wykład 4
Transkrypt
wykład 4
Receptory neurotransmiterów, klasyfikacja, drogi wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału Zasadnicze zjawiska i procesy elektryczne w neurobiologii i metody ich badań zjawisk elektrycznych w neurobiologii • Zjawiska/procesy: – – – – 1) Potencjał czynnościowy 2) Prądy w kanałach jonowych napięciowozależnych 3) Prądy w kanałach jonowych receptorów jonotropowych 4) Potencjały i prądy postsynaptyczne na przykładzie płytki końcowej w mięśniach (end-plate potential, end-plate current) • 1,4 : Badania za pomocą metody „voltage clamp” • 2,3 : badania za pomocą metody „patch-clamp” Metoda Voltage Clamp • Techniki tej używali w latach 50-tych Hodgkin i Huxley (nobel 1963) wyjaśniając dzięki niej mechanizm m.in. potencjału czynnościowego jako zjawiska, które można wytłumaczyć i opisać poprzez zmieniające się w czasie właściwości przewodnictwa błony komórkowej dla poszczególnych jonów Wyniki badań Hodgkina i Huxley’a nad przewodnictwem jonowym w zależności od napięcia błonowego w eksp. Voltage-clamp 3.5 Pharmacological separation of Na+ and K+ currents into components. Chlorek czteroetyloamoniowy • doświadczenia z lat 60-tych Potencjał spoczynkowy a stężenie jonów potasu Uwaga: stężenie wewnątrzkomórkowe potasu u kałamarnicy ok. 400 mM • • Hodkin i Katz w 1949 r eksperymenty (na aksonie kałamarnicy) ze zmianą stężenia pozakomórkowego K Potencjał równowagi zachowuje się „prawie” zgodnie z równaniem Nernsta Dowód, że potencjał spoczynkowy określa głównie gradient stężenia potasu • • • Czarna linia – predykcja potencjału zgodnie z równaniem Nernsta Czerwona linia – rzeczywiste dane pomiarowe potencjału Wykresy najbardziej się różnią dla niższych stężeń potasu (wpływ innych jonów) • Błona komórkowa jest znacznie bardziej przepuszczalna dla K niż dla innych jonów Wniosek: potas najbardziej wpływa na zachowanie spoczynkowego potencjału błonowego Rola sodu w gerneracji potencjału czynnościowego • Wniosek Hodgkina i Katza : w czasie Pcz następuje gwałtowny wzrost przepuszczalności dla sodu • O wartości maks. potencjału czynnościowego decyduje stężenie pozakomórkowe sodu (limituje potencjał równowagi dla sodu) • O wartości potencjału spoczynkowego decyduje stężenie potasu (wniosek: w potencjale spoczynkowym dominuje przewodnictwo potasowe) Metoda Patch Clamp • Technika patch-clamp (Erwin Neher, Bert Sakmann 1976 Max Planck Inst. Goettingen ; Nobel 1991) umożliwiła badanie przepływów jonowych (prądów) dla indywidualnych kanałów. • Ostatecznie udowodniła istnienie kanałów jonowoselektywnych a jednocześnie potwierdziła wcześniejsze postulaty odnośnie istnienia takich kanałów proponowane przez Hodgkina i Huxley’a Metoda Patch-clamp w badaniu właściwości kanałów jonowych i uzyskane wyniki • Kanały napięciowozależne (voltage-gated) Pomiary prądów jonowych przez pojedyncze kanały Na+ Prądy dośrodkowe • „Makroskopowy” prąd jest sumą mikroskopowych prądów pojedynczych (napięciowozależnych) kanałów Pomiary prądów jonowych przez pojedyncze kanały K+ • „Makroskopowe” prądy potasowe – dozewnątrz (outward) również są zsumowanymi prądami kanałów potasowych • Zarówno kanał potasowy jak i sodowy muszą posiadać „voltage sensor” – strukturę „wyczuwającą” napięcie 4.8 Structure of a simple bacterial K+ channel determined by crystallography. (Part 1) • Tetramer zbudowany z 4 podjednostek 4.8 Structure of a simple bacterial K+ channel determined by crystallography. (Part 2) Ujemne ładunki helisy „odwadniają” jony K • Przechodzą tylko nieuwodnione jony K+ Eksperymenty z patch-clamp wykazały podobieństwa i różnice pomiędzy różnymi kanałami jonowymi • Podobieństwa kanałów K i Na: • jonoselektywność, zależność prawdopodobieństwa otwarcia od napięcia, • zamykanie kanałów Na i K przez hyperpolaryzację • różnice kanałów K i Na: • w kinetyce otwarcia (szybkość, czas otwarcia), • depolaryzacja w kanale Na prowadzi oprócz otwarcia także do jego inaktywacji (nie w przypadku kanału potasowego • UWAGA! Wykryto również napięciowozależne kanały Na które nie są inaktywowane depolaryzacją i prowadzące do długotrwających Pcz – (blokowane przez lidokainę, benzokainę) Patch-clamp w badaniu różnorodności kanałów potasowych Własności różnych typów kanałów K+. Eksperymenty na oocytach X.laevis z ekspresją różnych typów kanałów K i pomiarami technika voltage-clamp Kir = Kanały K częściowo napięciowozależne Dwie zasadnicze podgrupy kanałów potasowych: 1. „prostujące” kanały odkomórkowe Rola w hyperpolaryzacji następczej występującej w przebiegu potencjału czynnościowego 2. dokomórkowe kanały prostujące (K-ir) K-ir grają istotną rolę m.in. w kontroli i regulacji potencjału spoczynkowego oraz wartości potencjału progowego. Potasowe „dowewnątrz prostujące” kanały jonowe (K-ir) Cechy: - osłabione przewodnictwo w warunkach depolaryzacji podwyższone w warunkach hyperpolaryzacji zdolność do wytwarzania większego dokomórkowego napływu jonów niż wypływu. Blokowanie kierunku „od” (wypływu jonów potasowych) w warunkach depolaryzacji jest skutkiem działania wewnątrzkomórkowego magnezu (Mg2+) oraz polyamin (spermina, putrescyna, spermidyna). Metoda Patch-clamp w badaniu właściwości kanałów jonowych • Kanały zależne od ligandu (np. neurotransmitera) Technika „patch-clamp” A) Eksperyment typu „outside-out” – pipeta zawiera roztwór o składzie podobnym do cytoplazmy. Na zewnątrz błony z kanałem roztwór jest podobny do zewnątrzkomórkowego. Mierzone jest natężenie prądu. Natomiast woltaż jest stabilizowany na dowolnie wybranej wartości Technika „patch-clamp” w badaniu prądu jonowego kanału receptorowego B) Przepływ prądu płynącego przez pojedynczy kanał jonowy po podaniu acetylocholiny (Ach) w sposób ciągły. Obserwacja: 1) Prąd płynie w postaci impulsów z zasadą „wszystko-albo-nic”. 2) Zwiększenie stężenia Ach nie powoduje zmiany natężenia prądu lecz wzrost prawdopodobieństwa otwarcia kanału Efekt postsynaptyczny jest wynikiem sumowania potencjałów z wielu kanałów jonowych. Czas otwarcia jest różny ale „amplituda” (natężenie prądu) zawsze ta sama. Technika patch-clamp z kanałem receptorowym: podawanie N-T przy zmienianych wartościach potencjału stabilizowanego napięcia Technika patch-clamp kanałem receptorowym: 1) Po związaniu z NT częstotliwość i średni czas otwarcia kanału są niezależne od napięcia 2) Kierunek i amplituda prądu zależy od napięcia. 3) Kierunek prądu „dąży” do osiągnięcia równowagi zgodnie z równaniem Goldmana-Hodgkina-Katza. 4) Testowany kanał jest tak samo przepuszczalny dla K+ i Na+ (ale różne kanały odpowiedzialne za wytwarzanie EPSP są różnie przepuszczalne dla K+ i dla Na+.) Isc = sc (Vm – Er) „reversal (null) potential” receptora, w tym przyp.= 0 (Są one różne dla różnych receptorów) Prąd płynie na zewnątrz Metoda Voltage-clamp Badanie prądów postsynaptycznych ma przykładzie złącza n-mięśń. w zależności od napięcia błonowego () • Badania te (wraz z manipulacją stężeń jonów) pomogły ustalić przepływ jakich jonów tworzy te prądy (małżeństwo Akira i Noriko Takeuchi 1960) (EPP) w złączu nerwowo-mięśniowym w warunkach niskiego poziomu Ca2+. Badanie złącza nerwowo-mięśniowego (ryc B) wystarczająco wysoki EPP powoduje powstanie Pcz w mięśniu (ryc C) spontaniczne „mini EPP” (ryc D) przy niskim poziomie Ca++ stymulacja nerwu ruchowego powoduje EPP podobne do „mini EPP” Terminy • EPP – end plate potential – potencjał płytki końcowej w mięśniu – pojęciowo równoważny: EPSP (excitatory postsynaptic potential); • EPC – end plate current – prąd płytki końcowej w mięśniu, pojęciowo równoważny EPSC excitatory postsynaptic current – pobudzający prąd postsynaptyczny: 5.16 The influence of the postsynaptic membrane potential on end plate currents. dośrodkowy outward) • Kierunek i wielkość prądu EPC zależą od zastosowanego postsynaptycznego napięcia błonowego • Potencjał „bez prądu” to tzw. „reverse potential” (potencjał odwrócenia) W warunkach typowego poziomu wapnia: • Złącze nerwowo-mięśniowe: • Pojedynczy potencjał czynnościowy uwalnia do 300 „kwantów” N-T • Otwarcie pojedynczego pęcherzyka daje pojedynczy „MINI” = rzędu kilku mV • Synapsa glutamatergiczna: • 1 potencjał czynnościowy uwalnia 5-10 kwantów N-T, • Każdy z nich powoduje EPSP=1mV (zdecydowanie za mało do wywołania potencjału czynnościowego) • EPC jest proporcjonalny do różnicy między danym napięciem (Vm) i potencjałem odwrócenia (Erev) i do przewodnictwa błony aktywowanej acetylocholiną (gACh) • EPC = gACh (Vm – Erev) Prądy EPC przy zmianie stężeń jonów pozakomórkowych (Na) i (↑K) Naout • Badania Takeushi ↑Kout Co by było gdyby • Kanał jonowy w płytce końcowej był przepuszczalny tylko dla K? tylko dla Na? 5.17 The effect of ion channel selectivity on the reversal potential. 5.17 The effect of ion channel selectivity on the reversal potential. Wartość potencjału „spoczynkowego” z równania GHK przy założeniu, że przepuszczalność dla sodu i potasu jest podobna do Erev (czyli ok. 0 mV) wniosek ? Wpływ potencjału błonowego w błonie postsynaptycznej na prądy płytki końcowej (end-plate currents – EPC) Naout ↑Kout • Obniżenie zewnątrzkomórkowego Na (ryc. D) powoduje przesunięcie „reversal potential” w stronę wartości ujemnych • Podwyższenie zewnątrzkomórkowego stężenia jonów K (ryc. E) powoduje przesunięcie „reversal potential” w stronę wartości dodatnich Na+ and K+ movements during EPCs and EPPs. (Part 1) • Dla typowego potencjału spoczynkowego mieśnia (-90 mV) w EPC dominuje prąd dośrodkowy jonów Na • (efekt netto prądów Na i K jest też dośrodkowy) Na+ and K+ movements during EPCs and EPPs. (Part 2) • Dla potencjału odwrócenia = 0mV oba prądy jonowe Na i K równoważą się (i znoszą wzajemnie) - „makroskopowy” EPC = 0. • Dla potencjału +70mV (równowaga dla Na) istnieje tylko prąd potasowy (dozewnątrz) (hyperpoplaryzuje komórkę postsynaptyczną) Prąd płytki końcowej -EPC i amplituda potencjału płytki końcowej -EPP w zależności od potencjału postsynaptycznego Szczytowa amplituda EPP w zależności od potencjału postsynaptycznego Erev Erev • Prądy dla potencjału powyżej „potencjału odwrócenia” hyperpolaryzują komórkę postsynaptyczną a dla potencjału poniżej „potencjału odwrócenia” depolaryzują komórkę. • Glutaminian zwykle również powoduje otwarcie kanałów przepuszczalnych zarówno dla Na jak i K dlatego ogólny opis zależności jest podobny jak w złączu nerwowomięśniowym Istotne terminy • • • • • Potencjał odwrócenia (tu dotyczy receptorowych kanałów jonowych): wartość potencjału powyżej którego kierunek prądu w kanale jonowym jest odwrotny niż dla potencjału poniżej; jeśli receptorowy kanał jonowy znajduje się dokładnie w warunkach tego potencjału (wynosi zwykle ok, 0 mV) ruch jonów netto jest zerowy (nie ma prądu) Potencjał równowagi: dotyczy określonego jonu i oznacza wartość potencjału która równoważy gradient stężenia jonu między przeciwnymi stronami błony komórkowej; wyznaczany równaniem Nernsta Potencjał spoczynkowy: potencjał błonowy osiągany i utrzymywany relatywnie stabilnie przez komórki w wyniku jako wypadkowa gradientów stężeń jonów i i różnych przepuszczalności dla różnych jonów; obliczany wg równania GoldmanaHodgkina-Katza Potencjał progowy: wartość potencjału przy której komórki nazywane komórkami „pobudliwymi” (neurony, mięśnie) wytwarzają tzw. Potencjał czynnościowy Potencjał czynnościowy: gwałtowna sekwencja zmian potencjału błonowego wg. charakterystycznego i powtarzalnego wzorca charakteryzująca tzw. komórki pobudliwe (neurony, kom. mięsniowe, niektóre endokrynne, a nawet roslinne) i wywołana szybkimi zmianami przewodnictwa dla określonych jonów ( w szczególności sodu i potasu). Potencjał postsynaptyczny (PSP) – bezpośredni efekt działania neurotransmitera • PSP – zmiana wartości potencjału błonowego w błonie postsynaptycznej synapsy chemicznej (w tym złącza nerwowomięśniowego) w efekcie działania neurotransmitera. (W wyniku działania neurotransmitera następują zmiany przewodnictwa elektrycznego i powstaje „prąd postsynaptyczny” (postsynaptic current – PSC) w wyniku którego ostatecznie dochodzi do zmiany potencjału postsynaptycznego • PSP - może być pobudzający (excitatory postsynaptic potential – EPSP) lub hamujący (inhibitory postsynaptic potential – IPSP). • PSP podlega sumowaniu czasowemu i przestrzennemu • Wartość potencjału odwrócenia zależy od charakterystyki kanału (przepuszczalności dla poszczególnych jonów) oraz od stężeń jonów na zewnątrz i wewnątrz kanału (zgodnie z równaniem GHK) • Rezultaty otwarcia receptorowego kanału jonowego zależą od różnicy między potencjałem spoczynkowym (całej komórki nerwowej) a wartością potencjału odwrócenia danego kanału receptorowego. • Prąd kanału po jego otwarciu (związaniu z neurotransmiterem) „stara się” zmienić potencjał spoczynkowy w kierunku potencjału odwrócenia dla danego kanału. Prąd jonowy w receptorowym kanale zależny jest od przewodnictwa kanału oraz różnicy potencjału spoczynkowego i potencjału odwrócenia dla kanału ale Skutki jego otwarcia zależą od innych kanałów („przeciekowych” oraz napieciowo-zależnych kanałów jonowych, które znacznie przeważają nad kanałami receptorowymi) Dlatego prąd kanału receptorowego nigdy nie pozwala na znaczne zbliżenie potencjału spoczynkowego do potencjału odwrócenia receptorowego kanału jonowego Postsynaptyczny potencjał pobudzający i hamujący (EPSP) (IPSP) • Relacja potencjału progowego i potencjału odwrócenia • EPSP (pobudzający) – jego potencjał odwrócenia (Erev) jest bardziej dodatni niż próg pobudliwości Reversal and threshold potentials determine postsynaptic excitation and inhibition. • Różnica między EPSP i IPSP • IPSP (hamujący) charakteryzuje się tym, że jego potencjał odwrócenia jest bardziej ujemny niż potencjał progowy. • EPSP jest depolaryzujący a IPSP zwykle hyperpolaryzujący ale nie musi (w pewnych warunkach IPSP może być depolaryzujący! Wystarczy aby jego Erev był poniżej progu pobudzenia czyli powstania potencjału czynnościowego) • EPSP jest depolaryzujący a IPSP zwykle hyperpolaryzujący ale nie musi (w pewnych warunkach IPSP może być depolaryzujący! ) • Wystarczy aby jego Erev był poniżej progu pobudzenia • Hamowanie (inhibicja) neuronów – 1. Poprzez IPSP (z reguły poprzez hyperpolaryzację) – 2. Poprzez „przeciek” (shunting inhibition) • Otwarcie kanału jonowego dla Cl- w sytuacji gdy w jego „rejonie” potencjał spoczynkowy jest równy potencjałowi równowagi dla chloru (i nie ma prądu jonowego i nie ma hyperpolaryzacji) • Skutek: Obniżenie oporu błonowego i umozliwienie neutralizacji dodatnich jonów w rejonie otwartego jonu chlorowego. Ponadto obniżony opór powoduje mniejsze zmiany potencjału (słabszą depolaryzację) pod wpływem działania pobudzającego NT np. glutaminianu (zgodnie z zależnością fizyczną V=IR) Receptory neurotransmiterów JONOTROPOWE - po związaniu z ligandem otwierają kanały jonowe, - - duże rozmiary, -zbudowane z podjednostek -pobudzenie wywołuje szybko potencjał postsynaptyczny (PSP), który jest jednak krótkotrwały („fast-PSP”- typowo ok. 20ms) METABOTROPOWE (G-protein coupled receptors GPCRs) - działają poprzez aktywację białek wiążących GTP - utworzone przez pojedynczy polipeptyd. - pobudzenie wywołuje długo trwający postsynaptyczny potencjał („slow-PSP”) - w zależności od różnych typów białek G i aktywowania różnych wtórnych przekaźników i wewnątrzkomórkowych szlaków tramsdukcji sygnału wpływają nie tylko na zmiany funkcjonowania kanałów jonowych ale na procesy metaboliczne a nawet molekularno-genetyczne (np. ekspresja genów) -Mogą bezpośrednio (przez aktywację białka G bez potrzeby indukcji wtórnych przekaźników) modulować aktywność kanałów jonowych Receptory jono i metabotropowe A) Szybkie PSP Otwarcie kanału jonotropowego receptora A) Wolne PSP Wielokrotnie dłuższy Zmiana właściwości kanału jonowego na skutek fosforylacji (kinaz białkowa PKA aktywowana przez receptor metabotropowy tzn. związany z białkiem G) (tu aktywacja receptora metabotropowego powoduje zamknięcie kanału dla K+ co trwa do czasu gdy fosfataza zdefosforyluje kanał) Jeszcze dłuższe działanie może być wtedy, gdy aktywowane są geny i modulowany metabolizm 10 ms 20s Receptory jonotropowe Receptory metabotropowe Receptory jonotropowe 1- nikotynowe Ach -dla kationów i jego „analogi”: (pentamery) GABAA -dla anionów glicynowy, -dla anionów 5-HT3 (podklasa receptora dla serotoniny), -dla kationów 2- jonotropowe glutamatergiczne tetramery 3- receptory purynergiczne P2X (trimery?) Nikotynowy receptor Ach (nACh) (model struktury jonotropowych receptorów) 1. 2. 3. W złączu nerwowo-mięśniowym W synapsach pomiędzy przedzwojowymi i pozazwojowymi neuronami obu części układu autonomicznego (parasympatycznego i sympatycznego) W mózgu Torpedo ray źródło receptora nACh Źródło -bungarotoksyny swoiście wiążącej receptor nACh Krait (Bungarus caeruleus) Receptor nikotynowy cholinergiczny Podjednostki są podwójne i na nich znajdują się miejsca wiążące ligand W miastenii przeciwciała obecne we krwi blokują wiązanie Ach do tych podjednostek mięśniowego AChR. Neuronalny nAChR zbudowany jest jedynie z podjednostek i innych niż w receptorze mięśniowym Neuronalny receptor Ach (nAChR) Neuronalny nAChR zbudowany jest jedynie z podjednostek i innych niż w r eceptorze mięśniowym (innych niż 1 i 1) Wiele wariantów budowy podjednostki (9) oraz (4) Możliwa kombinacja nawet tysięcy różnych „wersji” receptora z różnymi właściwościami ! Neuronalny nAChR prawdopodobnie jest odpowiedzialny za psychofizyczne efekty uzależnienia od nikotyny. Blokerem kanału jonowego w nACh jest hexametonium, antagonistą miejsca łączącego ACh jest trimetafan (powodujący gwałtowny spadek ciśnienia krwi), ponadto kurara Ilustracje medyczne: schorzenia z rolą receptora Ach w patogenezie • Miastenia gravis: – jedna z najlepiej poznanych chorób autoimmunologicznych jest spowodowana autoagresją przeciw mięśniowym receptorom Ach – Osłabienie siły mięśni – W miastenii nie ma objawów ze strony autonomicznego ukł nerwowego • Autoimmune autonomic ganglionopathy: – (AAG) schorzenie wywołane przeciwciałami przeciw neuronalnemu nAChR w zwojach autonomicznych. – Objawy AAG są różne np. niedociśnienie ortostatyczne, zaburzenia motoryki jelita i żołądka, anhidrosis, zaburzenia czynności pęcherza, zespół suchości. Często nieprawidłowy odruch źreniczny na światło (jonotropowy) Receptor serotoninowy – (5-HT3) (większość receptorów 5-HT jest metabotropowa) Występowanie: Obwodowe zakończenia nerwów czuciowych i w CNS Przepuszczalny dla K+ i Na+ (nieprzepuszczalny dla Ca2+ i innych dwuwartościowych jonów, pomimo podobnej szerokości otworu jak w nACh) Antagoniści receptora 5-HT3 są używani jako: leki przeciwwymiotne (ONDASETRON, GRANISETRON – blokują 5-HT3 receptory m.in. W dnie kom.IV i obwodowo w zak.nerwu X), antypsychotyczne i anksjolityki. Receptory GABAA - główne receptory hamujące w CSN GABAA to najczęściej występujący hamujący receptor GABA Agonista: muscimol Antagonista : bikukulina Pięć podjednostek oraz (głównie w siatkówce); - każda z różnymi podtypami. GABAA jest selektywny dla Cl(skutek otwarcia kanału zależy od wewnątrzkomórkowego stężenia Cl-, a to od aktywności kotrasportera potasu i chloru KCC2) u dorosłych - hyperpolaryzacja po otwarciu kanału hamujacy IPSP u noworodków i płodów pobudzający (brak kotransportera KCC2!) GABAC jest głównie w siatkówce (GABAB jest metabotropowy !) Kotransportery chloru Receptory GABAA- główne receptory hamujące w CSN GABAA modulowany przez wiązanie: - barbituranów (luminal) - benzodiazepin (diazepam) (potęgują wiązanie GABA i podwyższają hamowanie). Inne potęgujące działanie GABAA : - progesteron, - kortykosteron, - testosteron (zwł, neurosteroidy), - alkohol Odwrotnie działają substancje powodujące drgawki: picrotoxin (blokuje kanał) bicucullina (która zmniejsza wiązanie GABA). penicylina hamuje receptor blokując otwór dla jonów (UWAGA! drgawki należą do działań niepożądanych penicyliny!). Receptory siatkówkowe GABA nie są wrażliwe na bicuculinę, barbiturany i benzodiazepiny 6.9 Ionotropic GABA receptors. (Part 2) Receptor glicynowy – główny receptor hamujący w rdzeniu kręgowym i pniu mózgu Przepuszczalny dla ClPentamer (podjedn. oraz ) Trzy glicyny muszą być przyłączone, aby otworzyć kanał Strychnina (alkaloid z gat. roślin strączkowych) jest antagonistą receptora glicynowego. Główne typy jonotropowego receptora glutamatergicznego NMDA i AMPA/kainate i zasadnicze różnice • Receptory glutamatergiczne zbudowane z 4 podjednostek (tetramer) • Receptory NMDA i AMPA kolokalizują w błonie postsynaptycznej • Na schemacie prądy receptorowe w napięciu +50mV (prąd odśrodkowy) Glutamatergiczne jonotropowe receptory NMDA Cechy charakterystyczne: 1) Napięciowo zależne blokowanie przez Mg2+ 2) Glicyna konieczna dla efektywnego otwarcia kanału 3) Przewodzą również Ca2+ (potencjalnie patologiczne znaczenie prowadzące do tzw. ekscytotoksyczności) Właściwości receptora NMDA Wnioski z obserwacji charakterystyki receptora NMDA • Bez glicyny nie otwiera się • Bez magnezu kanał zachowuje się jak nieselektywny (poniżej potencjału odwrócenia dominuje prąd dośrodkowy, powyżej odwrotnie) • Z magnezem otwiera się jeśli potencjał błonowy wynosi ponad ok. -40mV (a więc wymaga depolaryzacji (oprócz oczywiście podania glutaminianu ! ). Konieczność depolaryzacji dla otwarcia kanału receptorowego to KLUCZOWA CECHA receptora NMDA. „rekreacyjne użytkowanie” NMDA • Fencyklidyna („angel dust”) blokuje kanał jonowy w receptorze NMDA • Ketamina („Special K”) – antagoniści receptora NMDA (stany dyssocjatywne – modele schizofrenii) Receptory metabotropowe Inna nazwa: G-protein coupled receptors = GPCRs Najliczniejsze odmiany receptorów Receptory „regulacyjne” - „brama” do biochemicznego i metabolicznego wnętrza komórki 5.22 A neurotransmitter can affect a postsynaptic cell via two types of receptor proteins. (Part 2) Najważniejsze receptory metabotropowe Muskarynowe receptory acetylocholinowe Receptory adrenergiczne Receptory dopaminergiczne Receptory GABAB Metabotropowe receptory serotoninergiczne Metabotropowe receptory purynergiczne Metabotropowe receptory glutamatergiczne Receptory neuropeptydów (wszystkie są GPCRs) np. receptory enkefalin µ, δ, κ Receptory cannabinoidów (CB1, CB2) Ogólny model receptora metabotropowego zewnątrzkomórki Jest on homologiczny do rodopsyny. Pojedynczy polipeptyd (7 transbłonowych helikalnych segmentów.) N Podobną budowę mają adrenergiczne receptory oraz muskarynowe receptory cholinergiczne (mACh) Miejsce wiążące N-T w środku receptora (nie dotyczy to mGluR i GABAB oraz Rec. Neuropeptydowych). wewnątrzkomórki C Sygnalizacja poprzez receptory sprzężone z białkiem G Białko G musi „wykryć” aktywację receptora! W zależności od typu białka G: Aktywacja (lub hamowanie) enzymu (jeden z czynników wzmacniających sygnał). - 1) cyklazy adenylowej: wytwarzanie (lub hamowanie) cAMP, ostatecznie aktywacja lub hamowanie kinazy białkowej PKA - 2) fosfolipazy C: tworzenie diacyloglicerolu (DAG) oraz IP3 – (IP3 uwalnia Ca2+ z magazynów śródkomórkowych), ostatecznie aktywacja kinazy białkowej PKC - 3) fosfolipazy A2: produkcja kw. Arachidonowego i jego metabolitów) - 4) cyklazy guanylowej: produkcja cGMP, ostatecznie: aktywacja kinazy białkowej PKG (cGMP działa głównie na kanały jonowe zależne od cyklicznych nukleotydów) G-protein coupled receptors (GPCR = „metabotropowe”) Pomimo nazwy („metabotropowe”) GPCR poprzez aktywację białka G bardzo często modulują kanały jonowe a nie bezpośrednio „wpływają na metabolizm” Aktywacja białka G (GTP-binding protein) oznacza wymianę GDP w GTP Zaktywowane białko zmienia aktywność enzymów oraz kanałów jonowych. Powstają też „second messengers” Szlaki transdukcji sygnału po aktywacji receptorów metabotropowych Dysocjacja białka G po zaktywowaniu Konwersja białka G do aktywnego stanu wiązania GTP „podmiana” GDP w GTP Stopień aktywności GTPazowej decyduje o charakterze danego typu białka G „AutoGTPazowa” hydroliza GTP Dwie drogi sygnalizacji poprzez GPCRs: jedna „w kierunku” aktywacji PKA, druga PKC ew. Gi PLC = fosfolipaza C DAG = diacyloglicerol PKA = cAMP zależna kinaza proteinowa PIP2=dwufosforan fosfatydyloinozytolu CaM = kinaza zależna od kalmoduliny i fosfatydylocholina PIP2 (DAG) pozosteje w błonie i aktywuje PKC • Uwalnianie wapnia z zasobów wewnątrzkomórkowych (Ca jest tu „trzeciorzędowym” przekaźnikiem): • 1. Receptor IP3 • 2. Receptor ryanodinowy* (m.in. w mięśniach - aktywowany depolaryzacją) – (*ryanodine – roslinny alkaloid z tropikalnej rośliny Ryania speciosa używany w mieszankach jako insektycyd) 7.7 Neuronal second messengers. (Part 3) • cAMP → PKA cGMP → PKG • Inaktywacja cAMP przez cAMP fosfodiesterazę • Inaktywacja cGMP przez cGMP fosfodiesterazę Białka uczestniczące w regulacji poziomu wapnia w cytoplazmie: Uwaga na usuwające wapń z komórki: 1) Pompę Ca zużywającą ATP oraz 2) wymiennik Ca/Na Fosfodiesteraza w transdukkcji sygnału w pręcikach siatkówki • PDE-5 • PDE-6 (rods) • Rola fosfodiesteraz w mechanizmie skurczu/rozkurczu mięśnia Sygnalizacja poprzez receptory sprzężone z białkiem G cAMP, Ca2+, diacyloglicerol aktywują kinazy proteinowe dla wielu różnych substratów (enzymy, kanały, białka strukturalne, czynniki transkrypcyjne). cAMP, cGMP, kwas arachidonowy i Ca2+ mogą też bezpośrednio otwierać i modulować kanały jonowe. Białka G mogą także bezpośrednio sprzęgać się z kanałami jonowymi (tzw G-protein gated ion channels) bez pośrednictwa „second messenger” Cechy sygnalizacji poprzez receptory sprzężone z białkiem G Konkretny typ receptora może łączyć się w większości tylko z jednym rodzajem białka G Neuron ma tylko określony podzbiór GPCR i białek G Amplifikacja sygnału w układzie receptora typu GPCR: 1- zaktywowany receptor może aktywować wielokrotnie białko G 2- każda cyklaza adenylowa może zsyntetyzować wiele cAMP 3- każda kinaza proteinowa może ufosforylować wiele kopii swojego substratu „Orkiestracja” odpowiedzi komórkowej Ten sam wtórny przekaźnik może jednocześnie aktywować liczne i różne szlaki metaboliczne i aktywować transkrypcję genów (tzw. „orchestrated response”.) 7.2 Amplification in signal transduction pathways. Korzyści związane z sygnalizacją poprzez receptory sprzężone z białkiem G (w porównaniu z szybką transmisją) 1.Amplifikacja sygnału 2.Duży zakres czasowy 1.Stosunkowo szybkie działanie poprzez modyfikację kanałów jonowych 2.Wydłużone działanie gdy sygnał przenoszony jest na przekaźniki wtórne do sekund lub minut 3.Duży zakres przestrzenny 1. mogą wpływać m.in. na ekspresję genów 4.„Cross talk” 1.Składniki transdukcji sygnału i ich enzymatyczne efektory (np. kinazy) oddziałuja wzajemnie na siebie 5.Skoordynowana modulacja („orkiestracja” różnych procesów) Specyfika działania receptorów metabotropowych Komórki regulują wrażliwość na agonistę poprzez zmianę ilości receptora ! Desensytyzacja chroni system sygnalizacji przed saturacją. -(szybka desensytyzacja) przez fosforylację receptora - („wolna” desensytyzacja) przez endocytozę receptora 7.5 Types of GTP-binding protein. ras Przegląd przykładowych receptorów metabotropowych dla różnych neurotransmiterów Receptory muskarynowe ACh Dystrybucja: 1) W mózgu (dominująca rola w cholinergicznej neurotransmisji) 2) Komórki efektorowe unerwiane przez pozazwojowe neurony układu PARASYMPATYCZNEGO (i niektóre układu sympatycznego). Główny mechanizm: zmiana własciwości kanałów jonowych. Np. Kanał dla K+ w sercu, (przykład G-protein gated ion channel). gwałtownie wzmaga przepuszczalność w odpowiedzi na pojawienie się acetylocholiny działającej przez mAChR Ponadto aktywacja muskarynowego receptora Ach aktywuje hamujace białko G obniżające aktywność cyklazy adenylowej i spadek cAMP, w rezultacie osłabienie aktywności PKA i zmniejszenie fosforylacji kanałów wapniowych (osłąbienie przepuszczalności) (a propos: odruch oczno-sercowy) Antagonisci mACh: atropina, ipratropium Receptory adrenergiczne Receptory dla noradrenaliny, adrenaliny (obie wiążą się do tego receptora) aktywują cyklazę adenylową hamują cyklazę adenylową. W mózgu głównymi receptorami adrenergicznymi są 2 i 1 Adrenergiczne receptory i są typowymi receptorami komórek docelowych unerwianych przez neurony pozazwojowe autonomicznego układu sympatycznego (z wyjątkiem gruczołów potowych i kom. Rdzenia nadnerczy). Receptory adrenergiczne Różnice w dystrybucji receptorów adrenergicznych: 1 : mięśniówka większości naczyń krwion, mięsień rozszerzający źrenicę, mięśnie pilomotoryczne 2 : CSN, płytki krwi, zakończenia obwodowych nerwów adrenergicznych 1 : serce, CSN 2 : drogi oddechowe, macica, mięśnie części naczyń Skutki stymulacji adenergicznej zależą od rodzaju receptora. Receptory adrenergiczne – punkt uchwytu wielu leków Agonistami receptorów R są adrenalina i noradrenalina – oraz fenylefryna Antagonistą receptorów R jest fentolamina (słabo wiąże też ) Agonistą receptorów jest isoproterenol (izoprenalina) Antagonistą receptorów jest propranolol (selekt. bloker 1 są metoprolol, atenolol) Wybiórczy agonista receptorów 2 – fenoterol, salbutamol Receptory dopaminergiczne w corpus striatum 80% w korze mózgowej. 5 podtypów (DA1-DA5) D1 i D5 aktywuja cyklazę adenylową D2, D3 i D4 hamują cyklazę adenylową. Receptory dopaminergiczne wiążą (ale mało swoiście) różne leki jak bromokryptyna, haloperidol, klozapina Receptor GABAB Obecne są w całym CSN, niekiedy kolokalizując z jonotropowymi receptorami GABAA. Receptory postsynaptyczne GABAB: działanie hamujące - tzw. „slow inhibitory postsynaptic potential” (powolna aktywacja przewodnictwa potasowego K+) Receptory presynaptyczne GABAB są elementem mechanizmu autorecepcyjnego (hamowanie uwalniania N-T poprzez aktywację kanałów K+ i hamowanie prądu wapniowego) Agonistą GABAB jest lek baclofen. Antagonistą GABAB jest phaclofen Metabotropowe receptory serotoninowe: 5-HT(1,2,4,5) (Uwaga! 5-HT3 jest jonotropowy) W mózgu: jądro szwu (n.raphae) w pniu mózgowym Dzielą się na podtypy 5-HT1,2,4,5 Receptory są sprzężone z cyklazą adenylową (pobudzając ją lub hamując) 5-HT bierze udział w modulacji rytmów dobowych, jedzenia, podwyższa ciśnienie krwi. Receptory 5-HT1A oraz 5-HT1B są głównie autoreceptorami i ich aktywacja w mechanizmie ujemnego sprzężenia zwrotnego hamuje uwalnianie serotoniny przez neurony raphe. Agoniści 5-HT1A oraz 5-HT1B obniżają lęk i agresję u myszy (wpływ na emocjonalne mechanizmy w których bierze udział serotonina). Z kolei myszy pozbawione tych receptorów są bardziej „lękliwe” i bardziej agresywne. Metabotropowe receptory purynergiczne Wiążą ATP, inne analogi nykleotydów i adenozynę Receptory adenozynowe oznacza się nazwami: A1, A2a, A2b, A3 ich antagonistą jest kofeina Aktywacja receptora A1 (licznego w mózgu) hamuje cyklazę adenylową i powoduje wzrost fosfolipazy C. Pozostałe receptory również działają poprzez te enzymy ale w różny sposób Receptory ATP oznacza się literą: P2(x,y,z,t,u) (ale z nich P2x i P2z są jonotropowe) . Glutaminergiczne receptory metabotropowe Typy mGluR Grupa I (mGluR1, mGluR5) Grupa II (mGluR2, -3) Uwagi aktywacja fosfolipazy C (wzrost IP3 i DAG), działają aktywująco - zahamowaniem cyklazy adenylowej (spadek poziomu cAMP), działają hamująco, - także zahamowanie kanałów Ca2+ Grupa III Mechanizm działania podobny do grupy II, (mGluR4, -6, - zlokalizowane bliżej centrum synapsy niż 7, -8) recept.gr.II, Antagoniści* MPEP (penetruje do mózgu, niekompetc.) Bez znaczenia leczniczego Nie ma selekt. i penetr. do mózgu *Generalnie brak selektywnych agonistów i antagonistów dla mGluR. Glutamatergiczne receptory metabotropowe typ I Receptory związane z białkiem G, aktywującym fosfolipazę C, Obecne są we wszystkich strukturach mózgu; Występują też pozamózgowo w automicznym ukł. nerwowym, w sercu, jelitach, kościach; Modulują aktywność neuronów i regulują uwalnianie GLU . Receptory dla (neuro)peptydów Bardzo liczna rodzina – (żadne nie są kanałami jonowymi) Typu „metabotropowego” – (GPCRs) Lub Sprzęgnięte z kinazą tyrozynową Przykładowe receptory: Receptory opioidów (wszystkie metabotropowe): µ, δ, κ Przykłady leków działających poprzez receptory peptydowe: loperamid - agonista opioidowego receptora µ (lek przeciwbiegunkowy, podawany obwodowo może mieć także działanie przeciwbólowe?) trimebutina – (Debridat) nieswoisty agonista receptorów opioidowych lek w zaburzeniach perystaltyki (pobudzając) w zespole jelita drażliwego loxiglumid – antagonista receptora CCK-A wywołuje uczucie głodu, może być też użyty w leczeniu refluksu (tzw. „GERD”) Transdukcja sygnału z receptorów metabotropowych Wtórne przekaźniki • Bardzo istotne elementy sygnalizacji receptorów metabotropowych Ważniejsze wtórne przekaźniki cAMP-zależna kinaza białkowa (PKA) neurotransmisja poprzez aktywację adenylocyklazy i cAMP, fosforyluje reszty Ser/Tre -Regulacja ekspresji genów poprzez [cAMP response element-building protein] = CREB -Regulacja syntezy katecholamin (poprzez hydrolazę tyrozyny) -Regulacja MAP-2 (microtubule associated protein) -Regulacja przewodnictwa błonowego (kanały K+) -Regulacja czułości receptora AMPA PKA 4 molekuły cAMP Tetramer Ca2+-Kalmodulinozależna kinaza białkowa: Wielofunkcyjna kinaza białkowa CaMII dekoduje wszelkie sygnały które podwyższają poziom Ca2+ -Fosforyluje hydrolazę tyrozyny, MAP-2, synapsin, kanały wapniowe, receptory glutaminianowe, Ca2+-ATPase, czynniki transkrypcyjne, -Kinaza CaMII jest aktywowana wapniem niezależnie od jego źródła -Jest szczególnie obfita w neuronach (nawet 2% wszystkich protein w hipokampie tj. 50x więcej niż w innych tkankach ) -Autofosforylacja jest jedną z najistotniejszych cech CaMII. Powoduje 400x wzrost powinowactwa do kalmoduliny i w efekcie aktywność CaMII trwa wiele sekund po spadku poziomu wapnia ! PKC (kinaza proteinowa C) (główny cel systemu sygnałowego PI) -PKC to kolektywna nazwa dla rodziny kinaz łączących się z sygnalizacją przez PI i fosforylujących reszty Ser/Thr -PKC aktywowana przez diacyloglicerol (DAG) i Ca2+. -Kinazy PKC są monomerami „kotwiczone” do różnych miejsc przez tzw. anchoring proteins -Do jej substratów należą liczne białka regulacyjne cyklu i wzrostu komórki oraz m.in. kanałów jonowych i receptorów takich jak NMDA i AMPA -W nowotworach PKC jest stymulowana nietypowo przez estry forbolu (promotory nowotworowe), które symulują działanie DAG. PKA, PKC, CaMKII są tzw. „ kinazami kognitywnymi” -PKA, PKC, CaMKII podlegają trwałym zmianom aktywności nie ustępującym nawet po zaniknięciu stymulującego je sygnału (wtórnego przekaźnika) Jest to rodzaj „pamięci” -Kinazy te modulują aktywność synaptyczną zdarzenia, jakim była długotrwała impulsacja serotoninergiczna PKA Po długiej stymulacji np. serotoninergicznej aktywne pojednostki C dostają się do jądra gdzie stymulują syntezę genów proteinaz (fosforylacja CREB) dla podjednostki R co powoduje trwałe wydłużenie aktywności PKA Transkrypcja genów zależna od aktywacji receptorów metabotropowych • Rola czynników transkrypcyjnych CREB (cAMP response element-binding) • Czynniki transkrypcyjne trwale związane z elementami regulacyjnymi genów. • Rozsiane sekwencje regulatorowe genu rozpoznawane przez czynniki transkrypcyjne – Czynnik transkrypcyjny CREB (dimery) aktywowany przez aktywną podjednostkę PKA, – Czynniki transkrypcyjne takie jak np. CREB trwale związane z regulacyjnymi cis-elementami DNA - CRE (cAMP response elements) i obecne w wielu genach • CRE maja sekwencję palindromiczą typu: • TGACGTCA • ACTGCAGT Receptory z aktywnością kinazy tyrozynowej – kolejni ważni gracze w sygnalizacji – partnerzy innych receprtorów PKTyr (Tyrozynowa kinaza proteinowa) Dwie klasy PKT 1) receptorowe (błonowe) 2) cytoplazmatyczne -Receptorowe PKT – - transdukcja licznych czynników wzrostu, regulacja cyklu oraz różnicowanie komórki - Cytoplazmatyczne PKT-te same procesy lecz bez udziału receptora Znaczenie: - fosforylacja tylko tyrozyny (mniejsze prawdopodobieństwo „błędnej” (przypadkowej) proteiny. -fosfotyrozyna wywołuje znacznie większe zmiany konformacyjne białka niż fosforylacja Ser/Thr -Stężenie kinaz tyrozynowych i ich substratów jest znacznie mniejsze w stosunku do pozostałych kinaz. Aktywacja ekspresji genów poprzez CREB: możliwość KONWERGENCJI sygnału NMDAR, L-VGCC Dodatek • Receptory z aktywnością kinazy tyrozynowej i ich znaczenie w medycynie • Hamowanie receptora c-KIT kinazy tyrozynowej jest wykorzystywane w leczeniu nowotworów: – przewlekłe białaczki – nowotwory stromalne („zrębowe”) przewodu pokarmowego – lek: imatinib – Złośliwych glejaków • Znaczna część GBM wykazuje amplifikację receptora nabłonkowego czynnika wzrostu (EGFR) mającego cechy PKTyr • ponadto w części przypadków pojawia się konstytutywnie zaktywowany zmutowany wariant EGFRvIII. panitumumab lapatinib Loew s. et. Al.. The Epidermal Growth Factor Receptor as a Therapeutic Target in Glioblastoma Multiforme and other Malignant Neoplasms Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry, 2009, 9, 703-715 Aspekty medyczne: Ekscytotoksyczność • Uszkodzenie/śmierć komórek na skutek nadmiernego pobudzenia spowodowanego glutaminianem (główny nurotransmiter pobudzający) • Zasadnicza rola receptorów NMDA (przepuszczających m.in. Jony wapnia) • Jony wapnia wnikające w nadmiarze do komórki aktywują enzymy (fosfolipazy, proteazy, endonukleazy) uszkadzające i niszczące komórkę. • Liczne schorzenia, w których stwierdzono lub podejrzewa się istotną rolę mechanizmów ekscytotoksycznych Schorzenia, w których stwierdzono lub podejrzewa się istotną rolę mechanizmów ekscytotoksycznych Udar (niedokrwienie) mózgu Otępienie naczyniopochodne (multi-infarct) Uraz mechaniczny mózgu i rdzenia Padaczka (zwł status epilepticus) Choroby zwyrodnieniowe ch. Alzheimera, ch. Parkinsona, stwardnienie zanikowe boczne (ALS), pląsawica Huntingtona Rasmussen encephalitis Stwardnienie rozsiane Schizofrenia Glutaminian jako smakołyk • Umami – nazwa smaku nadana przez Ikeda – związana z monosodium glutamate • Kwas glutaminowy odkryty w wywarze z wodorostów (brunatnic) morskich zw. Kombu przez prof. Ikeda z Uniw. W Tokio 1907, • Ikeda opatentował wytwarzanie monosodium glutamate (MSG, glutaminian jednosodowy) jako „usmaczniacza” GLU w niedokrwieniu (niedotlenieniu) Czynnikiem uwalniającym GLU może być: utrata zasobów energetycznych przez komórki, spadek produkcji ATP w mitochondriach ? zaburzenie działania pomp jonowych Wzrost GLU pozakomórkowego Aktywacja receptorów Napływ jonów Ca2+ do komórek Aktywacja syntazy NO i innych enzymów (fosfolipaza A2) Wzrost wolnych rodników GLU 100-500 mikromoli/L prowadzi do martwicy w hodowli neuronów GLU 20 mikromoli/L prowadzi do ich apoptozy Eksperymentalny bloker NMDA MK-801 (dizocilpine) zmniejsza uszkodzenie poischemiczne, pohipoglikemiczne i pourazowe Podobne działanie (i mechanizm) ma nimodypina Niestety, blokery receptorów GLU mają działania uboczne (represja normalnej neurotransmisji) Stwardnienie boczne zanikowe (ALS, chor. Lou Gherig) W części przypadków ALS opisano zaburzenia białek transporterowych EAAT1-2 Wykazano przy pomocy spektroskopii MRI wzrost GLU+GLN w opuszce chorych na ALS Riluzol (Rilutek) – lek blokujący uwalnianie GLU wydłuża przeżycie chorych z SLA Rasmussen encephalitis Stwierdzono obecność przeciwciał z krwi obwodowej przeciwko podjednostce GluR3 receptora AMPA co ma prowadzić do uszkodzenie ekscytotoksycznego neuronów kory mózgu (Rogers SW i wsp. Science 265, 648-651, 1994; He XP i wsp. Neuron, 20, 153-163, 1998) Stwierdzono również obecność p-ciał przeciw białku synaptycznemu Munc-18 co prowadzi do zaburzonego przewodnictwa (Yang R i wsp. Neuron, 28, 375-383, 2000) Zapalenie mózgu Rasmussena: autoagresja przeciw receptorowi GluR-3 ? • • • • Opis typowego przypadku: Dziewczynka - Padaczka od 3 r.ż Niedowład Obniżone cechy intelektualne (ale chodzi do szkoły) • Cechy zaniku półkuli • Obecnie - przebieg 13 lat • Neuropatologia: – „typowe” zmiany patologiczne mózgu, takie jak nacieki limfocytarne i grudki mikroglejowe itp. – Lecz także z cechami zaburzeń budowy kory (MCD)