Biologia molekularna

transkrypcja chromatyny
problem:
kompleks pol II RNA
nukleosom:
dysocjacja
histonów?
Jak to może działać:
>500 kD
145 bp DNA = 100 kD
rdzeń histonowy = 100 kD
skip:
-
split:
-
strip:
+
Skip czy Split czy Strip
?
Thoma 1991 Trends Genet 7: 175
skip?
Jak by to się mogło dziać?
przesuwanie się
wzdłuż pętli DNA
Studitsky, Clark, Felsenfeld 1974 Cell 76, 371
tak działa pol III RNA i fagowe pol RNA
(także zależne od ATP kompleksy remodelujące)
Studitsky i in. 2004 Trends Bioch Sci 29: 127-135
split ?
Jak by to się mogło dziać?
w ME transkrybowana chromatyna wydaje się być „gładka”
(o jednakowej grubości), nić jest grubsza niż gołe DNA,
przeciwciała wykrywają obecność histonów
czy to są artefakty?
Transcription
kb
3.53
-+
+3.5kb
CIN2
+3.0kb
2.03
1.58
a
+2.5kb
0.98
transkrypcja eksponuje dwie, normalnie ukryte, reszty
cysteinowe H3 na działanie czynników modyfikujących
i chromatografię powinowactwa Hg
mononukleosomy wydają się być niesfałdowane w postaci
dwu tetramerów histonów + nieduże białka niehistonowe
Prior & Allfrey 1983 Cell 34, 1a0a33a
HSP82
1.33
+2.0kb
0.82
w transkrybowanej chromatynie po trawieniu DNazą I
pojawiają się powtórzenia
połówek nukleosomów
Lee & Garrard 1991 EMBO J. 10, 607
powolna transkrypcja przez pol II RNA powoduje wyparcie z nukleosomu
jednego dimeru H2A-H2B Studitsky i in. 2004 Trends Bioch Sci 29: 127-135
strip ?
synteza histonów
obrót histonów
problem: które histony są dostępne do tworzenia nukleosomów ?
mitoza
faza
G2
zależne od replikacji
faza
G
konstytutywne
faza S
M
faza G1
zastępcze histony
faza S
faza G2
M
u wszystkich eukariota H3.3, u roślin wysoce zacetylowany H3.2
aktywna transkrypcja przez pol II RNA powoduje rozpad nukleosomów
Kulaeva i in. 2007 Mutat Res 618: 116-129
dynamiczna struktura
chromatyny
• w obrębie wysp CpG struktura chromatyny jest zależna od stanu
metylacji DNA
• modyfikacje histonów tworzą „kod histonowy”
• remodelowanie chromatyny
* z udziałem dużych kompleksów remodelujących zależnych od ATP
* niekiedy za pośrednictwem interferencji RNA (RNAi) NOBEL 2006
przykłady zależnej od RNA heterochromatynizacji:
- inaktywacja chromosomu X (Xi),
- wyciszenie centromerów i loci typu koniugacyjnego u drożdży
rozszczepkowych Schizosaccharomyces pombe
modyfikacje histonów
acetylacja lizyn
metylacja lizyn (mono, di, tri) oraz arginin (mono, di)
fosforylacja seryn i treonin
ubikwitynacja C-końcowych lizyn
ADP-rybozylacja
Allfrey i in. PNAS 51, 786-794
koniugacja SUMO do lizyn
Bradbury, BioEssays 14, 9-16
K – lizyna
S - seryna
acetylacja konserwowanych lizyn
(N końce H3 i H4 oraz wzorce ich acetylacji są konserwowane)
5
Ac
H4 N-terminus
12
Ac
Ac
16
20
Ac
Ac or Me
Ac-S-G-R-G-K-G-G-K-G-L-G-K-G-G-A-K-R-H-R-K-V-L-R-D+
+ + + + +
+
+
+
+
4
Me
H3 N-terminus
8
9
Ac
18
Ac
14
Ac
23
Ac
27
Ac or Me
A-R-T-K-Q-T-A-R-K-S-T-G-G-K-A-P-R-K-Q-L-A-T-K-A-A-R-K-S-A-P+
+
+ +
+
+ +
+
+
N
lizyna
Acetyl-CoA
C C g C e
N+
O C a b C d C
HAT (Histone
Acetyl-Transferase)
O
P
P
wiązanie
DNA
-
O
HDAC (Histone
Deacetylase)
-
-
-
C C
O
C
C e
C
C
C
-
O
-
P
-
-
C
N
-
-
-
N
e-N-acetylo-lizyna
brak wiązania DNA
-
odwracalne reakcje
CoA
O
O
-
--
-
-
-
-
-
rozmaitość kompleksów HAT
modyfikacje lizyny
LSD1 demetyluje histony
Klose & Zhang 2007 Nature Revi Mol Cell Biol 8, 307-318
a Mechanizm reakcji usuwania grup mon-metylowych
przez LSD1. Uważa się, że LSD1 katalizuje demetylację mono- i dimetylowanych reszt lizynowych w
reakcji oksydacji amin z FAD jako kemofactor. Loss
of the methyl group from mono-methyl lysine occurs
through an imine intermediate, which is hydrolysed to
form formaldehyde by a non-enzymatic process. b A
polypeptide backbone cartoon structure of LSD1
bound to Co-REST and the cofactor FAD. The twolobed amine oxidase (AO) domain is shown in orange
and yellow. The Tower domain is in green and the
SWIRM domain in blue. The Co-REST linker region
(pink) associates with the LSD1 Tower domain and the
SANT domain (red) situated at the top of the Tower
domain. c Depiction of the potential association of
LSD1–Co-REST with nucleosomal DNA. The bottom
half shows a nucleo-some with the core histone
octamer in the centre and the associated DNA double
helix in blue. The LSD1–Co-REST complex modelled
onto a nucleosome indi-cates that the SANT domain
of Co-REST (red) could interact with nucleosomal
DNA, whereas LSD1 tar-gets the histone H3 tail
where it protrudes from the DNA gyres (shown by
the arrow). d LSD1 w kompleksie Co-REST bierze
udział w represji genów neuronalnych w komórkach
nieneuronalnych. LSD1 uczestniczy w represji poprzez
usuwanie metylacji H3K4. e LSD1 w kompleksie
receptora adrogenu (AR) staje się aktywatorem
poprzez zmianę specyficzności do substratu, tak żę
katalizuje usuwanie metylacji H3K9.
Peterson, Laniel 2004 Curr. Biol. 14:R546-51
kod histonowy daje możliwość
acetylacji H4
- w 4 pozycjach,
fosforylacji H3 – w 2 pozycjach…
>4 000 kombinacji modyfikacji pojedynczego nukleosomu
kod histonowy
H4AcK8
H3AcK14
H3PhS10
= transkrypcja
H3MeK9 (trimetylacja)
brak acetylacji H3 lub H4
= represja transkrypcji
H4AcK4
H4AcK12
= tworzenie nowych nukleosomów w fazie S
H2APhS1
H2APhT119
H3PhT3
H3PhS10
H3PhS28
= skondensowana mitotyczna chromatyna
Peterson, Laniel 2004 Curr Biol 14, R546
ogólne cechy chromatyny
nieaktywnej
aktywnej
*
*
*
*
deacetylacja histonów
H4MeK12
5mCpG
obecność HP1 (izoformy α,β,γ)
*
*
*
*
H4AcK5, H3AcK9/14
H3MeK9
brak metylacji DNA
m-sca nadwrażliwe na DNazę I
acetylacja histonów na promotorach
TH
receptor hormonu
tarczycy
przykład czynnika
transkrypcyjnego
TH
ACGGTC
ADA2
ADA3
GCN5
HAT
p300
CPB
HAT
HAT
P/CAF
TACCCG
koaktywator
korepresor
HDAC
HAT
N-CoR
Sin3
RPD3
HAT
TA
TA
TAFII 250
P
pol.II
TB
TA
TA
P
TB
brak hormonu
TACCCG
HAT
TAFII 250
represja
transkrypcji
TR/RXR
hormon
aktywacja
transkrypcji
+
Wolffe 1997 Nature 387: 16 zmienione
aktywacja genów fazy S
korepresor Rb
HAT
CPB
TAF
250
II
P
TB
HAT
niska aktywność HAT
mitoza
G2
G1
S
Rb
TA
TA
koaktywator
HDAC1 (ang. Histone
Deacetylase)
geny fazy S WYŁĄCZONE
E/ +
R cyklina
/kinaza
cdk2
P
CPB
słaba aktywność
Ait-Si-Ali et al. Nature 396, 184 (1998) zmienione
TA
TA
P Rb
P
aktywny HAT
(ang. Histone
Acetyl
Transferase)
pol.II
P
korepresor
TAF
250
II
TB
kontrola przejścia
G1-S punkt R (ang.
Restriction)
HAT
T
HA
geny fazy S WŁĄCZONE
deacetylacja chromatyny
wyciszenie transkrypcyjne np. inaktywacja chromosomu X
5
me
º
º
3’..pGpCp..5’
5
me
5’..pCpGp..3’
MeCP2
represor transkrypcji
korepresor
Sin3
HDAC
RPD3
+
metylacja C w CpG występuje w wyciszonych
genach i inaktywowanych chromosomach X
metylacja CpG jest utrzymywana po replikacji
dzięki metylazie DNA specyficznej dla
hemimetylowanego DNA
5mC wiąże represor transkrypcyjny MeCP2
(MethylC-binding Protein-2)
MeCP2 wiąże korepresor Sin3 z deacetylazą
histonów RPD3
+
hypoacetylowane wyciszone włókno chromatyny
Nan et al. Mol.Cell.Biol. 16, 414 (1996); Cell 88, 1 (1997); Jones et al. Nat.Genet. 19, 187 (1998)
acetylacja domen chromatynowych
przykład: domena kurzych genów b-globinowych
kompleksy nukleosomów z antyAcK
0
DNA remaining
domain
boundary
10
30 kb
20
br
bH
bA
be
DNA loop domain
domain
boundary
kontrola:
nieaktywny gen
geny b-globiny
kurzej
m-sce nadwraż- owalbuminy
liwe na DNazę I
ogólna wrażliwość
na DNazę I
DNase I
0 1 2
DNase I (u/ml)
l wysoki poziom acetylacji chromatyny w całych domenach (pętlach DNA) indukuje ogólną
wrażliwość chromatyny na DNazę I
l wewnątrz tych domen w obrębie funkcjonalnych genów lub miejsc wiązania czynników
transkrypcyjnych w strukturze chromatyny występują małe miejsca nadwrażliwe na DNazę I
Hebbes, Clayton, Thorne, Crane-Robinson 1994 EMBO J. 13, 1823
owady – Dnmt2 nie ma N-końcowej domeny
odpowiedzialnej za interakcje z in. białkami
- metylacja DNA i histonów nie są ze sobą
powiązane
HMT – metylotransferaza histonów
MBP - białka wiążące zmetylowane DNA
Neurospora, Arabidopsis, człowiek
– metylacja DNA i histonów
współdziałają w wyciszaniu genów
różnice gatunkowe
interakcji metylacji
DNA i histonów
kooperatywna i samowzmacniająca się organizacja
maszynerii modyfikujących chromatynę i DNA
odpowiedzialnych za wyciszanie genów w komórkach
normalnych i nowotworowych
DNMT oddziałują z:
deacetylazami histonów (HDACs)
metylazami histonów (HMTases)
zależnymi od ATP kompleksami remodelujacymi chromatynę
białkami strukturalnymi chromatyny (z rodziny HP1)
pośrednio z MBD (białkami wiążącymi
zmetylowane DNA)
www.med.ufl.edu/biochem/keithr/fig4pt1.html
kolejność
deacetylacji histonów,
metylacji histonów,
metylacji DNA
jest różna
komórki normalne –
metylacja DNA dotyczy
regionów repetytywnych,
a większość wysp CpG
w promotorach jest
niezmetylowana
komórki nowotworowe –
powtarzalne DNA traci
metylację, a wyspy CpG
promotorów zyskują
metylację, co powoduje
wyciszenie bliskiego genu
wiązanie DNMT do odpowiednich regionów prawdopodobnie
zachodzi dzięki interakcjom białko–białko
http://www.med.ufl.edu/biochem/keithr/fig3.html
nukleosom
metylowane
CpG
DNA
modyfikacje histonów i metylacja DNA integrują funkcje jądrowe
istnieje zależność struktury nukleosomowej, lokalizacji
chromosomowej i aktywności transkrypcyjnej
Esteller, Almouzni 2005 EMBO Rep 6: 624-8
ATP- zależne kompleksy remodelujące chromatynę
3 klasy kompleksów konserwowane pomiędzy S.c., D.m., H.s.
Peterson 2002 EMBO Rep 3: 319–322
ATP- zależne kompleksy remodelujące chromatynę
3 klasy kompleksów konserwowane pomiędzy S.c., D.m., H.s.
Peterson 2002 EMBO Rep 3: 319–322
biochemiczna aktywność ATP-zależnych kompleksów
remodelujących chromatynę
etapy działania kompleksów
prowadzące do przesunięcia,
transferu, rozpadu nukleosomu
Vignali i in. 2000 Mol Cell Biol 20: 1899-1910
interakcje z czynnikami transkrypcyjnymi
decydują o kierowaniu kompleksów do
miejsc docelowych
regulacja cyklu komórkowego
przez kompleks SWI/SNF
oddziaływania między:
kompleksami HAT,
kompleksami remodelującymi
i czynnikami transkrypcyjnymi
umożliwiają utworzenie PIC
(ang. preinitiating complex)
enzymy remodelujące chromatynę ułatwiają różne etapy aktywacji genów
A.promotor drożdżowego genu
HO - przed powstaniem PIC
aktywator Swi5p rekrutuje
SWI/SNF i HAT (Gcn5p),
co zwabia aktywator SBF
http://highered.mcgrawhill.com/sites/dl/free/0072835125/126997/animation30.html
B. promotor ludzkiego IFN-β –
związane wyżej aktywatory
rekrutują HATy podczas
tworzenia PIC, acetylacja
histonów ułatwia
przyłączenie SWI/SNF,
który niszczy strukturę
nukleosomu związanego
z promotorem
C. promotor ludzkiego α1-ATkompleksy HAT (CBP,
P/CAF) i SWI/SNF
przyłączają się do
promotora po utworzeniu
PIC stymulując ekspresję
zmiany struktury chromatyny, rekrutacji czynników transkrypcyjnych i
kofaktorów w rejonie regulatorowym locus lizozymu w linii erytroblastów HD37
(Lys¯ ¯), multipotencjalnych komórkach prekursorowych HD50 MEP (Lys¯),
niestymulowanych (Lys+) i stymulowanych LPS komórkach prekursorowych
makrofagów HD11 (Lys++)
białe owale – czynniki
transkrypcyjne związane z
rdzeniami enhancerów,
promotorem i -2.4-kb
silencerem;
TR- receptor hormonu tarczycy,
związany do -2.4-kb silencera
obok m-sca CTCF
CH3 i Ac - m-sca metylacji DNA
i acetylacji histonów
szare kółka – nukleosomy
owale z linia kreskowaną –
kompleksy czynników
transkrypcyjnych obecne w
niektórych komórkach lub
stabilizowane po stymulacji
LPS
strzałki czarne i szare –
odpowiednio silne i słabe m-sca
nadwrażliwe na DNazę I
Lefevre i in. 2003
Mol. Cell. Biol. 23: 4386-4400
Lys¯ ¯
Lys¯
Lys+
Lys++
inne procesy zachodzące przy udziale enzymów
modyfikacji histonów i/lub remodelujących chromatynę
kompleks
remodelujący
NoRC wycisza
geny rRNA
Mayer i in. 2006 Intergenic transcripts
regulate the epigenetic state of rRNA
genes Mol Cell 22: 351-361
Wood i in. 2006 Combinatorial chromatin modifications
and memory storage: A code for memory? Learn Mem
13: 241-244
naprawa DNA – NER, NHEJ,
rekombinacja homologiczna, naprawa
genów transkrypcyjnie aktywnych
Shim i in. 2005 Mol Cell Biol 25: 3934-44
Kruhlak i in. 2006 Cell Biol 172: 823-834
Chai i in. 2005 Genes Dev 19: 1656-1661
acetylacji
podlegają
nie tylko
białka
histonowe
http://www.cellsignal.com/reference/pathway/Protein_Acetylation.html