkajším prostredím. Aby mohli
v živých organizmoch prebiehať metabolické deje, musia sa prijaté látky neprestajne
premieňať- tvoriť a odbúravať. Premena látok sú zložité chemické deje, ktoré sú časovo
i priestorovo zosúladené zložitými enzýmovými procesmi (Paulov, 1980). V praxi sa dosť
často stretávame s metabolickými poruchami, hlavne pri vysokoúžitkových dojniciach
(Novák, 2003). Tieto poruchy sú zapríčinené viacerými faktormi, ako napr. skrmovaním
závadných (plesnivých, kyslých) objemových krmív, nesprávnym zložením kŕmnej dávky,
vysokým podielom jadrových krmív, čo má za následok vytvorenie nestability bachorového
prostredia. Tým dochádza k zníženému rozmnožovaniu mikroorganizmov, ktoré v bachore
produkujú mikrobiálnu bielkovinu, sacharidy premieňajú na kyselinu octovú, propiónovú,
maslovú, enzýmy a vitamíny.
Zavádzaním industrializačných prvkov do technológie chovu hovädzieho dobytka,
najmä dojníc, sa zvyšuje efektívnosť živočíšnej výroby (Beseda, 1990). V tomto procese však
vzniká nekompromisná požiadavka dôsledne rešpektovať biologické potreby organizmu
283
v záujme udržania jeho vysokej produkcie. V opačnom prípade dochádza k metabolickým
poruchám alebo k tzv. produkčným chorobám. Metabolické poruchy môžu prebiehať skryte
(latentne) najmä v začiatočnom období píše Fečková (2001), spôsobujú však vážne
ekonomické straty na úžitkovosti, zhoršujú využiteľnosť krmiva, negatívne ovplyvňujú
reprodukčný proces, životaschopnosť mláďat, neskoršie klinické štádium má už zreteľné
prejavy a sprevádza ho aj hynutie, prípadne núdzové zabitie. Metabolický profilový test
(MPT)
je
významná
diagnostická
metóda
na
odhaľovanie
predklinických
štádií
metabolických porúch, a to najmä v chovoch dojníc (Kantíková a Balážik, 2003). Umožňuje
kontrolu zdravia a včasné odhalenie porúch metabolizmu (Slanina a Beseda 1992), odhalenie
rôznych endogénnych záťaží organizmu ešte pred klinickým prejavom ochorenia (Novanská,
1990), odhalenie príčin neadekvátnej úžitkovosti, poruchy vo výžive a utilizácii živín ako aj
niektoré toxické vplyvy, najmä na parenchymatózne orgány (Slanina et al., 1985).
Materiál a metodika
Dojnice sme sledovali v troch poľnohospodárskych podnikoch a to: PD Žiar, PD
Mariková a PD Naháč. Vybrané dojnice boli klinicky zdravé, na 3- 4 laktácii a rozdelené do
troch skupín podľa fyziologického stavu. V každej skupine bolo po päť kusov dojníc.
•
I. skupina- zasušené (4 týždne pred otelením)
•
II. skupina- postpartálne obdobie (4 týždne po pôrode)
•
III. skupina- v strede laktácie (4 mesiace po pôrode)
Krv pre laboratórne spracovanie krvného séra sme získali punkciou vena jugularis do troch
hodín po rannom kŕmení. Zachytávala sa priamo do označených centrifugačných skúmaviek.
Centrifugáciou zrazenej krvi pri 3000 ot.min-1 po dvoch hodinách po odbere sme získali krvné
sérum, v ktorom sme stanovili jednotlivé biochemické ukazovatele: sodík, draslík, glukóza
a cholesterol využitím biochemického analyzéra Microlab 300.
Výsledky a diskusia
Výsledky biochemických parametrov sú spracované v tabuľkách 1, 2 a 3. V prvom PD
Žiar (tabuľka 1) sa hodnoty všetkých sledovaných ukazovateľov (sodík, draslík, glukóza
a cholesterol) v krvnom sére vo všetkých skupinách pohybovali v referenčnom rozmedzí, ako
uvádzajú Slanina et al. (1992). Referenčné rozpätie u sodíka v krvnom sére je 135- 150
mmol.l-1, u draslíka je 4,0- 5,8 mmol.l-1, u glukózy je 2,2- 4,1 mmol.l-1 a referenčné
rozmedzie u cholesterolu je 1,5- 5,2 mmol.l-1
284
Tab. 1 Biochemické parametre
Tab. 2 Biochemické parametre
podniku PD Žiar
II
III
podniku PD Mariková
podniku PD Naháč
147 4,75 2,90
1,38
Gluk. Chol. skupina Na K Glu Chol
145 4,55 4,00 2,78
146 4,95 3,00 2,64
149 4,45 3,30
1,68
148 4,85 3,10 3,68
146 4,95 2,90
0,95
148 4,75 3,30
2,24
147 4,45 3,10 3,04
147 4,70 3,80 2,94
149 4,55 3,10
1,42
144 4,95 3,10 2,96
148 4,75 3,70 2,61
147 4,70 3,90
2,76
147 4,40 3,00 3,50
148 4,80 4,00 4,30
145 4,60 3,60
2,15
149 4,20 2,90 3,73
149 4,65 3,90 4,63
147 4,80 3,70
2,50
150 4,50 3,70
0,99
145 4,55 3,40 4,68
147 4,60 3,90 3,54
148 4,50 3,70
0,52
145 4,80 3,10 3,91
147 4,70 4,00 4,22
147 4,80 3,50
6,33
147 4,85 3,20 4,51
150 4,65 3,50 5,33
147 4,70 4,00
7,15
148 4,75 3,10 4,31
149 4,70 4,10 6,34
149 4,85 3,50
7,67
147 4,60 3,40
5,39
147 4,85 3,20 4,60
149 4,70 3,30 4,30
146 4,90 3,90
4,05
146 4,85 3,10 4,51
146 4,60 4,20 2,94
skupina Na K
I
Tab. 3 Biochemické parametre
Gluk. Chol.
skupina Na K
I
II
III
148 4,75 2,90 2,76
143 4,35 2,90 4,83
144 4,60 3,20 4,37
148 4,70 3,80 2,88
I
II
III
146 4,60 4,30 3,13
146 4,70 3,60 7,02
146 4,60 3,90 6,58
V PD Mariková (tabuľka 2) boli sledované hodnoty sodíka, draslíka aj glukózy vo
všetkých troch skupinách v referenčných rozmedziach, v súlade s tým, ako udávajú Slanina et
al.(1992). V prvej a druhej skupine bola zistená mierne znížená hladina cholesterolu
u niekoľkých dojníc a v tretej skupine bola zaznamenaná mierne zvýšená hladina cholesterolu
u všetkých dojníc.
V treťom sledovanom podniku v PD Naháč (tabuľka 3) bola zistená zvýšená hladina
cholesterolu u jednej dojnice v druhej skupine a u troch dojniciach v tretej skupine. Ostatné
sledované parametre, teda parametre sodíka, draslíka glukózy v krvnom sére sa pohybovali
v referenčných rozmedziach podľa Slaninu et al. (1992).
Záver
Poruchy metabolizmu, najmä vysoko produktívnych zvierat, sa výrazne zúčastňujú na
celkových stratách v živočíšnej výrobe. Ich výskyt s rozvinutými klinickými príznakmi je
menší, väčšinou prebiehajú v latentných formách, ktoré sú z ekonomického hľadiska
285
mimoriadne závažné. Metabolický profilový test umožňuje zisťovať zmeny metabolických
procesov a zabrániť tým vzniku klinických foriem ochorení.
Vo všetkých sledovaných podnikoch sa parametre minerálneho profilu, konkrétne
hodnoty sodíka a draslíka, pohybovali v rámci referenčných noriem. Zároveň sa
v referenčných normách pohybovali aj stanovené hodnoty glukózy vo všetkých troch
sledovaných družstvách. V PD Mariková a PD Naháč bola zistená zvýšená koncentrácia
cholesterolu u dojníc v strede laktácie.
Literatúra
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
BESEDA, I. 1990. Nové aspekty štúdia metabolických porúch hovädzieho dobytka profilovými testami.
Bratislava : SAV, 1990. s. 13. ISBN 80-224-0146-3.
FEČKOVÁ, M. 2001.Hodnotenie vybraných ukazovateľov metabolického profilu djníc v podmienkach PD
Močenok. Diplomová práca. 2001, s. 7.
KANTÍKOVÁ, M. – BALÁŽIK, T. 2003. Diagnostika metabolických porúch alebo prevencia je vždy
lacnejšia. In Slovenský chov, roč. 8, 2003, č. 7, s. 39-40.
NOVANSKÁ, M. 1990. Dynamika zmien ukazovateľov metabolických testov dojníc a ich príčiny.
Dizertačná práca. Nitra : VŠP. 1990. 115 s.
NOVÁK, M. 2003. Aplikácia nových prípravkov firmy Medipharm Slovakia pri metabolických poruchách
dojníc v praxi. In Slovenský chov, roč. 8, 2003, č. 5, s. 20.
PAULOV, Š. 1980.Fyziológia živočíchov a človeka. Bratislava: SPN. 1980, 648 s.
SLANINA, Ľ. et al. 1985. Klinická diagnostika vnútorných chorôb hospodárskych zvierat. 3. vyd.
Bratislava : Príroda. 1985. 493 s.
SLANINA, Ľ. – BESEDA, I. 1992. Metabolický profil hovädzieho dobytka vo vzťahu k zdraviu a produkcii.
2 vyd. Bratislava : ŠVS SR. 1992, ISBN 80-71-48-001-0.
ORTUŤOU VYVOLANÉ ZMENY V SEMENNÍKOCH POTKANOV IN VIVO
MERCURY INDUCED ALTERATIONS IN RAT TESTES IN VIVO
Slivková J., Massányi P., Lukáč N., Kováčik J., Toman R.1
Katedra fyziológie živočíchov, Fakulta biotechnológie a potravinárstva SPU v Nitre,SR
1)Katedra veterinárnych disciplín, Fakulta agrobiológie a potravinových zdrojov SPU v Nitre,SR
Abstract
In this study effects of mercury administration on the testicular structure of adult rats
were evaluated. Wistar rats received mercury (as HgCl2) in single intraperitoneal dose 20 mg
HgCl2 (group A), 10 mg HgCl2 (group B) and 5 mg HgCl2 (group C) per kilogram of body
weight and were killed after 48 hours following mercury administration. After the preparation
of histological samples the results were compared with control group (K).
Qualitative analysis showed that the shape of seminiferous tubules was typically oval, without
degenerative alterations. On the other hand, these observations revealed dilatation of blood
vessels in interstitium, undulation of basal membrane and occurrence of empty spaces in
286
germinal epithelium. Decreased relative volume of germinal epithelium, increased relative
volume of interstitium and increased occurrence of apoptosis suggests damaged interstitium
and revealed occurrence of edemas. The relative volume of seminiferous tubules showed
higher luminization. Also other evaluated criteria demonstrated significant differences
between control group and experimental groups. This study reports a negative effect of
mercury on the structure and function of testis.
Úvod
Ortuť patrí spolu s kadmiom a olovom k tým ťažkým kovom, ktorým sa vo svete
venuje zvýšená pozornosť kvôli ich karcinogénnym, mutagénnym a teratogénnym účinkom.
Živé organizmy nedisponujú homeostatickým mechanizmom, ktorý by reguloval koncentráciu
ortuti v tkanivách. Z tohto dôvodu sa ortuť zaraďuje medzi tzv. abiogénne prvky. Zároveň je
to nešpecifický jed , ktorý poškodzuje rôzne enzýmové systémy a tkanivá (Melicherčík
a Melicherčíková, 1997). Medzi orgány, ktorých základom sú tkanivá zložené z viacerých
typov buniek, patria samčie pohlavné orgány. Práve vzhľadom na rozmanitosť buniek tkanív
samčích pohlavných orgánov, nám môžu reprodukčné orgány slúžiť ako citlivé indikátory
negatívnych vplyvov exogénneho alebo endogénneho prostredia.
Materiál a metodika
V pokusoch sme použili pohlavne dospelých samcov (n=15) potkana laboratórneho
Wistar, vo veku minimálne 6 mesiacov. Zvieratá boli rozdelené do štyroch skupín. Skupine A
(n=4) sme aplikovali intraperitoneálne (i.p.) ortuť (20 mg.kg-1 živej hmotnosti) vo forme
chloridu ortuťnatého (HgCl2), skupine B (n=3) v koncentrácii 10 mg HgCl2 .kg-1 živej
hmotnosti, a v skupine C sme 3 potkanom aplikovali i.p. ortuť v koncentrácii 5 mg HgCl2.kg-1
živej hmotnosti. Posledná skupina – K (n=5) nám slúžila ako kontrola bez podania ortuti.
Ortuť sme riedili do požadovanej koncentrácie fyziologickým roztokom. Po 48 hodinách sme
potkanov usmrtili a odobrali sme vzorky obličiek na histologické a morfometrické analýzy.
Vzorky sa fixovali v 10% formalíne, odvodnili vo vzostupnom rade alkoholu a zaliali do
parafínu. Sériové rezy o hrúbke približne 10µm sme ukladali na odmastené a označené
podložné sklíčka. Po narezaní sa rezy farbili prehľadným farbením hematoxylín – eozínom
podľa platných metodík. Po zafarbení sa vzorky zamontovali do solakrylu a výsledkom sú
trvalé histologické preparáty vhodné na hodnotenie svetelným mikroskopom.
Na
histologických
preparátoch
semenníkov
sme
subjektívne
zhodnotili
ich
mikroskopickú stavbu rovnako ako aj stavbu semenotvorných kanálikov, intersticiálneho
287
tkaniva, Leydigových buniek, výskyt krvných kapilár v interstíciu, množstvo epitelu
kanálikov a priebeh spermatogenézy.
Na základe morfometrických kritérií sme v semenníku sledovali a kvantifikovali
nasledujúce parametre:
1. relatívny objem (%) semenotvorného epitelu, interstícia a lúmenu
2. priemer (µm) semenotvorného kanáliku a lúmenu semenotvorného kanáliku
3. počet jadier na konštantnú plochu
4. výšku (µm) semenotvorného epitelu
Dosiahnuté výsledky sme štatisticky zhodnotili použitím PC programu Excel. Ďalej sme
vypočítali rozdiely medzi skupinami F –testom. Preukaznosť sme hodnotili na hladine P <
0,05.
Výsledky
Po intraperitoneálnej aplikácii troch rôznych koncentrácií ortuti vo forme HgCl2 sme u
potkanov zistili hodnoty sledovaných parametrov. Výsledky získané zo všetkých štyroch
skupín (K, A, B, C) sú uvedené a štatisticky vyhodnotené v tabuľke č.1 a v tabuľke č.2.
Tabuľka 1 – Relatívny objem (%)
semenotvorného epitelu,
interstícia a lúmenu
epitelu a počtu jadier
plochu
* P < 0,05
Tabuľka 2 – Hodnotenie priemeru
semenotvorného kanálika, priemeru
lúmenu kanálika, výšky semenotvorného
na
K
A
B
C
Priemer semenotvorného kanálika (µm)
x
271,60
251,65
245,00*
218,67
SD
44,54
42,95
28,18
31,94
Semenotvorný epitel
CV
16,40
17,07
11,50
14,61
x
77, 49
65, 11
71, 08
71, 24
Median
266
238
238
210
SD
5, 00
4, 56
3, 06
2, 68
Priemer lúmenu semenotvorného kanálika(µm)
CV
6, 45
7, 00
4, 31
3, 76
x
135,36
122,15
133,93*
117,13
71, 32
SD
32,55
27,45
22,57
23,39
CV
24,05
22,47
16,85
19,97
Median
136
119
140
112
K
Median
79, 09
A
66, 18
B
71, 69
C
Interstícium
x
5, 84
9, 68
9, 64
10, 25
SD
1, 26
2, 07
2,11
1, 74
x
68,32
69,83
61,00
54,13*
CV
21, 58
21, 38
21,89
16, 98
SD
20,03
16,89
16,34
13,26
Median
5, 56
9, 56
9,93
9, 93
CV
29,32
24,19
26,79
24,50
Median
70
70
56
56
Lúmen
Výška semenotvorného epitelu (µm)
2
x
16,67
25,21
19,28
18,51
Počet jadier na plochu µm
SD
3,90
3,50
2,82
3,15
x
111,60
103,00
100,67
98,33
CV
23,40
13,88
14,63
17,02
SD
6,42
7,53
4,48
8,14
CV
5,75
7,31
4,45
8,28
Median
111
102
101
96
Median
15,69
24,82
19,12
17,65
288
Diskusia
V experimentálnych skupinách sme sledovaním nami hodnotených parametrov zistili
pokles relatívneho objemu semenotvorného epitelu a nárast relatívneho objemu interstícia, čo
naznačuje edematizáciu semenníka. Aj napriek tomu, že je údajov o reprodukčnej toxicite
ortute pomerne málo, vieme, že krvno – semenníková bariéra je pre ortuť priepustná (Lee,
1975). Chowdhury (1982) zistil, že HgCl2 zapríčiňuje degeneráciu semenníkov, bunkovú
deformáciu tak v semenotvorných kanálikoch ako aj v Leydigových bunkách a preukázateľne
aj zníženie hmotnosti semenníkov, a to u viacerých živočíšnych druhov. O pár rokov neskôr
dospel k podobným výsledkom aj Sharma et al. (1996) ktorý tvrdí, že podanie HgCl2
spôsobuje redukciu plodnosti ako aj parametrov ejakulátu u myší.
V prípade najtoxickejšej organickej formy ortuti - metylortuti sa predpokladá, že poškodzuje
spermatogenézu deléciou zárodočných buniek a tak vyvolá závislú apoptózu (Homna –
Takeda et al.,2001). Výsledky viacerých štúdií potvrdzujú cytotoxický účinok ortute na
Sertoliho bunky a zároveň aj jej schopnosť akumulovať sa v intersticiálnych Leydigových
bunkách ako aj v už spomenutých Sertoliho bunkách (Monsees et al., 2000; Ernst et al.,
1991). V súlade s našimi výsledkami sú aj zistenia Marettu et al. (1995), ktorí zistili, že ortuť
už v nízkych dávkach (5 ppm fenylortuti) zapríčiňuje zníženú pohyblivosť spermií a výskyt
abnormálne sa vyvíjajúcich buniek. V prípade vyšších dávok (30 ppm fenylortuti) zistili
výskyt abnormálneho zrenia spermií, zníženie objemu semena a zníženie množstva spermií.
Všetky zistené hodnoty nami meraných parametrov naznačujú, že ortuť má v uvedených
koncentráciách toxický účinok na celkovú štruktúru semenníkov a tým aj na priebeh
spermatogenézy.
Záver
Z dosiahnutých výsledkov v tejto práci môžeme vyvodiť nasledovné závery:
1. Kvalitatívne pozorovania zaznamenali dilatáciu krvných ciev v interstíciu,
unduláciu bazálnej membrány a objavenie sa prázdnych miest v niektorých oblastiach
semenotvorného epitelu.
2. Najvyšší objem semenotvorného epitelu sme pozorovali v kontrolnej skupine. Vo
všetkých pokusných skupinách bol zreteľný pokles relatívneho objem semenotvorného
epitelu, ale v žiadnej skupine nebol preukázaný. Relatívny objem interstícia rovnako ako aj
relatívny objem lúmenu bol nepreukázane vyšší vo všetkých pokusných skupinách. Tieto
výsledky poukazujú na poškodenie a edematizáciu interstícia ako aj na zvýšenú luminizáciu
kanálika.
289
3. Pri hodnotení priemeru semenotvorného kanálika sme zistili znižujúcu sa tendenciu,
ktorá bola preukazná v skupine B. Po podaní ortuti dochádza k preukaznému zvýšeniu
priemeru semenotvorného kanálika v skupine B, ale v skupine A a C sme sledovali tendenciu
zníženej luminizácie kanálika. Výška semenotvorného epitelu vykazovala výrazný pokles po
podaní ortuti a vo všetkých pokusných skupinách sa pohybovala od 68,32 do 54,13 µm.
Preukaznosť bola dokázaná v skupine C. Pri hodnotení počtu viditeľných jadier na sledovanú
konštantnú plochu sme zistili, že v kontrolnej skupine je ich 111,60 ale vo všetkých
pokusných skupinách je počet jadier nižší. Z dosiahnutých výsledkov možno konštatovať, že
aplikované koncentrácie ortuti vo forme HgCl2 majú negatívny efekt na štruktúru a následne
aj na funkciu semenníkov.
Práca bola riešená s podporou projektu APVV – 0299-06 a projektu VEGA 1/2417/05.
Literatúra
Ernst, E., Moller-Madsen, B., Danscher, G.: Ultrastructural demonstration of mercury in Sertoli and Leydig cells
of the rat following methyl mercuric chloride or mercuric chloride treatment. Reprod. Toxicol., 5, 1991, 205209.
Chowdhury A.R., Arora, U.: Toxic effect of mercury on testes in different animal species. Indian J. Physiol.
Pharmacol., 26, 1982, 246-249.
Lee, I.P., Dixon, R.L.: Effects of mercury on spermatogenesis studies by velocity sedimentation and serial
mating. J. Pharmacol. Exp. Therap., 193, 1975, 171-181.
Maretta, M., Marettova, E., Skrobanek, P., Ledec, M.: Effect of mercury on the seminiferous epithelium of the
fowl testis. Acta. Vet. Hung., 43, 1995, 153-161.
Melicherčík, M., Melicherčíková, D.: Bioanorganická chémia.: Chemické prvky a ľudská organizmus.
Bratislava: Príroda, 1997. 188 s. ISBN 80-07-01028-9
Monsees, T.K., Franz, M., Gephardt, S., Winterstein, U., Schill, W.B., Hayatpour, J.: Sertoli cells as a target for
reproductive hazards. Andrologia, 32, 2000, 239-246.
Homma-Takeda, S., Kugenuma, Y., Iwamuro, T., Kumagai, Y., Shimojo, N.: Impairment of spermatogenesis in
rats by methylmercury: involvement of stage- and cell- specific germ cell apoptosis. Toxicology. 169, 2001, 2535.
Sharma, A.K., Kapadia, A.G., Fransis, P., Rao, M.V.: Reversible effects of mercuric chloride on reproductive
organs of the male mouse. Reprod. Toxicol., 10, 1996, 153-159.
KUMULÁCIA ZINKU V TKANIVÁCH A VAJCIACH JAPONSKÝCH PREPELÍC
ZINC KUMULATION IN TISSUE AND JAPANESE QUAIL EGGS
Skalická, M., Naď, P, Koréneková, B.,
Katedra výživy,dietetiky a chovu zvierat, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Košice, SR
Abstract
The effect long – term addition of zinc on quality of Japanese quail eggs and tissues
was investigated. Japanese quails (n=48) were divided into 2 groups. Each group consisted of
24 birds. Group 1 was the control group. In the experimental group G3, Zn was administered
290
daily in form of water solution in dose 12 mg of Zn for one quail. The levels of Zn in tissues
and eggs were evaulate vith method AAS.
Key words: zinc, Japanse quail , egg, tissue
Úvod
V súčasnej dobe sa do popredia záujmu výskumu zaradili esenciálne prvky ako Cr,
Cu, Mo, Se a Zn, ktoré majú mimoriadny význam pre organizmus v rade katalytických,
enzymatických, aktivačných a regulačných procesoch.
Zinok je esenciálny prvok pre
zvieratá. Je súčasťou viacerých biochemických reakcií. Úloha zinku pre metabolizmus
organizmu vyplýva z jeho účasti v štruktúre rozličných enzýmov, dehydrogenázy, aldolázy,
fosfatázy, peptidázy a i. Viac než 70 enzýmov obsahuje zinok. Pri ďalších enzýmoch pôsobí
ako ko-faktor (Zowczak-Drabarczyk et al., 2004).
Jeho resorpcia je závislá od viacerých faktorov napr. vek, vzájomný pomer s inými
elementami. Dokázalo sa to pri ošípaných, hydine a psoch. Deficit zinku sa pozoroval aj
u hydiny. Nedostatok zinku narušuje aj reprodukciu. Narušená osteogenéza ako dôsledok
karencie zinku sa zistila pri hydine (Kottferová, 1996).
Cieľom experimentu bolo sledovanie hladín zinku v tkanivách, v bielku, žltku a
škrupine vajec Japonských prepelíc.
Materiály a metódy
V experimente boli použité Japonské prepelice v počte 48ks, rozdelené do 2 skupín po
24ks. Skupina K bola kontrolná. V skupine 2 bol zinok denne podávaný vo forme vodného
roztoku (ZnSO4.6H2O) v dávke 12 mg na jednu prepelicu. Prepelice boli kŕmené kompletnou
kŕmnou zmesou HYD –10.
Kŕmna zmes a voda boli podávané ad libitum. Podmienky
experimentu boli v súlade s etickými požiadavkami. Biologický pokus trval 58 dní. Vzorky
boli spracované mikrovlnným rozkladom a analyzované na prítomnosť Zn na AAS podľa
metodiky, ktorú uvádza Kocourek, (1992). Štatistické
analyzované
Studentovým
vyhodnotenie výsledkov bolo
t - testom v programe Microsoft Excel 7,0 na hladine
významnosti P ≤ 0,05; P ≤ 0,01 a P ≤ 0,001 medzi skupinami.
Výsledky a diskusia
V kontrolnej skupine na 50.deň sme zistili množstvo zinku v sledovaných tkanivách
a vo vajciach Japonských prepelíc. V prsnej svalovine 29,506 mg.kg-1, v stehennej svalovine
291
51,076 mg.kg-1 , v pečeni 50,607 mg.kg-1 , vo vaječnom bielku 26,118 mg.kg-1 , vo vaječnom
žĺtku 69,388 mg.kg-1 a v škrupine 76,505 mg.kg-1 zinku.
Zn je nevyhnutný pre rast, operenie, rast dlhých kostí. Jeho množstvo v kŕmnej diéte
nemalo by byť menej ako 25 mg.kg-1. Sahin and Kucuk (2003) navrhli, že suplementácia 60
mg Zn/kg KZ chráni prepelice
pred negatívnymi účinkami tepelného stresu. Na druhej
strane pri podaní vysokej dávky Zn sa organizmus homeostatickým mechanizmom vyrovnáva
so zvýšeným príjmom Zn.
V experimentálne skupine s dlhodobou aplikáciou zinku sme na 50. deň pozorovali,
že množstvo Zn štatisticky významne sa zvýšil v bielku, žĺtku, v škrupine vajec a v prsnej
svalovine Japonských prepelíc v porovnaní s kontrolnou skupinou. Štatisticky významne sa
znížili hladiny Zn v pečeni a v stehennej svalovine (tab.1) Nami zistené množstvo Zn v žĺtku
vajec (69,388 mg) z kontrolnej skupine bol vyšší ako uvádza Baumgartner a kol. (1999),
ktorí zistili priemerný obsah zinku v žĺtku vajec Japonských prepelíc 46,02 mg.
Prepeličie vajcia sú bohaté na minerálne látky a vitamíny. Obsahujú 1,1 % popolovín,
z minerálnych látok na 100 g vaječnej hmoty 59 mg vápnika, 220 mg fosforu, 3,8 mg železa,
11,6 mg horčíka, 0,11 mg medi a 1,46 mg zinku. Z vitamínov obsahujú prepeličie vajcia v
100 gramoch vaječnej hmoty 300 m.j. vitamínu A, 0,10 mg vitamínu PP, 0,12 mg vitamínu
B1, 0,85 mg vitamínu B2, 0,086 mg voľnej a 0,14 mg viazanej kyseliny listovej a 0,13 mg
vitamínu B6. Z amínokyselín si zasluhuje pozornosť vysoký obsah metionínu, cysteínu,
asparagínu, treonínu, serínu, glutamínu, izoleucínu a leucínu.
Mbe a kol, (2003) uvádzajú, že vysoké hladiny Ca redukujú Zn absorpciu u dospelých
prepelíc, ktorý sa prejavuje u vajec. Zistili, že dlhotrvajúci prídavok Zn spôsobil zníženie
hladín Ca v škrupine.
Množstvo zinku (mg.kg –1 ) v tkanivách a vajciach japonských prepelíc
Hladiny
zinku
kontrola
Zn
n
x
sd
xmax
n
x
sd
xmax
50.deň
prsná
stehenná
svalovina svalovina
12
12
29,506
51,076
5,575
4,212
37,360
58,440
12
12
57,971** 30,584*
17,065
15,454
90,458
59,970
pečeň
bielok
žĺtok
škrupina
12
50,607
11,087
61,200
12
44,497
10,970
50,887
12
26,118
1,707
28,420
12
71,089***
4,965
77,930
12
69,388
20,356
98,050
12
53,840**
6,867
61,750
12
76,505
8,976
89,590
12
50,820**
3,369
55,654
* štatistická významnosť na hladine P ≤ 0,05;
** štatistická významnosť na hladine P ≤ 0,01;
*** štatistická významnosť na hladine P ≤ 0,001.
292
Vysoký obsah Zn spôsobuje rozličné anémie organizmu. Nízke hladiny Fe dôsledku
pridania vysokej dávky Zn sú redukované nízkou dávkou Ca alebo vysokou dávkou vitamínu
D.
Hmotnosť vajec je veľmi variabilná a pri nosivých plemenách Japonských prepelíc je
v priemere 10,16g Hmotnosť vajec je na začiatku znášky nižšia a je silne závislá od výživy.
V pomere k hmotnosti tela znáša prepelica veľké, približne 10 gramové vajcia, čo predstavuje
7,8 % zo živej hmotnosti. Nami aplikovaný prídavok zinku neovplyvnil priemernú hmotnosť
vajec Japonských prepelíc, nakoľko v kontrolnej skupine
bola na 50. deň
10,00 g
a v experimentálnej skupine s prídavkom zinku bola priemerná hmotnosť vajec 10,11 g.
Záver
Z pokusu vyplýva, že prídavok
Zn nebol pravdepodobne dostatočne využitý
organizmom Japonských prepelíc a došlo ku nestabilite zinkovej väzby v tráviacom trakte.
Preto je vhodné v praktickej výžive zvierat použiť zinok v organickej väzbe, ktorá zinok
v nezmenenej forme dopraví do cieľového orgánu. Pomerne veľká časť mikroprvkov, ktoré
zvieratá prijímajú krmivami, nie je využitá a neplní svoju biologickú funkciu.
Literatúra
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
BAUMGARTNER, J. KONČEKOVÁ, Z., CSUKA, J., BENKOVA,J., ŠÁRNIKOVÁ K.B.,
SIMEONOVOVÁ,J.: Šľachtenie prepelice japonskej na obsah žĺtkového cholesterolu. In: Zborník referátov
z vedeckej konferencie s medzinárodnou účasťou „Genetika a morfogenetika v chove HZ“ . Nitra : VÚŽV,
1999: 158 .
MASSANYI, P., UHRIN, V., TOMAN, R., KOVACIK, J., BIRO, D.: Histological changes in the oviduct
of rabbits after administration of cadmium, J. Animal Feed Sci., 8, 1999, 255-261.
MBE,I.,RAPP, C., BAIN, MM., NYS, Y.: Supplementation of a corn – soybean meal diet with manganese,
copper, and zinc from organic or inorganic sources improves eggshell quality in aged laying hens. Poult.
Sci., 2003, 82, 1903-1913.
KOCOUREK, 1999, Method's of analysis residues substance in food. (1992) Praha, Czech republic
KOTTFEROVÁ J.: Residual contaminants of cadmium in relation to environmental protection, health and
quality of food products, Dissertation work, Košice, 1996.
SAHIN, K., KUCUK., O.: Zinc supplementation alleviates heat stress in Japanese quail, J. Nutrition., 133,
2003, 2808 –2811.
STOEPPLER, M. 1991 In: Merian E.: Metals and their compounds in the environment. VCH Weinhem- NY
- Basel - Cambridge, 803-852
ZOWCZAK-DRABARCZYK, M., TORLINSKA, T., ISKRA, M., MIELCARZ, G., MATYLLA, G.,
TORLINSKI, L.: Serum zinc concentration in patients colorectal cancer, Trace Elelements and Electrolytes
21, 2004, 236-239.
Práca vznikla za podpory projektu VEGA 1/2410/05
293
ZMENY KVALITATÍVNYCH UKAZOVATEĽOV BRAVČOVÉHO MÄSA POČAS
DLHODOBÉHO MRAZIARENSKÉHO USKLADNENIA
THE CHANGES OF NUTRITIONAL CHARACTERISTICS OF PORK MEAT DURING
THE LONG PERIOD OF FREEZING STORAGE
Sopková, D.
Ústav fyziológie, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Komenského 73, 041 81 Košice, SR
Abstract
Freezing is one of the most cautious ways of meat preservation. It enables long-term
storage without application of chemical additives and significant side-effect. However,
criteria of rozen meat have not been unambigously determined.
The changes in the nutritional characteristics of pork meat (m. longissimus dorsi) of
normal quality, and that of altered quality (PSE: pale, soft, exudative) were observed in
dependence on the length of freezing storage. The aim was to deepen and to make objective
the knowledge on the effect of freezing process on the parameters of quality of pork meat.
During freezing storage, the differences in the contents of total proteins and
aminoacids between the PSE and control meat were eliminated, the values of valine, lysine,
leucine, custine, histidine and arginine significantly decreased, probably in the form of free
aminoacids due to the elevated losses of meat juice after defreezing.
Úvod
Pre zabezpečenie plynulého zásobovania trhu mäsom a mäsovými výrobkami je
nevyhnutná konzervácia a úschova potravín, ktorá v plnom rozsahu zachováva alebo len
minimálne mení vlastnosti potravín. Z tohoto dôvodu je v popredí využívanie mraziarenskej
techniky. Zmrazovanie potravín a ich uchovávanie v pásme teplôt pod -18 oC je veľmi
výhodný spôsob konzervovania potravín, pretože nie je nutné aplikovať chemické prísady
a potraviny si po rozmrazení uchovávajú svoje vlastnosti, ale kritériá kvality zmrazeného
mäsa nie sú jednoznačne stanovené. Hodnotenie kvality zmrazeného mäsa sa vykonáva
organolepticky a fyzikálno-chemickými metódami.
Počas skladovania mäsa alebo roztokov izolovaných
proteínových preparátov
v zmrazenom stave dochádza k bočnej (side-to side) agregácii molekúl v prípade myozínu
a aktomyozínu a agregácii alebo intramolekulárnej transformácii v prípade globulárnych
proteínov (Matsumoto, 1990; Iguchi a kol.1991; Pástorová a kol. 1999, 2000). Toto vedie k
zmenám v extrahovateľnosti, enzymatickej aktivity, viskozity a funkčných vlastností týchto
294
proteínov. Zníženie extrahovateľnosti v soliach rozpustných frakcií (v podstate myofibrilárne
proteíny) a ATP-ázovej aktivity sú vo všeobecnosti považované za primárne indikátory
zmien v dôsledku zmrazenia (denaturácia), pričom prvá z nich je považovaná za relatívnu
mieru zmien vyskytujúcich sa v mäse počas skladovania pri negatívnych teplotách
(Matsumoto, 1990; Partman, 1997).
V práci sledujeme
vplyv mraziarenských teplôt a dlhodobého mraziarenského
skladovania na hodnoty aminokyselín s cieľom prehĺbiť poznatky o nutričných parametroch
mrazeného bravčového mäsa.
Materiál a metódy
Materiál bol odoberaný na bitúnku, kde sa vyselektovalo dvanásť ošípaných
s atypickým priebehom zrenia a následnými kvalitatívnymi zmenami mäsa PSE (pokusná
skupina), a dvanásť ošípaných s normálnym priebehom zrenia mäsa (kontrolná skupina). Po
porážke zvieraťa a 24 hodinovom chladení v chladiarni pri 4 oC, sme odoberali materiál na
rozrábkovej linke vykostením karé priamo z bravčových polovičiek.
Bravčové karé sa rozdelilo na dvanásť častí, jedenásť z nich bolo hlboko zmrazených
prúdom chladeného vzduchu v zmrazovacích tuneloch pri -40oC, prúdení vzduchu 4-6 m.s-1
a uložených do mraziarenského skladu na dlhodobé uskladnenie pri teplote -18 oC, relatívnej
vlhkosti 90-95%. Jedna vzorka bola určená na laboratórne vyšetrenia hneď po odobratí
materiálu ako čerstvá surovina. Vzorky bravčového karé, skladované v mraziarni boli
pravidelne v mesačných intervaloch z mraziarne vyberané a spracovávané.
Vzorky pre stanovenie aminokyselín boli spracované kyslou hydrolýzou. Mäsový
homogenát, prenesený do infúznych fliaš bol zaliaty 6N HCl. Hydrolýza prebiehala v sušičke
pri 1100C ± 30C po dobu 24 hodín (Dičáková, 2005).
Aminokyseliny boli analyzované klasickou metódou stĺpcovej chromatografie na
ionexoch automatickým analyzátorom aminokyselín AAA T 339. Zastúpenie jednotlivých
aminokyselín bolo vyjadrené v g.kg-1 a v mol.kg-1 celkového množstva aminokyselín.
Matematicko–štatistické porovnanie jednotlivých parametrov medzi pokusnou
a kontrolnou skupinou bolo robené Studentovým T-testom. Na vyhodnotenie dynamiky zmien
jednotlivých testovaných parametrov v priebehu 12 mesačného mraziarenského skladovania
sme použili test ANOVA a na porovnávanie kontrastov v rámci mesiacov TUKEY´S test.
295
Výsledky
V mrazenom mäse medzi porovnávanými skupinami sme zistili:
•
porovnaním strát mäsovej šťavy - vysoko signifikantne (P<0,001) väčšie straty
mäsovej šťavy v
PSE mäse po prvom mesiaci mraziarenského skladovania
a (P<0,01) po druhom mesiaci skladovania, v priebehu ďalších mesiacov sa rozdiely
v množstve uvolnenej mäsovej šťavy medzi PSE a kontrolným mäsom zmenšujú a sú
nesignifikantné
•
rozdiely v obsahu vody - medzi mrazeným PSE a kontrolným mäsom, na hladine
významnosti (P<0,01) konštatujeme po 1., 2. a 3. mesiaci skladovania. Po 4., 5. a 6.
mesiaci je už nižší obsah vody v PSE mäse menej signifikantný (P<0,05) a od
siedmeho mesiaca sa obsah vody v sledovanom mäse takmer vyrovnáva a rozdiely
napriek neustálemu poklesu sú štatisticky nevýznamné
•
pomerne vyrovnané hodnoty celkových bielkovín v PSE a kontrolnom mäse
prezentujú len malé rozdiely medzi porovnávanými skupinami, signifikantne vyššie
(P<0,05) hodnoty celkových bielkovín boli v čerstvom PSE mäse v porovnaní
s kontrolnou skupinou a tiež v PSE mäse po prvom mesiaci skladovania. V ďalších
mesiacoch sú rozdiely medzi porovnávanými skupinami štatisticky nevýznamné.
Počas skladovania sledovaním dynamiky zmien v rámci skupín sme zaznamenali:
Zvyšujúce sa percento strát mäsovej šťavy u obidvoch sledovaných skupín v závislosti
od dĺžky mraziarenského skladovania:
•
v PSE mäse signifikantné zvýšenie (P<0,01) sme zistili po 7., 8., 9. mesiaci a vysoko
signifikantné zvýšenie (P<0,001) po 10. a 11. mesiaci mraziarenského skladovania
•
v kontrolnom mäse vysoko signifikantne (P<0,001) stúplo
množstvo uvolnenej
mäsovej šťavy už po piatom mesiaci mraziarenského skladovania a stúpajúcu
tendenciu si udržalo až do konca mraziarenského skladovania.
Obsah vody v PSE a kontrolnom mäse v závislosti od dĺžky mraziarenského skladovania
priamo súvisel a odzrkadľoval zvyšujúce sa straty mäsovej šťavy v priebehu skladovania:
•
v PSE mäse sme zaznamenali signifikantný pokles (P<0,01) obsahu vody v porovnaní
s čerstvou surovinou po štyroch mesiacoch a vysoko signifikantný pokles (P<0,001)
od piatich mesiacov skladovania
•
v kontrolnom mäse
intenzívnejší
pokles obsahu vody, signifikantné zníženie
(P<0,05) už po treťom mesiaci, od štvrtého mesiaca mraziarenského skladovania
vysoko signifikantné (P<0,001) zníženie obsahu vody
296
Hodnoty celkových bielkovín v priebehu mraziarenského skladovania mierne klesali,
predovšetkým v PSE mäse, tento pokles bol však štatisticky nevýznamný.
HODNOTY AMINOKYSELÍN V TESTOVANOM MÄSE
V priebehu 12 mesačného mraziarenského skladovania zaznamenávame:
•
signifikantný pokles u esenciálnych aminokyselín: valínu od 7. mesiaca (P<0,001),
lyzínu od 8. mesiaca (P<0,01) a leucínu od 10. mesiaca (P<0,01),
•
signifikantný pokles neesenciálnych aminokyselín konštatujeme u cystínu od 6.
mesiaca (P<0,001), histidínu od 9. mesiaca (P<0,01) a arginínu od 10. mesiaca
(P<0,01)
•
signifikantné zvýšenie sme zaznamenali u esenciálneho izoleucínu od 6. mesiaca
a fenylalanínu od 7. mesiaca skladovania na hladine významnosti (P<0,05)
a u neesenciálnej kyseliny glutámovej od 3. mesiaca (P<0,001) v kontrolnej skupine
•
štatisticky nevýznamné kolísanie hodnôt aminokyselín konštatujeme u esenciálneho
treonínu, metionínu a neesenciálneho alanínu, tyrozínu, kyseliny asparágovej,
glycínu, prolínu a serínu
Záver
V priebehu mraziarenského skladovania sa rozdiely v obsahu celkových bielkovín
a aminokyselín medzi PSE a kontrolným mäsom eliminujú, pravdepodobne vplyvom
zvýšených strát mäsovej šťavy v kontrolnom mäse po rozmrazení a následným znížením
obsahu vody, takmer na hodnoty PSE mäsa.
Na základe týchto výsledkov predpokladáme, že hodnoty valínu, lyzínu, leucínu,
cystínu, histidínu a arginínu sa znižujú vplyvom zvýšených strát mäsovej šťavy v podobe
voľných aminokyselín. V priebehu mraziarenského skladovania sa signifikantne zvýšili
hodnoty izoleucínu, fenylalanínu a kyseliny glutámovej, kde pravdepodobne nedochádza
k stratám v podobe voľných aminokyselín stratou mäsovej šťavy a zvýšenie hodnôt môže byť
čiastočne zapríčinené zvyšujúcimi sa stratami vody v priebehu mraziarenského skladovania
a tým vyššou koncentráciou svalových proteínov.
Literatúra
Dičáková, Z.: Mliekarstvo, 36, 2: 28-31, 2005.
Iguchi, S.M.M., Tsuchiya, T., Matsumoto, J.J.: Bull. Japa. Soc. Sci. Fish., 47, 11, 1991, 1499.
Matsumoto, J.J.: Chemical Deterioration of Proteins. Eds. Whitaker J.R., Fujimaki, M., ACS Symposium Series
123, American Chem. Soc., Washington D.C., 1990, 95.
Partman, W.: Z. Ernährungswiss, 16, 1997, 167.
297
Pástorová,B., Molnárová,M., Staníková,A: Phys. Res., 48, 3: 17, 1999.
Pástorová,B., Staníková,A., Molnárová,M., Halagan,J., Buleca,J.: Acta Vet. Hungar, 48(1), 107-111, 2000.
ANALÝZA PRODUKTOV DEGRADÁCIE LIPIDOV V TUKOVOM TKANIVE
OŠÍPANÝCH
THE ANALYSIS OF PRODUCTS OF HYDROLYTIC AND OXIDATIVE
DEGRADATION OF ADIPOSE TISSUE
Sopková D., Staníková A., Pástorová B.
Ústav fyziológie, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Komenského 73, 041 81 Košice, SR
Abstract
The changes in the basic lipid constants (peroxidation number, number of fat acidity
and thiobarbituric acid) of pork meat (m. longissimus dorsi) of normal quality, and that of
altered quality (PSE: pale, soft, exudative) were observed in dependence on the length of
freezing storage. The aim was to deepen and to make objective the knowledge on the effect of
freezing process on the parameters of quality of pork fat.
Statistically significant changes in the basic lipid constants in thermally untreated frozen
pork fat occur in general after month 6 of freezing storage in both groups.
Úvod
Tuk ošípaných a hydiny má pomerne vysoký obsah nenasýtených mastných kyselín,
čo ovplyvňuje jeho konzistenciu a náchylnosť na oxidáciu (Pipová a kol. 1995; Byrne a kol.
2002).Na výslednú kvalitu tuku získaného z jatočných zvierat majú vplyv intravitálne faktory,
ako je druh zvieraťa, jeho pohlavie, vek, zloženie kŕmnej dávky, a lokalizácia v tele živočícha
(Enser a kol. 2000), ale tiež fyzické zaťaženie, zlé zaobchádzanie so zvieratami a iné stresové
faktory pôsobiace tesne pred odporazením zvyšujú spotrebu energie, čo spôsobuje zvýšenie
počtu voľných radikálov v bunkách, ktoré značne urýchľujú oxidatívnu degradáciu tuku post
mortem (Bystrický a kol. 1999; Máté a kol. 1999). Pretože produkty oxidatívnej degradácie
veľmi výrazne negatívne ovplyvňujú organoleptické vlastnosti potravín, ich analýze sa venuje
veľká pozornosť. Existuje celý rad metód, od tých najjednoduchších kvalitatívnych až po
veľmi presné analytické metódy (Bakalová a kol. 2000; Fenaille a kol. 2001).
Finálnym produktom, ktorý vzniká v najväčšom množstve je malonyldialdehyd
(Marcinčák a kol. 2002; Faix a kol. 2005). Pri hlbokej oxidácii tukov vznikajú cyklické
peroxidy a z nich hydroxykyseliny, tzv. lojovatenie tukov.
298
Počas získavania, spracovávania a skladovania tukov dochádza k chemickým zmenám,
ktoré senzoricky a dieteticky znehodnocujú tuky a sú zdrojom zdraviu škodlivých zlúčenín.
Stres a zlé zaobchádzanie so zvieratami tesne pred porážkou zvyšuje počet voľných radikálov
a hladinu adrenalínu v organizme, čo značne urýchľuje degradáciu tuku post mortem.
Zamerali sme sa preto na analýzu produktov hydrolytickej a oxidatívnej degradácie lipidov
normálneho a PSE mäsa v priebehu 12-mesačného mraziarenského uskladnenia.
Materiál a metódy
Dvanásť ošípaných s atypickým priebehom zrenia mäsa a následnými kvalitatívnymi
zmenami mäsa PSE tvorilo pokusnú skupinu, a dvanásť ošípaných s normálnym priebehom
zrenia mäsa kontrolnú skupinu. Po porážke zvieraťa a 24 hodinovom chladení v chladiarni pri
4 oC, sme odoberali materiál na rozrábkovej linke vykostením karé priamo z bravčových
polovičiek, na ktorých bola ponechaná minimálne 2 cm vrstva chrbtovej slaniny, potrebná na
stanovenie kvality tukovej zložky mäsa.
Bravčové karé sa rozdelilo na dvanásť približne rovnakých častí, jedenásť z nich bolo
hlboko zmrazených prúdom chladeného vzduchu v zmrazovacích tuneloch pri -40oC, prúdení
vzduchu 4-6 m.s-1 a uložených do mraziarenského skladu na dlhodobé uskladnenie pri teplote
-18 oC, relatívnej vlhkosti 90-95%. Jedna časť bola určená na laboratórne vyšetrenia hneď po
odobratí materiálu ako čerstvá surovina.
Materiál na stanovenie kvality tukovej zložky mäsa:
¾ peroxidové číslo (PČ) metódou podľa Helclová a kol. (1991)
¾ číslo kyslosti tukov (ČKT) metódou Helclová a kol. (1991)
¾ tiobarbiturové číslo (TBA) metódou podľa Bulla a Marnetta (1985)
bol skladovaný v mraziarni a pravidelne v mesačných intervaloch z mraziarne vyberaný
a spracovávaný.
Matematicko–štatistické
porovnanie
jednotlivých
parametrov
medzi
pokusnou
a kontrolnou skupinou bolo robené Studentovým T-testom. Na vyhodnotenie dynamiky zmien
jednotlivých testovaných parametrov v priebehu 12 mesačného mraziarenského skladovania
sme použili test ANOVA a na porovnávanie kontrastov v rámci mesiacov TUKEY´S test.
299
Výsledky
V tukovom tkanive medzi porovnávanými skupinami konštatujeme, že:
•
hydrolytické zmeny tukovej zložky sú prezentované
vo všeobecnosti
vyššími
hodnotami ČKT v PSE skupine ako v skupine kontrolnej
•
signifikantne vyššie (P<0,05) sú hodnoty ČKT v prvom, druhom a ôsmom mesiaci
mraziarenského skladovania
•
oxidačné zmeny zaznamenané PČ sme zistili v kontrolnej skupine, signifikantne
vyššie (P<0,001) hodnoty PČ v šiestom mesiaci a
(P<0,05) vo štvrtom, piatom
a siedmom mesiaci skladovania
•
maximálnu prípustnú hodnotu PČ 6 mmol.kg-1 tuku sme u obidvoch sledovaných
skupín namerali v jedenástom mesiaci skladovania
•
rozdiely v TBA čísle medzi pokusnou a kontrolnou skupinou sú štatisticky
nevýznamné
V priebehu mraziarenského skladovania.
Porovnaním hodnôt základných tukových konštánt počas 12-tich mesiacov
mraziarenského skladovania s čerstvou surovinou a zhrnutím dosiahnutých výsledkov medzi
skupinami sme zistili, že k štatisticky významným zmenám v tepelne neošetrenom mrazenom
bravčovom tuku dochádza:
•
ČKT po šiestom mesiaci uskladnenia v obidvoch sledovaných skupinách (hodnoty
nad 1 mg KOH.g-1)
•
PČ po šiestom mesiaci uskladnenia v PSE skupine, v kontrolnej skupine po štvrtom
mesiaci uskladnenia (hodnoty 3,5 až 4,2 mmol.kg-1)
•
TBA po šiestom mesiaci uskladnenia v kontrolnej skupine, po siedmom mesiaci
uskladnenia v PSE skupine (hodnoty 0,9 až 1 mmol.kg-1)
Záver
Analýzou výsledkov získaných pri sledovaní kvality čerstvého tukového tkaniva
jatočne opracovaných tiel ošípaných sme zistili, že hydrolytické poškodenie tukového tkaniva
je ovplyvnené stresovými faktormi pôsobiacimi pred porážkou. Zaznamenali sme
signifikantne vyššie hodnoty čísla kyslosti tukov u ošípaných s kvalitatívne zmeneným PSE
mäsom. Nezistili sme však štatisticky významne vyššie hodnoty produktov oxidatívnej
degradácie tukov v čerstvej surovine medzi pokusnou a kontrolnou skupinou, čo je v súlade
300
s výsledkami BYSTRICKÝ a DIČÁKOVÁ (1998); BYSTRICKÝ a kol. (1999). Hodnoty
primárnej oxidatívnej degradácie lipidov už v čerstvom tukovom tkanive obidvoch skupín
ošípaných sú však všeobecne vyššie (PČ PSE skupina 2,35; kontrolná skupina 2,31mmol.kg-1)
a naznačujú, že toto poškodenie je podmienené aj inými faktormi ako stresovým zaťažením.
Skladovanie takejto suroviny vedie k urýchleniu oxidatívnych zmien v tukovej zložke
aj pri mraziarenských teplotách. Deštruované bunky tkanív sú bohatým zdrojom nenasýtených
mastných kyselín, tvoriacich vnútrobunkové štruktúry. Tieto sú v priebehu propagačnej fázy
autooxidácie zdrojom voľných radikálov a urýchľujú produkciu hydroperoxidov a peroxidov
mastných kyselín aj v ostatných tukoch. Po zvýšení teploty dochádza k rýchlemu priebehu
terminálnej fázy autooxidácie, produkcii terminálnych produktov oxidatívnej degradácie
lipidov – tuchnutie tukov. Danému problému je možné predísť predovšetkým:
•
maximálnou možnou elimináciou stresu zvierat in vivo a predovšetkým ante mortem
•
suplementáciou krmiva antioxidantmi, hlavne v tuku rozpustným vitamínom E
•
dodržiavaním teplôt v mraziarenských skladoch s maximálnym zvýšením teploty
na -15 oC, tak ako to stanovuje POTRAVINOVÝ KÓDEX SR
Súčasná legislatíva nestanovuje požiadavky pre sledovanie základných tukových konštánt
(ČKT, PČ, TBA) v čerstvej a mrazenej surovine. Tretia časť POTRAVINOVÉHO KÓDEXU
SR ustanovujúca konkrétne požiadavky pre všetky komodity v piatej hlave konkretizuje len
osobitné požiadavky pre škvarené živočíšne tuky vrátane bravčovej masti. V zmysle
NARIADENIA VLÁDY SR č. 286/2003 z.z, Prílohy č.4 v časti B, ustanovujúcej osobitné
hygienické požiadavky pre živočíšne tuky a mäsové výrobky tiež absentuje čerstvá a mrazená
surovina. Na základe našich zistení navrhujeme legislatívne stanoviť požiadavky na čerstvé
a mraziarensky ošetrené tukové tkanivo.
Literatúra
BAKALOVA, R., MILEVA, M., KOTSEV, CH., BARDAROV, V., RIBAROV, St.: Determination of
malondialdehyde in biological samples by solid-phase extraction and high-performance liquid chromatography.
Methods Find Exp. Clin. Pharmacol., 22,2000, 267-269.
BYRNE, D.V., BREDIE, W.L.P., BAK, L.S., BERTELSEN, G., MARTENS, H., MARTENS, M.: Sensory and
chemical analysis of cooked porcine meat patties in relation to warmed-over flavour and pre-slaughter stress.
Meat Science, 59, 3, 2002, 229-249.
BYSTRICKÝ, P., DIČÁKOVÁ, Z.: Živočíšne tuky v potravinách. Slov. vet. čas., Supl. 1, 1998, 3–42.
BYSTRICKÝ, P., DIČÁKOVÁ, Z., PAULSEN, P.: Oxidačné zmeny v tukovom tkanive ošípaných. Hygiena
Alimentorum XX, 1999, 48-50.
ENSER, M., RICHARDSON, R.I., WOOD, J.D., GILL, B.P., SHEARD, P.R.: Feeding linseed to increase the n3 PUFA of pork: fatty acid composition of muscle, adipose tissue, liver and sausages, Meat-Science, 55, 2000,
201-212.
301
FAIX, S., FAIXOVÁ, Z., BOLDIZAROVÁ, K., JAVORSKÝ, P.: The effect of long-term high heavy metal
intake on lipid peroxidation of gastrointestinal tissue in sheep,Vet. Med.- Czech, 50, 2005 (9):401-405.
FENAILLE, F., MOTTIER, P., TURESKY, R.J., ALI, S., GUY, P.A.: Comparison of analytical techniques to
quantify malondialdehyde in milk powders. J. Chromatogr. A, 921, 2001, 237-245.
MARCINĆÁK, S., TUREK, P., SOKOL, J., POPELKA, P., BYSTRICKÝ, P.: Determination of
malondialdehyde in pork by HPLC as the 2,4-dinitrophenylhydrazine derivate. Folia Veterinaria, 46, 3, 2002,
135-138.
MÁTÉ, D., TUREK, P., KORIMOVÁ, Ľ.: Využitie prírodných antioxidantov v mäsovej výrobe. Hygiena
Alimentorum XX, 1999, 148-149.
PIPOVÁ, M., CABADAJ, R., NAGY J.: Hygiene of Poultry ,Eggs, Fish, and Game. Datahelp Košice, 1995, 110
s.
MORFOLOGICKÉ ZMENY V MATERNICI OVIEC PO APLIKÁCII
CLOPROSTENOLU A EKVÍNNEHO CHORION-GONADOTROPÍNU
MORPHOLOGICAL CHANGES IN THE UTERUS OF SHEEP AFTER APPLICATION
OF CLOPROSTENOL AND EQUIN CHORION GONADOTROPINE
Staníková, A., Pástorová, B., Halagan, J., Sopková, D., Maraček, I.
Ústav fyziológie, Katedra normálnej anatómie, histológie a fyziológie, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Košice
Abstract
Qualitative and quantitative histological changes in the uterus Slovak merino sheep were
investigated following the synchronization and hormonal treatment. The investigations were
carried out on 40 sheep in the period of physiological anoestrus. Oestrus induction in
anoestrus sheep was achieved by intravaginal instillation of fluorogestonacetate
(40mg/sponge) oestrus was detected 2 – 5 days after removal of sponges. During inducted
oestrous cycle in sheep on 7 day were administered of Cloprostenol (synthetic PGF2α) 250
ng/head, as first injection on day 1 and as second injection on 11 days was used in sheep that
did not responded on first treatment. Next day after first application of Cloprostenol was
administrated of the equine chorione gonadotropine (eCG) hormone in dose of 750, 1000 and
1500 IU. The animals were killed on average 72 h following the Cloprostenol injection. The
uterus samples were processed by common histological methods for examination under a light
microscope and under an electron microscope. A scanning electron microscope Stereoscan
Cambridge 2A and Joel were used to examine the samples.
Our investigations showed that the administration of PGF2α resulted in a less
significant decrease in the mass of uterus (p<0.05) than that observed after the application of
eCG (p<0.001). An increase in the uterus cervix mass, observed following the administration
of PGF2α was of low significance (p<0.1) however that recorded after the administration of
eCG (750 and 1500 IU) was more significant (p<0.01) and the most significant increase was
elicited by administration of 100 IU eCG (p<0.001).
302
The number of glands in the uterus cervices increased significantly (p<0.05) only after
the highest administered dose of eCG (1500 IU), however the epithelium height increased
significantly (p<0.001) after all doses of the hormones administered (i.e. also after PGF2α).
The height of the surface epithelium of cervix increased on the level of significance p<0.001
following the administration of all hormonal preparations tested. Higher statistical
significance was recorded for changes in the cervical epithelium.
Cervical epithelial cilia of experimental sheep were many times elongated in
comparison with those in the control animals. Secondary and tertiary projections were also
observed. SEM examinations showed that the cervical epithelial surface was covered with
dense microvillus and cilia and secretion blebs cud be observed in many places.
The administration of oestrus inducing preparations elicits responses in the uterus of
anoestrus sheep similar to those observed during the natural oestrus.
Key words: anoestrus, induction of oestrus cycle, sheep, uterus, histology, light and electron
microscope, observations.
Úvod
Pre úspešné zvládnutie riadenej reprodukcie je dôležité poznať funkcie regulačných
mechanizmov, ale aj úlohu gonadotropných, steroidných a tkanivových hormónov [1,9,10],
podieľajúcich sa na riadení a udržiavaní fyziologických estrálnych cyklov a funkcií orgánov,
počnúc hypotalamom, hypofýzou, vaječníkmi až maternicou [6,7,17].
Aktivita endokrinných štruktúr regulujúcich pohlavné funkcie je ovplyvňovaná
optimálnou látkovou výmenou a krvením [12] v neuroendokrinných štruktúrach.
V dostupnej literatúre sú známe práce, ktoré sa zaoberajú štúdiom zmien pohlavného
aparátu u rôznych druhov zvierat počas estrálneho cyklu a za rôznych experimentálnych
podmienok [2,3,8].
Tieto morfologické zmeny sa navonok prejavujú predovšetkým zmenou koncentrácií
gonadotropíny uvoľňujúcich hypofyzárnych a ovariálnych hormónov, ako aj histologickými
zmenami cieľových orgánov, ktoré tieto hormóny produkujú. Na ovariálnej činnosti závisí
stav vajcovodu a maternice [11,15]. Cieľom našej práce bolo získanie objektívnych funkčne –
morfologických údajov o charakteristike zmien maternice oviec po hormonálnom ovplyvnení.
Materiál a metodika
Do pokusu sme zaradili 40 oviec plemena slovenské merino, 2 – 4 ročných v období
fyziologického anestru. Zvieratá boli chované za štandardných podmienok a boli rozdelené do
303
piatich
skupín.
Estrálny
cyklus
oviec
v anestrickom
období
sme
indukovali
fluórogestonacetátom (40 mg/ intravaginálnu špongiu) v trvaní 12 dní. Ruja bola detegovaná
2 – 5 dní po vybratí špongií. V prebiehajúcom estrálnom cykle na 7. deň od zaznamenanej
ruje sa i. m. injikovala prvá dávka cloprostenolu (PGF2α) 250 ng/kus ako 1. deň ošetrenia
a oviec, ktoré na prvé podanie PGF2α neodpovedali na 11. deň cyklu boli ošetrené druhou
dávkou cloprostenolu. Nasledujúci deň po prvej dávke cloprostenolu boli ovce ošetrené
ekvínnym choriovým gonadotropným (eCG) hormónom v dávkach 750, 1000 a 1500 IU.
Zvieratá boli vykrvené v priemere 72 hodín od aplikácie eCG. Maternice pre štúdium
v svetelnom mikroskope sa fixovali v médiu formalín – sublimát – kyselina octová ( v
objemových dieloch 4 : 1 : 2). 6 nm hrubé parafínové rezy sme farbili hematoxylín –
eozínom. Vzorky maternice pre štúdium v rastrovacom elektrónovom mikroskope sa
premývali fosfátovým pufrom, potom Karnovského roztokom a dofixovali 3% roztokom
glutaraldehydu v kakodylátovom pufri (pH všetkých roztokov bolo 7,4 a teplota 4 ºC). Potom
nasledovalo spracovanie vzoriek podľa M u r a k a m i h o
a kol. [13] dehydratácia
etylalkoholom, sušenie metódou kritického bodu, pozlátenie vo vákuu a prehliadanie v
rastrovacom elektrónovom mikroskope Stereoscan Cambridge 2A a Jeol.
Výsledky
Zistili sme, že hmotnosti materníc sa po podaní PGF2α zvyšovali na nižšej hladine
významnosti (p<0.05) ako po stimulácii PMSG (p<0.001). Hmotnosť maternicových krčkov
sa po aplikácii PGF2α zvyšovali len na nízkej hladine významnosti (p<0.1) ale po podaní
PMSG (750 a 1500 IU) sa hladina významnosti zvyšovala (p<0.01) a najvyššia bola po
podaní 1000 IU PMSG (p<0.001). Odpoveď krčku maternice na superovulačné stimulácie sa
prejavila aj zmenami v počte žliaz, zmenami výšky epitelu žliaz ako aj zmenami výšky
povrchového epitelu krčku maternice u synchronizovaných a hormonálne stimulovaných
oviec, ktorých štatistická významnosť sa zvyšovala so zvyšujúcou sa dávkou podaných
hormónov. Počty žliaz krčku maternice sa signifikantne zvyšovali (p<0.05) až po najvyššej
podanej dávke PMSG (1500 IU) ale výška ich epitelu sa signifikantne zvyšovala (p<0.001) po
všetkých dávkach podaných hormónov (teda aj PGF2α). Výška povrchového epitelu krčku
maternice sa zvyšovala po podaní všetkých dávok hormonálnych preparátov na úrovni
p<0.001. Tieto zmeny sú štatisticky významnejšie u epitelu krčka maternice.
Sliznica cervixu u kontrolných zvierat tvorí nižšie riasy, z ktorých vystupujú len
ojedinelé sekundárne výbežky. Slizničné riasy v cervixe sa po hormonálnom ovplyvnení na
rozdiel od kontrol mnohonásobne predĺžili a sú tu prítomné sekundárne alebo aj terciárne
304
výbežky. Aj tu je zreteľné bohatšie zastúpenie žliaz. Z pozorovaní pomocou rastrovacieho
elektrónového mikroskopu sme zistili, že povrch sliznice cervixu u hormonálne
stimulovaných oviec pokrývajú husté mikroklky a cílie, ktoré na určitých miestach tvoria buď
súvislú vrstvu alebo tvoria ojedinelé trsy. Na mnohých miestach sme pozorovali väčšie
sekrečné granuly (blebs).
Diskusia a záver
Synchronizácia cyklu u oviec s cyklickým žltým telieskom je najúspešnejšia v období
včasnej luteálnej fázy, pretože aktivite cyklického žltého telieska počas exogénnej
progesterónovej dominancie sa nezamedzí. K luteolýze dochádza stimuláciou uvoľnenia
uterinného prostaglandínu. Samotný prostaglandín sa indukuje odňatím, alebo doznením
exogénneho zdroja gestagénu [14], čím narastá koncentrácia estradiolu po odznení
dominancie progesterónu s priamym pôsobením na maternicu.
Ako vhodný hormón pre superovuláciu sa používa eCG, pre svoj skorý účinok a
jednoduchý spôsob podávania [9]. Prostaglandín F2α patrí medzi vazokonstriktory
maternicových ciev a stimuluje kontrakcie maternice [3] a je dôležitý pre luteolýzu a následne
ovplyvňuje folikulogenézu v štádiu výberu v procese dominancie a nadväzne i ovuláciu resp.
ovulačný pomer (ovulation rate OR).
Výskyt cílií v maternici študovali viacerí autori [4,16], ktorí sa domnievajú, že bunky s
vysokou mitotickou aktivitou nemajú cílie a že cílie sa vytvárajú iba pred delením buniek,
ktoré sú stimulované estradiolom. Počas pohlavného cyklu prechádza sliznica maternice
radom zmien, ktoré sa sústreďujú do dvoch základných procesov – proliferácie a sekrécie. D a
v i e s a H o f f m a n [5] tvrdia, že nástup mitotickej aktivity epitelu maternice v procese
proliferácie nie je závislý od progesterónovej aktivity, ale je stimulovaný a udržiavaný
estrogénovou aktivitou a na základe pozitívnej spätnej väzby produkciou LH z hypofýzy. Z
uvedeného vyplýva, že po hormonálnom ovplyvnení oviec 1500 IU PMSG sme na sliznici
krčku maternice pozorovali zvýšený výskyt cílií usporiadaných v trsoch, alebo na iných
miestach tvoria súvislú vrstvu. Aj proces sekrécie je riadený hormonálne, to znamená, že
existuje priamy vzťah steroidných hormónov k sekrečnej činnosti. Je známa skutočnosť, že
progesterón má za následok zníženie množstva sekrétu .
Dosiahnuté výsledky prinášajú návody na zistenie optimálnych dávok a kombinácií
hormonálnych preparátov používaných na superovuláciu s priaznivým biologickým účinkom
na reprodukčnú schopnosť oviec s minimálnymi vedľajšími účinkami na reprodukčné orgány.
305
Literatúra
1.
ARENDARČIK, J., - MAROSSY, A., - ITZE, L. (1974): Účinok syntetického LH- RH a L –Dopa na
hladinu LH v sére oviec určovaný rádioimunotestom (RIA). In : Čsl. Fyziol., vol. 23, 1974, pp. 250 –
251.
2. BEŇOVÁ, K., - TOROPILA, M., - FALIS, M., - PALUCHOVÁ, K., - NOVÁKOVÁ,
J.(2001): The effect of ionising radiation on an organism in dependence on the dose,
type, age and sex (In Slovak ). Proc: Topical problems of bioclimatology of animals.,
VFÚ Brno, 2001, pp. 10 – 11.
3. CLARK, K. E., - AUSTIN, J. E., - STYS, S. J. (1981): Prostaglandins. vol. 22, 1981,
pp. 333 – 348.
4. CLARK, M. V. – BRIENSFIELD, T. H. (1973) : Ciliated stromal cells in the hamster uterus. In : Biol.
Reprod., vol. 8, 1973.
5. DAVIES, J. – HOFFMAN, L. H. (1973) : Studies on the progestational endometrium of the rabbit. In :
Amer. J. Anat., vol. 137, 1973, pp. 423 – 446.
6. HRIŇÁKOVÁ, G. (2005) : Funkčná histológia povrchového epitelu a žliaz endometria bahníc po
ukončenom puerpériu. 48. kolo ŠVOČ, 2005.
7. KRAJNIČÁKOVÁ, M., - CIGÁNKOVÁ, V., - LENHARDT, Ľ., - KOSTECKÝ, M., - MARAČEK, I.
(2002) : Functional and Morphological Evaluation of the Mucosa of Endometrium and Oviduct in
Postpartum Goats. In : Acta Vet. Brno, vol. 71, 2002, pp. 517 – 522.
8. KRAJNIČÁKOVÁ, M., - KOSTECKÝ, M., - DANKO, J., - LENHARDT, Ľ., - CIGÁNKOVÁ, V., MARAČEK, I. (2002) : Biometric. Idices of the uterus and oviducts in post – parturient goats. In : V.
košický morfologický deň s medzinárodnou účasťou, Zborník referátov, Košice, 31. máj 2002, pp. 143
– 144.
9. MARAČEK, I. (1991) : Niektoré aspekty regulácie a riadenia reprodukčného cyklu a sexuálnych
funkcií plemeníc prežúvavcov. Doktorská dizertačná práca, Košice, 1991.
10. MAROSSY, A., - ARENDARČIK, J. (1974): Vplyv LH – RH , L – Dopa a hypofyzárneho extraktu
ošípaných deleného na Sephadexe G – 25 na hladinu FSH a LH v krvnom sére anestrálnych oviec. In :
Čsl. Fyziol., vol. 23, 1974, pp. 266 – 267.
11. Mc DONALD, L. E. (1975) : Veterinary endocrinology and reproduction. Lea and Febiger,
Philadelphia, 1975.
12. MITRO, A., - JALČ, P., - MAROSSY, A., - DAXNEROVÁ, Z., - POMFY, M., MARŠALA, J. (1983): Model of irreversible complete cerebral ischemia. In : Biologia., vol. 38, 1983,
pp. 679 – 682.
13. MURAKAMI, I., - YAMAMOTO, K., - ITHOSIMA, T. (1977): Modified tanninosmium conductive
staining method for noncoated SEM specimens and aplication to icrodissection SEM of spleen. In :
Arch. Histo. JAP., vol. 40, 1977, pp. 35 – 40.
14. SMITH, J. F. – FAIRCLOUGH, R. J. – PETERSON, A. J. (1979) : Plasma levels of progesterone,
Provera, oestradiol – 17 beta and 13, 14 – dihydro- 15- Keto prostaglandin F in cows treated with
Provera impregnated sponges. In : J. Reprod. Fert., vol. 55, 1979, pp. 359 – 364.
15. STANÍKOVÁ, A., - RAJTOVÁ, V., - MOLNÁROVÁ, M., - PÁSTOROVÁ, B., - HALAGAN, J.
(2000) : Qualitative and quantitative changes in the oviducts of ewess after hormonal stimulation. In :
Czech J. Anim. Sci., vol. 45, 2000, pp. 11 – 15.
16. TACHI, S. (1974) : Influence of ovarian hormones on formation of solitary cilia and behaviour of the
centrioles in uterine epithelial cells of the rat. In : Biol. Reprod., vol. 10, 1974.
17. UHRÍN, V. (1992 ) : Funkčná morfológia epitelov vajcovodu a maternice kravy. VÚŽV Nitra,
Vydavateľstvo SAP – Slovak Academic Press, s.r.o. Bratislava, 1992, pp. 80 – 140.
306
KONZUMÁCIA MLIEKA A MLIEČNYCH VÝROBKOV U SLOVENSKEJ
POPULÁCIE
MILK AND DAIRY PRODUCTS CONSUMPTION IN SLOVAK POPULATION
Šramková, K., Chlebo, P. , Kopčeková, J. , Dudriková, E. *, Mrázová, J.
Katedra výživy ľudí FAPZ SPU Nitra,
* Ústav hygieny a technológie mlieka UVL Košice
Abstract
The aim of the study was to evaluate milk and dairy products consumption in adult population
in Slovak Republic – in the case of 483 random selected adults at the age from 25 to 95 years
(52,80 % females and 47,20 % men), with average age 47,60 ± 15,01 years. Used research
method was nutritional questionnaire. Body mass index was assessed according to criteria of
WHO (2004). In the sample occured overweight in 56,31 % of respondents (45,88 % females
and 67,98 % men) and obesity in 16,98 % of adults (13,73 % females and 20,61 % men).
Android risk of metabolic complications of obesity was determined according to waist-to-hip
ratio values in 28,63 % of females and 89,47 % of men. The most prefered consumed milk
was semi-bold milk (56,71 %) and low-fat milk (26,29 %). Milk consumption refused 9,03 %
of females and 8,77 % of men, low-fat milk did not consume more men than females (20,30
% versus 30,77 %), acidified milk refused 28,14 % of females a 25,00 % of men, yoghurts
with higher fat content refused 52,69 % of females and 53,66 % of men.
Úvod
Mlieko a mliečne výrobky sú jednou zo základných zložiek racionálnej výživy moderného
človeka. Mlieko má vo výžive ľudí výsostné postavenie. Konzumuje sa už viac ako 10 000
rokov. Okrem základných živín a príslušnej energie poskytuje ľudskému organizmu mnoho
látok, ktoré sa vyznačujú nielen významnými výživovými, funkčnými, ale aj zdravotnými
účinkami. Mlieko má nezastupiteľnú úlohu vo výžive pre obsah plnohodnotných proteínov,
vrátane cenných srvátkových bielkovín, vápnika, draslíka a fosforu, ľahko stráviteľného
mliečneho tuku s vysokým obsahom konjugovanej kyseliny linolovej (často a pozitívne sa
dáva do súvisu s prevenciou voči vzniku chronických civilizačných ochorení), vitamínov (A,
D, skupiny B ) a mliečneho cukru – laktózy (Valík, 2006, Babinská, 2005).
Cieľom práce bolo sledovať a zhodnotiť konzumáciu mlieka a mliečnych výrobkov i životný
štýl a antropometrické parametre u vybranej časti dospelej populácie SR. Zámerom tiež bolo
307
zistiť pokrytie odporúčaných výživových dávok konzumom mlieka a vybraných mliečnych
výrobkov.
Materiál a metodika
Sledovali a hodnotili sme konzumáciu mlieka a mliečnych výrobkov u dospelej populácie v
Žilinskom, Trenčianskom, Banskobystrickom, Bratislavskom a Prešovskom kraji. Výskum
sme uskutočnili dotazníkovou metódou. Zúčastnilo sa ho 483 náhodne vybratých osôb vo
veku 25-95 rokov (52,80 % žien a 47,20 % mužov). V skupine žien bol priemerný vek 47,60
± 15,01 rokov, v skupine mužov 47,90 ± 15,00 rokov. Takmer 75 % osôb (cca 2/3) bolo vo
veku najviac 50 rokov a približne 30 % (cca 1/3) vo veku viac ako 50 rokov (tab. 1).
Tabuľka 1 Rozdelenie súboru podľa veku a pohlavia
Vek
ženy
muži
spolu
n
%
n
%
n
%
≤ 50 rokov
174
68,24
153
67,11
327
67,70
> 50 rokov
81
31,76
75
32,89
156
32,30
Z antropometrických parametrov sme použitím kalibrovaných váh merali a hodnotili telesnú
hmotnosť, použitím pásového meradla telesnú výšku, obvod pásu, obvod bokov. Hodnotili
sme index telesnej hmotnosti – BMI (na základe kritérií podľa WHO, 1995, WHO, 2000,
WHO, 2004), ktorý sme vypočítali z antropometrických parametrov (z telesnej hmotnosti a
telesnej výšky) nasledovne: body mass index = hmotnosť v kg / (výška v m)2. Z obvodu pása
a bokov sme vypočítali index centrality, tzn. pomer pás-boky (WHR; waist to hip ratio) ako podiel
obvodu pása a bokov v centimetroch. WHR sme hodnotili podľa Kleinwächterovej, Brázdovej
(2001).
Väčšinu súboru tvorili vydaté ženy, resp. ženatí muži (tab. 2). Pri hodnotení zdravotného
stavu prevažoval zdravotný stav priemerný/dobrý, z hľadiska fyzickej aktivity pri zamestnaní
práca fyzicky ľahká alebo stredná, zo vzdelania stredoškolské vzdelanie a z pohľadu
pracovného pomeru zamestnané osoby (tab. 3).
Tabuľka 2 Zaradenie osôb v súbore
ženy
muži
spolu
n
%
n
%
n
%
Slobodný/á
41
16,08
37
16,23
78
16,15
Ženatý/vydatá
175
68,63
167
73,25
342
70,81
Rozvedený/á
17
6,67
12
5,26
29
6,00
Vdovec/a
22
8,62
12
5,26
34
7,04
308
Tabuľka 3 Charakteristika súboru
Sledované
ukazovatele
Hodnotenie
podpriemerný
ženy
muži
spolu
n
%
n
%
n
%
31
12,16
35
15,35
66
13,66
64,31
121
53,07
285
59,01
Zdravotný stav priemerný/dobrý 164
veľmi dobrý
60
23,53
72
31,58
132
27,33
fyzicky ľahká
138
54,12
108
47,37
246
50,93
stredná
105
41,18
95
41,67
200
41,41
ťažká
12
4,71
25
10,96
37
7,66
základné
34
13,33
13
5,70
47
9,73
stredoškolské
172
67,45
151
66,23
323
66,87
vysokoškolské
49
19,22
64
28,07
113
23,40
študent
9
3,53
6
2,63
15
3,11
Pracovný
zamestnaný
164
64,31
159
69,74
323
66,87
pomer
dôchodca
72
28,24
57
25,00
129
26,71
nezamestnaný
10
3,92
6
2,63
16
3,31
Práca
Vzdelanie
Vzhľadom na to, že sme v dospelej populácii zisťovali konzum potravín z mliečnej skupiny,
zaujímalo nás aj pokrytie odporúčaných výživových dávok konzumom jednotkovej porcie
mlieka a vybraných mliečnych výrobkov: mlieka v množstve 250 g; z mliečnych výrobkov jogurtu v množstve 150 g a tvrdého syra v množstve 30 g. Na modelový výpočet nutričného
a energetického príjmu z konzumu vybraných potravín a nápojov (mlieka, mliečnych
výrobkov) sme použili nutričný software Alimenta 4.3e a príjem sme porovnali
s odporúčanými výživovými dávkami pre Slovenskú republiku (OVD SR) z roku 1997
(Vestník, 1997) a vyjadrili ich vo forme percentuálnej úhrady OVD pre jednotlivé kategórie
dospelých osôb (žien a mužov).
Výsledky a diskusia
Na základe klasifikácie hmotnosti podľa BMI sme zistili podhmotnosť u 7 osôb, t.j. 1,45 %,
nadhmotnosť u 272 opýtaných, t.j. 56,31 % (45,88 % žien a 67,98 % mužov) a obezitu u 82
osôb, t.j. 16,98 % (13,73 % žien a 20,61 % mužov) (tab. 4). Priemerná hodnota BMI bola
v súbore 25,82 ± 4,24 kg.m-2 a WHR 0,86 ± 0,11. Index centrality, poukazujúci na androidné
riziko, sa týkal menej ako tretiny žien (28,63 %) a takmer 90 % mužov (89,47 %) (tab. 5).
309
Z hodnotenia
konzumu
mlieka
a mliečnych
výrobkov
sme
zistili,
že
najviac
uprednostňovaným mliekom bolo polotučné mlieko u viac ako polovice osôb (tab. 6).
Respondenti najčastejšie uprednostňovali polotučné mlieko (56,71 %), menej nízkotučné
(26,29 %) a najmenej plnotučné mlieko (17,00 %). Plnotučné mlieko preferovali najmä muži
(21,12 % versus 13,03 %) a nízko-/polotučné mlieko naopak o 8,09 % viac žien (86,97 %
versus 78,18 %).
Tabuľka
4
Podhmotnosť,
nadhmotnosť
a obezita
u
dospelých
osôb
podľa
medzinárodnej klasifikácie BMI (podľa WHO, 1995, WHO, 2000, WHO, 2004)
BMI klasifikácia
ženy
muži
n
%
n
%
Podhmotnosť
< 18,50
7
2,75
0
0
vážna
< 16,00
1
0,39
0
0
stredná
16,00-16,99
0
0
0
0
mierna
17,00-18,49
6
2,35
0
0
Normálny rozsah
18,50-24,99
18,50-22,99
86
33,72
31
13,60
23,00-24,99
42
16,47
42
18,42
117
45,88
155
67,98
25,00-27,49
58
22,75
61
26,75
27,50-29,99
24
9,41
47
20,61
35
13,73
47
20,61
30,00-32,49
20
7,84
33
14,47
32,50-34,99
11
4,31
8
3,51
35,00-37,49
4
1,57
6
2,63
37,50-39,99
0
0
0
0
0
0
0
0
Nadhmotnosť
≥ 25,00
Pre-obezita
25,00-29,99
Obezita
≥ 30,00
I. stupňa
30,00-34,99
II. stupňa
35,00-39,99
III.stupňa
≥ 40,00
Tabuľka 5 Index centrality - WHR
ženy
muži
spolu
Riziko
norma
n
%
n
%
n
%
gynoidné
< 0,85
182
71,37
24
10,53
206
42,65
androidné
≥ 0,85
73
28,63
204
89,47
277
57,35
Tabuľka 6 Preferencia mlieka
Mlieko
ženy
muži
spolu
n
%
n
%
n
%
nízkotučné
76
29,83
51
22,54
127
26,29
polotučné
146
57,14
128
56,34
274
56,71
plnotučné
33
13,03
48
21,12
81
17,00
310
Tabuľka 7 Odmietanie mlieka a mliečnych výrobkov
ženy
muži
spolu
n
%
n
%
n
%
mlieko
23
9,03
20
8,77
43
8,90
zakysané mlieko
72
28,14
57
25,00
129
26,71
nízkotučné
52
20,30
70
30,77
122
25,26
134
52,69
122
53,66
256
53,00
33,75
97
42,75
183
37,89
131
51,27
125
54,90
256
53,21
nízkotučný tvaroh
71
27,81
77
33,77
148
30,24
vysokotučný
107
41,76
95
41,67
202
41,72
jogurty
vysokotučné
jogurty
mäkké nízkotučné 86
syry
mäkké
vysokotučné syry
tvrdé syry
tvaroh
Pri sledovaní konzumácie mlieka a mliečnych výrobkov sme sa zamerali najmä na odmietanie
jednotlivých druhov potravín z mliečnej skupiny, čo poukazuje na pestrosť alebo naopak
jednostrannosť stravy (tab. 7). Mlieko vôbec nekonzumovalo 9,03 % žien a 8,77 % mužov.
Ženy nekonzumovali z mliečnych výrobkov najmä jogurty s vysokým obsahom tuku (52,69
%), na druhom mieste mäkké vysokotučné syry (51,27 %) a vysokotučný tvaroh (41,76 %).
Muži najviac odmietali konzum mäkkých vysokotučných syrov (54,90 %), vysokotučných
jogurtov (53,66 %) a na treťom mieste mäkkých nízkotučných syrov (42,75 %). Jurkovičová
(2005) uvádza, že plnotučné mlieko preferujú najmä mladšie osoby, a že trend spotreby
mlieka u mužov i u žien v priebehu posledných šiestich rokov prudko klesá.
Prepočtom krytia odporúčaných výživových dávok konzumom mlieka a mliečnych výrobkov
sme zistili, že konzum jednej jednotkovej porcie polotučného mlieka 1,5 % t.v.s. (250 g)
predstavuje príjem vápnika 302 mg a energetický príjem 484,96 kJ (115,81 kcal), čo znamená
krytie OVD jednotlivých kategórií dospelých žien a mužov podľa veku a fyzickej záťaže pre
vápnik (tzn. 800–1000 mg/deň) na 24,75–37,75 % (priemerne 33,77 ± 3,40 %) a pre energiu
na 3,13 až 6,38 % (v priemere na 4,62 ± 0,92 %). Konzumácia bieleho jogurtu (min. 1,5 %,
311
max. 1,8 % t.v.s.) v množstve 150 g poskytuje 171 mg vápnika a 319,65 kJ (76,33 kcal).
Jogurt pokryje pre jednotlivé kategórie žien OVD vápnika na 15,55–21,38 % (v priemere na
18,45 ± 2,13 %) a OVD energie na 2,06 až 3,76 % (priemerne na 2,74 ± 0,59 %). Tvrdý syr
(eidam, 45 % t.v.s.) v množstve 30 g poskytuje 286,8 mg vápnika a energiu 430,69 kJ (102,85
kcal) a zabezpečí úhradu OVD pre vápnik u dospelých žien na 26,07–35,85 % (v priemere na
30,94 ± 3,70 %) a energiu 2,78 až 5,07 % (priemerne na 3,69 ± 0,84 %). Z celkového
zhodnotenia vyplýva, že jedna porcia potravín pokryje OVD pre vápnik na 27,72 ± 0,84 %
(15,55 až 37,75 %) a OVD pre energetický príjem len na 3,68 ± 0,17 % (2,06 až 6,38 %).
Záver
Nadhmotnosť alebo obezitu sme v súbore zistili až u takmer troch štvrtín súboru (73,29 %
osôb), a to u viac mužov až (o 28,98 %) ako žien (59,61 % žien, ale až 88,59 % mužov).
Plnotučné mlieko preferujú najmä muži. Z mliečnych výrobkov respondenti uprednostňovali
vo všeobecnosti výrobky so zníženým obsahom tuku. Jednotková porcia polotučného mlieka
a vybraných mliečnych výrobkov pokryje odporúčaný príjem pre vápnik u dospelých osôb
z jednej štvrtiny (na 27,72 %), zatiaľ čo má nízky obsah energie - len 4 % odporúčaného
energetického príjmu. Na základe toho možno plne odporúčať konzum mlieka a mliečnych
výrobkov u dospelých osôb, a to rôznych výrobkov v závislosti od ich zdravotného stavu,
resp. telesnej hmotnosti.
Literatúra
1.
2.
BABINSKÁ, K. 2005. Výživa bez mlieka. In: Výživa a zdravie, roč. 49, 2005, č.2, s.21.
JURKOVIČOVÁ, J. 2005. Vieme zdravo žiť? Bratislava : Univerzita Komenského v Bratislave, 2005, 166 s.
ISBN 80-223-2132-X.
3. VALÍK, Ľ. 2006. Prospešnosť konzumácie mlieka. In: Výživa a zdravie, roč. 50, 2006, č. 3-4, s. 15.
4. Vestník MZ SR, roč. 45, čiastka 7-8, zo dňa 28. apríla 1997.
5. WHO. Physical status: the use and interpretation of anthropometry. Report of a WHO Expert Committee.
WHO Technical Report Series 854. Geneva : World Health Organization, 1995.
6. WHO. Obesity: preventing and managing the global epidemic. Report of a WHO Consultation. WHO
Technical Report Series 894. Geneva : World Health Organization, 2000.
7. WHO expert consultation. Appropriate body-mass index for Asian populations and its implications for
policy and intervention strategies. In The Lancet, 2004; 157-163.
Práca bola podporená z projektu VEGA 1/2321/05 a KEGA 3/5082/07.
Kontaktná adresa:
Ing. Katarína Šramková, PhD., Katedra výživy ľudí, Fakulta agrobiológie a potravinových
zdrojov SPU Nitra, Tr. A. Hlinku 2, 949 01 Nitra
312
INDEX ZDRAVÉHO STRAVOVANIA U DOSPELÝCH ŽIEN
HEALTHY EATING INDEX IN ADULT WOMEN
Šramková, K. 1, Kolesárová, A. 1, Brányik, K. 2, Mišiaková, M. 3
1
Katedra výživy ľudí FAPZ SPU Nitra,
2 NsP
Dunajská Streda, 3ADOS Nitra
Abstract
The aim of the study was to evaluate the nutrition in Slovak adult women and to analyse the
actual nutrition according to Healthy Eating Index. 24-hours dietary records (n = 161) were
evaluated by using software Alimenta version 4.3e. 41,61 % of protocols contained five food
groups (cereals, vegetables, fruit, milk, meat). The ground of the nutrition was cereals and/or
their products in the case of 98,89 % protocols, 89,44 % of anamnesis contained vegetables
and/or its products, 88,82 % of protocols contained milk and/or dairy products, and 82,23 %
of records contained meat, poultry and/or fish. Fruit or fruit products represented the
component part of 68,32 % of retrospective protocols. Receipt of cholesterol (maximal 300
mg a day) exceeded 30,43 % of nutritional records, daily fat receipt (maximal 30 % from
daily energy receipt) was higher in the case of 67,08 % protocols, receipt of saturated fat was
in 70,37 % of dietary records (was is too much) higher as is recommended (10 % of total
energy content).
Úvod
Faktory životného štýlu, vrátane nutričných faktorov, sa významne uplatňujú v prevencii
neinfekčných chorôb.
Štúdia bola zameraná na zhodnotenie výživy vybranej skupiny slovenských žien a na analýzu
aktuálneho spôsobu výživy prostredníctvom indexu zdravého stravovania.
Materiál a metodika
V skupine náhodne vybraných žien dospelého veku (25-58 rokov) sme hodnotili stravovanie
použitím 24-hodinových retrospektívnych stravovacích anamnéz (161 ks). Veková
charakteristika súboru žien je v tab. 2. Celodenný záznam stravy sme počítačovo spracovali v
nutričnom programe Alimenta verzia 4.3e (vypracovaný vo Výskumnom ústave
potravinárskom v Bratislave), ktorý používa Potravinovú banku dát zloženia potravín.
Celodenný príjem potravy sme na základe výsledkov zo spracovania v nutričnom software
zhodnotili podľa tzv. HEI (Healthy Eating Index) - Indexu zdravého stravovania (tab. 1).
313
Hodnotili sme všetky potravinové skupiny - obilniny, zelenina, ovocie, mlieko, mäso (ich
prítomnosť/neprítomnosť v celodennej strave) a štyri výživové odporúčania: celkový tuk
(položka 61374 vo výstupe z nutričného software Alimenta 4.3e), nasýtený tuk (položka
61375 vo výstupe z nutričného software Alimenta 4.3e), cholesterol (položka 52610 vo
výstupe z nutričného software Alimenta 4.3e), sodík (položka 54111 vo výstupe z nutričného
software Alimenta 4.3e).
Tabuľka 1 Index zdravého stravovania - HEI (Healthy Eating Index)
Zložka
Interval
Kritériá pre max.
Kritériá pre min.
hodnotenia
hodnotenie 10 b
hodnotenie 10 b
1. obilniny
0 – 10
6 – 11 porcií
0 porcií
2. zelenina
0 – 10
3 – 5 porcie
0 porcií
3. ovocie
0 – 10
2 – 4 porcie
0 porcií
4. mlieko
0 – 10
2 – 3 porcie
0 porcií
5. mäso
0 – 10
2 – 3 porcie
0 porcií
6. celkový tuk
0 – 10
30 % a menej energie
45 % a viac energie
7. nasýtený tuk
0 – 10
< 10 % energie
15 % a viac energie
8. cholesterol
0 – 10
300 mg a menej
450 mg a viac
9. sodík
0 – 10
2400 mg a menej
4800 mg a menej
10. pestrosť
0 – 10
8 a viac rôznych
3 a menej rôznych
položiek za deň
položiek za deň
Skupina potravín
Výživové odporúčania
Výsledky a diskusia
Priemerný počet zaradených potravinových skupín do stravovacích anamnéz bol 4,27 ± 0,27
(tab. 2). Poukazuje to na celkom dostatočnú pestrosť stravy. Z celkového počtu 161
nutričných protokolov (24-hod. retrospektívnych záznamov) obsahovala potraviny zo
všetkých piatich sledovaných potravinových skupín menej ako polovica (41,61 %) z
hodnotených nutričných protokolov (tab. 3). Štyri až päť potravinových skupín obsahovala
podstatná časť nutričných protokolov (86,33 %), čo poukazuje na pestrosť stravy. Pozitívne
je, že len malá časť stravovacích záznamov bola zložená len z dvoch potravinových skupín
(1,24 %), zatiaľ čo potraviny len z troch skupín potravinovej pyramídy (tzv. pyramídy
314
zdravia) boli súčasťou 12,42 % retrospektívnych nutričných anamnéz. Jednoznačne možno
tvrdiť, že stravovanie obsahujúce zložky len z dvoch, prípadne z troch potravinových skupín
nespĺňajú požiadavku dostatočnej pestrosti stravy.
Tabuľka 2 Veková charakteristika súboru žien a počet potravinových skupín
zaradených do stravovania (ukazovatele deskriptívnej štatistiky)
Vek (roky)
Počet potravinových skupín
priemer ± SD
44,42 ± 9,84
4,27 ± 0,72
minimum
25,00
2,00
maximum
58,00
5,00
medián
46,00
4,00
modus
51,00
4,00
Tabuľka 3 Počet potravinových skupín zaradených do stravovania
Počet potravinových skupín
Stravovanie obsahujúce potraviny z príslušného počtu
potravinových skupín
n
%
0
0
0,00
1
0
0,00
2
2
1,24
3
20
12,42
4
72
44,72
5
67
41,61
U najväčšieho počtu stravovacích záznamov sme zistili zaraďovanie potravín z „cereálnej
skupiny“ potravinovej pyramídy, a to u 143 (98,89 %) protokolov (tab. 4). Na druhom mieste
bola „zeleninová skupina“, ktorej potraviny boli zahrnuté do stravy v prípade 144 (89,44 %)
nutričných protokolov. Za zeleninovou skupinou nasledovala „mliečna skupina“, pričom
mlieko a mliečne výrobky obsahovalo 143 (88,82 %) stravovacích anamnéz, ďalej „mäsová
skupina“ so 134 (83,23 %) protokolmi, obsahujúcimi mäso, hydinu, ryby, prípadne výrobky
z nich. Najmenej zaraďované boli potraviny z „ovocnej skupiny“, nakoľko ovocie, príp.
ovocné výrobky sa nachádzali v 110 (68,32 %) restrospektívnych anamnézach. Americký
inštitút pre výskum rakoviny iniciovl v roku 1991 nutričný program „Denne päťkrát pre lepšie
315
zdravie” (Five a day for best Health). Pravidlo stravovania „Päťkrát dene ovocie a zeleninu”
úspešne
bojuje
proti
chronickým
neinfekčným
chorobám
(najmä
nádorovým
a
kardiovaskulárnym) (ŠRAMKOVÁ, 2004, ŠRAMKOVÁ, 2005).
Podľa USDA (US Department of Agriculture) potravinovej pyramídy sa odporúča konzum
z potravinovej skupiny obilniny 6-11 jednotkových porcií (JP) denne, zelenina 3-5 JP, ovocie
2-4 JP, zo skupiny mlieko a mliečne výrobky a rovnako aj zo skupiny mäso, ryby, hydina
a strukoviny 2–3 JP denne (US Department of Agriculture, 1997).
Tabuľka 4 Zaradenie potravín do denného stravovania
Potraviny
/potravinové Stravovanie obsahujúce príslušné potraviny
skupiny
n
%
1. obilniny
156
98,89
2. zelenina
144
89,44
3. ovocie
110
68,32
4. mlieko
143
88,82
5. mäso
134
83,23
Hodnotením výživových odporúčaní sme zistili dodržiavanie najmä odporúčania pre príjem
cholesterolu – maximálne 300 mg cholesterolu spĺňala strava v prípade viac ako dvoch tretín
(69,57 %) 24-hod. nutričných protokolov. Na druhom mieste bolo odporúčanie pre príjem
celkového tuku, keďže jeho príjem predstavoval najviac 30 % z celkového denného
energetického príjmu v prípade tretiny (32,92 %) nutričných anamnéz. Tretie miesto obsadil
príjem saturovaného (nasýteného) tuku, ktorý spĺňala len menej ako tretina stravovacích
záznamov (29,63 %)
(tab. 5). Ukazovatele opisnej štatistiky sú pre vybrané výživové
odporúčania uvedené v tab. 6. Priemerné hodnoty pre príjem nasýteného tuku a cholesterolu
zodpovedá výživovým odporúčaniam. V prípade príjmu celkového tuku a sodíka sú
priemerné hodnoty vyššie ako odporúčané.
Odporúčané výživové dávky SR určujú vo všeobecných odporúčaniach podiel tukov na
celkovom objeme energie na maximálne 30 % s nasledujúcou štruktúrou mastných kyselín:
saturované mastné kyseliny 10 %, monoénové mastné kyseliny 10-12 %, polyénové mastné
kyseliny 8-10 % (Vestník MZ SR, 1997). Hlavnými zdrojmi cholesterolu sú vaječný žĺtok,
produkty s obsahom mliečneho tuku, živočíšne tuky a mäso. Každých 200 mg cholesterolu
prijatého stravou denne zvýši koncentráciu sérového LDL-cholesterolu (LDL, low density
lipoproteins, lipoproteíny s nízku hustotou) priemerne asi o 6 mg/dl (0,155 mmol/l). Nasýtené
316
mastné kyseliny sa vyskytujú v živočíšnych tukoch aj v rastlinných olejoch. K bohatým
zdrojom saturovaných mastných kyselín patrí maslo, živočíšny tuk a tropické oleje (palmový,
kokosový olej a olej z palmových jadier). V USA a v Európe tvoria nasýtené mastné kyseliny
12-15 % z celkového energetického príjmu. V priemere na každé 1 % energie prijatej vo
forme nasýtených mastných kyselín, ktoré zvyšujú cholesterol, sa v porovnaní s kyselinou
olejovou hladina LDL-cholesterolu zvýši asi o 2 mg/dl (0,025 mmol/l). Jedna nasýtená
mastná kyselina - kyselina stearová (C18:0) nezvyšuje koncentráciu LDL-cholesterolu.
Hlavným zdrojom tejto kyseliny je hovädzí loj a kakaové maslo (Grundy, 2003).
Tabuľka 5 Výživové odporúčania
Výživové odporúčania
Stravovanie
zodpovedajúce
príslušnému
výživovému odporúčaniu
n
%
53
32,92
7. nasýtený tuk (max. 10 % 96
29,63
6. celkový tuk (max. 30 % energie)
energie)
8. cholesterol (max. 300 mg)
112
69,57
9. sodík (max. 2400 mg)
40
24,84
Tabuľka 6 Výživové odporúčania (ukazovatele deskriptívnej štatistiky)
Parameter
Výživové odporúčanie Parameter
6. celkový tuk *
Výživové odporúčanie
8. cholesterol (mg)
priemer ± SD
32,13 ± 9,00
priemer ± SD
233,80 ± 180,33
minimum
2,17
minimum
1,03
maximum
54,67
maximum
1041,58
medián
32,45
medián
188,09
modus
35,56
modus
145,58
7. nasýtený tuk
9. sodík (mg)
priemer ± SD
8,87 ± 4,21
priemer ± SD
3733,16 ± 2049,72
minimum
0,39
minimum
336,50
maximum
24,78
maximum
13116,06
medián
8,65
medián
3490,79
modus
11,44
modus
3009,15
* percentuálny podiel z energie (z energetického príjmu)
317
Záver
Hodnotením stravovania dospelých žien sme zistili, že zo 161 nutričných protokolov (24-hod.
retrospektívnych záznamov) malo 41,61 % obsiahnutých všetky základné potravinové
skupiny, čo poukazuje na dostatočnú pestrosť stravy u menej ako polovice anamnéz.
Základom väčšiny protokolov (98,89 %) boli cereálie a výrobky z nich, zelenina a zeleninové
výrobky boli súčasťou 89,44 % záznamov, mlieko a mliečne výrobky obsahovalo 88,82 %
stravovacích anamnéz, mäso, prípadne výrobky z neho 83,23 % protokolov. Najmenej boli
zaraďované potraviny z ovocnej skupiny potravinovej pyramídy - v 68,32 % retrospektívnych
anamnézach.
Odporúčaný denný príjem cholesterolu 300 mg prekračovalo 30,43 % nutričných protokolov,
príjem celkového tuku v množstve maximálne 30 % z denného energetického príjmu bol vyšší
v prípade 67,08 % nutričných anamnéz, príjem saturovaného (nasýteného) tuku bol až u 70,37
% vyšší ako odporúčaných 10 % celkového príjmu energie. V strave dospelých žien je
potrebné zredukovať najmä príjem nasýtených tukov, a teda najmä tukov živočíšneho pôvodu
a dbať na zastúpenie rôznych potravinových skupín v dennej strave.
Literatúra
1.
2.
3.
4.
5.
GRUNDY, S.M. 2003. Factors Determining Blood Cholesterol Levels. In: Encyclopedia of Food Sciences
and Nutrition. Volume 2. Second Edition. Oxford : Elsevier Science, 2003. p. 1237-1243. ISBN 0-12227055-X
ŠRAMKOVÁ, K. 2004. 5-krát denne ovocie a zeleninu. In: Gastro : Gastro informuje, roč. 15, 2004, č.
3/4, s. 7-8.
ŠRAMKOVÁ, K. 2005. Ovocie a zeleninu päťkrát denne pre zdravie. In: Výživa a zdravie, roč. 49, 2005,
č.54, s. 26-38.
US Department of Agriculture, 1997. Pyramid Servings Data. Results from USDAs 1994-1996 Continuing
Survey of Food Intakes by Individuals.1997. US Department of Agriculture, Agriculture Research Service,
Food Survey Research Group, Bethesda, MD.
Vestník MZ SR, roč. 45, čiastka 7-8, zo dňa 28. apríla 1997.
Práca bola podporená z projektu VEGA 1/2321/05 a KEGA 3/5082/07.
Kontaktná adresa: Ing. Katarína Šramková, PhD., Katedra výživy ľudí, Fakulta agrobiológie
a potravinových zdrojov SPU Nitra, Tr. A. Hlinku 2, 949 01 Nitra
318
VLIV VYBRANÝCH MIKROKLIMATICKÝCH PODMÍNEK PROSTŘEDÍ NA
JAKOSTNÍ PARAMETRY MLÉKA NA VOLNÉM USTÁJENÍ
THE INFLUENCE OF MICROCLIMATIC PARAMETERS OF STABLING
ENVIRONMENT ON MILK QUALITY OF COWS IN FREE STABLING SYSTEM
Šťastná, J., Šoch, M.,
Katedra anatomie a fyziologie hospodářských zvířat, Zemědělská fakulta, Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích
Department of Anatomy and Physiology of Farm Animals, Faculty of Agriculture, University of South Bohemia in Ceske
Budejovice
Abstract:
The experiment was realized in a brick stable with stocker floor and boxes with plastic litter
made from separated slurry. The average number of the animals was 509 Holstein cows with
average production 7741.65 liters of milk per year, during the experiment. The ventilation
was provided by an overhead inlet shaft and by lateral windows. Temperature and relative
humidity of the stabling environment were measured in hour intervals. Through the
experiment were founded MSCC and microorganisms tendencies to grow up, and milk protein
(casein) and fat to decline in DM after growing temperature.
Key words: cows, milk, quality, temperature, humidity
Acknowledgement:
This project was supported by NAZV 1G58053 a GAČR 523/03/H076.
*Corresponding author: Jana Šťastná, ZF JU v Č. Budějovicích, Studentská 13., 370 05
České Budějovice, e-mail: [email protected], tel.: +420387772618
HODNOTENIE FREKVENCIE MIKROJADIER V KOSTNEJ DRENI MYŠI PO
PODANÍ MORFÍNU A PROTEÁZY ASPERGILLUS ORYZAE
THE EVALUATION OF MICRONUCLEUS FREQUENCY IN THE BONE MARROW OF
MICE TREATED WITH MORPHINE AND PROTEASE OF ASPERGILLUS ORYZAE
Šutiaková, I., Šutiak, V., Kovalkovičová, N., 1Poračová J., Váczi, P., Sabová, L.
Department of Pharmacy and Pharmacology, University of Veterinary Medicine, 73, Komenského, 041 81 Košice, Slovak
Republic, 1Department of Biology, Faculty of Humanities and Natural Sciences, PU, 1, 17th November, Prešov, Slovak
Republic
Abstract
In this study we have used 4 groups of mice with 4 animals in each, using 1 negative control K- (obtained 1ml of 0.9% NaCl sol. (PS) i.p. and 20 µl of the PS s.c. into tail), 1 positive
control - KA+ (obtained 30mg of morphini HCl (M) .kg in 0.1% sol. i.p. and 20 µl of PS s.c.
319
into tail) and 2 experimental groups of mice. The first of them - B-group (obtained except of
M as in group KA+ also A. oryzae protease (PAO) diluted in relation 1:20 in 20 µl of PS s.c.
into tail & also C-group of mice which obtained except of M as in group KA+ also PAO
diluted in relatio1:10 in 20 µl of PS s.c. into tail). The effects of both agents in mice were
observed via following the dynamics of the body temperature, genotoxicity & cytotoxicity
criteria of studies. The experiments demonstrated that used M induced already alone
significant decrease of body temperature (P<0.05) as well as in groups with the PAO,
however body temperature decrease in KA+ was not significant (P> 0.05) when we compare
the data in relation with values before administration of agent. However in cases when were
taken the comparisons in relation with the K- data the P<0.05 decreases of body temperature
were observed not only in B- and C-groups but also in KA+group of mice. Significant
differences in micronucleated polychromatic and normochromatic erythrocytes was observed
(P<0.001); resp. (P< 0.001) in experimental group of mice which obtained 30 mg/kg b. w. of
morphine and PAO (1:10) into tail against negative control. The ratio of polychromatic to
normochromatic erythrocytes of female mice of both exposed groups was not significantly
changed in comparison to negative control. Supported by Vega grant No. 1-2408-05.
Introduction
Analgesic morphine & endogenous opioid ligands are implicated in diverse function in the
central & peripheral nervous system, especially in acute & chronic pain management. In
experimental & clinical studies, peripheral analgesic effects of opioids have been observed
mainly during the inflammatory-induced pain (Welte et al., 1992, Antonijevic et al., 1995.,
Walter and Stella, 2004, Costa et al., 2004, 2007). The capacity of morphine in attenuation of
inflammation & pain has been demonstrated within a few hours after the induction of
inflammation. This could be due to an enhancement of the permeability of the perineurium &
to activation of opioid receptors in the terminal nerve endings, which may undergo structural
changes in the acidic environment of the inflammation (Stein, 1993). A recently observed
phenomen, the development of "dark neurons" is associated with both chronic constriction
injury & morphine tolerance. This observation of interrelationships between neural
mechanisms underlying hyperalgesia & morphine tolerance may lead to a better
understanding of the pain (Mayer et al., 1999). On the other hand, according to the Physicians
Desk Reference (PDR) (Anonymous 2005), no formal studies to assess the mutagenic
potential of morphine have been conducted for the FDA. In vivo genotoxicity tests play
an important role in genotoxicity studies. Increases in micronucleated bone marrow cells are
320
given great regulatory weight indicating that the test compound is likely to be a genotoxic
agent. An alternative explanation for the in vivo micronucleus effect is that it is a consequence
of body temperature which is caused in rodents by morphine (Tweats et al, 2007 a, b). Our
previous experiments with mice demonstrated that Aspergillus oryzae protease induced
a pronounced inflammation reaction (Šutiak and Šutiaková, 1991, Šutiak et al., 2002) and this
experience we have utilized in the following our experiments.
The main aim of this work was to evaluate the efficacy of morphine treatment in model of
acute inflammation with Aspergillus oryzae protease in mice and we examined the interaction
effect of mutual administration of both agents on the induction of micronuclei in bone marrow
and cytotoxicity in mice.
Materials and methods
Animals
Female laboratory mice (Mus musculus var. alba) of the strain ICR (age of 5 months)
obtained from the officially approved supplier (by SVaFA Bratislava - SK-CH-40 004 on
5.5.2004 - the Animal breeding facility) of the laboratory animals (Division of toxicology and
breeding of laboratory animals of the Institute of Experimental Pharmacology at the SAS,
91954 Dobra Voda). Mice were adapted to the experimental conditions for the period of 7
days before its starting. They were fed on the commercially available and standard diet
(Kŕmna zmes pre myši a potkany MP of the firm Top Dovo, 919 54 Dobrá Voda, producer
PD Horné Dubové - Naháč, SR. Together with food they obtained also water both
administered ad libitum and kept in plastic boxes, containing the metallic cowering at the
temperature 20 ± 2.0 ˚C and 50-54 % humidity on the natural light/ dark cycle.
Chemicals and reagents
Morphini HCl purchased from Hoechst-Biotika, Martin, producer a.s. Slovenská Ľupča, SR.
0.9% NaCl solution (Infusio natrii chlorati isotonica) obtained from Infusia a.s. Hořatev, CR
and Thiopental ICN inj. (thiopentalum natricum) was of the firm ICN a.s. Roztoky, CR. The
enzyme protease of Aspergillus oryzae (CAS No. 9014-01-1, EC 232-752-2) was purchased
from Sigma Aldrich St. Louis-Steinheim, Germany. We used also methanol p.a. (No. 305 34
0503), Lachema Lach, Ner, s.r.o. Neratovice, CR, Giemsa-Romanowski, Diagnostica, Merck,
Darmstadt, May-Grünwald, R6 020305, Vakos, XT a.s., Praha, CR & Foetal bovine serum
(No. A-15-043-PAA), Laboratories GmbH Germany.
Doses and exposure
321
The animals were divided into 4 groups with 4 animals in each using 1 negative control - K(obtained 1ml of 0.9% NaCl sol. - Infusio natrii chlorati isotonica (PS) i.p. & 20 µl of the PS
s.c. into tail), 1 positive control - KA+ (obtained 30mg of morphini HCl (M).kg in 0.1% sol.
i.p. & 20 µl of PS s.c. into tail) & 2 experimental groups of mice. The first of them - B-group
(obtained except of M as in group KA+ also A. oryzae protease (PAO) diluted in relatio1:20
in 20 µl of PS s.c. into tail & also C- group of mice which obtained except of M as in group
KA+ also PAO diluted in relatio1:10 in 20 µl of PS s.c. into tail). 4 days after administration
of drugs the mice were anesthetised with 75 mg of thiopentalum natricum (Thiopental ICN 1
g inj. plv. sol.).kg b.w. i.p. after solubilisation with the 0.9 % PS & carefully decapitated
(Šutiak et al.1981). Blood samples were obtained & used for analyses.
Temperature test method
The body (rectal) temperature of mice were monitored by the Geratherm GmbH Digital
thermometer, model 8022, Germany at: -0.5 h before starting of experiment and 0.5; 1; 2; 3;
4; 6 & 24 h after administration of agents.
Body weight of animals
Body weights of animals were measured by the Metler Toledo AG type BDI 201 scales
Greifen-See, Switzerland & U.S.A.
Micronucleus (MN) test
At appropriate time points, the experimental animals were killed, a 10 ml centrifuge tube was
filled with 5.0 ml of foetal calf serum for each individual. All mice were carefully decapitated
96 h after the end of exposure (Šutiak et al.1980) & both femora were removed. The
preparations were then air dried & fixed in absolute methanol for 5 min. Smears were stained
with May Grünwald-Giemsa & analyzed for the presence of MN in both polychromatic
erythrocytes (PCEs) and normochromatic erythrocytes (NCEs). 1000 PCEs & the
corresponding number of NCEs per animal were analysed for the presence of MN. The ratio
of PCEs to NCEs (P/N) was calculated for all treated & control groups. Criteria for scoring
follow those data of Mac Gregor et al. (1987) and OECD Guideline 474 (1997).
Statistical treatment of data
The results were compared by Student´s test using the Sigma Stat program (Statistical
software, Jandel Scientific) was employed for statistical evaluation of the results. P1 is relation
to values at –0.5h & P2 is relation to K-group.
322
Results
Body weight measurement of animals demonstrated no significant differences between the
individual animal groups (K-group = 33.55 ± 2.105 g, B-group = 33.71±1.317 g, C-group =
33.50 ± 0.696 g & KA+group = 33.98 ± 0.676 g with the values of P2 = 0.753; 0.762 and
0.422 respectively related to values of K-group). Studies of the body temperature dynamics in
individual groups of mice demonstrated that the rectal temperature did not changed
significantly its values only in K-group of mice (P1 < 0.184) during the experiment, in relation
to the values before administration. In other groups the rectal temperature decreased more to
maximal lowest levels also at the time interval 0.5 h after administration (B-group = P1 <
0.008; C-group = P1 < 0.0002 & KA+group = P1 < 0.089). The comparisons of the body
temperature dynamics of individual animal groups in relation to the K-group pointed to the
fact of significant decrease of rectal body temperature with the following values (B-group =
P2 < 0.009; C-group = P2 < 0.01 & KA+group = P2 <0.038. The results of mice bone marrow
micronucleus tests studies after exposure to the morphine and PAO administration of 30
mg/kg b. w. morphine and 1:20 PAO into tail did not increase the frequency of the MN PCE s
(P ≥ 0.286) and MNCEs (P ≥ 0.086) in the bone marrow of mice against negative control.
Significant differences in micronucleated polychromatic and normochromatic erythrocytes
was observed (P< 0.001); resp. (P< 0.001) in experimental group of mice which obtained 30
mg/kg b. w. of morphine and PAO (1:10) into tail. The ratio of polychromatic to
normochromatic erythrocytes of female mice of both exposed groups was not significantly
changed in comparison to negative control (Table 1).
Table 1 Micronucleus frequencies and distributions in bone marrow cells of female mice
after exposure morphine and protease Aspergillus oryzae
Group
Control
Animal
MNPCEs
MN distribu – NNCEs
Mn
distribu- Ratio
tion in PCEs
tion in NCEs
PCEs/
1
2
3
1
2
3
NCEs
K1/1
1000
18
18
0
0
9
5
4
0
1,31
K1/2
1000
14
11
2
0
15
11
2
0
1,20
K1/3
1000
9
9
0
0
14
12
1
0
1,26
K1/4
1000
15
15
0
0
12
8
2
0
1,46
Mean ± SD
Experim. 1:20
PCEs
14.0 ± 3.742
12.5 0 ± 2.646
E2/1
1000
11
11
0
0
10
8
1
0
1,25
E2/2
1000
22
22
0
0
21
4
4
3
1,09
E2/3
1000
19
17
1
0
25
10
6
1
0,97
323
E2/4
Mean ± SD
P=
Experim. 1:10
Pos. control
1000
18
16
1
17.50 ± 4.655
0
25
21
1
1
0,839
20.25 ±7.089
0.286
0.086
E3/1
1000
28
26
1
0
40
36
2
0
1,29
E3/2
1000
29
27
1
0
35
31
2
0
0,77
E3/3
1000
32
30
1
0
27
23
2
0
1,12
E3/4
1000
24
24
0
0
33
33
0
0
0,52
Mean ± SD
28.25±3.304
P =
= <0.001
33.75±5.377
=<0.001
C4/1
1000
21
21
0
0
32
30
1
0
0,84
C4/2
1000
25
23
1
0
32
24
4
0
1,03
C4/3
1000
28
16
6
0
25
17
4
0
0,60
C4/4
1000
24
24
0
0
28
24
2
0
0,79
Mean ± SD
24.50 ± 2.887
29.25 ± 3.403
P=
< 0.004
= < 0.001
Discussion
Opioids are considered to exert their analgesic effects within CNS mainly & the evidence has
begun to accumulate knowledge that potent analgesia can be elicited also by activation of
opioid receptors in peripheral inflammed tissues. In peripheral tissues such as in joints opioids
act to reduce inflammation & morphine has been administered locally for a relieving painful
inflammatory disorders (Kosta et. al. 2007). We have studied the effect of morphine
interaction at the local inflammatory process induced by PAO. We have registered also a
positive effect of morphine at the lower dose of PAO. Our results demonstrated that morphine
may have good interaction effect also at the induction of inflammation peripherally not only
via CNS action, especially at the lover concentration of enzyme results in contrast to Kcontrol.
In vivo genotoxicity tests in particular bone marrow cytogenetic tests play an
important role in the risk and hazard assessments. Increases in the micronucleated bone
marrow cells are given great regulatory weight indicating that the test compound is likely to
be a genotoxic agent. However non physiological temperatures have been known for some
time to induce also cytogenetic damage. An alternative explanation for the in vivo
micronucleus effects is that it is consequence of hypothermia which is caused in rodents by
morphine (Twents et. al. 2007a, b; Asanami and Shimono, 1997). These were the arguments
why we have also measured the body temperatures in mice. The highest statistically
significant changes were observed most frequently in time scale between 0.5 to 1.0 h after
administration of morphine1 h after application of morphine. From our results can be seen
324
that administration of morphine alone to mice significantly increase the frequency
micronuclei at the PCE and NCE erythrocytes and we registered also the cytotoxic effects. In
addition to the central nervous system opioid receptors can be found also in peripheral organs
and work is in progress to determine morphine’s mechanism of action in greater detail
including the site of receptors important to the genotoxic response (Sawant and Couch, 1995).
Supported by Vega grant No. 1-2408-05.
References
Asanami, S. and Shimono, K.: Mutat. Res., 390, 79-83, 1997. Costa, B. et al.: NaunynSchmiedeberg's Arch Pharmacol.369, 294-299, 2004. Costa, B. et al.: Eur. J. Pharmacol.,
556, 75-83, 2007. Mayer, D.J. et al.: Proc. Natl.Acad.Sci., USA, 96, 7731-7736, 1999.
Welte, M. et al.: Br. J. Anestesth., 69, 637-639, 1992. Antonijevic, I. et al.: J. Neuroscienci.,
15, 165-172, 1995. Sawant, S.G. and Couch, D.B.: Environ. Mol. Mutagen., 25, 279-283,
1995. Walter, L. et al.: Br. J.Pharmacol., 141, 775-778, 2004. Stein, C.: Anesth. Analg., 76,
182-191, 1993. Šutiak, V. et al.: Služba zdrav., Health Service, 4, 245-248, 1981. Šutiak, V.
et al.: Folia Veter., 35, 1-2, 1991. Šutiak, V.: Bangladesh Vet. J., 36, 1-2, 51-55, 2002. OECD
Guideline for testing of chemicals 474, 1997. Mammalian erythrocyte micronucleus test. 21st
July 1997. MacGregor, J.T. et al.: Mutat. Res., 189, 103-112, 1987. Anonymous 2005. PDR
2005 Physicians Desk Reference, Medical Economics Montvale, NJ, 2005. Tweats, D.J. et
al.: Mutat. Res., 627, 78-91, 2007a. Tweats, D.J. et al.: Mutat. Res., 627, 92-105, 2007b.
Kontaktná adresa: Prof. MVDr. Václav Šutiak, PhD., Ústav farmácie a farmakológie, UVL,
Komenského 73, 041 81 Košice.
MÁ ZVÝŠENÁ HLADINA MATERNÁLNEHO TESTOSTERÓNU VPLYV NA
POMER DRUHÉHO A ŠTVRTÉHO PRSTA (2D:4D) U LABORATÓRNEHO
POTKANA?
DOES INCREASED MATERNAL TESTOSTERONE LEVEL HAVE AN EFFECT ON
THE SECOND-TO-FOURTH-DIGIT RATIO (2D:4D) IN RATS?
Talarovičová A., Kršková, L., Blažeková, J.
Univerzita Komenského v Bratislave, Prírodovedecká fakulta, Katedra živočíšnej fyziológie a etológie, Mlynská dolina B-2,
842 15 Bratislava [email protected]
Abstract
325
The purpose of the study was to investigate effects of increased maternal testosterone level on
the second-to-fourth-digit ratio (2D:4D) in rats.
Digit length of the 2nd and 4th of both forepaws in control (C) and testosterone treated (T)
groups of male and female rats (C: 8 males, 8 females; T: 8 males, 8 females) was measured
at 90 days of age. Animals of the T group were prenatally exposed to testosterone (a single
intramuscular injection of 2.5 mg testosteroni isobutyras) on gestation day 14.
Our results showed that males and females of groups prenatally treated with testosterone had
the 2D:4D ratio lower than C (P<0.001) on both left and right forepaw. The 4th digit was
longer in T group than in C group in both genders (P<0.001).
Our results suggest that higher level of maternal testosterone during intrauterine development
influence digit ratio in laboratory rats. Since a similar relationship is known also in humans,
this observation may be useful for noninvasive evaluation of androgen status in rats under
experimental conditions.
Úvod
Testosterón, klasicky ponímaný ako mužský pohlavný hormón neobmedzuje svoje účinky len
na maskulinizáciu pohlavných orgánov ale významnou mierou zasahuje aj do procesu
sexuálnej diferenciácie centrálnej nervovej sústavy (CNS) (Baron-Cohen a kol., 2004; Morris
a kol., 2004). Zvýšenie jeho hladiny počas senzitívnych období vývinu vedie k maskulinizácií
CNS (Garcia-Falgueras a kol., 2005), kým jeho nedostatok naopak CNS feminizuje
(Hotchkiss a kol., 2002; Casto a kol., 2003). Je zodpovedný za adekvátne formovanie
sexuálne dimorfických jadier v area preoptica (POA) (Gorski a kol., 1980; Hsu a kol., 2001)
čím zároveň zasahuje do procesu formovania sexuálnej, rodovej a druhovej sebaidentifikácie
daného pohlavia (Dörner a kol., 2001). Jeho nedostatok v prenatálnom období sa spája
s rozvojom homosexuality u mužov a naopak s jeho zvýšenou hladinou sa spája preferencia
rovnakého pohlavia u lesbických žien (Miller, 1994).
So zvýšenou hladinou testosterónu sa tiež spája vznik pervazívnych vývinových porúch, ako
je napríklad autizmus (Baron-Cohen, 2002), alebo poruchy pozornosti (ADHD) (Jesmin
a kol., 2004). Literatúra tiež uvádza existenciu spojitosti medzi zvýšenou hladinou
prenatálneho testosterónu a niektorými morfologickými znakmi napr. rozdielmi v pomere
ukazováka a prstenníka (2D:4D) (Manning a kol., 1998). Podľa Peichel a kol. (1997)
modulujú androgény vývin pohlavných orgánov vplyvom na Hox gény, ktoré veľmi úzko
súvisia aj s vývinom prstov u myší aj u ľudí.
326
Ženy majú 2D:4D pomer v priemere väčší než muži (Manning a kol., 1998). Podobné
výsledky zistili aj Brown a kol. (2002a) na pravej zadnej končatine u myší. U
homosexuálnych žien prichádza pravdepodobne účinkom prenatálneho testosterónu
k maskulinizácii (zmenšovaniu) tohto pomeru (Williams a kol., 2000). Podobne je tomu aj
u pacientov s kongenitálnou adrenálnou hyperpláziou (CAH), kde v dôsledku intrauterinného
vystavenia zvýšenej hladine androgénov (Kreze a kol., 2004) dochádza u oboch pohlaví
k znižovaniu pomeru 2D:4D (Brown a kol., 2002b). Podľa Manning a kol. (2001) prichádza
k maskulinizácii pomeru 2D:4D aj u autistov. Rovnako je tomu aj u jedincov s ADHD
(deBruin a kol., 2006).
Cieľom našej práce je zistiť existenciu vzťahu medzi prenatálne zvýšenou hladinou
testosterónu a pomerom prstov 2D:4D u laboratórneho potkana.
Materiál a metodika
V experimente sme použili potomstvo 6 samíc laboratórneho potkana kmeňa Wistar z chovnej
stanice Dobrá Voda. Zvieratá boli chované pri svetelných podmienkach 12D:12L s prístupom
k vode a potrave ad libitum. Samice sme pripustili vo veku 10 týždňov a rozdelili na skupinu
s podaným testosterónom (T; na 14. deň gravidity intramuskulárne aplikovaný 0,1 ml
prípravku Agovirin Depot, Biotika, Slovenská Ľupča = 2,5mg Testosteroni isobutyras) a
kontrolnú skupinu (K; na 14. deň gravidity aplikovaný olivový olej).
Merania 2. a 4. prstu na predných labkách sme uskutočnili na 32 živých zvieratách (8 K
samcov, 8 T samcov, 8 K samíc, 8 T samíc) prostredníctvom posuvného meradla s presnosťou
na desatiny milimetra vo veku približne 80 dní. Údaje sme vyhodnotili t-testom.
Výsledky
Porovnaním druhého a štvrtého prsta a 2D:4D pomeru ľavej a pravej prednej labky samčieho
a samičieho potomstva sme zistili nasledovné skutočnosti:
Samce prenatálne ovplyvnené testosterónom majú oproti kontrole pomer 2D:4D signifikantne
nižší (P<0,001) na ľavej aj pravej labke (Obr. 1). Rovnako u samíc prenatálne vystavenie
zvýšenej hladine testosterónu spôsobilo pokles v pomere 2D:4D (P<0,001) na ľavej aj pravej
labke (Obr. 2). Takisto veľkosť štvrtého prsta na ľavej aj pravej labke samcov bola
signifikantne väčšia u testosterónovej skupiny (P<0,001). Vo veľkosti druhého prsta na oboch
labkách sme u samcov nezistili signifikantný rozdiel (Obr. 3). U samíc sa nám podobne ako
u samcov potvrdili rozdiely iba v dĺžke štvrtých prstov na oboch labkách (P<0,001), pričom
tak ako u samcov, mali testosterónom ovplyvnené samice štvrtý prst dlhší (Obr. 3).
327
1,4
1,2
**
**
ľavá
pravá
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Kontrola
Testosterón
Obr. 1. Pomer druhého a štvrtého prsta ľavej a pravej prednej labky samcov potkana.
Hodnoty sú udávané ako priemer ± SEM, **P<0,001.
1,2
**
**
ľavá
pravá
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Kontrola
Testosterón
Obr. 2. Pomer druhého a štvrtého prsta ľavej a pravej prednej labky samíc potkana.
Hodnoty sú udávané ako priemer ± SEM, **P<0,001.
Tab.3: Dĺžka druhého a štvrtého prsta predných labiek potkana.
samce
samice
labka
prst
kontrola
testosterón
kontrola
testosterón
ľavá
2.
0,76 ± 0,02
0,7 ± 0,02
0,68 ± 0,03
0,64 ± 0,02
4.
0,67 ± 0,02
0,8 ± 0,01**
0,63 ± 0,03
0,75 ± 0,01**
2.
0,71 ± 0,01
0,67 ± 0,01
0,67 ± 0,02
0,64 ± 0,02
4.
0,65 ± 0,01
0,79 ± 0,02**
0,64 ± 0,02
0,78 ± 0,01**
pravá
Hodnoty sú udávané ako priemer ± SEM, **P<0,001.
Diskusia
Z našich výsledkov vyplýva, že zvýšená hladina maternálneho testosterónu počas
prenatálneho vývinu mláďat signifikantne znižuje pomer 2D:4D u samcov aj u samíc na
oboch predných labkách. Ak vychádzame z predpokladu, že je tento pomer dôležitým
328
ukazovateľom prenatálneho vplyvu androgénov (Manning a kol., 1998) ide podobne ako
v prípade homosexuálnych žien (Williams a kol., 2000) ale aj žien s CAH (Brown a kol.,
2002b) o účinok prenatálne zvýšenej hladiny testosterónu.
V dôsledku zvýšenia hladiny testosterónu počas gravidity prichádza k tzv. maskulinizácii
plodu, ktorá sa prejaví nielen na poklese hodnoty pomeru 2D:4D (Rizwan a kol. 2007), ale aj
na vzniku extrémne mužského mozgu (Baron-Cohen, 2002).
U oboch pohlaví nami testovaných potkanov prenatálne ovplyvnených zvýšenou hladinou
testosterónu sme zistili, že prišlo k štatisticky preukaznému predĺženiu štvrtého prsta na
pravej aj ľavej končatine u oboch pohlaví. Aj tu ide pravdepodobne o maskulinizačný účinok
testosterónu ktorý vedie u mužov k zvýšeniu veľkosti štvrtého prsta (Peters a kol., 2002).
Vplyv zvýšenej hladiny prenatálneho testosterónu na pomer 2D:4D ako aj na samotnú dĺžku
štvrtého prsta u oboch pohlaví nami testovaných potkanov poukazuje na fakt, že spojitosť
medzi prenatálnym testosterónom a dĺžkou prstov existuje aj u iných živočíšnych druhov ako
je človek. Potkany sa preto v budúcnosti (podobne ako myši) môžu využívať ako animálny
model na štúdium korelácie medzi prenatálnou hladinou testosterónu, dĺžkou prstov
a niektorými
špecifickými
prejavmi
resp.
poruchami
správania
súvisiacimi
práve
s prenatálnymi účinkami testosterónu.
Záver
Prenatálne zvýšená hladina testosterónu maskulinizuje 2D:4D pomer u potomstva
laboratórneho potkana samčieho aj samičieho pohlavia.
Poďakovanie
Tento projekt bol zrealizovaný vďaka finančnej podpore grantu VEGA 43434/07
Literatúra
Baron-Cohen S, Lutchmaya S, Knickmeyer R. (eds.) Prenatal Testosterone in Mind. A Bradford Book, London,
pp. 131, 2004.
Baron-Cohen S. The extreme male brain theory of autism. Trends Cogn. Sci., 6:248-254, 2002.
Brown WM, Finn, CJ, Breedlove SM. Sexual Dimorphism in Digit-length Ratios of Laboratory Mice. The
anatomical Record 267:231-234, 2002a.
Brown WM, Hines M, Fane BA, Breedlove SM. Masculinized Finger Length Patterns in Human Males and
Females with Congenital Adrenal Hyperplasia. Horm. Behav. 42:380-386, 2002b.
Casto JM, Ward OB, Bartke A. Play, copulation, anatomy, and testosterone in gonadally intact male rats
prenatally exposed to flutamide. Phys.Behav. 79:633-641, 2003.
de Bruin EI, Verheij F, Wiegman T, Ferdinand RF. Differences in finger length ratio between males with autism,
pervasive developmental disorder-not otherwise specified, ADHD, and anxiety disorders. Developmental
Medicine &Child Neurology 48:962-965, 2006.
Dörner G, Götz F, Rohde W, Plagemann A, Lindner R, Peters H, Ghanaati Z. Genetic and Epigenetic Effects on
Sexual Brain Organization Mediated by Sex Hormones. Neuroendocrinol. Lett., 22:403-409, 2001.
329
Garcia-Falgueras A, Pinos H, Collado P, Pasaro E, Fernandez R, Jordan CL, Segovia S, Guillamon A. The role
of the androgen receptor in CNS masculinization. Brain Res., 1035:13-23, 2005.
Gorski RA, Harlan RE, Jacobson CD, Shryne JE, Southam AM. Evidence for the existence of a sexually
dimorphic nucleus in the preoptic area of the rat. J. Comp. Neurol., 193:529-39, 1980.
Hotchkiss AK, Ostby JS, Vandenbergh JG, Gray LE. Androgens and Environmental Antiandrogens Affect
Reproductive Development and Play Behavior in the Sprague-Dawley Rat. Environ Health Perspect 110:435439, 2002.
Hsu HK, Yang RC, Shih HC, Hsieh YL, Chen UY, Hsu C. Prenatal exposure of testosterone prevents SDN-POA
neurons of postnatal male rats from apoptosis through NMDA receptor. J. Neurophysiol., 86:2374–2380, 2001.
Jesmin S, Togashi H, Sakuma I, Mowa CN, Ueno K, Yamaguchi T, Yoshioka M, Kitabatake A. Gonadal
Hormones and Frontocortical Expression of Vascular Endothelial Growth Factor in Male Stroke-Prone,
Spontaneously Hypertensive Rats, a Model for Attention-Deficit/Hyperactivity Disorder. Endocrinology
145:4330-4343, 2004.
Kreze A, Langer P, Klimeš I, Stárka L, Payer J, Michálek J. (eds.) Všeobecná a klinická endokrinológia.
Academic electronic press, Bratislava pp. 912, 2004.
Manning JT, Baron-Cohen S, Wheelwright S, Sanders G. The 2nd to 4th digit ratio and autism. Developmental
Medicine &Child Neurology 43:160-164, 2001.
Manning JT, Scott D, Wilson J, Lewis-Jones DI. (). The ratio of 2nd to 4th digit length: A predictor of sperm
numbers and concentrations of testosterone, luteinizing hormone and oestrogen. Hum. Reprod. 13:3000–3004,
1998.
Miller EM. Prenatal sex hormone transfer: A reason to study opposite-sex twins. Person. Individ. Diff. 17:511529, 1994.
Morris JA, Jordan CL, Breedlove SM. Sexual differentiation of the vertebrate nervous system. Nat. Neurosci.,
7:1034-1039, 2004.
Peichel CL, Prabhakaran B, Voght TF: The mouse Ulnaless mutation deregulates posterior HoxD gene
expression and alters appendicular patterning. Development. 124:3481-3492, 1997.
Peters M, Mackenzie K, Bryden P. Finger length and distal finger extent patterns in humans. Am J Phys
Anthropol, 117: 209-17, 2002.
Rizwan S, Manning JT, Brabin BJ. Maternal smoking during pregnancy and possible effects of in utero
testosterone: evidence from the 2D:4D finger length ratio. Early Hum Dev. 83:87-90, 2007.
Williams TJ, Pepitone ME, Christensen SE, Cooke BM, Huberman AD, Breedlove NJ, Breedlove TJ, Jordan
CL, Breedlove SM: Finger-length ratios and sexual orientation. Nature 404:455-456, 2000.
Kontaktná adresa:
Mgr. Alžbeta Talarovičová, Univerzita Komenského v Bratislave, Prírodovedecká fakulta,
Katedra živočíšnej fyziológie a etológie, Mlynská dolina B-2, 842 15 Bratislava,
[email protected]
POSSIBLE INTERACTION OF SOMATIC CELL COUNT AND QUARTER MILK
FLOW PATTERNS
Tančin,V1 Ipema,2 A. H., Mačuhová,1 L., Uhrinčať,1 M., Hogewerf2 P.
1Slovak
Centre of Agricultural Research, Hlohovská 2, SK-949 92 Nitra, Slovakia, [email protected]
Sciences Group Wageningen UR, P.O. Box 65, NL-8200 AB Lelystad, The Netherlands
2Animal
Abstract
Milk flow parameters at udder and quarter levels were studied in relation to somatic cell
count (SCC) and other risk factors for mastitis (duration of decline and overmilking phase).
Thirty-eight Holstein cows in their first to sixth lactations were investigated during 10 mo of
lactation. Monthly milk samples were collected for SCC during morning milking. The SCC
differentially affected whole udder milk flow and quarter level milk flow. At both the udder
330
and quarter levels milk yield was reduced in groups with high SCC. Quarters with high SCC
(over 500 x 103 cells/mL) had lower peak flow rate and longer overmilking phases when
compared with quarters with low SCC (less than 200 x 103 cells/mL). The quarters with a
longer duration of the decline phase (over 80 s) had greater SCC and peak flow rate but had
lower milk yield compared with quarters with a shorter duration of the decline phase (less
than 27 s). Duration of the overmilking phase influenced all measured parameters except
SCC. We conclude that for good udder health the duration of the decline phase at the quarter
level should be considered for milking parameters and udder preparation before milking.
Introduction
Somatic cell count (SCC) is an indicator of mastitis and its relationship to the parameters
of milk flow pattern could be important for improving of milking conditions. The duration of
the decline phase for udder milk flow was positively correlated with SCC perhaps implying a
negative effect of overmilking individual quarters within the udder (Naumann et al., 1998).
Overmilking the udder creates a high risk for poor udder health (Natzke et al., 1978) although
no correlation between the duration of overmilking of earlier milked out quarter and SCC was
found (Wellnitz et al., 1999). It is also known that cows with a high peak flow rate are more
sensitive to mastitis (Grindal and Hillerton, 1991). Few studies have addressed the quarter
milk flow pattern or milkability and SCC (Naumann and Fahr, 2000; Kohler and Kaufmann,
2003). We have found that quarters with longer decline phases had greater SCC (Tančin et al.,
2002) and quarters with a high peak flow had a longer decline phase (Tančin et al., 2003,
2006). It is important to know if there are quarter milk flow characteristics that can be used
for earlier identification of health problems or if specific milk flow characteristics are risk
factors for mastitis.
An experiment was conducted to study the milk flow characteristics at the udder and
quarter levels in relation to SCC and other mastitis risk factors (duration of decline and
overmilking phase).
Materials and methods
The study was conducted at the experimental farm “De Vijf Roeden” in the Netherlands in
1999 and 2000. Thirty-eight Holstein cows (first to sixth lactation) were investigated during
10 mo of lactation. Cows were free of clinical symptoms of mastitis. Cows were milked twice
a day at 0530 and 1530 h in a 2 x 3 open auto tandem milking parlor. Premilking udder
preparation lasted 8 to 10 s per udder and consisted of forestripping, cleaning and drying with
331
a dry paper towel. A cluster was attached immediately after preparation. Quarter milk was
collected in receiver jars that were mounted in a basement below the milking stalls (Tančin et
al., 2006a). The milk samples for SCC were collected monthly at the end of a milking from
the quarter milk receiver jars. The cow was included in the statistical analysis if one quarter
was found to have SCC higher than 200 x 103 cells/mL. There were 3,262 quarter milk flow
curves and 804 udder milk curves flow from 22 cows (6 primiparous and 16 multiparous).
The milk yield and the milk flow measures at quarter and udder levels were analyzed by
the mixed model procedure (SAS, version 8.2, 2001). The results of SCC were log
transformed.
Results
The SCC differentially affected whole udder milk flow and quarter level milk flow (Table
1). At both the udder and quarter levels milk yield was reduced in groups with high SCC.
Quarters with high SCC (over 500 x 103 cells/mL) had lower PFR and longer overmilking
phases when compared with quarters with low SCC (less than 200 x 103 cells/mL). There was
a tendency for longer duration of the decline phase in quarters with high SCC but this effect
was not seen at the udder level.
The duration of decline phase at the quarter level influenced all measured end points
except the duration of the increase phase (Table 2). Quarters with long duration of the decline
phase (over 80 s) had higher SCC and higher PFR but had lower milk yield compared with
quarters with lower duration of the decline phase (less than 27 s). Quarters with longer
duration of decline phase had longer duration of overmilking. Duration of the overmilking
phase affected all measured parameters except SCC (Table 2).
Discussion
The duration of the decline phase and the PFR could be important factors related to SCC.
We found higher SCC in quarters with duration of decline phase over 80 s. The data agree
with our published results (Tančin et al., 2002). The quarters with a longer decline phase had
less milk yield and higher PFR than quarters with a shorter decline phase. Quarters with a
longer overmilking phase had lower milk yield and higher PFR but there was no effect on
SCC. On the basis of these findings we suggest that quarters with a long overmilking phase
are quarters that are milked out faster because of a higher PFR and a lower milk yield.
Quarters with a long decline phase could be more sensitive to health problems because they
are comprised mostly of quarters with high PFR (Grindal and Hillerton, 1991).
332
When SCC was evaluated, no difference in PFR at the udder level was detected but a
reduction of PFR in quarters with high SCC was observed. These quarters had the longest
duration of the decline phase in spite of the lowest PFR. We believe that one or more quarters
with high SCC within such udders reduce milk yield and consequently PFR. Additionally, we
can speculate that reduced PFR in such quarters could be related to high SCC by influencing
the free flow of milk through milk ducts from alveoli to cistern. Other unknown peripheral
mechanisms may limit milk flow as well (Bruckmaier et al., 1993). The relationship between
SCC and the decline phase is more difficult to explain because we do not know if a high SCC
is a consequence of or the reason for the longer duration of the decline phase. The majority of
machine-induced infections occur near the end of milking and a possible explanation could be
adapted from Philpot and Nickerson (1991). They discussed the possible importance of
reduced milk flow near the end of milking. Reduced milk flow near the end of milking
decreases the chance of microorganisms being flushed out of the teat and increases the
likelihood of infection in the quarter. The duration of decline phase at the quarter level,
therefore, should be minimized because of the possible negative relationship to udder health.
Present machine milking systems, however, are not able to reduce the duration of the decline
phase.
The duration of decline phase at the udder level indicates the overmilking of one or more
quarters. No effect of SCC score on the decline phase at the udder level was observed
although quarters with high SCC had the longest overmilking. A negative effect of the
duration of overmilking phase on udder health at the udder level has been described (Natzke
et al., 1978; Naumann et al., 1998) but this relationship seems to have less importance at the
quarter level (Wellnitz et al., 1999). Our data also showed that quarters with long duration of
overmilking did not differ in SCC from quarters with short overmilking. Osteras and Lund
(1988) reported that overmilking for > 1 min predisposes cows to subclinical mastitis under
field conditions.
References
Bruckmaier, R. M., M. Schallibaum, and J. W. Blum. 1993. Escherichia coli endotoxin-induced mastitis in dairy
cows: changes and importance of insulin-like growth factor I and oxytocin. Milchwissenschaft 48:374-378
Grindal, R. J., and J. E. Hillerton. 1991. Influence of milk flow rate on new intramammary infection in dairy
cows. J. Dairy Res. 58:263-268.
Kohler, S. D., and O. Kaufmann. 2003. Quarter-related measurements of milkings and milk parameters in an
AMS herd. Milchwissenschaft 58:3-6.
Natzke, R. P., P. A. Oltenacu, and G. H. Schmidt. 1978. Change in udder health with overmilking. J. Dairy Sci.
61:233-238
Naumann, I., and R. D. Fahr. 2000. Investigation of milk flow from udder quarters. Arch. Tierz., Dummerstorf
43:431-440
333
Naumann, I., R. D. Fahr, and G. Lengerken. 1998. Relationship between somatic cell count of milk and special
parameters of milk flow curves of cows. Arch. Tierz., Dummerstorf 41:237-250.
Osteras, O., and A. Lund. 1988. Epidemiological analyses of the associations between bovine udder health and
milking machine and milking management. Prev. Vet. Med. 6:91-108.
Philpot W. N., and S. C. Nickerson. 1991. Mastitis: counter attack. A strategy to combat mastitis. Published by
Babson Bros. Co., Naperville, IL
SAS 8,2 Institute Inc., Cary, NC, USA, 2001.
Tančin, V., B. Ipema, D. Peškovičová, P. Hogewerf, and J. Mačuhová. 2003. Quarter milk flow patterns in dairy
cows: factors involved and repeatability. Vet. Med. – Czech 48:275-282.
Tančin, V., B. Ipema, P. Hogewerf, P. Groot Koerkamp, S. Mihina, and R. M. Bruckmaier. 2002. Milk flow
patterns at the end of milking at the whole udder or quarter levels: relationship to somatic cell counts.
Milchwissenschaft 57:306-309.
Tančin, V., B. Ipema, P. Hogewerf, P., and J. Mačuhová. 2006. Sources of Variation in milk flow characteristics
at udder and quarter levels. J. Dairy Sci. 89:978-988
Wellnitz, O., R. M. Bruckmaier, and J. W. Blum. 1999. Milk ejection and milk removal of single quarters in high
yielding dairy cows. Milchwissenschaft. 54:303-306.
Kontaktná adresa: doc. Ing. Vladimír Tančin, DrSc.Slovak Centre of Agricultural Research,
Hlohovská 2, SK-949 92 Nitra, Slovakia, [email protected]
Table 1. Least squares means and SEM of measured variables at udder and quarter level in
relation to the level of somatic cell count (SCC).
Udder level SCC, cells/mL
Quarter level SCC, cells/mL
2x105-
< 2x105
Number
353
a
Milk yield, kg
18.61±0.47
a
Milking time, s
463± 5
Peak flow, kg/min 3.79±0.21a
2x105-5x105
> 5x105
210
241
b
17.61±0.45
b
P<
5x105
< 2x105
2669
b
17.30±0.47
b
> 5x105
291
a
0.0001 4.29±0.14
a
P<
302
b
4.01±0.14
b
3.61±0.14c
b
0.0001
429±14
434±15
0.0001 372±13
362±12
367±13
0.0001
3.94±0.21b
3.79±0.21a
0.0009 0.95±0.05a
0.91±0.04a
0.83±0.05b
0.0001
Milk yield in 1st
min, g
1661±104
1732±105
1582±105
0.1114 422±21a
398±23b
320±23c
0.0001
Phase increase, s
83±4
81±4
83±4
0.8106 75±4
75±4
75±4
0.9159
a
b
b
212±10
172±10
178±10
0.0001 231±16
221±16
228±16
0.0875
Phase of decline, s 169±10
171±10
168±10
0.8996 63±6
67±6
70±6
0.0578
66±6a
62±7a
79±7b
0.0042
Phase plateau, s
Phase
of
overmilking, s
abc
Least squares means within 1 line of evaluated level without a common superscript letter
were significantly different at P < 0.05
334
Table 2. Least squares means and SEM of measured variables in relation to the duration of
decline and overmilking phases
Category of decline, s
<27
Number
Category of overmilking, s
27-79
>80
P<
789
1695
a
Milk yield, kg
4.04±0.15
a
Milking time, s
Peak flow, kg/min 0.79±0.05
min, g
Phase increase, s
346±22a
75±4
286±16
985
b
3.75±0.15
b
>100
0.99±0.05
392±23b
400±23c
P<
0.0001 0.83±0.05
161±15
of
overmilking, s
log
cells/mL
x,
63±7a
74±7b
71±7b
4.68±0.08a
4.87±0.07b
4.91±0.08b
309±13
b
0.96±0.04
380±21b
426±23c
b
72±4
b
0.0001
0.0001
c
0.90±0.04
75±4
0.0001 278±15
3.65±0.15c
c
b
a
Phase of decline, s
Phase
334±23a
0.7471 80±5
c
3.98±0.14
366±12
a
0.0001
1019
b
b
a
76±4
232±15
0.0001 4.27±0.15
0.0001 427±12
c
0.89±0.05
b
1258
a
a
358± 13
b
75±4
a
Phase plateau, s
4.11±0.14
359±13
385±13
Milk yield in 1st
778
a
b
a
abc
15-99
of
quarters
SCC
<15
0.0001
0.0001
0.0002
c
227±14
173±15
0.0001
75±4a
68±4b
65±5b
0.0001
4.80±0.08
4.77±0.08
4.85±0.08
0.0025
0.0003
Least squares means within 1 line of evaluated level without a common superscript letter
were significantly different at P < 0.05.
PROTEÍNY AKÚTNEJ FÁZY VO VZŤAHU K VYBRANÝM UKAZOVATEĽOM
VNÚTORNÉHO PROSTREDIA U DOJNÍC
ACUTE PHACE PROTEINS IN RELATION TO SELECTED PARAMETERS OF
INTERNAL STATUS IN DAIRY COWS
Tóthová, Cs., Nagy, O., Konvičná, J., Petrovič, V., Pisarčíková, J., Kováč, G.
University of Veterinary Medicine, Košice, Slovak Republic
Abstrakt
Zámerom práce bolo sledovanie koncentrácie vybraných proteínov akútnej fázy –
haptoglobínu (Hp) a sérového amyloidu A (SAA) – v krvnom sére dojníc vo vzťahu k rôznym
fázam reprodukčného cyklu, ako aj vo vzťahu k niektorým ukazovateľom bielkovinového
metabolizmu (celkové bielkoviny, albumín, urea, kreatinín, celkové imunoglobulíny).
Analýzy boli vykonané celkovo u 64 dojníc plemena slovenský strakatý dobytok, ktoré boli
rozdelené do 9 skupín podľa reprodukčného obdobia – od 4 týždňov pred pôrodom do 10
týždňov po pôrode. V prípade Hp a SAA sme zaznamenali významné rozdiely priemerných
hodnôt ich koncentrácií v jednotlivých skupinách počas sledovaného obdobia (P<0,05 resp.
335
0.1526
P<0,001). Koncentrácie Hp a SAA u dojníc v ranom popôrodnom období boli signifikantne
vyššie v porovnaní s neskorším popôrodným obdobím. Významné rozdiely priemerných
hodnôt počas sledovaného obdobia sme zistili aj u celkových bielkovín (P<0,001), urey
(P<0,001) a celkových imunoglobulínov (P<0,05). Koncentrácia albumínu, ako jedného
z predstaviteľov negatívnych proteínov akútnej fázy, sa postupne znižovala v popôrodnom
období až po obdobie 4 týždne po pôrode. Pri hodnotení korelačných vzťahov bola zistená
významná korelácia dynamiky medzi Hp a SAA (P<0,001), celkovými bielkovinami a ureou
(P<0,05), resp. celkovými imunoglobulínmi (P<0,01), a medzi celkovými imunoglobulínmi
a ureou (P<0,001). Naše výsledky poukazujú na to, že v období okolo pôrodu dochádza
k významným
zmenám
v koncentrácii
proteínov
akútnej
fázy,
ako
aj
v celom
bielkovinovom metabolizme dojníc.
Abstract
The aim of this study was to evaluate the concentrations of selected acute phase
proteins – haptoglobin (Hp) and serum amyloid A (SAA) – in blood serum of dairy cows in
relation to different phases of reproduction cycle, as well as to some variables of protein
metabolism (total proteins, albumin, urea, creatinin, total immunoglobulins). The analysis
were performed in dairy cows of a low-land black spotted breed divided into 9 groups
according to the reproduction period – from 4 weeks before parturition to 10 weeks after
parturition. In case of Hp and SAA we found significant differences in average values of their
cocentrations in several groups during the monitored period. The Hp and SAA concentrations
in cows during early postparturient period were significantly higher compared with later
postparturient period. We found significant differences of average values throughout the
monitored time in total proteins (P<0,001), urea (P<0,001), and total immunoglobulins
(P<0,05). The concentration of albumin, like one of representant of negative acute phase
proteins, decreased progressively in postparturient period until 4 weeks after parturition. In
assessment of correlation relations we found significant correlations of dynamics between Hp
and SAA (r=0,916; P<0,001), total proteins and urea (r=0,668; P<0,05), total proteins and
total immunoglobulins (r=0,826; P<0,01), and between total imunoglobulins and urea
(r=0,899; P<0,001). Our results suggests, that in time around parturition there are significant
changes in concentrations of acute phase proteins, as well as in complete protein metabolism
of dairy cows.
336
Úvod
Prechodné, alebo peripartálne obdobie je najkritickejším obdobím u dojníc z pohľadu
zdravia, produkcie a úžitkovosti. Predstavuje konečnú fázu gravidity a začiatok laktácie,
spravidla 3 týždne pred a 3 týždne po pôrode (Grummer a kol., 1995). Väčšina infekčných
ochorení a metabolických porúch, ako pôrodná paréza, ketóza, syndróm stučnenia kráv,
dislokácie slezu, zadržanie lôžka, metritída, sa vyskytuje u kráv v tomto období (Stabel a kol.,
2003). Imunosupresia v uvedenom období vedie k zvýšenej náchylnosti k mastitídam
(Mallard a kol., 1998). V dôsledku oslabenia imunitného systému kravy sa stanú menej
rezistentnými voči infekčným ochoreniam, nastávajú veľké zmeny v celom metabolizme
a naruší sa homeostáza. Na tieto zmeny zvieratá reagujú sledom fyziologických reakcií.
Jedným z nich je aj odpoveď akútnej fázy zápalu ako súčasť všeobecného nešpecifického
imunitného systému. Základná odpoveď na vniknutie patogénov alebo poškodenie sa začína
aktiváciou makrofágov. Aktivované makrofágy uvoľňujú celý rad produktov známych ako
cytokíny, z ktorých najvýznamnejšie sú TNF-α, interleukín-1 a interleukín-6. Uvedené
mediátory medzi inými funkciami podporujú produkciu rôznych proteínov v pečeni, ako sú
sérový amyloid A (SAA) a haptoglobín (Hp) (Kováč a kol., 2005). Zámerom práce bolo
sledovanie koncentrácie vybraných proteínov akútnej fázy – haptoglobínu a sérového
amyloidu A – v krvnom sére dojníc vo vzťahu k rôznym fázam peripartálneho obdobia, ako aj
vo vzťahu k niektorým ukazovateľom bielkovinového metabolizmu.
Materiál a metodika
Vybrané proteíny akútnej fázy – haptoglobín (Hp) a sérový amyloid A (SAA) - a
vybrané parametre bielkovinového profilu - celkové bielkoviny (CB), albumín (Alb), urea
(U), kreatinín (Kreat) a celkové imunoglobulíny (CIg) - boli sledované celkovo u 64 dojníc
plemena slovenský strakatý dobytok a jeho krížencov v poľnohospodárskom podniku
s modernizovanou technológiou chovu. Zvieratá boli kŕmené 2 krát denne osobitnou kŕmnou
dávkou podľa fázy laktácie a produkcie mlieka. Základ ich krmiva tvorili objemové krmivá,
a to siláž a senáž. Dojnice mali voľný prístup k pitnej vode z vlastnej studne. Zvieratá boli
rozdelené do 9 skupín podľa určitých štádií predpôrodného a popôrodného obdobia: 1. - 4
týždne pred pôrodom (n=6), 2. – 1 týždeň pred pôrodom (n=8), 3. – 1 týždeň po pôrode (n=6),
4. – 2 týždne po pôrode (n=11), 5. – 3 týždne po pôrode (n=7), 6. – 4 týždne po pôrode (n=6),
7. – 5 týždňov po pôrode (n=6), 8. – 8 týždňov po pôrode (n=7), 9. – 10 týždňov po pôrode
(n=7).
337
Všetky parametre sa hodnotili v krvnom sére. Krv sa odoberala priamou punkciou v.
jugularis. Pred každým odberom boli zvieratá klinicky vyšetrené bežnými klinickými
vyšetrovacími metódami. Hodnoty CB, Alb, U a Kreat sa stanovovali automatickým
biochemickým analyzátorom Alizé firmy Lisabio. CIg sa analyzovali spektrofotometricky
turbidimetrickou metódou zink-sulfátovým testom. Stanovenie Hp a SAA bolo vykonávané
metódou enzýmovej imunoanalýzy (ELISA) použitím komerčných ELISA testov firmy
Tridelta Development, Ltd. , Wicklow, Írsko.
Vyhodnotenie dosiahnutých výsledkov bolo vykonané stanovením priemerných
hodnôt (x) a smerodajných odchýlok (sd). Významnosť rozdielov priemerných hodnôt vo
vzťahu k jednotlivým sledovaným obdobiam bola hodnotená 1 faktorovou analýzou rozptylov
(ANOVA). Významnosť rozdielov priemerných hodnôt medzi jednotlivými skupinami bola
vyhodnotená nepárovým t-testom. Zároveň boli vyhodnotené korelačné vzťahy medzi
sledovanými ukazovateľmi.
Výsledky
Výsledky stanovenia koncentrácie Hp, SAA a parametrov bielkovinového profilu sú
zhrnuté v tabuľke 1. Blížiacim sa pôrodom sme u dojníc zaznamenali postupné zvyšovanie
koncentrácií Hp a SAA, pričom ich najvyššiu priemernú hodnotu (346,64 resp. 127,83 µg/ml)
sme zistili u dojníc 1 týždeň po pôrode. V skupine 2 týždne po pôrode sme pozorovali
významný pokles koncentrácie SAA (P<0,05). K signifikantnému zníženiu priemernej
hodnoty Hp došlo až u dojníc 3 týždne po pôrode. Rozdiely priemerných hodnôt koncentrácie
Hp a SAA počas celého sledovaného obdobia v jednotlivých skupinách dojníc boli významné
(ANOVA, P<0,05 resp. P<0,001).
Štatisticky významné rozdiely sme zistili aj u CB (P<0,001), U (P<0,001) a CIg
(P<0,05). Po signifikantnom poklese koncentrácie CB u dojníc 1 týždeň pred pôrodom došlo
k následnému vzostupu ich hodnoty, s ďalším významným zvýšením priemernej hodnoty 2
týždne po pôrode (P<0,05). V koncentráciách CIg sme pozorovali počas sledovania trend
postupného zvyšovania hodnôt. Najvyššiu priemernú koncentráciu 31,82 UZST sme
zaznamenali u dojníc 10 týždňov po pôrode. V prípade albumínu sme zistili opačný trend, a to
postupné znižovanie jeho koncentrácie v krvnom sére dojníc počas peripartálneho obdobia.
Pri hodnotení korelačných vzťahov medzi Hp a SAA bola významná korelácia (P<0,001).
Hodnotením korelačných vzťahov medzi sledovanými ukazovateľmi bielkovinového profilu
sme zistili významnú koreláciu dynamiky medzi CB a U (P<0,05), resp. CIg (P<0,01), a
medzi CIg a U (P<0,001).
338
Diskusia
Úlohou proteínov akútnej fázy je izolovať a neutralizovať patogény, zamedziť ich
ďalšiemu šíreniu, minimalizovať poškodenie tkaniva, podporovať opravné procesy a obnoviť
normálne fyziologické funkcie (Kushner, 1982). Koncentrácia sérového amyloidu A sa
zvyšuje v krvnom sére dojníc bezprostredne po pôrode (Alsemgeest a kol., 1993). Ametaj
(2005) tiež uvádza, že k zvýšeniu dvoch hlavných proteínov akútnej fázy, Hp a SAA,
dochádza hneď po pôrode. My sme pozorovali nesignifikantné zvýšenie ich koncentrácií už 1
týždeň pred pôrodom. Koncentrácie Hp a SAA sú zvýšené úmerne k počtu somatických
buniek a zápalovým procesom mliečnej žľazy (Kováč a kol., 2007).
Pechová a kol. (2002) sledovali dojnice v období od 2 týždňov pred pôrodom do 5
týždňov po pôrode, počas ktorého koncentrácia albumínu bola rovnaká a neprekročila
fyziologické rozpätie. My sme zaznamenali postupné klesanie jeho koncentrácie
v peripartálnom období, najnižšiu hodnotu 35,03 g/l sme zistili u dojníc 4 týždne po pôrode.
Albumín, ako jeden z predstaviteľov negatívnych proteínov akútnej fázy, je vhodnejším
ukazovateľom pri rozlišovaní chronických procesov od akútnych stavov, k výraznému
znižovaniu jeho koncentrácie v plazme totiž dochádza najmä pri chronických ochoreniach. Pri
chronických infekciách odpoveď pozitívnych proteínov akútnej fázy je menej evidentná
(Stephensen, 1999).
Rôzne typy imunoglobulínov, sú vylučované bovinnými plazmatickými bunkami. Van
Kampen a Mallard (1997) uvádzajú, že pred pôrodom a pri pôrode sa nachádza v krvi menšie
množstvo B-buniek, než po pôrode. Vzhľadom na ich funkčnú aktivitu sa v období okolo
pôrodu pozoruje znížená produkcia protilátok. Aj naše výsledky poukazujú na to, že
v peripartálnom období je nižšia koncentrácia celkových imunoglobulínov v krvi, k ich
zvyšovaniu dochádza až v neskoršom popôrodnom období. Mordak a Nicpoń (2006)
zaznamenali v postpartálnom období nižšiu koncentráciu celkových proteínov. Spomínané
znižovanie môže byť zapríčinené transferom γ-globulínov z krvi do mliečnej žľazy
(Kupczyński a kol., 2002). Naše výsledky sú v rozpore s týmito tvrdeniami, my sme totiž
zaznamenali v popôrodnom období signifikantné zvýšenie ich koncentrácií.
Záver
Naše výsledky poukazujú na to, že v období okolo pôrodu dochádza k významným
zmenám v koncentrácii proteínov akútnej fázy, ako aj v celom bielkovinovom metabolizme
dojníc. Zaznamenali sme v sledovanom období signifikantné zmeny v dynamike ich hodnôt
ako aj niektoré korelačné súvislosti.
339
Literatúra
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Ametaj, B.N.: A new understanding of the causes of fatty liver in dairy cows. Advances in Dairy
Technology, 17, 2005: 97-112.
Alsemgeest, S.P., Taverne, M.A., Boosman, R., van der Weyden, B.C., Gruys, E.: Peripartum acutephase protein serum amyloid-A concentration in plasma of cows and fetuses. Am. J. Vet. Res., 54 (1),
1993: 164-167.
Grummer, R.R.: Impact of changes in organic nutrient metabolism on feeding the transition dairy cow.
J. Anim. Sci., 73, 1995: 2820-2833.
Kováč, G., Popelková, M., Tkáčiková, Ľ., Burdová, O., Ihnát, O.: Interrelationship between somatic cell
count and acute phase proteins in serum and milk of dairy cows. Acta Vet. Brno, 76, 2007.
Kováč, G., Vargová, M., Popelková, M.: Proteíny akútnej fázy u zvierat. VI. Celoslovenský seminár
z fyziológie živočíchov. 8 – 9. júna 2005. SPU Nitra. Zborník z vedeckých seminárov s medzinárodnou
účasťou. 113-116. ISBN 80-8069-526-1.
Kupczyński, R., Chudoba-Drozdowska, B.: Values of selected biochemical parameters of cows blood
during their Drying-off and the beginning of lactation. Electronic Journal of Polish Agricultural
Universities, Veterinary Medicine, 5(1), 2002.
Kushner, I.: The phenomenon of the acute phase response. Ann. N. Y. Acad. Sci., 389, 1982: 39-48.
Mallard, B.A., Dekkers, J.C., Ireland, M.J., Leslie, K.E., Sharif, S., Van Kampen, C.L., Wagter, L.,
Wilkie, B.N.: Alteration in immune responsiveness during the peripartum period and its ramification on
dairy cow and calf health. J. Dairy. Sci., 81, 1998: 585-595.
Mordak, R., Nicpoń, J.: Values of some blood parameters in dairy cows before and after delivery as
a diagnostic monitoring of health in herd. Electronic Journal of Polish Agricultural Universities,
Veterinary Medicine, 9(2), 2006.
Pechová, A., Podhorský, A., Lokajová, E., Pavlata, L., Illek, J.: Metabolic effects of chromium
supplementation in dairy cows in the peripartal period. Acta Vet. Brno, 71, 2002: 9-18.
Stabel, J.R., Goff, J.P., Kimura, K.: Effects of supplemental energy on metabolic and immune
measurements in periparturient dairy cows with Johnes disease. J. Dairy Sci., 86, 2003: 3527-3535.
Stephensen, C.B.: Burden of infection on growth failure. J. Nutr., 129, 1999: 5348-5388.
Van Kampen, C., Mallard, B.A.: Effects of peripartum stress and health on circulating bovine
lymphocyte subsets. Veterinary Immunology and Immunopathology, 59, 1997: 79-91.
Tabuľka 1. Koncentrácia Hp, SAA a vybraných ukazovateľov bielkovinového profilu
v krvnom sére dojníc v sledovaných obdobiach reprodukčného cyklu (x ± sd).
Parametre
Hp
Anova
Skupiny dojníc
x
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
60,49
83,04
346,64a,
106,69
26,5a
172,6
32,48
32,25
31,99
9
b
c
d
285,4
79,13
78,87
48,36
70,67
38,88
40,91
24,59i
c
g
d,h
b,c,d
(µg/ml)
sd
37,82
189,30
283,83
163,17
25,61
P
< 0,05
0
SAA
x
34,81b,e,j
9,16f,j
e,f,g,h,i
4,78
57,35
74,71
33,21
12,08
59,81
33,25
34,67
31,64
x
75,15a
67,88a,A,
70,13e,f,g
76,55A,e
74,81
84,27
79,38
81,19
83,50
,b
c,d,B,C,D
,h,E
c,i
d,f
B,g
C,h
b,D,E,i
5,47
5,07
5,32
4,51
11,76
5,23
7,82
8,29
36,52
37,36
35,64
35,03
40,25
38,54
40,00
a,b,c,d
c
sd
(g/l)
127,83a,
sd
(g/l)
Alb
51,35
,c,d
(µg/ml)
CB
6,31a,b
x
4,83
a
40,12
b
38,54
< 0,001
< 0,001
n. s.
d
340
sd
x
U
a,
3,81
1,74
4,81
b,C,D
3,77
c,E,F
3,88
A,B
(mmol/l)
sd
x
Kreat
4,07
0,57
133,9
3,66
4,69
0,49
0,45
b
x
CIg
(UZST)
sd
17,28
4,39
2,56
d
4,09
130,40
122,25
31,20
C,b,
23,88
23,44
A,a,B
D
2,57
3,87
3,79
A,
5,13
3,87
4,26
4,90
5,47B,
C.E,G
0,90
c
118,12
0
sd
d
d,G
A,a
(µmol/l)
4,49
a,b,c,
0,87
0,49
0,77
1,25
0,87
98,83
106,2
111,7
122,8
118,9
a
A,b,c,d,e
d
7
8
1
3
21,84
14,52
14,62
18,38
23,32
17,79
25,41
26,85
27,31
28,28
30,26
31,61
31,82
A,C
a,b
B,D
3,47
5,82
5,01
4,59
3,22
8,02
n. s.
e
24,48
8,01
< 0,001
D,F
< 0,05
Rovnaké indexy v riadkoch znamenajú štatistickú významnosť rozdielov priemerných hodnôt
medzi jednotlivými skupinami:
a, b, c, d, e, f, g, h, i, j - P<0,05
A, B, C, D, E, F, G - P<0,01
VIABILITY OF PREIMPLANTATION RABBIT TRANSGENIC EMBRYOS
Turanova Z.,1,2 Makarevich A.V1., Bauer M1., Chrenek P.1,2
1Slovak
2Faculty
Agricultural Research Centre in Nitra, Slovak Republic
of Biotechnology and Food Sciences, Slovak University of Agriculture in Nitra, Slovak Republic
Abstract
The objective of this study was to compare quality of transgenic (TR) and nontransgenic rabbit embryos in relation to preimplantation developmental rate, a number of
blastomers in ICM and percentage of apoptotic index.
The TR embryos were produced by microinjection of the EGFP and hFVIII genes into
both pronuclei of fertilized rabbit eggs. The developmental rate and allocation of EGFP
positive cells was examined at blastocyst (96h PC) by fluorescent microscope or by PCR as in
case of hFVIII gene using. The transgenic rabbit embryos with hFVIII gene were also
produced by mating of transgenic rabbits and flushing at 1-cell stage.
Percentage of transgenic embryos reached blastocyst stage (90 and 88%) did not differ
significantly from those in non-transgenic embryos (98% resp.). Based on fluorescence
analysis the integration rate of EGFP gene in blastocyst stage embryos was 20%. The
efficiency of hFVIII transgene integration as determined by PCR was 17%. No differences
were observed in the total cell number, ICM area cell number and apoptotic nuclei between
the groups. The higher number of total cell (142) and ICM area cells (36) were found in no-
341
transgenic rabbit embryos. The index of apoptotic nuclei (2.8%) was detected in nontransgenic rabbit embryos.
Our preliminary results indicate that transgenic rabbit embryos (with EGFP or hFVIII
gene construct) are of comparable quality with non-transgenic ones in concern of blastocyst
rate, total and ICM area cell number and apoptotic index.
Introduction
In vitro manipulations on embryos have been widely used to produce genetically
modified (transgenic or cloned) animals. The main obstacle at this technologies is lower
survival and developmental abnormality of embryos. It could be caused by instability of
integrated transgene or by other factors. Biological material in in vitro conditions is different
in quality and vitality compared to in vivo conditions. Although efficiency of non-transgenic
embryos production in in vitro conditions increased in the last decade, the quality of these
embryos is still different compared to in vivo-derived embryos, particularly in morphology
and metabolism, chromosomal abnormalities (Shi et al., 2004) and ultrastructural changes
(Popelková et al., 2005). Cleavage-stage arrest of embryos was also documented in different
species, including human, bovine, mice and rabbit and their relation to apoptosis. Production
of transgenic embryos by microinjection of foreign gene into pronucleus of fertilized eggs
resulted in decrease of survival of microinjected embryos (Makarevich et al., 2005). This may
be caused by several factors including microinjection technique (single or double) (Chrenek et
al., 2005), culture conditions (Chrenek et al., 1998), transgene localization, number of copies
in the genome of embryo, total and ICM area cell number. The aim of this study was to
compare quality of transgene and non-transgene rabbit embryos in relation to blastocyst rate,
total cell number and ICM cell number in embryos and apoptotic index.
Material and Methods
Biological material
Three days before mating, New Zealand White rabbit donors (SARC Nitra) were
treated with PMSG (Werfaser, 20 IU/kg of body weight, Austria) followed by hCG
(Werfachor, 40 IU/kg of body weight, Austria) 72h later (Chrenek et al., 2002). At 19 to 20h
after mating, the pronuclear stage eggs were flushed from the oviducts of the animals with
PBS. The selection of flushed eggs were done in CIM medium+10%FCS (Gibco BRL). The
embryos were cultured in in vitro conditions (5%CO2, 39°C, k-DMEM + 10% FCS. Gibco
BRL) as was early reported (Chrenek et al., 2005).
342
Gene constructs
The EGFP reporter gene were used for microinjection into fertilized rabbit eggs after
linearization of the plasmid (Clontech, USA) with Cla I. The second gene construct consists
of a 2.5 kb murine whey acidic protein promoter (mWAP), 7.2 kb cDNA of the human
clotting factor VIII (hFVIII), and 4.6 kb of 3’ flanking sequences of the mWAP gene. This
gene had been provided by Dr. H. Lubon, American Red Cross, MD, USA. The plasmid was
digested with Not I to release the 14.3 kb insert and purified in a Qiaex II gel extraction kit
(Qiagen, USA).
Production of rabbit transgenic embryos in vitro (EGFP gene)
After the evaluation of the flushed ova, the eggs with both pronuclei were subjected to
microinjection in CIM medium +10% fetal bovine serum (FBS, both from Gibco BRL, USA)
using Olympus microscope equipped with micromanipulation units (Alcatel, France) and
microinjector (Eppendorf, Femto Jet, Germany). The eggs were fixed by suction with a
holding pipette, and 4µg/ml of the DNA (EGFP or hFVIII) in 1-2 pl were microinjected using
air pressure into one pronucleus (single microinjection, SM). Swelling of pronuclei by 10%
indicated successful microinjection. The eggs were cultured in k-DMEM medium
supplemented with 10% FBS (Gibco BRL, USA) at 5% CO2 and 39°C up to the blastocyst
stage (96hpc) for the analysis of transgene integration using fluorescent microscope (Chrenek
et al., 2005).
Production of rabbit transgenic embryos in vivo (hFVIII gene)
Transgenic rabbits (F4 generation) carrying human factor VIII (gene construct
mWAP-hFVIII, Chrenek et al., 2005) were mated to produce rabbit transgenic embryos,
which were then flushed out from oviducts at 1-cell (20hpc).
Differential staining
Embryos were incubated in freshly prepared 0.2% Triton X-100 in PBS containing
2mg/ml BSA for 20s, and immediately washed twice in PBS-BSA medium. Embryos were
transferred into PBS-BSA containing 30µg/ml propidium iodid (PI) and incubated in the dark
for 5min in a 37°C warm chamber, and washed twice in PBS-BSA medium. Next, embryos
were incubated in 4% paraformaldehyd (PFA) containg 10µg/ml bisbenzimide (Hoechst) for
30min at RT, followed by twice washing in PBS-BSA medium. Embryos were incubated in
a freshly prepared ice-cold solution of 0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate (v/v) for 5
min and then washed twice in PBS-BSA medium. Washed embryos were mounted on glass
slides and examined under a Leica fluorescence microscope.
Analysis of apoptosis (TUNEL)
343
Transgenic embryos were removed from culture medium, washed 3x5min in PBS
supplemented with PVP (PBS-PVP, 4mg/ml) and then fixed for 5min in 3.7% formaline and
for 10min in 70% ethanol. For membrane permeabilization, embryos were incubated for
15min in 0.5% Triton X-100 in PBS. The embryos were processed for TUNEL using
a MEBSTAIN Direct Apoptosis Detection Kit (Immunotech, Marseilles, France) according to
the kit instructions. Afterwards, the embryos were counterstained with propidium iodid (PI, 1
µg/ml v PBS). After the washing, embryos were placed on a coverslip and covered with 5µl
of Vectashield mounting medium (Vector Laboratories, Burlingame, CA). For ICM
(embryoblast) determination, the method of differential staining including incubation of
embryos in PI and Hoechst 33342 (Chrenek et al., 2005) was used.
PCR
Total DNA was isolated from microinjected embryos, reached the blastocyst stage
(Chrenek et al., 2005). As negative controls, DNA isolated from non-microinjected rabbit
embryos. DNA was subjected to 30 cycles of amplification (30s at 94 °C, 30s at 64 °C, and
30s at 72 °C) using two sets of primers for the hFVIII gene: 5'-GTA GAC AGC TGT CCA
GAG GAA-3' and 5'-CAT GCT GAA TAG CTT CAC GAG TCT T-3' giving a PCR product
of 357 bp, or 5'-GTA GAC AGC TGT CCA GAG GAA-3' and 5'-GAT CTG ATT TAG TTG
GCC CAT C-3' with a PCR product of 578 bp (Paleyanda et al., 1997).
Statistic analysis
Total number of blastomere, ICM cells, number of apoptotic nuclei were analysed by
SAS software (SAS Institute, 2002).
Results and discussion:
The rate of development of rabbit embryos microinjected with either the EGFP or
hFVIII gene constructs into the male pronucleus (SM) is presented in Table 1. No significant
difference in development rate up to blastocyt stage of microinjected rabbit embryos (90 vs
88%) between EGFP and hFVIII gene construct was found. Based on fluorescence analysis
the integration rate of EGFP gene in blastocyst stage embryos was 20%. The efficiency of
hFVIII transgene integration as determined by PCR was 17%.
The total cell number, number of cells in ICM area and percento of apoptotic cells
apoptotic index of transgenic rabbit embryos at blastocyst stage are shown in Table 2. No
differences were observed in the total cell number, ICM area cell number and apoptotic nuclei
between the groups. The higher number of total cell (142) and ICM area cells (36) were found
344
in no-transgenic rabbit embryos. The lower number of apoptotic nuclei (2.8%) we detected in
non-transgenic rabbit embryos.
Table 1. In vitro development of microinjected rabbit embryos and transgene integration rate
____________________________________________________________________________________________________________
Treatment
group
Number
Morula
Blastocyt
Transgene
of
stage
stage
integration
embryos
n/N
n/N
n/N
N
(%)
(%)
(%)
________________________________________________________________________
EGFP
100
90/100(90) 90/100(90)
18/90 (20)
hFVIII
100
89/100(89) 88/100(88)
15/88 (17)
________________________________________________________________________
Non-injected 100
98/100 (98) 98/100 (98)
________________________________________________________________________
Table 2. Influence of gene integration on the quality of preimplantation rabbit transgenic
embryos
____________________________________________________________________
Gene
no. of
Total cell
No.
Apoptotic
Apoptotic
construct
embryos
number
ICM
cells
index
N
of Blastocyst
cells
embryo
n (%)
n (%)
(%)
____________________________________________________________________
EGFP
50
133 ± 2.1
35 ± 0.5(26) 6 ±0.1
(4.5) ± 0.2
hFVIII
50
126 ± 1.8
31 ± 0.3(25)
4 ± 0.1
(3.2) ±0.1
Non-TR
25
142 ± 2.2
36 ± 0.6(25)
4 ± 0.1
(2.8) ±0.1
____________________________________________________________________
Microinjection of foreign gene into the pronucleus of eggs can result in DNA
rearrangement during integration and can cause decreased yield of blastocyst stage embryos
(Voss et al. 1996). It is possible that other factors, associated with the microinjection itself, for
example, mechanical damage by microinjection pipette, exposure of the zygote to a
microscope light of a higher intensity, or their combination may result in decreased quality of
Mi-derived
embryos.
In
our
experiments
lower
developmental
rate
of
microinjected/transgenic rabbit embryos was observed, it was not different from nontransgenic control.
Present results, obtained on the embryos microinjected/transgenic with two different
gene constructs demonstrated that embryo cell number and ICM area cell number were
comparable to those in the non-microinjected/non-transgenic embryos. The microinjection
345
procedure in our study tended to decrease blastocyst rate and cell number, but embryo quality
was not significantly affected compared to non-transgenic one.
Acknowledgment:
This work was supported by the Slovak Research and Development Agency under the
contract No. LPP-0126-06.
References:
Chrenek P. et al.: Theriogenology 50, 1998, 659-666.
Chrenek P. et al.: Czech J. Anim Sci., 47(2), 2002, 45-49.
Chrenek P. et al.: Transgenic Res, 14, 417- 428, 2005.
Chrenek P. et al.: Zygote 13, 39-44, 2005.
Makarevich A.V. et al.: Zygote 13, 125-137, 2005.
Popelkova M. et al.: Zygote 13 (4), 2005, 283-293.
Voss, A.K. et al.: Theriogenology 34, 1996, 813-824.
ULTRASONOGRAFICKÉ A HISTOLOGICKÉ SLEDOVANIE ÚČINKU
HORMONÁLNEJ INDUKCIE ESTRU BAHNÍC MIMO CHOVATEĽSKEJ SEZÓNY
ULTRASONOGRAPHIC AND HISTOLOGICAL STUDY OF HORMONAL OESTRUS
INDUCTION EFFECT IN ANESTROUS EWES
Vlčková, R., Valocký, I., Lazar, G., Maraček, I.
Katedra normálnej anatómie, histológie a fyziológie, Ústav fyziológie, UVL Košice
Abstract
Ultrasonic imaging of ovarian structures is rapid and highly accurate method for veterinary
applications in sheep reproduction. In the present study, ovaries were USG analysed with 5.0
MHz linear and 7.5 MHz convex transducer. Follicular data were analysed quantitatively and
qualitatively. The ovaries were picked up at the end of laparotomy and fixed in 10 %
formalin. Sections of ovarian tissue were stained with haematoxylin and eosin and Azan
staining. Ovarian slides were microscopically studied and quantitatively and qualitatively
analysed by LUCIA-G ver. 4.6. Number of follicles < 3 mm monitored by USG was
significant lower (P<0.01) after CIDR-G treatment. Image analysis of ovary sections
determined not significant increase in total number of follicles and follicles < 3 mm opposite
to that monitored by USG. Half of total number of antral follicles visible on the ovary surface
is prepared for recruitment. The rate of atresia is not significantly higher after CIDR-G
treatment and follicles in selection undergone atresia in 100 %. Increase in the number of
follicles < 3 mm monitored by USG is due to impossibility of USG to notice image of
follicles beginning to create the cavity and with very small cavities. We observed better effect
on the follicle surviving after used FGA with 1000 IU eCG treatment.
346
Úvod
Ultrasonografické zobrazovanie je veľmi presnou a rýchlou metódou pre hodnotenie štruktúry
ovárií. Ultrasonografické snímače s lineárnym prevodníkom sú najvhodnejšie pre veterinárne
aplikácie vyžadované u mliečneho dobytka a v reprodukcii oviec (6). Ultrasonograf vybavený
7.5 MHz prevodníkom má lepšie využitie v štúdiu malých ovariálnych štruktúr (vyvíjajúce sa
folikuly), pretože má detailnejší obraz. V tejto práci sme analyzovali stav folikulov oviec
v anestrickom období, ošetrených progesterónom/syntetickým gestagénom (Fluorogestón
acetát, FGA) a 1000 m.j. eCG použitím USG a histologických metód analýzou obrazu
(LUCIA-G ver. 4.6).
Materiál a metódy
Experimenty sme vykonali v poľnohospodárskom družstve podhorskej oblasti Nízkych Tatier
na vaječníkoch 8 bahníc mimo estrickej sezóny. Bahnice vyčlenené na pokus boli na
vyradenie, 4 – 10 ročné, plemena zošľachtená valaška, vážili 45 – 50 kg a boli v strednej
telesnej kondícii (BCS 2,5 – 3,5). Bahnice boli chované tradičným salašníckym spôsobom
s extenzívnou až polo intenzívnou pastvou a boli dokrmované kukuričným šrotom (750 g
šrotu na kus a deň) – flushing. Bahnice sa dojili klasicky ručne, ráno a večer. Medzi dojeniami
sa pásli. Štyri bahnice sme indukovali k estru v jarnom období (koncom apríla; anestrus)
aplikáciou pošvových polyuretánových tampónov
prípravku Chrono-gest (Intervet,
Holandsko) s účinnou látkou fluorogestón acetát (FGA – 40 mg v tampóne) a 4 bahnice
prípravkom Eazy-breed CIDR-G (9 % progesterón; Nový Zéland). Pre zvýšenie ovulačného
pomeru (OR) bola bahniciam bezprostredne po vysadení tampónov a CIDR-G aplikovaná i.m.
injekcia v dávke 1000 m.j. eCG (Sergon a.u.v., Bioveta a.s., ČR). Ultrasonografické (USG)
vyšetrenie vaječníkov sme uskutočnili priamo na ich povrchu počas laparotómie (48 – 62
hodín po podaní eCG) prístrojom Sono ACE – 600V (Medison Co., Kórea) s 5 MHz
lineárnou sondou PB – 06LV50/65AD (Medison Co., Kórea) a 7,5 MHz konvexnou sondou
so
získaním
USG
snímok.
Získané ultrasonogramy
sme
vyhodnotili
kvalitatívne
a kvantitatívne podľa metód uvádzaných v literatúre (3, 4). Vaječníky pre histologické
spracovanie sme fixovali v 10 % formole. Fixované a vypraté vaječníkové vzorky sme po
odvodnení v stúpajúcom rade etanolov, presýtení metylsalicylátom a benzén-parafínom
zalievali priamo do parafínu. Parafínové rezy o hrúbke 5 – 7 µm sme získali rezaním na
sánkovom mikrotóme firmy Reichert (Nemecko). Po odparafínovaní rezov v xyléne, ich
zavodnení v zostupnom etanolovom rade a vypratí vo vode sme na farbenie parafínových
rezov použili prehľadné farbenie hematoxylín-eozínom a Azanom. Postup spracovania a
347
farbenia vzoriek sme dodržali podľa popisu Vaceka (14). Ofarbené preparáty sme po
odvodnení vzostupným etanolovým radom a presýtení xylénom montovali do kanadského
balzamu. Hotové preparáty sme prezerali a vyhodnocovali mikroskopom ZEISS Axiolab
(Nemecko). Mikrofotografie sme získali prostredníctvom programu pre analýzu obrazu
LUCIA G Verzia 4,60 – System for Image Processing, prepojením svetelného mikroskopu s
PC pomocou kamery PAL GKB CCD camera CC-8603. Vyhodnocovali sme každý dvadsiaty
rez. Všímali sme si počty a veľkosti neatretických a atretických Graafových folikulov na
povrchu vaječníka. Ich atréziu sme posudzovali podľa kritérií opísaných autormi Marion,
Gier a Choudary (10). Pri jednotlivých metódach vyhodnocovania počtu a veľkostí
povrchových terciárnych folikulov sme štatisticky udali ich aritmetický priemer a smerodajnú
odchýlku. Štatistické rozdiely sme hodnotili Studentovým t-testom.
Výsledky
Pri vyhodnocovaní ultrasonogramov (tab. 1) sme zaznamenali celkový počet folikulov takmer
rovnaký po ošetrení FGA aj progesterónom. Počet folikulov v štádiu náboru bol pomerne
nízky, ale signifikantne vyšší po ošetrení tampónmi impregnovanými FGA. Ostatné údaje
neboli štatisticky významné. Pri vyhodnocovaní histologických preparátov (tab. 1) bol
zaznamenaný približne dvojnásobný počet všetkých povrchových folikulov a vyšší počet
folikulov náborových a v štádiu výberu po ošetrení FGA tampónmi. Rozdiely týchto údajov
nevykazovali štatistickú významnosť.
Tabuľka 1. Počty terciárnych folikulov po ošetrení FGA, progesterónom a eCG
Skupina oviec Metóda
Suma folikulov
F < 3 mm
F > 3 mm
CH 1000
USG
10,87 ± 1,94
2,83 ± 0,98 **
8,00 ± 2,45
(nv = 7)
Histológia
26,50 ± 15,60
12,00 ± 8,69
14,50 ± 7,32
C 1000
USG
10,40 ± 2,30
1,80 ± 0,84**
8,60 ±2,41
(nv = 4)
Histológia
18,00 ± 8,89
9,50 ± 5,00
8,50 ± 4,83
CH – Chrono-gest (FGA), C – CIDR-G (progesterón), ** P < 0,01
Priemerné veľkosti najväčších folikulov viditeľných na povrchu vaječníkov oviec ošetrených
FGA tampónmi aj CIDR sú uvedené v tab. 2. Nezaznamenali sme tu signifikantné rozdiely pri
jednotlivých metódach vyhodnocovania pri rôznom hormonálnom ošetrení.
348
Tabuľka 2. Veľkosti najväčších folikulov po ošetrení FGA, progesterónom a eCG
Skupina oviec
Metóda
Priemer
najväčších
Veľkosť max. F
F (mm)
(mm)
CH 1000
USG
6,95 ± 2,63
12,1
(nv = 7)
Histológia
6,53 ± 0,96
7,5
C 1000
USG
6,36 ± 0,71
6,9
(nv = 4)
Histológia
5,50 ± 1,73
7,5
CH – Chrono-gest (FGA), C – CIDR-G (progesterón)
Graf 1. Výskyt atrézie po ošetrení oviec FGA tampónmi, progesterónom a eCG
105
CH1000
100
C1000
%
95
90
85
80
75
∑F
F < 3 mm
F > 3 mm
CH – Chrono-gest (FGA), C – CIDR-G (progesterón)
Pri analyzovaní histologických preparátov sme určili percentuálne zastúpenie atretických
folikulov v štádiu náboru, výberu a celkovú atréziu po ošetrení bahníc progesterónom a FGA
tampónmi (graf 1). Zaznamenali sme všeobecne vyššie percento výskytu atrézie po ošetrení
prípravkom CIDR-G, pričom všetky folikuly v štádiu výberu podľahli atretickým zmenám.
Tieto rozdiely neboli signifikantné.
Diskusia
U anestrických oviec musí byť progestagén nahradený folikuly stimulujúcimi prípravkami
(napr. PMSG/eCG) na indukovanie rastu folikulov, estru a ovulácie. Na zvýšenie počtu
ovulácií sme použili metódu stimulácie, kde sme podali eCG v čase vybratia tampónov/CIDR
a vo vyšších dávkach, ako uvádzajú rôzni autori (2, 9). Použitie prirodzeného progesterónu
a syntetických gestagénov je všeobecne uplatnené (9, 11). Počet povrchových terciárnych
folikulov po FGA ošetrení tvoriacich zásobu, z ktorej sa vyvinú ovulačné folikuly, súhlasí
349
s popisom Scaramuzziho a i. (12). Syntetické gestagény a vyššie dávky eCG podporujú
selekciu v kohorte náborových folikulov rezultujúcich v zmnoženom výskyte dominantných
ovulácie schopných folikulov, ktoré sú pripravené vo väčšom počte ovulovať a zvýšiť tak
ovulačný pomer (8). Atrézia folikulov je u väčšiny cicavcov primárne indukovaná apoptózou
buniek granulózy a téky. Vysoká dávka eCG (1000 m.j.) zvyšuje vplyv na atréziu
vyselektovaných folikulov. Istú úlohu tu môže zohrávať koncentrácia IGF-I vo folikulovej
tekutine, ktorá je rozhodujúcim faktorom, či folikul dozrie alebo podľahne atrézii (1). USG
vyšetrením vaječníkov použitím 5,0 MHz sondy získame lepšiu penetráciu tkanivom,
ale menej detailný obraz. Pri použití 7,5 MHz sondy je prípad opačný (7). Asi štvrtina
všetkých folikulov vykazuje tvorbu malých dutín, ktoré sú citlivé na gonadotropín a vo
folikulovej tekutine obsahuje androgén. Viac vyvinuté folikuly vykazujú aktivitu aromatázy
v dôsledku obsahu estrogénu vo folikulovej tekutine (13). Pozorovať v nich jasnú líniu vo
veľkosti, kedy sa folikuly stanú závislými na gonadotropíne a vo veľkosti, kedy sú folikuly
vyselektované pre ovuláciu (5). Väčšina folikulov > 4 mm v proestre a estre sa stane
preovulačnými.
Záver
Zvýšený počet folikulov < 3 mm zaznamenaný ultrasonograficky je výsledkom dostupného
zariadenia USG na zobrazovanie folikulov, začínajúcich tvoriť dutinu, ktorá je veľmi malá.
Lepší výber a proces dominancie folikulov sa zaznamenal po ošetrení FGA a 1000 m.j. eCG.
Literatúra
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Armstrong, D.G., McEvoy, T.G., Baxter, G., 2001. Effect of dietary energy and protein on bovine
follicular dynamics and embryo production in vitro: associations with the ovarian insulin-like growth
factor system. Biol. Reprod., 64:1624-32.
Bari, F., Khalid, M., Olf, B., Haresign, W., Murray, A., Merrel, B., 2001. The repeatability of
superovulatory response and embryo recovery in sheep. Theriogenology, 56(1):147-155.
Bartlewski, P.M., Beard, A.P., Rawlings, N.C., 2000. An ultrasound-aided study of temporal
relationships between the patterns of LH/FSH secretion, development of ovulatory.sized antral follicles
and formation of corpora lutea in ewes. Theriogenology, 54:229-245.
Dickie, A.M., Paterson, C., Anderson, J.L.M., Boyd, J.S., 1999. Determination of corpora lutea
numbers in Booroola – Texel ewes using transrectal ultrasound. Theriogenology, 51:1209-1224.
Driancourt, M.A., 2001. Regulation of ovarian follicular dynamics in farm animals. Implications for
manipulation of reproduction. Theriogenology, 55:1211-39.
Fricke, P.M., 2002. Scanning the future – ultrasonography as a reproductive management tool for dairy
cattle. J. Dairy Sci., 85:1918-1926.
Grygar, I., Kudláč, E., 1997. Sonografie u krávy. Sonografie u malých přežvýkavcú. In:
Ultrasonografie ve veterinárním porodnictví a gynekologii, Hlučín, 1997,135-196.
Maraček, I., Hendrichovský, V., Kucharský, P., 1991. Analýza plodnosti ako východisko pre
intenzifikáciu reprodukcie oviec. Veterinářství, 41:107-110.
Maraček, I., Krajničáková, M., Kostecký, M., Danko, J., Švantner, R., 2004. Indukcia a synchronizácia
ruje dojných bahníc zošľachtenej valašky počas laktácie: 85 %-ná úspešnosť, 167 %-ná natalita.
Slovenský chov, 1:29-30.
350
10. Marion, G.B., Gier, H.T., Choudary, J.B., 1968. Micromorphology of the bovine ovarian follicular
system. J. Reprod. Fertil., 27(2):451-465.
11. Notter, D.R., Cocket, N.E., Hadfield, N.E., 2003. Evaluation of melatonin receptor 1a as a candidate
gene influencing reproduction in a fall-lambing sheep flock. J. Anim. Sci., 81:912-917.
12. Scaramuzzi, R.J., Adams, N.R., Baird, DT., Campbell, B.K., Dawning, J.A., Findlay, J.K., Henderson,
K.M., Martin, G.B., McNatty, K.P., McNeilly, A.S., TsonisS, C.G., 1993. A model for follicle selection
and the determination of ovulation rate in the ewe. Reprod. Fertil. Dev., 5:459-478.
13. Strmšnik, L., Pogačnik, M., Čebulj Kadunc, N., Kosec, M., 2002. Examination of oestrus cycle and
early pregnancy in sheep using transrectal ultrasonography. Slov. Vet. Res., 39(1):47-58.
14. Vacek, Z., 1990. Histologická technika. In: Histológia a histologická technika, Vydavateľstvo Osveta,
1990, 267-488, ISBN 80-217-0084-X.
Kontaktná adresa
MVDr. Radoslava Vlčková, Ústav fyziológie KNAHF, Komenského 73, 041 81 Košice
Práca bola podporená grantom VEGA 1/0612/03 a projektom aplikovaného výskumu AV
4/0113/06
THE EFFECT OF WATER SALINITY ON THE EMBRYONIC AND
LARVALDEVELOPMENT IN THE COMMON FROG RANA TEMPORARIA L.
Zamachowski W., R. Stawarz, nad G. Formicki
Institute of Biology, Pedagogical University, ul. Podbrzezie 3, 31–054 Kraków
Abstract
Research was carried out on the embryos and larvae of the common frog Rana temporaria L.
The effect of different concentrations of NaCl on the development of approx. 2,200 embryos
and approx. 2,000 larvae was studied. It was found that the 5‰ solution of NaCl was a lethal
concentration for both the embryos and larvae. In the 1‰ solution of NaCl the development
of eggs was similar to that in pure water; the same concerned the mortality of embryos. It was
found that the vulnerability of larvae to salinity depended on their developmental stage.
Young larvae with external gills were most vulnerable to salinity, whereas older larvae were
less vulnerable. The mortality of embryos and larvae increased in line with the growth of
NaCl concentration in the solution. The duration of metamorphosis became prolonged as well.
The present studies have shown that the common frog Rana temporaria is a typical freshwater
amphibian with a very small tolerance for salinity.
Key words: salinity, embryonic development, larval development, common frog, Rana
temporaria.
Introduction
The reproduction and development of amphibians is usually connected with water
environments. However, the occurrence, breeding and larval development of about 70
amphibian species were reported also from saline waters. Well-known is a strong resistance of
Asiatic Rana cancrivora to salinity. Adult individuals of this species were found to tolerate
351
salinity of even 28‰, and its larvae of even 35‰ [1]. In the neighbourhood of Bangkok,
Uchiyama et al. [2] observed the occurrence of Rana cancrivora in water with salinity of
33‰. Gordon and Tucker [3] reported the breeding of Rana cancrivora from waters with
salinity from 6‰ to 24‰. They described the mechanism of great adaptation abilities of this
frog, which can live and breed in both freshwater and marine water of salinity reaching 32‰.
Most of the European amphibian species avoid saline waters. There are, however, a few
species that are able to survive in waters with small salinity. The studies on the occurrence
and reproduction in anurans have shown that some species lay eggs in slightly saline waters.
Frogs Rana esculenta and Rana ridibunda and toads Bufo viridis and Bufo calamita were
observed to lay eggs in coastal waters of the Baltic Sea [4,5,6,7].
A great tolerance for salinity was observed in Bufo viridis. Gordon [8] reported that it
tolerated salinity to 19‰, and exceptionally to 23‰. The other toads, inhabiting the Danube
delta, were resistant to salinity reaching 29‰ [9]. Viertel studied the places of courtship and
egg-laying of Rana temporaria and the tolerance of its embryos for salinity. Viertel found that
this frog chose for breeding waters of the smallest salinity but used also water bodies of
salinity approximating the maximal tolerable salinity by its embryos. Adult Rana temporaria
kept for 240 hours in water of salinity ranging from 3‰ to 6‰ showed the loss of body mass,
the increased haematocrite index of peripheral blood and changes in the water content of the
skin, muscles, heart and kidneys [10].
Rana temporaria is generally considered a little tolerant amphibian for salinity but in the
literature there are no detailed data on its development in the saline environment and tolerance
for salinity.
The aim of this study was to determine the lethal and tolerable concentrations of NaCl for
developing eggs, embryos and larvae of Rana temporaria and to describe their development
in waters of different salinity.
Material and methods
The experiments were performed from 20–31 March to 1–10 July 2004. The development of
eggs, embryos and larvae of Rana temporaria was observed in solutions with different
concentrations of NaCl. Eggs were taken from the pseudo-uterus of sexually mature females
and placed in 250 ml glass dishes, 10 cm in diameter. Next, they were submerged in water
with sperms taken from seminal vesicles and testes of sexually mature males. After a lapse of
approx. 15 min. the eggs were rinsed with water and submerged with solution containing
different concentrations of NaCl. The dishes with fertilized eggs were divided into 7 groups: a
control group with eggs developing in pure water and 6 experimental groups where eggs were
352
subject to action of 1‰, 2‰, 3‰, 4‰, 5‰ and 6‰ NaCl solutions. To maintain the constant
concentration of NaCl the solutions were changed in the dishes every 24 hours. Each dish
contained 50–60 eggs. Altogether, approx. 2,200 eggs were investigated. The temperature of
water and solutions were maintained in the dishes at 19–21oC and pH at 7.2–7.6.
The remaining fertilized eggs were placed in a large aquarium with pure water and the
hatched tadpoles were used for experiments on the effect of NaCl on their development. The
lethal concentrations of NaCl were established for three developmental groups of the larvae,
i.e. for stage 23, stage 25 and stage 26–30, following the classification by Gosner [11]. It has
been found that for these stages the lethal concentration (LC 50) of NaCl solution was 5‰.
The experiments were conducted in 6 groups: a control group with larvae developing in pure
water and 5 experimental groups with larvae subject to action of 1‰, 1.5‰, 2‰, 3‰ and 4‰
NaCl solutions. Each experimental group comprised 100 larvae. They were kept in groups of
25 in aquariums approx. 1000 ml in volume. Altogether approx. 2000 larvae were
investigated. In the aquariums the temperature of water ranged from 19°C to 21°C and pH
from 7.2 to 7.6. Water and solutions were changed every 48 hours. The larvae were fed every
2 days on dried nettle and boiled yolk of hen’s eggs. The larvae were controlled 2–3 times a
day; dead larvae were removed from the aquariums. Experiments were carried out in three
series beginning from the larvae in developmental stage 23 (opercular fold covers base of
gills), next in stage 25 (spiracle forms) and in stages 26–30 (hindlimb bud). They were
conducted until the metamorphosis of the larvae. The rate of development of the larvae and
their survival were determined. In this way it was possible to find out the response of larvae in
different developmental stages to salinity. To establish differences between the control group
and the experimental groups with embryos and larvae subject to action of different
concentrations of NaCl, the test of two structural indices was used [12]. A difference was
considered statistically significant at P<0.01. A statistical U Mann-Whitney analysis (for
mortality difference between control and investigated groups) was made using the
STATISTICA programme. The study was approved by the ethical committee at the
Pedagogical University of Krakow.
Results
Embryonic development
The 5‰ NaCl solution is lethal (LC50) for the fertilized eggs of Rana temporaria. In this
solution, just as in 6‰ solution, most of the cleavaging eggs die in the stage of a few
blastomers. The remaining eggs die in the stage of blastula. The concentrations of 1‰-4‰
were tolerated by embryos and their mortality varied depending on the concentration. In the
353
1‰ NaCl solution and in pure water the mortality of embryos was similar. The higher
mortality was found in the 2‰ and 3‰ solutions (as compared with the control, a difference
was statistically significant already in the stage of cleavaging, while in the 4‰ solution only
few embryos (2.7%) left egg capsules. A large number of developing eggs die during the
cleavaging and in the stages of blastula and gastrula. Particularly high mortality was observed
during the entire embryonic development in the 4‰ solution. The mortality of embryos
markedly increased with the growth of NaCl concentrations (Table. 1). In addition, in the 3‰
and 4‰ solutions the embryos developed more slowly as compared to the embryos
developing in pure water. The larvae leaving egg capsules had a less developed tail and buds
of external gills. They were also smaller. Most of the dead embryos were deformed.
Table 1. Development of Rana temporaria embryos in NaCl solutions of different
concentrations.
N – number of eggs. Numbers of embryos in particular stages were given in per cent (%).
Developmental stages
Gosner (1960)
CONCENTRATION OF NACL IN PERCENTAGE (‰)
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
N =396
N =358
N=360
N=295
N=370
N=280
N=152
100 %
100 %
100 %
100%
100 %
100 %
100 %
99.5
98.6
97.2
93.2
67.6
25.0
9.2
CONTROL
Fertilization (1)
First divisions (3–7)
P=0.100 P=0.006* P=0.000* P=0.000* P=0.000* P=0.000*
Blastula (8–9)
99.5
98.3
96.1
91.2
*
Gastrula (10–12)
97.5
97.0
*
P=0.056 P=0.001
P=0.000
P=0.000
96.1
82.7
28.1
91.9
*
Neural plate (13)
0.0
53.8
*
P=0.140 P=0.000
P=0.000
P=0.000*
96.1
82.0
20.0
91.9
*
0.0
*
P=0.000
P=0.000*
P=0.252 P=0.001* P=0.000* P=0.000*
Development of neural tube (14– 97.0
96.1
91.9
81.0
*
16)
Tail bud (17)
96.8
P=0.252 P=0.001
P=0.000
P=0.000*
95.8
78.3
6.7
91.9
*
Muscular response (18–19)
96.5
P=0.237 P=0.002
P=0.000
P=0.000*
95.8
76.6
2.7
91.3
*
Leaving of egg capsules (21–22)
96.5
*
P=0.312 P=0.002
P=0.000
P=0.000*
95.8
76.6
2.7
91.3
*
P=0.312 P=0.002
*
14.3
*
*
*
P=0.000
P=0.000*
– statistically significant difference at P<0.01
Larval development
354
The lethal concentration (LC50) of NaCl solution for larvae in stages 23, 25, and 26–30 of the
larval development was 5‰. In this solution the majority of the larvae died in a few hours,
and only the most resistant individuals survived as long as 48 hours. In tolerable solutions the
greatest resistance to salinity was shown by the larvae in stage 26–30 (Table. 4), and the least
from stage 23 of the larval development (Table. 2). The larvae which since their leaving the
egg capsules (stage 23) were kept in the 1‰, 1.5‰ and 2‰ NaCl solutions reached the
metamorphosis. In the 3‰ and 4‰ solutions they only reached the stage of formation
development of hind limbs (stage 31–36). Many of them died after reaching stage 26–30.
Beginning from this developmental stage, in all concentrations of NaCl statistically
significant differences were found between all the experimental groups and the control group.
The larvae were clearly smaller than the larvae in the same developmental stages but kept in
pure water. Most of the larvae kept in the 2‰ NaCl solution reached the maximum
developmental stage (stage 37–41). The initial stage of metamorphosis (stage 42–43) was
reached by a mere 20% of the larvae, and only 18% of the tadpoles passed through the full
metamorphosis. Also the 1.5‰ solution had a toxic effect. In this solution only 35% of the
larvae passed the metamorphosis. In the 1‰ solution the mortality was lower, and all the
larvae which reached the initial stage of metamorphosis (stage 42–43) passed through it.
Nevertheless the mortality was high, and a comparison to the control group showed a
statistically significant difference (Table. 2).
Table 2. Development of Rana temporaria larvae from stage 23 (opercular fold covers base
of gills), according to Gosner 1960, in NaCl solutions of different concentrations. In each
solution 100 larvae were used in the experiment.
Developmental stages
Gosner (1960)
CONCENTRATION OF NACL IN PERCENTAGE (‰)
Control 1.0
1.5
2.0
3.0
4.0
Opercular fold covers base of gills (23)
100
100
100
100
100
100
Spiracle forms (25)
98
97
100
96
98
100
P=0.3276
P=0.0784
P=0.2072
P=0.5000
P=0.0784
Hindlimb bud (26–30)
98
P=0.0036
Toe differentiation
98
(31–36)
Rapid hindlimb growth (37–41)
*
88
P=0.0036
98
80
88
80
*
80
P=0.0001
P=0.0001
P=0.0001
P=0.0000
P=0.0002
*
P=0.0000
P=0.0000
25
*
50
65
*
55
*
79
82
*
*
P=0.0000
P=0.0000*
1
*
P=0.0000*
58
*
P=0.0000*
355
Forelimbs protrude, tail begins to regress 95
75
(42–43)
38
P=0.0001
Tail greatly reduced (44)
95
75
95
*
75
P=0.0000
*
P=0.0000*
18
P=0.0000
*
35
P=0.0001
*
20
*
35
P=0.0001
Tail reduced to stub (45)
*
P=0.0000*
18
P=0.0000
*
P=0.0000*
– statistically significant difference at P<0.01
Resistant to salinity was higher in the larvae which beginning from stages 25 and 26–30 of the
larval development were placed in NaCl solutions. In particular concentrations more of them
reached the metamorphosis. The larvae placed in stage 25 in the 1‰, 1.5‰ and 2‰ solutions
developed in a similar way. A difference between the control group and experimental groups
was statistically significant only in terminal stages of the larval development. Also their
behaviour was similar to the behaviour of the larvae developing in pure water. Only a slight
decrease in foraging activity was noted. The proportion of the transformed larvae reached
88% (1‰ solution) and 80% (1.5‰ and 2‰ solution), whereas in pure water as much as 98%
of the larvae passed through the metamorphosis. In the 3‰ solution, 50% of the larvae
reached the metamorphosis. In this solution higher mortality was observed during the
particular phases of metamorphosis and a comparison with the control group showed a
statistically significant difference (Table. 3).
Table 3. Development of Rana temporaria larvae from stage 25 (spiracle forms), according to
Gosner 1960, in NaCl solutions of different concentrations. In each solution 100 larvae were
used in the experiment.
Developmental stages
Concentration of NaCl in percentage (‰)
Gosner (1960)
Control 1.0
1.5
2.0
3.0
4.0
Spiracle forms (25)
100
100
100
100
100
100
Hindlimb bud (26 – 30)
99
100P=0.1587 100P=0.1587 98P=0.2820
100P=0.1587 88P=0.0011*
Toe differentiation
99
100
100
98
100
55
(31 – 36)
P=0.1587
P=0.1587
P=0.2820
P=0.1587
P=0.0000*
Rapid hindlimb growth 99
98
100
98
93
(37 – 41)
P=0.2820
P=0.1587
P=0.2820
P=0.0166
Forelimbs protrude, tail 98
90
88
begins to regress (42–43)
Tail greatly reduced (44)
98
P=0.0102
P=0.0036
90
85
P=0.0102
Tail reduced to stub (45)
98
88
P=0.0036
*
P=0.0007
85
*
80
*
80
*
P=0.0001
P=0.0007
80
*
P=0.0001
61
*
80
*
P=0.0001
P=0.0001*
P=0.0000*
50
*
P=0.0000*
– statistically significant difference at P<0.01
356
In the 4‰ solution the larvae did not pass the metamorphosis. Their development stopped at
stage 31–36 (i.e. development of hind limbs). The larvae died one by one, whereas in other
concentrations larvae reached the stage of metamorphosis. Larvae which in stage 26–30 were
placed in the 1‰ and 1.5‰ NaCl solutions developed just as those in pure water. More than
90% of the larvae reached the metamorphosis. Those kept in the 2‰ and 3‰ solutions
developed more slowly but considerable part of them reached the metamorphosis. In the 2‰
solution, 82% of the tadpoles passed the metamorphosis, whereas in the 3‰ solution – 73%; a
comparison with the control group showed a statistically significant difference only in the
terminal phase of the metamorphosis (Table. 4). In the 4‰ solution the larvae reached stage
37–41 of the larval development and died.
Table 4. Development of Rana temporaria larvae from stage 26–30 (hindlimb bud),
according to Gosner 1960, in NaCl solutions of different concentrations. In each solution 100
larvae were used in the experiment.
Developmental stages
Concentration of NaCl in percentage (‰)
Gosner (1960)
Control 1.0
1.5
2.0
3.0
4.0
Hindlimb bud (26–30)
100
100
100
100
100
100
Toe differentiation
99
100
99
98
100
82
P=0.1587 P=0.5000 P=0.2807
P=0.1587
P=0.0000*
99
95
69
P=0.5000 P=0.2807 P=0.2807
P=0.0509
P=0.0000*
Forelimbs protrude, tail begins to regress 98
99
94
(42–43)
P=0.2820 P=0.5000 P=0.5000
P=0.0785
99
80
(31 – 36)
Rapid hindlimb growth (37 – 41)
Tail greatly reduced (44)
99
98
98
98
95
98
98
88
P=0.0001*
P=0.2820 P=0.1284 P=0.0360
Tail reduced to stub (45)
98
99
95
82
P=0.2820 P=0.1284 P=0.0002
*
73
*
P=0.0000*
– statistically significant difference at P<0.01
Discussion
The present studies have shown that both the embryonic and larval development of Rana
temporaria is possible only in water of a slight salinity. In the 1‰ NaCl solution the fertilised
eggs develop just as in pure water. No marked and statistically significant differences in the
course of embryonic development and in a number of larvae leaving egg capsules have been
found. The mortality of embryos is 4.2% in the 1‰ solution, whereas in pure water – 3.5%.
The mortality is small and may be considered natural. It is within the range given by Viertel,
357
following Mittmann, who stated that the natural mortality might reach 10% at the end of the
metamorphosis. An increase in the mortality of embryos was found in the 2‰ NaCl solution,
while in the 4‰ solution only a very small number of larvae (2.7%) left egg capsules and as
many as 97.3% of the embryos died. The results of these observations confirm the data
obtained by Viertel. He observed an increased mortality of Rana temporaria embryos in
solutions of 2.3‰ and higher. In the 5.2‰ solution a hundred per cent mortality appeared.
The 5‰ and 6‰ solutions were lethal for embryos; most of them died in the stages of
striation and blastula. In developing eggs the stage of gastrula was critical. In this stage a
large number of embryos died in all solutions.
The larvae of Rana temporaria are characterised by different vulnerability to salinity,
depending on the stage of their development. The larvae in stage 23 are most vulnerable. In
this group a small number of larvae (18%) pass through the metamorphosis still in the 2‰
solution (Figure. 1).
The development of the larvae is uneven; it stops at different stages and the mortality is high.
The metamorphosis is prolonged to 12 (1‰ solution) and 18 days (2‰ solution), whereas in
pure water it takes only 6 days (Figure. 2). A higher resistance to salinity is shown by young
larvae (stage 25). When placed in NaCl solutions, they reach the metamorphosis also in the
3‰ solution. Their development and the process of metamorphosis are irregular, too. In the
2‰ and 3‰ solutions it continues for 20 days. The fully formed larvae with hind limb buds
(stage 26–30) develop in the 1‰ and 1.5‰ in a similar way as in pure water and do not show
greater alterations of the development and behaviour. More than 95% of the larvae reach the
metamorphosis. Also in the 2‰ and 3‰ solutions more than 70% of the larvae reach the
metamorphosis (82% and 73%, respectively). At the 4‰ salinity the larvae reach the
number of larvae
maximum development (stage 37–41) and stop then.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
C
1,00 ‰
stage 23
1,5 ‰
2,00 ‰
stage 25
stages 26-30
3,00 ‰
358
Figure 1. Number of transformed Rana temporaria larvae, depending on the developmental
stage in which they were placed in NaCl solutions of different concentrations. In each solution
100 larvae were used in the experiment. Developmental stages followed Gosner (1960).
Changes in the vulnerability to salinity in Bufo melanostictus were described by Strahan [13].
He also found the growth of tolerance for salinity in line with the development of the larvae.
He noticed that external gills and a tail were particularly vulnerable to saline water. Salinity
affected also the circulation of blood and water content in the larvae. If tadpoles are placed in
NaCl dilution their ability to uptake Na+ in exchange for NH4+ across the gills decreases [14,
15]. Accumulation of NH4+ in the body fluids enables tadpoles to tolerate high ambient
salinities [16]. Changes observed in the larvae of Rana temporaria under the influence of
salinity were similar to those described by Strahan in Bufo melanostictus.
In summing up, one should stress that Rana temporaria is an anuran with a very small
tolerance for salinity. Field studies conducted by Viertel and the author’s own observations
showed that the growth of salinity probably caused a decrease in amphibian populations
strictly connected with fresh water. In the small ponds where sewage and water from coal
mines are released the growth of salinity is especially high. Another factors, just as the
contamination by nitrogen compounds [17,18,19] and UV-B radiation [20,21,22], causes
mortality. These factors acting together with the growth of salinity may cause a decrease in
the number of habitats for amphibians’ development.
25
days
20
15
10
5
0
C
1,00 ‰
stage 23
1,5 ‰
stage 25
2,00 ‰
3,00 ‰
stages 26-30
Figure 2. Duration of the process of metamorphosis (in days; from the first transformed
larvae to the last one) in individual groups of Rana temporaria larvae subject to action of
different NaCl concentrations beginning from a determined developmental stage.
Developmental stages followed Gosner (1960).
359
References
1. Gordon M.S. K. Schmidt–Nielsen, and H.M. Kelly. 1961. Osmotic regulation in the crab–eating frog (Rana
cancrivora). Journal of Experimental Biology. 38, 659–678.
2. Uchiyama M., T. Murakami, and H. Yoshizawa. 1990. Notes on the development of the crab–eating frog Rana
cancrivora. Zool. Sci. 7, 73–78.
3. Gordon M.S., and V.A. Tucker. 1968. Further observations on the physiology of salinity adaptation in the
crab–eating frog (Rana cancrivora). Journal of Experimental Biology 49, 185–193.
4. Kauri H. 1948. Über die Ausbreitung und die Ausbreitungsumstände der Wechselkröte (Bufo viridis) im
Ostseegebiet. Lunds Universitets Årsskrift N. F. 44, 1–30.
5. Gislen T., and H. Kauri. 1959. Zoogeography of the Swedish amphibians and reptiles. Acta Vertebratica 1,
197–97.
6. Viertel B. 1999. Salt tolerance of Rana temporaria: spawning site selection and survival during embryonic
development (Amphibia, Anura). Amphibia–Reptilia. 20, 161–171.
7. Andrén C., and G. Nilson. 1985. Habitat and other environmental characteristics of the natterjack toad (Bufo
calamita Laur.) in Sweden. British Journal of Herpetology 6, 419–424.
8. Gordon M.S. 1962. Osmotic regulation in the green toad (Bufo viridis). Journal of Experimental Biology 39,
261–270.
9. Stoitovici F., and E.A. Pora. 1951. Comportared la variatuini de salinitate, Nota XXX. Influenta variatiunilor
de salinite si a factorulai ecologie aspura supravieturii si mediului interior la Bufo viridis in diferitele periode, a
le anului. Stud.Stüntif. Acad. Rep. Pop. Române Fil. Cluj. 2, 159–219.
10. Zamachowski W. 1999. Reactions of frog Rana temporaria on different salt contents. Biologické Dni.
Proceedings from International Scientific Conference. Banská Bystrica. 1999. 170–171.
11. Gosner K.L. 1960. A simplified table for staging anuran embryos and larvae with notes on identification.
Herpetologica 16, 183–190.
12. Stanisz A. 1998. Przystępny kurs statystyki. StatSoft Polska. pp. 1–362.
13. Strahan R. 1957. The effect of salinity on the survival of larvae of Bufo melanostictus Schneider. Copeia. 2,
146–147.
14. Dietz T.H., and R.H. Alvarado. 1974. Na+ ands Cl- transport across gill chamber epithelium of Rana
catesbeiana tadpoles. American Journal of Physiology. 226, 764–770.
15. Boonkoom V., and R.H. Alvarado. 1971. Adenosinetriphosphate activity in gills and larval Rana catesbeiana.
American Journal of Physiology. 220, 1820–1824.
16. Jørgensen. C.B. 1997. Urea and amphibian water economy. Comparative Biochemistry and Physiology –
Part A. 117, 161–170.
17. Berger L. 1989. Dissapearance of amphibian larvae in the agricultural landscape. Ecol. Int. Bull. 17, 65–73.
18. Oldham R.S., D.M. Latham, D. Hilton-Brown, M. Towns, A.S. Cooke, and A. Burn. 1997. The effect of
ammonium nitrate fertiliser on frog (Rana temporaria) survival. Agriculture, Ecosystems and Environment 61,
69–74.
19. Rouse J.D., C.A. Bishop, and J. Struger. 1999. Nitrogen pollution: An assessment of its threat to amphibian
survival. Environ. Health Perspect 107, 799–803.
20. Blaustein A.R., P.D., Hoffman D. Grant Hokit J.M. Kiesecker S.C. Walls and J.B. Hays. 1994. UV repair
and resistance to solar UV–B in amphibian eggs: A link to population declines? Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 91,
1791–1795.
21. Hatch A.C., and A.R. Blaustein. 2000. Combined effects of UV–B, nitrate, and low pH reduce the survival
and activity level of larval cascades frogs (Rana cascadae). Archives of Environmental Contamination and
Toxicology 39, 494–499.
22. Lizana M., and E.M. Pedraza. 1998. The effects of UV–B radiation on toad mortality in mountainous areas
of Central Spain. Conserv. Biol. 12, 703–707.
360
CIRKADIÁNNA ORGANIZÁCIA A PORUCHY BIORYTMOV
V KARDIOVASKULÁRNOM SYSTÉME
THE CIRCADIAN ORGANISATION AND DISTURBANCES OF CIRCADIAN
RHYTHMS IN THE CARDIOVASCULAR SYSTEM
Zeman, M.1, Bada, V.2, Dulková, K.2, Liška, D. 2, Kováčiková, Z. 1, Košťál, L.1,3,
Herichová, I.1,
1Katedra
živočíšnej fyziológie a etológie, Prírodovedecká fakulta UK v Bratislave,
interná klinika FNsP, Kramáre, Bratislave,
3Ústav biochémie a genetiky živočíchov, SAV Ivanka pri Dunaji
2Tretia
Abstract
The paper deals with disturbances of circadian rhythms in blood pressure and heart rate in
hypertensive patients. Increased frequency
of circadian rhythms disturbances in
cardiovascular system in developed countries is well known but their ethiology is not
understood. We hypothesize that a changed life style with shift of activity to late nights, light
contamination of environment and shift work may represent risk factors that can contribute to
higher incidence of cardiovascular diseases in developed countries. According to our present
results conditions of continuous ambulatory blood pressure monitoring substantially influence
the final share of different rhythm abnormalities, e.g non-dippers, reversed dippers or extreme
dippers. Frequency of all three rhythms disturbances is increased when measurement is
performed in hospital in comparison with home conditions. The findings underlay a role of
stress and activated sympathetic system in development of rhythm abnormalities in
cardiovascular system.
Úvod
Medzi najčastejšie civilizačné choroby patria poruchy kardiovaskulárneho systému a
nádorové ochorenia. Aj keď sú to muktifaktoriálne podmienené poruchy, ktorých etiológia nie
je kompletne známa, všeobecne sa akceptuje, že jednou z príčin ich stúpajúcej incidencie je
zmena životného štýlu obyvateľov vyspelých štátov sveta. Zmenený životný štýl zahŕňa
viacero prominentných aspektov, akými sú napríklad neprimeraná výživa s nadbytkom
energetických zdrojov, obmedzený pohyb, zvýšené stresové zaťaženie a pod. Dôležitosť
týchto faktorov je všeobecne akceptovaná vo vedeckej sfére a relatívne dobre prezentovaná aj
verejnosti. Jedným z faktorov moderného životného štýlu, ktorý je veľmi málo akcentovaný
vo vedeckej sfére a prakticky neznámy pre verejnosť, je narušovanie rytmického spôsobu
života, determinovaného pravidelným striedaním fáz svetla a tmy počas 24 h cyklu.
361
K to