pobierz plik artykułu - Inżynieria i Aparatura Chemiczna

pobierz plik artykułu - Inżynieria i Aparatura Chemiczna

Prosimy cytować jako: Inż. Ap. Chem. 2012, 51, 4, 151-153
INŻYNIERIA I APARATURA CHEMICZNA
Nr 4/2012
str. 151
Ewa LIWARSKA-BIZUKOJĆ
e-mail: [email protected]
Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii, Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności, Politechnika Łódzka, Łódź
Rola cyfrowej analizy obrazu w monitoringu osadu czynnego
w oczyszczalniach ścieków
Wstęp
Oczyszczanie ścieków metodą osadu czynnego składa się dwóch
głównych etapów: (I) mikrobiologicznego rozkładu zanieczyszczeń
zawartych w ściekach oraz (II) separacji biomasy osadu czynnego od
ścieków oczyszczonych. Skuteczność oczyszczania ścieków na każdym
z tych etapów zależy w dużym stopniu od składu mikroorganizmów
osadu czynnego, w tym od form morfologicznych pojedynczych bakterii oraz tworzonych przez nie skupisk (agregatów) mikrobiologicznych określanych mianem kłaczków osadu czynnego. Pod względem
morfologicznym kłaczki można podzielić na typowe, nitkowate i silnie rozdrobnione (tzw. kłaczki typu pinpoint) [Bitton, 2005]. Niekiedy
wyróżniany jest jeszcze czwarty typ morfologiczny kłaczków – wzrost
dyspersyjny bakterii. Zachodzi on w sytuacji, w której kłaczki ulegają
prawie całkowitej deflokulacji i zanikają, a w zamian następuje intensywny przyrost wolno pływających bakterii.
Podstawowe obserwacje mikroskopowe osadu czynnego może przeprowadzić doświadczony mikrobiolog przy użyciu zwykłego mikroskopu świetlnego, ale można też zastosować towarzyszące obecnie
mikroskopom kamery cyfrowe oraz oprogramowanie komputerowe
pozwalające na zbieranie, obróbkę i analizę obrazów mikroskopowych.
W tym drugim przypadku wyniki uzyskuje się łatwiej i szybciej, a co
najważniejsze są one bardziej obiektywne. Od kilkunastu lat cyfrowa
analiza obrazu (CAO) wykorzystywana jest w monitorowaniu osadu
czynnego i badaniach nad nim.
Celem niniejszej pracy jest wskazanie i charakterystyka głównych
zastosowań cyfrowej analizy obrazu do oceny morfologii i składu osadu czynnego (Rys. 1). Zostaną przedstawione przykładowe procedury
wykonania CAO.
Udział ten w języku angielskim określany jest terminem field area (FA)
i obliczany według następującego wzoru:
FA =
Ak
Ac
(1)
gdzie:
Ak – suma pól powierzchni rzutu kłaczków na danym obrazie [μm2];
Ac – całkowite pole powierzchni analizowanego obrazu [μm2].
[Grijspeerdt i Verstraete, 1997] jako pierwsi zaobserwowali, że pomiędzy FA a zawiesiną ogólną (Zog) istnieje zależność wprost proporcjonalna. [Liwarska-Bizukojć i Bizukojć, 2006] stwierdzili liniową korelację pomiędzy FA a Zorg lub Zog podczas biologicznego oczyszczania
modelowych ścieków komunalnych oraz modelowych ścieków przemysłowych zawierających wysokie stężenia surfaktantów.
W celu wyznaczenia wartości FA należy ze świeżo pobranej próby
osadu czynnego przygotować trzy preparaty mikroskopowe, a następnie wykonać co najmniej 35 obrazów mikroskopowych. Obrazy wykonywane są podczas obserwacji prowadzonych w jasnym polu przy
powiększeniu 100×. Obróbkę obrazów należy rozpocząć od wyekstrahowania jednej z warstw z obrazu kolorowego RGB uzyskując w ten
sposób obraz w skali szarości. Następnie ustalana jest odpowiednia
wartość progowa (threshold) i wykonywana segmentacja obrazu, a dokładniej segmentacja kłaczków. Na tak przygotowanym obrazie mierzone są pola powierzchni poszczególnych obiektów (kłaczków) i pole
powierzchni całego obrazu. W ten sposób uzyskuje się wartość FA. Korzystając z mikroskopów wyposażonych w zmotoryzowany stolik preparatowy można wykonać obraz obejmujący cały preparat. Wówczas
takich obrazów wystarczy wykonać kilka (od 5 do 8) i obliczyć dla nich
FA. Wyniki powinny być bardziej obiektywne, gdyż nie ma ryzyka pominięcia kłaczków znajdujących się w obrębie preparatu, ani też wzięcia pod uwagę danego obiektu więcej niż jeden raz. Obecnie w ramach
projektu rozwojowego planowane jest opracowanie procedury pozwalającej w ten sposób wyznaczać wartość FA.
Pomiary podstawowych parametrów morfologicznych kłaczków
osadu czynnego
Rys. 1. Możliwości wykorzystania cyfrowej analizy obrazu do monitoringu osadu
czynnego; PAO – bakterie akumulujące polifosforany
Zastosowania cyfrowej analizy obrazu
Szacowanie stężenia biomasy
Jednym z pierwszych zastosowań analizy obrazu w technologii osadu
czynnego było wykorzystanie jej do oszacowania stężenia biomasy osadu czynnego. Tradycyjnie stężenie biomasy wyrażane jest za pomocą
stężenia zawiesiny organicznej (Zorg). Posługując się techniką cyfrowej
analizy obrazu, można obliczyć udział powierzchniowy kłaczków na
pojedynczym obrazie i na tej podstawie szacować stężenie biomasy.
Parametry morfologiczne kłaczków dzieli się na dwie grupy: (I) parametry opisujące wielkość kłaczków i (II) parametry opisujące kształt
kłaczków. Do podstawowych parametrów charakteryzujących wielkość
kłaczków należą pole powierzchni rzutu kłaczka i średnica kłaczka.
Na podstawie średnicy kłaczki dzieli się na duże (średnica powyżej
500 μm), średnie (średnica w granicach od powyżej 100 do 500 μm lub
od powyżej 150 do 500) oraz małe (mniejsze równe 100 lub 150 μm)
[Eikelboom i van Buijsen, 1999; Jenkins i in., 2004].
Z punktu widzenia całego procesu oczyszczania ścieków (rozkład
mikrobiologiczny i separacja) najlepiej, jeśli w osadzie dominują kłaczki średnie. Do kłaczków małych i średnich łatwiej wnika tlen i inne
substraty niezbędne dla wzrostu bakterii tworzących kłaczek. Z kolei
większe kłaczki łatwiej sedymentują ze względu na większą prędkość
opadania. Wielkość kłaczków jest parametrem, który ma duże zastosowanie w ocenie kłaczków podczas codziennej eksploatacji oczyszczalni ścieków. Informuje nas o ryzyku pogorszenia właściwości sedymentacyjnych osadu oraz pośrednio o przebiegu samego biologicznego
oczyszczania ścieków. Stwierdzono, że obecność substancji toksycznych w ściekach przyczynia się do rozdrobnienia kłaczków nawet do
rozmiarów kłaczków pinpoint [Liwarska-Bizukojć, 2008]. [Mesquita
i in., 2011b] zaobserwowali, że dodanie NaCl do modelowych ście-
Prosimy cytować jako: Inż. Ap. Chem. 2012, 51, 4, 151-153
INŻYNIERIA I APARATURA CHEMICZNA
str. 152
ków komunalnych (stężenie NaCl w ściekach 0,5%) przyczyniło się do
wzrostu wielkości kłaczków i poprawy właściwości sedymentacyjnych
osadu, natomiast ta sama ilość NaCl dodana do ścieków z przetwórstwa
ryb spowodowała deflokulację kłaczków, dominację kłaczków małych
aż do kłaczków typu pinpoint, dyspersyjny wzrost bakterii i w efekcie
mętny odpływ. W innej pracy [Mesquita i in., 2011a] wykazali przydatność pomiaru wielkości kłaczków do oszacowania wartości indeksu
objętościowego osadu, a w konsekwencji do predykcji zjawiska puchnięcia osadu. Badania były prowadzone w ośmiu oczyszczalniach ścieków położonych w północnej Portugalii przez okres 2 lat.
Parametry morfologiczne związane z kształtem kłaczków to przede
wszystkim kolistość, wypukłość i wymiar/średnica fraktalna kłaczków.
Kolistość kłaczków (K) świadczy o regularności ich kształtu i podobieństwie do koła. Wypukłość definiowana jest jako stosunek obwodu
wypukłego do obwodu zwykłego danego kłaczka. Jej wartość informuje o gładkości linii brzegowej kłaczka. Im wypukłość jest mniejsza od
jedności, tym więcej nierówności ma linia brzegowa kłaczka. Średnica
fraktalna (FD) kłaczków jest również miarą nieregularności linii brzegowej kłaczków:
FD =
l
Obwod
rLok
Nr 4/2012
Braga w Portugalii, a w drugim przez dwa lata w ośmiu oczyszczalniach
ścieków położonych w północnej części Portugalii.
Ponadto wykazano, że pomiar całkowitej długości nitek na obrazie
w odniesieniu do objętości zawiesiny (TL/Vol) jest również dobrym
wskaźnikiem puchnięcia osadu, skorelowanym z IO, ale powinien być
wykorzystywany do oceny osadu w danej oczyszczalni ścieków, a nie
do porównywania osadów z różnych obiektów [Mesquita i in., 2008;
Schuler i Jassly, 2007]. Dla danej oczyszczalni ścieków stwierdzono
liniową zależność pomiędzy IO a TL/Vol (R2 = 0,83) [Mesquita i in.,
2011a]. Zaobserwowano również, że w przypadku puchnięcia osadu
dominują Gram(-) bakterie nitkowe, podczas gdy w warunkach normalnych, dla typowych kłaczków, liczba Gram(-) i Gram (+) bakterii nitkowych jest zrównoważona [Mesquita i in., 2011a]. Na rys. 2 przedstawiono schemat możliwych sposobów postępowania w celu oznaczenia
udziału bakterii nitkowych za pomocą CAO.
(2)
gdzie:
Lok – długość najdłuższej osi kłaczka (μm).
Dla koła FD przyjmuje wartość 1, a wraz ze zwiększaniem się nierównomierności linii brzegowej rośnie powyżej jedności. [Arelli i in.,
2009] na podstawie monitoringu kłaczków osadu czynnego w oczyszczalni ścieków komunalnych w Bolonii (Włochy) działającej w skali pilotowej wyznaczyli wartość FD pozwalającą na rozróżnienie kłaczków
o słabej strukturze od mocnych. Kłaczki, których średnica fraktalna wynosi poniżej 1,5 kwalifikowane są jako mocne, a kłaczki o FD większej
lub równej 1,5 jako kłaczki słabe. Wyznaczenie wartości FD kłaczków
w codziennej eksploatacji oczyszczalni ścieków może być przydatne
do oceny przebiegu oczyszczania ścieków i właściwości sedymentacyjnych osadu. Kłaczki słabe to kłaczki o otwartej, luźnej strukturze, o dużej powierzchni pustych przestrzeni i dużej liczbie bakterii nitkowych.
Ich dominacja świadczy o niskim stosunku F/M (pożywienie/stężenie
biomasy), deficycie tlenu lub niskim stężeniu biogenów. Kłaczki mocne
mają zwartą strukturę, dużą gęstość, małą liczbę bakterii nitkowych,
a ich dominacja świadczy o dobrej kondycji osadu czynnego.
Określenie udziału bakterii nitkowych
Bakterie nitkowe pełnią w osadzie czynnym dwojaką rolę. Z jednej
strony przyczyniają się do powstawania agregatów tworząc swoiste
rusztowanie pod ich budowę, a z drugiej strony nadmierna liczba tych
bakterii powoduje, że kłaczki osadu czynnego mają zbyt luźną strukturę
i źle sedymentują. Nadmierny przyrost bakterii nitkowych w osadzie
czynnym jest jedną z najczęstszych przyczyn puchnięcia osadu. Miarą
spuchniętego osadu w ujęciu makroskopowym jest objętościowy indeks
osadu (IO), a w skali mikroskopowej jest to m.in. liczba bakterii nitkowych. Od około 10 lat do oszacowania udziału bakterii nitkowych
w osadzie czynnym stosowane są techniki CAO. Jedna z pierwszych
prac [da Motta i in., 2001] opublikowanych w tej dziedzinie wykazała,
że wzrost wartości IO jest poprzedzony zwiększeniem liczebności bakterii nitkowych. Badania były prowadzone przez rok w oczyszczalni
ścieków Nancy-Maxévile (Francja) oczyszczającej ścieki komunalne,
a liczebność bakterii nitkowych wyrażano za pomocą średniej długości
bakterii nitkowych na obrazie (AL/I) oraz całkowitej długości bakterii nitkowych widocznych na obrazie (TL/I). Nieco późniejsze badania
[Amaral i Ferreira, 2005] wykazały, że spośród kilku parametrów wyrażających udział bakterii nitkowych w osadzie najlepszym jest stosunek całkowitej długości nitek na obrazie do zawiesiny ogólnej (TL/
TSS). Pomiędzy tym parametrem a IO stwierdzono zależność liniową,
a współczynnik korelacji R2 wynosił 0,885. [Mesquita i in., 2008] potwierdzili tę zależność uzyskując jeszcze wyższy współczynnik korelacji R2 = 0,934. W pierwszym przypadku badania były prowadzone przez
3,5 miesiąca w oczyszczalni ścieków komunalnych w miejscowości
Rys. 2. Określenie udziału bakterii nitkowych w osadzie czynnym za pomocą CAO
Określenie udziału bakterii akumulujących polifosforany (PAO)
W ostatnich latach do identyfikacji bakterii PAO najczęściej stosowane są metody fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH). Mogą być
one połączone z technikami cyfrowej analizy obrazu w celu dokonania ilościowej oceny udziału PAO w osadzie czynnym [López-Vázquez
i in., 2008].
Udział bakterii PAO w biomasie osadu czynnego można oszacować
też w sposób pośredni oznaczając zgromadzony wewnątrzkomórkowo
poli-β-hydroksymaślan (PHB) lub polifosforany. W obydwu przypadkach niezbędne jest zastosowanie odpowiedniej metody barwienia preparatu mikroskopowego. [Pandolfi i in., 2007] przedstawili procedurę
barwienia i cyfrowej analizy obrazu PHB zgromadzonego wewnątrz
komórek bakterii nitkowych. Do barwienia polifosforanów wykorzystywane są najczęściej dwie grupy metod: (I) z błękitem toluidynowym
lub (II) z diamidynofenyloindolem (DAPI). W pierwszym przypadku
granulki polifosforanów barwią się na kolor niebiesko-czarny, a w drugim wykazują jasnożółtą barwę we fluorescencji [Seviour i in., 2003;
Ma i in., 2009]. Dotychczas brakuje doniesień literaturowych na temat
procedur CAO do oznaczenia zgromadzonych wewnątrzkomórkowo
Prosimy cytować jako: Inż. Ap. Chem. 2012, 51, 4, 151-153
INŻYNIERIA I APARATURA CHEMICZNA
Nr 4/2012
polifosforanów zabarwionych uprzednio z zastosowaniem jednej z wymienionych metod.
Identyfikacja pierwotniaków i metazoa
Pierwotniaki to druga, obok bakterii, ważna grupa mikroorganizmów
wchodzących w skład osadu czynnego. Ich obecność przyczynia się do
obniżenia liczby bakterii, stężenia Zog, a także BZT5 w ściekach oczyszczonych. W 2007 roku pojawiły się pierwsze publikacje, w których
zaproponowano półautomatyczne procedury CAO połączone z analizą
dyskryminującą (discriminant analysis) i sieciami neuronowymi, które
umożliwiają identyfikację niektórych pierwotniaków i metazoa.
Procedury te składają się z następujących etapów: (I) przygotowanie
preparatów i zbieranie obrazów, (II) obróbka i analiza obrazów, (III)
porządkowanie i obróbka danych. W ramach pierwszego etapu trzeba
wybrać gatunki lub rodzaje mikroorganizmów, które chcemy identyfikować. Biomasa osadu czynnego pobierana jest z części napowietrzanej
i możliwie jak najszybciej poddawana analizie mikroskopowej (najlepiej w czasie poniżej 3 h). Obserwacje mikroskopowe prowadzone są
w jasnym polu. Powiększenie zależy od tego, jakiej wielkości organizmy wytypowaliśmy do identyfikacji. Należy przygotować kilka preparatów i zebrać od 100 do 200 obrazów mikroskopowych z różnymi
mikroorganizmami [Ginoris i in., 2007].
Drugi etap obejmuje następujące czynności: (I) wstępna obróbka
obrazów: przekształcenie obrazu kolorowego do obrazu w skali szarości, wzmocnienie kontrastu przez lokalny histogram korekcyjny, zastosowanie filtrów medianowych i kapeluszowych (bottom hat) w celu
wzmocnienia brzegów obiektów; (II) segmentacja: zdefiniowanie obszaru zainteresowania na obrazie, ustalenie wartości progowej (threshold) i przekształcenie w obraz binarny; (III) końcowa obróbka: operacje morfologiczne zamykania, wypełniania i otwierania obrazu; (IV)
pomiar parametrów morfologicznych i ich dokumentacja [Ginoris i in.,
2007]. Mierzonych jest kilkadziesiąt parametrów morfologicznych od
typowych, takich jak średnica, obwód, kolistość do charakterystycznych parametrów zdefiniowanych na potrzeby opisu morfologicznego
pierwotniaków i metazoa, takich jak na przykład stosunek średniej szerokości ciała do szerokości ciała czy średnia szerokość stylika.
W trzecim etapie dokonuje się podziału organizmów wytypowanych
do analizy na te ze stylikiem i bez stylika [Ginoris i in., 2007; Amaral
i in., 2008]. Następnie obliczone wcześniej parametry morfologiczne są
poddane analizie dyskryminacyjnej. Jej celem jest określenie, które parametry morfologiczne bądź ich liniowe kombinacje pozwalają na rozróżnienie poszczególnych, wytypowanych wcześniej organizmów od
innych. Kolejna czynność tego etapu to trenowanie sieci neuronowych.
Do treningu należy użyć co najmniej kilkudziesięciu przedstawicieli
gatunku/rodzaju, który użytkownik chce identyfikować. Trening sieci
neuronowych może odbywać się z wykorzystaniem algorytmu optymalizacyjnego Levenberga-Marquardta lub optymalizacji elastycznej
(resilient optimization). Na zakończenie wyniki powinny być poddane
obróbce statystycznej.
W dotychczasowych badaniach stwierdzono stosunkowo wysoką
skuteczność identyfikacji pierwotniaków i metazoa za pomocą opisanej
powyżej procedury. Jest ona satysfakcjonująca zwłaszcza dla organizmów bezstylikowych i wynosi około 85%. Gorzej sytuacja wygląda
w przypadku organizmów ze stylikiem. Tutaj procent rozpoznawalności wynosi około 51%. Czas wykonania procedury identyfikacyjnej dla
pierwotniaków i wielokomórkowych organizmów wynosi od 3 do 4 godzin, co jest pewną wadą w jej stosowaniu.
Wnioski
Cyfrowa analiza obrazu od kilkunastu lat znajduje zastosowanie
w monitoringu osadu czynnego. Najczęściej wykorzystywana jest do
dwóch celów: pomiarów wielkości i kształtu aglomeratów oraz do
określenia udziału bakterii nitkowych w osadzie czynnym. Obydwa
wymienione zastosowania tej techniki analitycznej ściśle wiążą się ze
zdolnościami sedymentacyjnymi osadu i procesem separacji biomasy
od ścieków oczyszczonych.
str. 153
W mniejszym stopniu CAO znajduje zastosowanie w oszacowaniu
stężenia biomasy osadu czynnego, określaniu udziału bakterii PAO oraz
identyfikacji pierwotniaków i metazoa. Te dwa ostatnie kierunki zastosowania CAO zaczęły rozwijać się stosunkowo niedawno i ich rozwój
będzie z pewnością kontynuowany.
LITERATURA
Amaral A.L., Ferreira E.C., 2005. Activated sludge monitoring of a wastewater treatment plant using image analysis and partial squares regression Anal.
Chim. Acta 544, 246-253. DOI: /10.1016/j.aca.2004.12.061
Amaral A.L., Ginoris Y.P., Nicolau A., Coelho M.A.Z., Ferreira E.C., 2008.
Stalked protozoa identification by image analysis and multivariable statistical techniques. Anal. Bioanal. Chem., 391, 1321-1325. DOI: 10.1007/s00216008-1845-y
Arelli A., Luccarini L., Madoni P., 2009. Application of image analysis in activated sludge to evaluate correlations between settleability and features of
flocs and filamentous species. Wat. Sci. Technol., 59, no. 10, 2029-2036. DOI:
10.2166/wst.2009.119
Bitton G., 2005. Wastewater microbiology. 3rd ed., John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey.
da Motta N., Pons M.N., Roche N., Vivier H., 2001. Characterisation of activated sludge by automated image analysis. Biochem. Eng. J., 9, 165-173. DOI:
10.1016/S1369-703X(01)00138-3
Eikelboom D.H., van Buijsen H.J.J., 1999. Podręcznik mikroskopowego badania
osadu czynnego. Wyd. Seidel-Przywecki, Szczecin
Ginoris Y.P. , Amaral A.L., Nicolau A., Coelho M.A.Z., Ferreira E.C., 2007.
Development of an image analysis procedure for identifying protozoa
and metazoa typical of activated sludge system Water Res. 41, 2381-2589.
DOI: 10.1016/j.watres.2007.02.006
Grijspeerdt K., Verstraete W., 1997. Image analysis to estimate the settleability and concentration of activated sludge. Wat. Res., 31, 1126-1134. DOI:
10.1016/S0043-1354(96)00350-8
Jenkins D., Richard M.G., Daigger G.T., 2004. Manual on the Causes and Control of Activated Sludge Bulking, Foaming and other Solids Separation Problems. IWA Publishing, London
Liwarska-Bizukojć E., 2008. Oddziaływanie anionowych i niejonowych surfaktantów na osad czynny, Zesz. Nauk. nr 1022, Wyd. PŁ, Łódź
Liwarska-Bizukojć E., Bizukojć M., 2006. Effect of selected anionic surfactants
on activated sludge flocs. Enz. Microb. Technol., 39, 660-668. DOI: 10.1016/
j.enzmictec.2005.11.020
López-Vázquez C.M., Hooijmans C.M., Brdjanovic D., Gijzen H.J., van Loosdrecht M.C.M., 2008. Factors affecting the microbial populations at full-scale enhanced biological phosphorus removal (EBPR) wastewater treatment plants in the Netherlands Wat. Res., 42, 2349-2360. DOI: 10.1016/
j.watres.2008.01.001
Ma Y., Peng Y., Wang X., 2009. Improving nutrient removal of the AAO process
by an influent bypass flow by denitrifying phosphorus removal Desalination,
246, 534-544. DOI: 10.1016/j.desal.2008.04.061
Mesquita D.P., Amaral A.L., Ferreira E.C., 2011a. Identifying different types
of bulking in an activated sludge system through quantitative image analysis
Chemosphere, 85, 643-652. DOI: 10.1016/j.chemosphere.2011.07.012
Mesquita D.P., Ribeiro R.R., Amaral A.L. Ferreira E.C., Coelho M.A.Z., 2011b.
Image analysis application for the study of activated sludge floc size during
the treatment of synthetic and real fishery wastewaters Environ. Sci. Pollut.
Res., 18, 1390-1397. DOI: 10.1007/s11356-011-0496-2
Mesquita D.P., Dias O., Amaral A.L., Ferreira E.C., 2008. Relationship between
sludge volume index and biomass structure within activated sludge systems
Anais do XVII COBEQ – Congresso Brasileiro de Engenharia Química (CDROM), Recife, Brasil, 14-17 Setembro de 2008
Pandolfi D., Pons M.N., da Motta M., 2007. Characterization of PHB storage in
activated sludge extended filamentous bacteria by automated colour image
analysis Biotechnol Lett., 29, 1263-1269. DOI: 10.1007/s10529-007-9387-5
Schuler A., Jassly D., 2007. Filament content threshold for activated sludge
bulking. Artifact or reality? Water Res., 41, 4349-4356. DOI: 10.1016/
j.watres.2007.06.021
Seviour R.J., Mino T., Onuki M., 2003. The microbiology of biological phosphorus removal in activated sludge systems FEMS Microbiology Reviews,
27, 99-127. DOI: 10.1016/S0168-6445(03)00021-4
Praca została wykonana w ramach projektu rozwojowego
NR14-0004-10.