Politechnika Częstochowska Uniwersytetem Lille 1 we Francji

Politechnika Częstochowska
we współpracy z
Uniwersytetem Lille 1 we Francji
Streszczenie rozprawy doktorskiej
Mgr inż. Agnieszki Rorat
Assessment of the vermicomposting process applied to
sewage sludge by monitoring of the compost quality and
immune responses of three earthworm species: Eisenia
fetida, Eisenia andrei and Dendrobaena veneta
Ocena procesu wermikompostowania osadów ściekowych poprzez monitorowanie
jakości produktu i odpowiedzi immunologicznej trzech gatunków dżdżownic
kompostowych: Eisenia fetida, Eisenia andrei oraz Dendrobaena veneta
Promotor pracy:
Profesor Małgorzata Kacprzak
Promotor pomocniczy:
Dr hab. inż. Krzysztof Fijałkowski
Opiekun naukowy:
Profesor Franck Vandenbulcke
1.
Wstęp
Obecnie, gospodarka osadami ściekowymi stanowi ogromne wyzwanie w dziedzinie
inżynierii środowiska. Kolejne dyrektywy unijne wprowadziły konieczność dostosowania
polskiego prawa do norm europejskich oraz poszukiwania nowych, skutecznych rozwiązań w
zakresie zagospodarowania tych odpadów. Oceniono, iż objętość produkowanego osadu
ściekowego zwiększy się z 540292 Mg s.m./rok w 2013 do 642400 Mg s.m./rok w 2015 [1].
Zgodnie z danymi GUS, głównymi kierunkami zagospodarowania osadów ściekowych w
2013 były wciąż składowanie (19%), rolnictwo i rekultywacja (25%), spalanie (13%) i inne
(43%). Nowe, innowacyjne strategie powinny przede wszystkim usprawniać istniejące
technologie oczyszczania ścieków, ale też minimalizować ilość powstających osadów. Ze
względu na implementację jednej z dyrektyw Unii Europejskiej, zakazującej składowanie
osadów od 2016 roku, konieczne jest poszukiwanie nowych metod ich zagospodarowania.
Wermikompostowanie
to
stosunkowo
nowa
eko-biotechnologia,
wykorzystująca
dżdżownice jako naturalne bioreaktory w procesie dekompozycji materii organicznej [2]. W
Europie z powodzeniem stosuje się trzy gatunki tych bezkręgowców: Eisenia fetida, Eisenia
andrei oraz Dendorbaena veneta, które będąc detrytusożercami w naturze, przyspieszają
rozkład złożonych substancji organicznych i obieg materii organicznej. Pierścienice te pełnią
istotną rolę organizmów modelowych w badaniach ekotoksykologicznych, biologicznych i
genetycznych. Wybrane gatunki charakteryzują się dużą odpornością na zmieniające się
warunki atmosferyczne i obecne w podłożu zanieczyszczenia, wysokim wskaźnikiem
rozrodczości i niskim czasem koniecznym do osiągnięcia dojrzałości płciowej. Cechy te
powodują, iż możliwym jest wprowadzenie dżdżownic do procesu kompostowania osadów
ściekowych, których zagospodarowanie staje się wyzwaniem dla inżynierii i ochrony
środowiska ze względu na konieczność spełnienia norm stawianych przez dyrektywy unijne.
Ze względu na dużą zawartość szeregu zanieczyszczeń, w tym metali ciężkich, chemikaliów
oraz mikroorganizmów patogennych, osady ściekowe nie mogą być bezpośrednio stosowane
w rolnictwie. Wermikompostowanie, jako niedroga i skuteczna technika biodegradacji
odpadów prowadzi do powstania kompostu o wysokiej jakości, jednak duża zawartość
zanieczyszczeń substratu stanowi problem z punktu widzenia ekotoksykologii. Wybrane
parametry fizyczno-chemiczne służą ocenie jakości uzyskanego produktu, podczas gdy
biologiczne parametry układu odpornościowego dżdżownic mogą posłużyć jako narzędzia
biomonitorowania procesu.
2
2.
Hipotezy
A) Modyfikacje procesu wermikompostowania wpływają na jakość uzyskanego produktu
W ninijeszej pracy uwględniono parametry biotyczne i abiotyczne, które mogą wpływać
na
jakość
produktu
uzyskanego
w
procesie
wermikompostowania.
W
serii
eksperymentów zastosowano różne gatunki dżdżownic kompostowych (Eisenia fetida,
Eisenia andrei oraz Dendrobaena veneta) w różnych gęstościach hodowlanych, substrat
(osady ściekowe) pochodzące z różnych oczyszczalni ścieków na terenie Polski oraz
Francji charakteryzujące się różną zawartością metali ciężkich, wielopierścieniowych
węglowodorów aromatycznych oraz różnymi właściwościami fizyczno-chemicznymi.
Zaproponowano kilka strategii
procesu z wykorzystaniem różnych substancji jako
materiałów strukturotwórczych.
B) Jakość mieszaniny kompostowej wpływa na układ immunologiczny dżdżownic
Zanieczyszczenia obecne w osadach ściekowych, takie jak metale ciężkie oraz
wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne mogą wpływać na układ immunologiczny
dżdżownic kompostowych na poziomie tkankowym, komórkowym oraz transkrypcji
genów. Poszczególne parametry mogą zostać wykorzystane w procesie jako biomarkery
stanu fizjologicznego dżdżownic.
C) Dżdżownice kompostowe wpływają na jakość i ilość zanieczyszczeń w mieszaninie
kompostowej
3.
Cel pracy
A) Cel główny: Określenie wpływu dżdżownic gatunku Eisenia fetida, Eisenia andrei oraz
Dendrobaena veneta na jakość produktu powstałego w procesie wermikompostowania
osadów ściekowych
B) Cel
naukowy:
Zbadanie
molekularnych
i
immunologicznych
mechanizmów
zaangażowanych w interakcje między dżdżownicami a zanieczyszczeniami obecnymi w
osadach ściekowych
C) Cel utylitarny: Opracowanie technologii połączonego procesu kompostowania –
wermikompostowania osadów ściekowych z uwzględnieniem parametrów fizycznochemicznych i biologicznych limitujących prawidłowy przebieg procesu
3
4.
Część badawcza
A)
Detekcja mikroorganizmów w osadach ściekowych metodą real-time PCR.
Spośród ponad tysiąca różnych gatunków bakterii, znajdujących się w 1 g gleby, mniej niż
1% może być hodowanych metodami tradycyjnymi. Metody te są limitowane nie tylko
odpowiednim składem pożywki, ale również koniecznością odtworzenia warunków
naturalnych. Gatunki szybciej rosnące lub szczepy mikroorganizmów lepiej zaadaptowane do
zadanych warunków hodowli mogą zaburzyć istniejący obraz składu mikrobiologicznego.
Metody tradycyjne oparte na technikach hodowlanych lub mikroskopijnych, pozwoliły na
sklasyfikowanie wielu organizmów obecnych w ściekach i osadach ściekowych. Mimo tego,
wciąż pozostaje wiele niesklasyfikowanych gatunków i powstają nowe szczepy gatunków już
istniejących. Jedną z metod biologii molekularnej, omijającą konieczność hodowli
mikrobiologicznej, jest real-time PCR. Jej ogromną zaletą jest możliwość izolacji DNA
bezpośrednio ze środowiska [3], co zapewnia analizę w naturalnych warunkach. Wysoce
precyzyjna metoda real-time PCR stanowi obiecujące narzędzie biologii molekularnej, dzięki
któremu możliwa jest szybka i dokładna diagnostyka mikrobiologiczna
Celem
badań
było
zoptymalizowanie
metody real-time
PCR
jako
narzędzia
pozwalającego na monitorowanie wybranych patogenów w procesie technologicznym
oczyszczania ścieków. W pracy uwzględniono zarówno gatunki uważane a organizmy
wskaźnikowe (jak Escherichia coli) oraz poszczególne organizmy patogenne, takie jak
Escherichia coli O157:H7. Ponadto, w celu wyeliminowania problemu fałszywie dodatnich
wyników, wynikającego z izolacji materiału genetycznego z żywych i martwych komórek,
zastosowano barwnik EMA (monazydek bromku etydyny). Dwa artykuły stanowią
podrozdziały pracy:
a) Fijałkowski F., Kacprzak M., Rorat A. 2014. Occurrence changes of Escherichia coli
(including O157:H7 serotype) in wastewater and sewage sludge by quantitation
method of (EMA) Real Time – PCR. Desalination and Water Treatment.(52: 46-52)
b) Kacprzak M., Fijałkowski K, Grobelak A., Rosikoń K., Rorat A. 2014. Escherichia
coli and Salmonella spp. early diagnosis and seasonal monitoring in the sewage
treatment process by the EMA-qPCR method. Polish Journal of Microbiology (2:143148)
4
B)
Wplyw zanieczyszczeń zawartych w osadach ściekowych na układ odpornościowy
dżdżownic kompostowych
Wiele zanieczyszczeń znajdujących się w glebie może wpływać na funkcjonowanie
całych ekosystemów, a w konsekwencji stanowić zagrożenie dla ludzkiego zdrowia. W
związku z rosnącym rozwojem cywilizacyjnym, poziom stężenia metali ciężkich, pestycydów
i antybiotyków w glebie ciągle rośnie. Spośród organizmów żyjących w glebie, dżdżownice
uważane są za organizmy modelowe w badaniach ekotoksykologicznych, fizjologicznych i
genetycznych ze względu na krótki cykl życiowy i szeroki zakres tolerancji w stosunku do
zmieniających się warunków. Biomarkery, czyli indykatory stresu wywołanego u dżdżownic,
mogą posłużyć jako wskaźniki dysfunkcji całych ekosystemów. Spośród wielu dobrze
poznanych gatunków dżdżownic, w pracy skupiono szczególną uwagę nad trzema gatunkami
kompostowców stosowanych z powodzeniem w Europie: Eisenia fetida, Eisenia andrei i
Dendrobaena veneta. Gatunki te wykazują umiejętność przetwarzania materii organicznej w
cenny produkt, wemikompost, mogący posłużyć jako nawóz. Substratami w reakcji
wermikompostowania mogą być nie tylko odpady komunalne, ale też osady ściekowe. Ze
względu
na
dużą
zawartość
szeregu
zanieczyszczeń,
w
tym
metali
ciężkich,
wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych czy mikroorganizmów, koniecznym
jest biomonitorowanie procesu poprzez określenie wpływu wymienionych zanieczyszczeń na
poszczególne parametry układu odpornościowego dżdżownic. Poszczególne biomarkery
reakcji odpornościowej u dżdżownic mogą posłużyć jako bioindykatory dysfunkcji
ekosystemów oraz jako narzędzia do biomonitorowania procesu wermikompostowania. Układ
odpornościowy dżdżownic opiera się na aktywności komórek immunologicznych
(celomocytów), które podzielone są na dwie grupy. Amebocyty , które wykazują aktywność
fagocytarną, wykryte zostały u wszystkich poznanych gatunków, podczas gdy obecność
autofluorescencyjnych eleocytów jest charakterystyczna dla wybranych gatunków. Źródłem
wspomnianej
fluorescencji
jest
częściowo ryboflawina, zaangażowana w procesy
odpornościowe. Liczba komórek odpornościowych, zawartość ryboflawiny oraz zmiany
ekspresji poszczególnych genów zaangażowanych w reakcję stresową ulega zmianom pod
wpływem zanieczyszczeń obecnych w substracie [4, 5].
W pracy odnaleziono specyficzne biomarkery umożliwiające przyżyciową identyfikację
podobnych morfologicznie gatunków, określono wpływ metali ciężkich na przeżywalność,
rozrodczość , poszczególne parametry układu odpornościowego u dżdżownic oraz ekspresję
genu metaliotioneiny. Uzyskane wyniki pozwoliły na stworzenie profilu odpowiedzi
5
immunologicznej dżdżownic kompostowych w zetknięciu z zanieczyszczeniami zawartymi w
osadach ściekowych i zostały opisane w kolejnych artykułach stanowiących podrozdziały
pracy:
a) Rorat A, Kachamakova-Trojanowska N, Jozkowicz A, Kruk J, Cocquerelle C,
Vandenbulcke F, Santocki M, Plytycz B. 2014. Coelomocyte-derived fluorescence
and DNA markers of composting earthworm species. Journal of experimental zoology
Part A, Ecological genetics and physiology 321:28-40
b) Homa J., Rorat A., Kruk J., Cocquerelle C., Plytycz B., Vandenbulcke F., 2015.
Dermal exposure of Eisenia andrei earthworms: Effects of heavy metals on
metallothionein and phytochelatin synthase gene expressions in coelomocytes.
Environmental Toxicology and Chemistry 34, 1397-1404
c) Rorat A, Kacprzak M, Vandenbulcke F, Płytycz B. 2013. Soil amendment with
municipal sewage sludge affects the immune system of earthworms Dendrobaena
veneta. Applied Soil Ecology 64:237-244.
C)
Wermikompostowanie
Charles Darwin okrzyknął dżdżownice w 1881 roku „inżynieriami ziemi”, jednocześnie
zwracając po raz pierwszy uwagę naukowców na te bezkręgowce. Prawie sto lat później,
doceniono wysoki potencjał dżdżownic kompostowych w procesie przetwarzania materii
organicznej w wermikompost. Kompostowanie i wermikompostowanie to metody
biologicznego rozkładu odpadów w obecności tlenu, które doskonale wpasowują się w
strategię recyklingu wartościowych makro i mikroskładników z osadów ściekowych.
Wermikompostowanie to stosunkowa nowa, niedroga i przyjazna środowisku biotechnologia,
w której dżdżownice zatrudnione są jako naturalne bioreaktory w procesie dekompozycji
materii organicznej. Spośród wielu zalet metody wyróżnić należy redukcję objętości,
zwiększenie biodostępności związków odżywczych dla roślin, redukcję ilorazu C/N oraz
akumulację niektórych niebezpiecznych zanieczyszczeń. Pierwsze próby wykorzystania
dżdżownic gatunku Eisenia fetida do biokonwersji odpadów podjęła grupa amerykańskich
naukowców w 1977 roku, a niedługo później jako substrat w procesie zastosowano z
powodzeniem osady ściekowe [6, 7].
W skład rozdziału wchodzą trzy artykuły naukowe opisujące serię doświadczeń mających na
celu opracowanie propozycji rozwiązania technologicznego poprzez określenie modyfikacji
procesu wermikompostowania wpływających na jakość uzyskanego produktu:
6
a) Rorat A., Suleiman S., Grobelak A., Grosser A., Vandenbulcke F., Plytycz B.,
Kacprzak M. Mutual interactions between sewage sludge-amended soil and
earthworms comparison between Eisenia fetida and Eisenia andrei composting
species. Environmental Science and Pollution Research. In press
b) Suleiman H., Rorat A., Grobelak A., Grosser A., Milczarek M., Plytycz B., Kacprzak
M., Vandenbulcke F., Determining the performance of vermicomposting process
according to sewage sludge characteristics and earthworm species Submitted
c) Rorat A., Włóka D.,Grobelak A., Grosser A., Sosnecka A., Milczarek M.,
Vandenbulcke F., Kacprzak M. Vermiremediation of PAHs and heavy metals in
sewage sludge composting proces. Submitted
5.
Wnioski
a) Modyfikacje procesu wermikompostowania: różne gatunki dżdżownic, czas
kompostowania, gęstość hodowli dżdżownic, różne materiały strukturotwórcze, różne
czynniki biotyczne i abiotyczne, wpływają na jakość uzyskanego produktu.
b) Poszczególne fizyczne i chemiczne parametry kompostu determinują odpowiedź
immunologiczną dżdżownic
c) Dżdżownice
przyspieszają
rozkład
wielopierścieniowych
aromatycznych i akumulują niektóre metale ciężkie
7
węglowodorów
6. Literatura
1.
Bień, J., et al., Kierunki zagospodarowania osadów w Polsce po roku 2013. Inżynieria
i Ochrona Środowiska, 2011. 14: p. 375-384.
2.
Wang, L., Y.-T. Hung, and K. Li, Vermicomposting Process, in Biological Treatment
Processes, L. Wang, N. Pereira, and Y.-T. Hung, Editors. 2009, Humana Press. p. 715732.
3.
Shannon, K.E., et al., Application of real-time quantitative PCR for the detection of
selected bacterial pathogens during municipal wastewater treatment. Sci Total
Environ, 2007. 382(1): p. 121-9.
4.
Homa, J., et al., Metal-specific effects on metallothionein gene induction and
riboflavin content in coelomocytes of Allolobophora chlorotica. Ecotoxicol Environ
Saf, 2010. 73(8): p. 1937-43.
5.
Plytycz, B., et al., Riboflavin content of coelomocytes in earthworm (Dendrodrilus
rubidus) field populations as a molecular biomarker of soil metal pollution. Environ
Pollut, 2009. 157(11): p. 3042-50.
6.
Mitchell, M.J., et al., Conversion of sludges into ″topsoils″ by earthworms. Compost
Sci, 1977. 18(4): p. 28-32.
7.
Mitchell, M.J., S.G. Hornor, and B.I. Abrams, Decomposition of Sewage Sludge in
Drying Beds and the Potential Role of the Earthworm, Eisenia foetida1. J. Environ.
Qual., 1980. 9(3): p. 373-378.
8