Podstawowe procedury laboratoryjne w bakteriologii klinicznej

Transkrypt

Podstawowe procedury
laboratoryjne
w bakteriologii klinicznej
1
2
Podstawowe
procedury
laboratoryjne
w bakteriologii
klinicznej
3
Wydane przez World Health Organization w 2003 r. pod tytułem ,,Basic Laboratory
Procedures in Clinical Bacteriology’’, wydanie 2
 World Health Organization 2003
 Copyright for the Polish edition by Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2005
Dyrektor Generalny World Health Organization udzielił praw
na wydanie w je˛zyku polskim Wydawnictwu Lekarskiemu PZWL,
które jest całkowicie odpowiedzialne za polskie wydanie.
Wszelkie prawa zastrzeżone.
Przedruk i reprodukcja w jakiejkolwiek postaci
całości ba˛dź cze˛ści ksia˛żki
bez pisemnej zgody wydawcy sa˛ zabronione.
Redaktor ds. publikacji medycznych mgr Anna Plewa
Redaktor mgr Alicja Pałkiewicz
Redaktor techniczny Maria Karczewska
Korekta Zespół
Projekt okładki i stron tytułowych Jolanta Krafft-Przeździecka
Dawkowanie leków
Autorzy i Wydawnictwo dołożyli wszelkich starań, aby wybór i dawkowanie leków w tym
opracowaniu były zgodne z aktualnymi wskazaniami i praktyka˛ kliniczna˛. Mimo to, ze
wzgle˛du na stan wiedzy, zmiany regulacji prawnych i nieprzerwany napływ nowych
wyników badań dotycza˛cych podstawowych i niepoża˛danych działań leków, Czytelnik
musi brać pod uwage˛ informacje zawarte w ulotce doła˛czonej do każdego opakowania, aby
nie przeoczyć ewentualnych zmian we wskazaniach i dawkowaniu. Dotyczy to także
specjalnych ostrzeżeń i środów ostrożności. Należy o tym pamie˛tać, zwłaszcza w przypadku nowych lub rzadko stosowanych substancji.
ISBN 83-200-3133-8
Wydanie I
Wydawnictwo Lekarskie PZWL
00-251 Warszawa, ul. Miodowa 10
tel. (0-prefiks-22) 695-40-33
Ksie˛garnia wysyłkowa:
tel. (0-prefiks-22) 695-44-80
infolinia: 0 801-142-080
www.pzwl.pl
e-mail: promocja
0pzwl.pl
Skład i łamanie: EGRAF, Warszawa
Druk i oprawa: Pabianickie Zakłady Graficzne S.A., Pabianice
4
Przedmowa do polskiego wydania
Pierwszym, podstawowym celem diagnostyki mikrobiologicznej jest identyfikacja czynnika etiologicznego zakażenia. Wskazanie drobnoustroju odpowiedzialnego za infekcje˛ jest podstawa˛wyboru sposobu leczenia, poste˛powania zmierzaja˛cego do ograniczenia jego rozprzestrzeniania sie˛, a także oceny rokowania.
Rozpoznanie danego mikroorganizmu może być dokonane przez bakterioskopowe badanie próbki od pacjenta, hodowle˛ i identyfikacje˛. Czynnik etiologiczny zakażenia można też identyfikować na podstawie obecności w próbkach
antygenów, które wykrywa sie˛ za pomoca˛ serologicznych metod diagnostycznych. Jeszcze inna˛ droga˛ poste˛powania jest wykrywanie charakterystycznego dla
drobnoustroju kwasu nukleinowego, do czego służa˛ wprowadzone w ostatnich
latach techniki molekularne. Pośrednio czynnik etiologiczny zakażenia może być
rozpoznany na podstawie swoistych przeciwciał wytworzonych w zakażonym
organizmie. Odpowiednio dobrane antygeny i metody pozwalaja˛ na oznaczenie
zarówno klas, jak i miana przeciwciał.
Wybór metody diagnostycznej jest podyktowany wieloma wzgle˛dami, takimi jak:
zdolność drobnoustrojów do wzrostu w warunkach in vitro i szybkość jego
wzrostu, charakter zakażenia i jego przebieg, wyposażenie laboratorium, wykształcenie personelu, wreszcie możliwości finansowe. Prawidłowe wykonanie
badania mikrobiologicznego, niezależnie od zastosowanej metody, wymaga
poste˛powania według określonych szczegółowo procedur, które obejmuja˛:
pobranie i transport próbek, metode˛ przeprowadzenia badania w pracowni
mikrobiologicznej, sposób opracowania, wydania i interpretacji wyniku. Wydane
pod patronatem WHO ,,Podstawowe procedury laboratoryjne w bakteriologii
klinicznej’’ (Basic Laboratory Procedures in Clinical Bacteriology) to publikacja
podsumowuja˛ca aktualne wytyczne w zakresie doboru materiału w określonych
zakażeniach i pobierania próbek, identyfikacji drobnoustrojów oraz oznaczania
lekooporności. Informacje w niej zawarte maja˛ na celu ujednolicenie techniki
badań mikrobiologicznych i podniesienie jakości usług laboratoryjnych w krajach
rozwijaja˛cych sie˛ i tych, w których diagnostyka mikrobiologiczna nie jest dobrze
zorganizowana lub doceniana, na co wskazuje wysokie zużycie antybiotyków
i szybko wzrastaja˛ca liczba szczepów wieloopornych.
Publikacji, która˛ maja˛ Państwo przed soba˛, nie można traktować jako zbioru
obowia˛zuja˛cych procedur, może ona jednak pomóc w tworzeniu własnych
procedur w laboratorium mikrobiologicznym, być cennym źródłem nauki metod
diagnostycznych, szczególnie prostych i tanich, szczegółowo w podre˛czniku
opisanych. Niektóre metody diagnostyczne dotycza˛ chorób w Polsce nie spotykanych, np. cholera, wrzód mie˛kki, mycetoma, jednak szybkie i cze˛ste przemieszczanie sie˛ ludzi ustawicznie grozi przemieszczaniem sie˛ drobnoustrojów, a łatwy
doste˛p do mało popularnych w Polsce procedur diagnostycznych może pomóc
w rozpoznaniu, a wie˛c w zapobieganiu i rozpowszechnieniu sie˛ niekonwencjonalnego zakażenia. Niniejsza publikacja be˛dzie z pewnościa˛ cennym podre˛cznikiem,
szczególnie dla studentów analityki medycznej, wydziału lekarskiego i stomatologii, na rynku brak bowiem opracowania z zakresu diagnostyki mikrobiologicznej,
której studenci ucza˛ sie˛ na ćwiczeniach.
Opisane w publikacji procedury nie uwzgle˛dniaja˛ komercyjnych metod badawczych opartych na aparatach i podłożach do monitorowanego posiewu krwi
i płynów ustrojowych, do przyspieszonej diagnostyki gruźlicy oraz gotowych
5
podłożach do przesiewowych półilościowych badań moczu. ,,Podstawowe procedury laboratoryjne w bakteriologii klinicznej’’ zawieraja˛ opis metod identyfikacji
i oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów opieraja˛cych sie˛ na podłożach
różnicuja˛cych i prostych testach wskaźnikowych, bez uwzgle˛dnienia metod
półautomatycznych lub automatycznych. Metody oznaczania lekowrażliwości
i identyfikacja nowych mechanizmów oporności, ze wzgle˛du na zmieniaja˛ca˛ sie˛
sytuacje˛ epidemiologiczna˛, wymagaja˛ cia˛głej modyfikacji i aktualizacji, sta˛d
procedury opisane w podre˛czniku należy traktować jako ogólne, w praktyce
opieraja˛c sie˛ przede wszystkim na rekomendacjach Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów.
Podre˛cznik nie uwzgle˛dnia metod molekularnych i immunochemicznych w diagnozowaniu zakażeń. Zgodnie z tytułem przedstawione sa˛ rzeczywiście podstawowe procedury laboratoryjne i warto podkreślić, że korzyści dla mikrobiologa
z takiego podejścia do diagnostyki sa˛ naprawde˛ duże. Szczególnie cenne jest
przypomnienie, jak ważny jest i ile informacji może dostarczyć preparat
bezpośredni: można nauczyć sie˛ oszcze˛dności, liczyć czas badania. Cenna˛cze˛ścia˛
podre˛cznika jest podkreślanie w każdym z rozdziałów konieczności kontroli
wewna˛trz- i zewna˛trzlaboratoryjnych procedur oraz kontroli sprze˛tu i testów.
Podsumowuja˛c, przedstawiona publikacja może być pomocna w opracowaniu
i wdrożeniu tańszych, a jednocześnie rzetelnych metod diagnostyki mikrobiologicznej.
Prof. dr hab. med. Anna Przondo-Mordarska
6
Spis treści
Wste˛p
................................................
10
Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11
Zapewnienie jakości badań bakteriologicznych . . . . . . . . . . . . . . . . .
12
Wprowadzenie . . . . . . . . . .
Definicje . . . . . . . . . . . . . .
Wewne˛trzna kontrola jakości
Zewne˛trzna kontrola jakości
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
12
12
16
27
CZE˛ŚĆ I. BADANIA BAKTERIOLOGICZNE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
29
Krew
30
.................................................
Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Kiedy i u kogo może wysta˛pić bakteriemia
Pobieranie próbek krwi . . . . . . . . . . . . . .
Podłoża do posiewu krwi . . . . . . . . . . . .
Prowadzenie hodowli z krwi . . . . . . . . . .
.
.
.
.
.
30
30
31
32
33
Płyn mózgowo-rdzeniowy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
36
Wprowadzenie . . . . . . . . . . .
Pobieranie i transport próbek
Ocena makroskopowa . . . . .
Badanie mikroskopowe . . . . .
Wste˛pna identyfikacja . . . . . .
Oznaczanie lekowrażliwości .
Mocz
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
7
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
48
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
Kał . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
41
41
43
46
47
47
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Czynniki etiologiczne i objawy kliniczne . . . . . . . . . . . . . .
Właściwe ukierunkowanie diagnostyki laboratoryjnej . . . . .
Pobieranie i przesyłanie próbek kału . . . . . . . . . . . . . . . .
Badanie wizualne próbek kału . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Podłoża transportowo-wzbogacaja˛ce i posiew próbek kału
Podłoża do hodowli patogenów jelitowych . . . . . . . . . . . .
Wste˛pna izolacja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Wste˛pna identyfikacja izolowanych szczepów . . . . . . . . . .
Końcowa identyfikacja mikrobiologiczna . . . . . . . . . . . . . .
Identyfikacja serologiczna . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
41
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.................................................
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
36
36
37
37
39
40
......
......
......
moczu
......
......
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Pobieranie materiału do badania . . . . . . .
Hodowla i interpretacja . . . . . . . . . . . . . .
Interpretacja wyników posiewu ilościowego
Identyfikacja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Oznaczanie lekowrażliwości . . . . . . . . . .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
48
48
50
51
52
53
53
54
56
62
67
SPIS TREŚCI
Zakażenia górnych dróg oddechowych . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . .
Flora fizjologiczna gardła . . . . . . . .
Bakteryjne czynniki zapalenia gardła
Pobieranie i przesyłanie próbek . . . .
Mikroskopia bezpośrednia . . . . . . .
Hodowla i identyfikacja . . . . . . . . . .
Badanie lekowrażliwości . . . . . . . . .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
73
73
74
75
76
76
78
Zakażenia dolnych dróg oddechowych . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
79
Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Najcze˛stsze postacie kliniczne zakażeń
Pobieranie próbek plwociny . . . . . . . .
Opracowanie plwociny w laboratorium
(w zakażeniach niegruźliczych) . . . .
Hodowla Mycobacterium tuberculosis .
Interpretacja hodowli M. tuberculosis . .
Podstawowe zasady bezpieczeństwa .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
73
.......................
.......................
.......................
79
79
81
.
.
.
.
.
.
.
.
81
85
88
88
Choroby przenoszone droga˛ kontaktów seksualnych . . . . . . . . . . . .
89
Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Zapalenie cewki moczowej u me˛żczyzn .
Próbki z żeńskich narza˛dów płciowych .
Próbki z owrzodzeń narza˛dów płciowych
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
119
8
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
Oznaczanie wrażliwości na antybiotyki . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
113
113
114
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Podział bakterii ze wzgle˛du na wymagania tlenowe . . . . . . . . . . . . . .
Diagnostyka zakażeń bakteriami beztlenowymi . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
113
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
Zakażenia bakteriami beztlenowymi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
100
100
103
104
105
107
108
112
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Podstawowe zasady oznaczania lekowrażliwości . . . . .
Kliniczna definicja terminów ,,oporny’’ i ,,wrażliwy’’ . . . .
Wskazania do rutynowego oznaczania lekowrażliwości .
Wybór leków do oznaczania lekowrażliwości
w laboratoriach klinicznych . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Zmodyfikowana metoda Kirby-Bauera . . . . . . . . . . . . .
Bezpośrednie a pośrednie oznaczanie lekowrażliwości .
Czynniki techniczne wpływaja˛ce na wielkość
strefy zahamowania w metodzie dyfuzyjno-kra˛żkowej
Kontrola jakości . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
100
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
Ropne wydzieliny, rany i ropnie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
89
90
93
96
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Postacie kliniczne i najcze˛stsze czynniki etiologiczne
Pobieranie i transport próbek . . . . . . . . . . . . . . . . .
Ocena makroskopowa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Badanie mikroskopowe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Hodowla . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Identyfikacja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Badanie lekowrażliwości . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
119
119
120
122
...........
...........
...........
123
125
133
...........
...........
134
136
SPIS TREŚCI
Badania serologiczne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Metody kontroli jakości . . . . . . . . . . . . .
Reakcje serologiczne . . . . . . . . . . . . . .
Odczyny serologiczne w diagnostyce kiły
Wykrywanie aglutynin w gora˛czce . . . . .
Odczyn ASO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Wykrywanie antygenów bakteryjnych . . .
.
.
.
.
.
.
.
138
138
141
142
150
152
155
CZE˛ŚĆ II. NAJWAŻNIEJSZE PODŁOŻA I ODCZYNNIKI . . . . . . . . . . .
157
Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
158
Patogeny, podłoża i odczynniki diagnostyczne . . . . . . . . . . . . . . . . .
159
Krew . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Płyn mózgowo-rdzeniowy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Mocz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Kał . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Górne drogi oddechowe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Dolne drogi oddechowe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Próbki z układu moczowo-płciowego do diagnostyki chorób
przenoszonych droga˛ kontaktów seksualnych . . . . . . . . . . . . . . . . .
Ropa i wysie˛ki . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Lista rekomendowanych podłoży i odczynników diagnostycznych dla
laboratoriów mikrobiologicznych o średnim poziomie referencyjności
160
161
161
162
164
165
Wybrana literatura uzupełniaja˛ca . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
171
Skorowidz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
172
9
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
138
165
166
167
Wste˛p
Choroby zakaźne sa˛ najcze˛stsza˛ przyczyna˛ zgonów w krajach rozwijaja˛cych sie˛,
ich diagnozowanie i leczenie stanowi ważne wyzwanie dla służby zdrowia.
Światowa Organizacja Zdrowia (WHO, World Health Organization) od wielu lat
wspiera rozwój i wprowadzanie standardowych technik w diagnostyce laboratoryjnej. Pierwszy program pod patronatem WHO z 1960 roku dotyczył standaryzacji oznaczania lekowrażliwość patogenów bakteryjnych. W 1976 roku1
WHO Expert Committee on Biological Standardization wskazał na konieczność
stosowania metody dyfuzyjno-kra˛żkowej w oznaczaniu wrażliwości na antybiotyki2.
Równocześnie podje˛to działania w celu wprowadzenia kontroli jakości badań
laboratoryjnych. W 1981 roku WHO ustanowiła Mie˛dzynarodowy Program
Kontroli Jakości Badań Mikrobiologicznych. Laboratoria, które uczestnicza˛
w programie, moga˛ pełnić przewodnia˛ role˛ we wprowadzaniu kontroli jakości
badań w skali kraju na wszystkich poziomach systemu usług medycznych.
Publikacja, która˛ maja˛ Państwo przed soba˛, jest podsumowaniem aktualnych
wytycznych WHO, dotycza˛cych pobierania próbek do badań laboratoryjnych,
identyfikacji drobnoustrojów oraz oznaczania lekooporności. Wprowadzenie do
praktyki laboratoryjnej informacji zawartych w podre˛czniku ma na celu ujednolicenie techniki badań mikrobiologicznych i oceny lekowrażliwości oraz
podniesienie jakości usług laboratoryjnych, zarówno na poziomie centralnym, jak
i średnim. Podre˛cznik koncentruje sie˛ raczej na procedurach niż na podstawowych
technikach mikroskopowania i barwienia, które zostały opisane szczegółowo
w innych publikacjach WHO3.
1
The public health aspects of antibiotics in feedstuffs. Report on a Working Group, Bremen,
1–5 October 1973. Copenhagen, WHO Regional Office for Europe, 1973 (document no. EURO 3604
(2)).
2
WHO Expert Committee on Biological Standardization. Twenty-eight report. Geneva, World Health
Organization, 1977 (WHO Technical Report Series, No. 610).
3
Manual of basic techniques for a health laboratory, 2nd ed. Geneva, World Health Organization,
2003.
10
Wprowadzenie
Koszty zwia˛zane z chorobami zakaźnymi wcia˛ż stanowia˛nieproporcjonalnie duże
obcia˛żenie dla budżetu zdrowia w krajach rozwijaja˛cych sie˛. Według Światowego
Raportu Zdrowia (The world health report)1 ostra biegunka jest przyczyna˛
2,2 milionów zgonów rocznie. Ostre infekcje układu oddechowego (głównie
zapalenie płuc) sa˛ kolejna˛ ważna˛ przyczyna˛ śmiertelności, odpowiedzialna˛ za
około 4 miliony zgonów rocznie. Analiza doste˛pnych danych wskazuje, że
w krajach rozwijaja˛cych sie˛ patogenami wywołuja˛cymi zapalenie płuc w dzieciństwie sa˛ cze˛ściej niż wirusy, takie bakterie, jak Haemophilus influenzae
i Streptococcus pneumoniae. W różnych regionach świata pojawiły sie˛ szczepy
H. influenzae wytwarzaja˛ce β-laktamazy i S. pneumoniae o zmniejszonej wrażliwości na benzylopenicyline˛, sprawiaja˛c, że nadzór nad tymi patogenami jest
coraz bardziej istotny.
Choroby przenoszone droga˛kontaktów seksualnych sa˛coraz cze˛stsze. W konsekwencji niewystarczaja˛cego nadzoru epidemiologicznego i niedostatecznych
działań profilaktycznych aktualne sa˛ wcia˛ż zagrożenia epidemia˛ lub pandemia˛,
wywołana˛ czynnikami bakteryjnymi lub wirusowymi. Dla skutecznej kontroli
i profilaktyki chorób zakaźnych konieczny jest rozwój prostych narze˛dzi nadzoru
epidemiologicznego i monitorowania choroby oraz prostych i czułych metod
diagnostycznych.
Aby sprostać wyzwaniom w wyżej opisanej sytuacji, system usług laboratoryjnych musi być oparty na współpracy sieci laboratoriów wykonuja˛cych diagnostyke˛ mikrobiologiczna˛ dla centrów medycznych, lekarzy klinicystów i epidemiologów. Złożoność zadań powinna wzrastać proporcjonalnie: od podstawowych,
poprzez średnie, do centralnych laboratoriów (zależnie od poziomu referencyjności laboratorium — przyp. tłum.). Tylko w ten sposób możliwe be˛dzie dostatecznie
szybkie zebranie istotnych informacji, które usprawnia˛ nadzór, umożliwia˛
wczesna˛ diagnostyke˛ epidemii lub nietypowych zakażeń oraz rozwój, zastosowanie i ocene˛ określonych środków interwencji.
1
The world health report 2000, Geneva, World Health Organization, 2000.
11
Zapewnienie jakości badań
bakteriologicznych
Wprowadzenie
Programy zapewniania jakości sa˛ skutecznym sposobem zagwarantowania
standardów usług diagnostyki laboratoryjnej i podnoszenia tych standardów, jeśli
zachodzi potrzeba. W mikrobiologii poje˛cie jakości wykracza poza zagadnienia
techniczne, dotycza˛c szybkości, kosztów oraz przydatności klinicznej testu. Testy
laboratoryjne sa˛ stosunkowo drogie i wraz z poste˛pem medycyny proporcjonalnie
zwie˛kszaja˛ obcia˛żenie budżetu służby zdrowia.
Definicje
Cecha˛ testu dobrej jakości jest jego wartość kliniczna, np.: w profilaktyce
i leczeniu choroby. Inne cechy jakości testu, to:
• Niezawodność: Czy wynik jest wiarygodny?
• Powtarzalność: Czy otrzymamy taki sam wynik w powtórnym badaniu?
• Szybkość: Czy test jest wystarczaja˛co szybki, aby był użyteczny dla lekarza
zalecaja˛cego leczenie?
• Współczynnik koszt–korzyść: Czy koszt badania jest proporcjonalny do korzyści
dla pacjenta i społeczeństwa?
Czynniki wpływaja˛ce na wiarygodność
i powtarzalność wyników laboratoryjnych
Przyczyny błe˛dów:
• Personel. Wyniki pracy personelu laboratorium pozostaja˛ w ścisłym zwia˛zku
ze stopniem edukacji i dokształcaniem, doświadczeniem oraz warunkami
zatrudnienia.
• Czynniki środowiskowe. Na wyniki moga˛ wpływać: warunki przestrzenne,
oświetlenie, wentylacja, temperatura, nadmierny poziom hałasu, niebezpieczne
warunki pracy.
• Materiał do badań. Sposób i czas pobrania materiału do badań oraz pochodzenie próbki, cze˛sto pozostaja˛ce poza kontrola˛ laboratorium, maja˛ bezpośredni zwia˛zek z możliwościa˛ uzyskania wiarygodnych wyników. Czynnikami,
wpływaja˛cymi na jakość wyników, które pozostaja˛ pod kontrola˛ laboratorium,
sa˛: transport, przechowywanie, przygotowanie próbek do badania oraz identyfikacja. Laboratorium pełni funkcje˛ edukacyjna˛ wobec osób odpowiedzialnych za pobieranie i transport próbek. Pisemne instrukcje powinny być
przygotowane w przyste˛pny sposób i regularnie omawiane z klinicystami
i piele˛gniarkami.
• Materiały laboratoryjne. Jakość odczynników, chemikaliów, szklanych naczyń, barwników, podłoży do hodowli oraz zwierza˛t laboratoryjnych wpływa
na wiarygodność wyników badań.
• Metody badań. Niektóre metody sa˛ bardziej wiarygodne niż inne.
• Sprze˛t. Brak sprze˛tu, niewystarczaja˛ce lub niezgodne ze standardem wyposażenie sa˛ przyczyna˛ uzyskiwania niewiarygodnych wyników.
12
PODSTAWOWE PROCEDURY LABORATORYJNE W BAKTERIOLOGII KLINICZNEJ
• Badanie i odczyt. Pospieszne odczytywanie wyników lub brak badania
wystarczaja˛cej liczby pól mikroskopowych moga˛ być powodem błe˛dów.
• Sprawozdanie. Błe˛dy w przepisywaniu lub niekompletne opisy wyników.
Jakość interpretacji wyników badań
W mikrobiologii szczególnie ważna jest interpretacja wyników. Na każdym etapie
badania próbki rezultaty powinny być interpretowane w celu wyboru, do
kolejnego etapu badania, testu optymalnego pod wzgle˛dem szybkości i wiarygodności.
Zapewnienie jakości w laboratorium
mikrobiologicznym
Zapewnienie jakości jest suma˛ działań, w które zaangażowane jest laboratorium,
aby zapewnić dobra˛ jakość wyników. Działania te musza˛ być:
– kompletne: aby zapewnić kontrole˛ na każdym etapie procesu — od pobrania
próbki do przedstawienia końcowego wyniku lekarzowi (ryc. 1);
– racjonalne: aby skoncentrować sie˛ na najbardziej krytycznych etapach procesu;
– regularne: aby zapewnić stała˛ kontrole˛ procedur;
– cze˛ste: aby szybko wykryć i skorygować błe˛dy.
DOBRA JAKOŚĆ BADAŃ LABORATORYJNYCH
TO DOBRA JAKOŚĆ MEDYCYNY
Zapewnienie jakości pozwala na możliwie oszcze˛dne stosowanie drogich testów;
określa także zasadność i wartościowość nowych testów, podnosi jakość usług
szpitalnych i pozaszpitalnych laboratoriów oraz zapewnia porównywalność
otrzymanych wyników niezależnie od miejsca ich wykonania.
Rodzaje gwarancji jakości
Istnieja˛ dwa rodzaje gwarancji jakości: wewne˛trzna i zewne˛trzna.
• Wewne˛trzna. Tak zwana KONTROLA JAKOŚCI. Każde laboratorium ma
system sprawdzania jakości wykonywanych przez siebie testów.
Na wewne˛trzna˛ kontrole˛ jakości składaja˛ sie˛:
– cia˛gły monitoring jakości testów;
– pełne sprawdzanie wszystkich etapów diagnostyki: od pobrania próbki do
badania (jeśli jest to możliwe) do odesłania końcowego wyniku.
Laboratoria maja˛ etyczna˛ odpowiedzialność wobec pacjenta za przedstawienie
dokładnych i przydatnych wyników.
WEWNE˛TRZNA KONTROLA JAKOŚCI JEST NIEZBE˛DNA
DLA PRAWIDŁOWEGO FUNKCJONOWANIA PROCEDURY
13
ZAPEWNIENIE JAKOŚCI BADAŃ BAKTERIOLOGICZNYCH
PACJENT Z INFEKCJA˛
Pobieranie
materiału
10
Transport, oznaczanie
Przechowywanie
▲
▼
Próbka,
dane kliniczne
▼
▼
▼
WYNIK WSTE˛PNY
przekazany lekarzowi
▼
Ocena makroskopowa, zapach
WYNIK KOŃCOWY
przekazany lekarzowi
Mikroskopia, interpretacja
▼
Hodowla: wybór podłoża, temperatury, atmosfery
▼
▼
Izolacja czystych kolonii, antybiogram
▼
Identyfikacja, interpretacja
(zanieczyszczenie, komensal lub patogen)
WHO 90960
Ryc. 1. Etapy diagnostyki mikrobiologicznej zakażenia u pacjenta.
• Zewne˛trzna. Tak zwana OCENA JAKOŚCI. Wyniki działalności laboratorium
kontrolowane sa˛przez zewne˛trzna˛ instytucje˛. W niektórych krajach podleganie
zewne˛trznej ocenie jakości jest obowia˛zkowe (regulacje rza˛dowe) i wymagane
do uzyskania licencji.
Na zewne˛trzna˛ ocene˛ jakości składaja˛ sie˛:
– okresowy monitoring jakości testów;
– wybiórcza kontrola procesu identyfikacji i niekiedy technik izolacji.
Kryteria jakości w mikrobiologii
Przydatność kliniczna
Ważnym kryterium jakości badania mikrobiologicznego jest jego przydatność
w zapobieganiu i leczeniu chorób zakaźnych; jest to tak zwana przydatność
kliniczna. Warunkiem koniecznym do uzyskania poża˛danego efektu klinicznego
jest współpraca mie˛dzy lekarzem i laboratorium.
Poniższe przykłady obrazuja˛ przydatność kliniczna˛:
1. Izolacja kilku kolonii Gram-ujemnych pałeczek z plwociny lub z wymazu
z gardła hospitalizowanego pacjenta oraz identyfikacja drobnoustrojów z antybiogramem nie maja˛ żadnego znaczenia klinicznego, ponieważ żadna z tych
procedur nie wpłynie na podje˛te leczenie.
2. W przypadku izolacji Streptococcus pyogenes wykonanie pełnego antybiogramu nie ma znaczenia klinicznego, ponieważ benzylopenicylina jest lekiem
z wyboru, zawsze aktywnym in vitro.
3. W przypadku izolacji Escherichia coli u pacjenta z biegunka˛ bez domieszki
krwi, identyfikacja serotypu nie jest klinicznie przydatna, jeśli nie można
wykazać zwia˛zku mie˛dzy serotypem a chorobotwórczościa˛.
4. Rutynowa identyfikacja mieszanej flory beztlenowej widocznej w preparacie
barwionym metoda˛ Grama nie ma znaczenia klinicznego. Jest czasochłonna,
droga i nie wpłynie na leczenie pacjenta.
5. Jeśli z próbek pobranych z dróg oddechowych zostana˛ wyizolowane grzyby,
celowe jest wykonanie testu identyfikuja˛cego Cryptococcus. Dalsza iden-
14
tyfikacja nie ma znaczenia klinicznego, ponieważ nie wpłynie na sposób
leczenia pacjenta.
Podsumowuja˛c, badanie dobrej jakości to takie, które jest dokładne i dostarcza
informacji użytecznych w zapobieganiu i leczeniu chorób zakaźnych. Izolacja
i identyfikacja wszystkich mikroorganizmów w próbce nie jest konieczna.
Wiarygodność
Dla badań ilościowych wiarygodność badania jest mierzona przez porównanie
otrzymanych wyników z rzeczywista˛ wartościa˛. Poniżej przedstawiono przykłady
badań tego typu:
– określanie ste˛żenia antybiotyków w surowicy;
– pomiar wartości minimalnego ste˛żenia hamuja˛cego (MIC) antybiotyków
in vitro;
– określanie miana przeciwciał w surowicy.
Dla badań jakościowych wiarygodność badania określana jest przez ocene˛
zgodności wyniku ze stanem rzeczywistym. Poniżej przedstawiono przykłady
opisanych badań:
– identyfikacja patogenów;
– oznaczanie wrażliwości izolatów na antybiotyki metoda˛ dyfuzji kra˛żkowej.
Konieczne jest stosowanie standardowej terminologii. Zawsze należy używać
mie˛dzynarodowych nazw drobnoustrojów, np.: Staphylococcus aureus, NIE
,,patogenne gronkowce’’; Streptococcus pyogenes, NIE: ,,paciorkowce hemolizuja˛ce’’.
Niezbe˛dne jest stosowanie jednolitych, uznanych metod diagnostycznych. Oznaczanie lekowrażliwości metoda˛ dyfuzji kra˛żkowej powinno być wykonywane
zgodnie z przyje˛tymi, mie˛dzynarodowymi standardami, na przykład zmodyfikowana˛ metoda˛ Kirby-Bauera (str. 125).
Powtarzalność
Powtarzalność i precyzja wykonywanych badań ograniczone sa˛ przez dwa
czynniki:
1. Brak jednorodności. Pojedyncza próbka pochodza˛ca od pacjenta może
zawierać wie˛cej niż jeden drobnoustrój. Powtarzanie hodowli może wie˛c
prowadzić do izolacji różnych mikroorganizmów.
2. Brak stabilności. Wraz z upływem czasu mikroorganizmy w próbce w różnym
stopniu namnażaja˛ sie˛ lub gina˛. Powtarzanie hodowli może prowadzić do
izolacji różnych drobnoustrojów. W zwia˛zku z powyższym, w celu uzyskania
wie˛kszej dokładności, badania powinny być przeprowadzane jak najszybciej
po pobraniu próbek.
Skuteczność
Skuteczność badań mikrobiologicznych jest to możliwość uzyskania właściwej
diagnozy dotycza˛cej patogenu lub stanu patologicznego. Powyższa wartość
oceniana jest według dwóch kategorii:
15
1. Czułość diagnostyczna.
Czułość =
ogólna liczba dodatnich wyników
ogólna liczba zakażonych pacjentów
Im wie˛ksza czułość testu, tym mniejsza liczba fałszywie ujemnych wyników.
Na przykład czułość agaru MacConkeya jest zbyt niska w odniesieniu do izolacji
Salmonella typhi z kału. Ten ważny patogen jelitowy może zostać przeoczony
z powodu nadmiernego wzrostu niepatogennych bakterii jelitowych.
2. Swoistość diagnostyczna
Swoistość =
ogólna liczba ujemnych wyników
ogólna liczba niezakażonych pacjentów
Im wie˛ksza swoistość testu, tym mniejsza liczba fałszywie dodatnich wyników.
Przykłady:
• Barwienie preparatów z plwociny metoda˛ Ziehl-Neelsena jest wysoce
swoiste w diagnostyce gruźlicy, ponieważ daje nieliczne fałszywie dodatnie
wyniki.
• Barwienie preparatów moczu metoda˛ Ziehl-Neelsena jest dużo mniej
swoiste, ponieważ daje wiele fałszywie dodatnich wyników (z powodu
obecności atypowych pra˛tków).
• Test Widala ma bardzo niska˛ swoistość w diagnostyce duru brzusznego,
ponieważ krzyżowo reaguja˛ce przeciwciała, powstałe w przebiegu infekcji
wywołanych pokrewnymi serotypami Salmonella, daja˛ fałszywie dodatnie
wyniki.
Czułość i swoistość testu sa˛ ze soba˛ zwia˛zane. Czułość testu może być wyższa
kosztem zmniejszenia jego swoistości i vice versa. Obydwie wartości pozostaja˛
także w zwia˛zku z cze˛stościa˛ wyste˛powania danej choroby w badanej populacji.
Wewne˛trzna kontrola jakości
Wymagania
Program wewne˛trznej kontroli jakości powinien być praktyczny, realny i ekonomiczny.
Program wewne˛trznej kontroli jakości nie powinien oceniać każdej procedury,
odczynnika czy podłoża do hodowli każdego dnia pracy. Powinien oceniać
procedure˛, odczynniki czy podłoże do hodowli zgodnie z praktycznym schematem, uwzgle˛dniaja˛cym wpływ każdego elementu na jakość badania.
Procedury
Wewne˛trzna kontrola jakości rozpoczyna sie˛ od właściwych działań laboratorium.
16
Spis działań laboratoryjnych
Każde laboratorium powinno mieć wykaz działań, który obejmuje:
– sprza˛tanie miejsca pracy,
– zasady higieny osobistej,
– zasady bezpieczeństwa,
– wyznaczone poza obszarem laboratorium strefy socjalne i dla pala˛cych,
– poste˛powanie ze skażonym materiałem i jego usuwanie,
– odpowiednie szczepienia personelu, np. przeciw wirusowemu zapaleniu
wa˛troby typu B,
– dbałość o sprze˛t,
– pobieranie próbek na badania,
– rejestracje˛ próbek,
– eliminacje˛ nieodpowiednich próbek,
– poste˛powanie z próbka˛,
– zapis wyników,
– wydawanie wyników.
Zawarte w spisie działania powinny być dokładnie realizowane, regularnie
oceniane i aktualizowane.
Dbałość o sprze˛t
Istotne znaczenie ma dbałość o wyposażenie laboratorium. Badania wysokiej
jakości nie moga˛ być wykonywane sprze˛tem niskiej jakości lub niewłaściwie
utrzymanym.
W tabeli 1 przedstawiono wykaz rutynowych działań, maja˛cych zapewnić
właściwa˛ dbałość o sprze˛t. Zakres temperatur działaja˛cego urza˛dzenia może być
rejestrowany w formie przedstawionej na ryc. 2.
Podłoża do hodowli
Podłoża do hodowli moga˛ być przygotowywane ze składników podstawowych,
z komercyjnie doste˛pnych podłoży sypkich lub zakupione w formie gotowej do
użycia. Ze wzgle˛dów ekonomicznych, z uwagi na łatwość transportu i przechowywania oraz wyższa˛ jakość w porównaniu z podłożami przygotowanymi
w laboratorium, rekomendowane sa˛ komercyjnie doste˛pne podłoża sypkie. Dla
uzyskania najlepszych wyników konieczne jest uwzgle˛dnienie uwag uje˛tych
w poniższych punktach.
Wybór podłoża
Sprawnie działaja˛ce laboratorium zaopatrzone jest w najmniejszy możliwy
asortyment podłoży zgodnych z profilem wykonywanych badań. Dobrym
przykładem jest podłoże agarowe, które może być użyte jako baza do przygotowania agaru z krwia˛, agaru czekoladowego oraz kilku innych selektywnych podłoży.
Do izolacji patogennych Enterobacteriaceae z kału niezbe˛dne jest jedno wysoce selektywne podłoże (agar Salmonella-Shigella lub agar z cytry-
17
nianem deoksycholanu) oraz jedno mniej selektywne podłoże (agar MacConkeya).
W celu identyfikacji Campylobacter spp. należy zastosować specjalne podłoże.
Zamawianie i przechowywanie suchych podłoży
1. Należy zamawiać ilość, która zostanie zużyta w cia˛gu 6 miesie˛cy lub
maksymalnie w cia˛gu roku.
2. Całość należy podzielić i umieścić w pojemnikach, których zawartość powinna
zostać zużyta w cia˛gu 1–2 miesie˛cy.
3. Szczelnie domkna˛ć pokrywki pojemników. Suche podłoża absorbuja˛ wilgoć
z otoczenia. W wilgotnym klimacie należy uszczelnić zamknie˛cie pojemnika,
używaja˛c parafiny woskowej (wypełnić przestrzeń mie˛dzy pokrywka˛ i pojemnikiem roztopionym woskiem i poczekać do zastygnie˛cia).
4. Zapisać date˛ zamknie˛cia na każdym pojemniku.
5. Przechowywać w ciemnym, chłodnym, przewiewnym miejscu.
6. Odwracać pojemnik tak, aby najpierw został zużyty starszy materiał.
Tabela 1. Kontrola jakości sprze˛tu
Sprze˛t
Podstawowe czynności
Monitorowanie
Przegla˛d
techniczny
i konserwacja
Anaerostat
Cotygodniowe czyszczenie wne˛trza po- Użycie paska wskaźnikowego z błe˛ki- Cotygodniowa
jemników.
tem metylenowym w każdym cyklu.
kontrola uszczelek i szczelności
Reaktywacja katalizatora po każdym cy- Odnotowanie czasu odbarwienia wskaklu (160°C, 2 h).
źnika co tydzień
zamknie˛cia
Wymiana katalizatora co 3 miesia˛ce
Autoklaw
Co miesia˛c czyszczenie i wymiana wody
Wirówka
Przemywanie ścian wewne˛trznych środkiem dezynfekcyjnym co tydzień oraz
po uszkodzeniu probówki lub rozlaniu
zawartości
Sterylizator szkła na Czyszczenie urza˛dzenia wewna˛trz co
suche, gora˛ce pomiesia˛c
wietrze
Sprawdzenie poziomu i uzupełnienie Co 6 miesie˛cy
wody przed każdym cyklem.
Zapis czasu i temperatury lub ciśnienia
każdego cyklu.
Cotygodniowy zapis wyniku testu z użyciem przetrwalników (przyp. tłum.:
testy biologiczne)
Wymiana szczotek co rok
Zapis czasu i temperatury każdego Co 6 miesie˛cy
cyklu
Cieplarka
Czyszczenie ścianek
i półek co miesia˛c
Mikroskop
Przecieranie soczewek szmatka˛ lub bi- Sprawdzenie ustawienia kondensatora Co rok
buła˛ do soczewek po każdym dniu
co miesia˛c
pracy
Umieszczenie w pokrowcu z mikroskoCzyszczenie i smarowanie mechanizmu
pem naczynia z błe˛kitem krzemionstolika co tydzień
kowym, w celu zapobiegania wzrosPrzykrycie pokrowcem nie używanego
towi grzybów w wilgotnym środowisku
urza˛dzenia
Chłodziarka
Czyszczenie i rozmrażanie co 2 miesia˛ce Zapis temperatury każdego dnia rano Co 6 miesie˛cy
i po każdym przerwaniu zasilania pra˛(zakres temp.: 2 – 8°C)
dem
Łaźnia wodna
Przecieranie ścian wewne˛trznych i wymiana wody co miesia˛c
18
wewne˛trznych Zapis temperatury na pocza˛tku każ- Co 6 miesie˛cy
dego dnia pracy (zakres temp. 35
± 1°C)
Codzienne sprawdzanie poziomu wody Co 6 miesie˛cy
Zapis temperatury pierwszego dnia każdego tygodnia (zakres temp.:
55 – 57°C)
Temperatura
Urza˛dzenie
Pokój
Odczytywać codziennie. Sprawdzić, czy odczytana wartość temperatury jest dopuszczalna.
W przypadku nieprawidłowości zapisać temperature˛ w rubryce.
X
XI
XII
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
IX
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
VIII
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
VII
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
VI
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
V
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
IV
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
III
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
II
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
I
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
1
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
Data
Data
1
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
2
2
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
3
3
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
4
4
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
5
5
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
6
6
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
7
7
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
8
8
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
9
9
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
10
10
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
11
11
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
12
12
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
13
13
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
14
14
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
15
15
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
16
16
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
17
17
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
18
18
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
19
19
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
20
20
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
21
21
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
22
22
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
23
23
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
24
24
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
25
25
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
26
26
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
27
27
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
28
28
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
29
29
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
30
30
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
31
Ryc. 2. Zapisy temperatury działaja˛cych urza˛dzeń.
19
31
7. Jeśli pojemnik został otwarty, zapisać date˛ jego otwarcia.
8. Wyrzucić wszystkie suche podłoża, które ściemniały lub w których powstały
zlepione grudki.
9. Prowadzić rejestr przechowywanych podłoży.
Przygotowanie podłoża
1. Należy ściśle przestrzegać zaleceń producenta.
2. Przygotować ilość, która zostanie zużyta przed upływem terminu przydatności
(patrz poniżej).
Tabela 2. Zestaw szczepów zalecanych w kontroli jakościa
Bakterie beztlenowe
Gram-dodatnie ziarenkowce
Enterococcus faecalis (ATCC 29212 lub Bacteroides fragilis
33186)
Clostridium perfringens
Staphylococcus aureus (ATCC 25923)
Enterobacteriaceae
Staphylococcus epidermidis
Citrobacter freundii
Streptococcus agalactiae
Enterobacter cloacae
Streptococcus mitis
Escherichia coli (ATCC 25922)
Streptococcus pneumoniae
Klebsiella pneumoniae
Streptococcus pyogenes
Proteus mirabilis
Gram-ujemne kwasooporne bakterie
Salmonella typhimurium
Moraxella catarrhalis
Serratia marcescens
Haemophilus influenzae typ b
Shigella flexneri
β-laktamazoujemne
Yersinia enterocolitica
β-laktamazododatnie
Inne Gram-ujemne pałeczki
Haemophilus parainfluenzae
Acinetobacter lwoffi
Neisseria gonorrhoeae
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853)
Neisseria meningitidis
Vibrio cholerae (nie-01)
Grzyby
Candida albicans
a
Powinny zostać wybrane szczepy najbardziej odpowiadaja˛ce wymaganiom laboratorium.
Przechowywanie gotowych podłoży
1. Ochrona przed światłem.
2. Ochrona przed ciepłem. Podłoża zawieraja˛ce krew, inne składniki organiczne
lub antybiotyki powinny być przechowywane w chłodziarce.
3. Termin przydatności gotowego podłoża, które jest przechowywane w niskiej
temperaturze, w ciemnym miejscu, zależy od jego składu.
Przecie˛tne terminy użyteczności:
– probówki z bawełnianym korkiem — 3 tygodnie;
– probówki z nieszczelna˛ nakładka˛ — 2 tygodnie;
– pojemniki z zakre˛tka˛ — 3 miesia˛ce;
– płytki Petriego szczelnie zamknie˛te w plastikowych woreczkach — 4 tygodnie.
Kontrola jakości przygotowanych podłoży
1. Oznaczenie pH. Wartość pH prawidłowo przygotowywanych sypkich podłoży
nie musi być rutynowo sprawdzana. Podłoża przygotowywane ze składników
20
Tabela 3. Testy kontrolne dla powszechnie stosowanych podłoży
Podłoże
Inkubacja
Agar z żółcia˛ i eskulina˛
24 h
Agar z krwia˛
Agar czekoladowy
Dekarboksylaza (pokryta
olejem)
– lizyny
Organizm wskaźnikowy
Oczekiwany wynik
Enterococcus faecalis
Streptococcus α-hemolizuja˛cy
Wzrost i zaczernienie
Brak wzrostu
24 h, CO2
S. pneumoniae
Wzrost i β-hemoliza
Wzrost i α-hemoliza
24 h, CO2
Haemophilus influenzae
Wzrost
Shigella typhimurium
Shigella flexneri
S. typhimurium
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
sterylnym
48 h
– ornityny
48 h
Dihydrolaza
– argininy
48 h
S. typhimurium
Proteus mirabilis
Dodatni
Ujemny
Żelatynaza (szybki test)
24 h
Escherichia coli
Serratia marcescens
Ujemny
Dodatni
24 h
E. coli
P. mirabilis
E. faecalis
Czerwone kolonie
Bezbarwne kolonie (brak wzrostu mgławicowego)
Brak wzrostu
Agar Kliglera (patrz Trójcukrowy agar
żelazowy)
Agar MacConkeya z fioletem krystalicznym
Bulion malonianowy
24 h
E. coli
K. pneumoniae
Ujemny (kolor zielony)
Dodatni (kolor niebieski)
Agar z mannitolem
24 h
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
E. coli
Żółte kolonie
Różowe kolonie
Brak wzrostu
Czerwień metylowa/Voges-Proskauer
48 h
E. coli
K. pneumoniae
Dodatni/ujemny
Ujemny/dodatni
Agar Mueller-Hintona
24 h
E. coli ATCC 25922
Akceptowane rozmiary strefy zaS. aureus ATCC 25923
hamowania (tab. 24, str. 126)
Pseudomonas aeruginosa ATCC
27853
Bulion azotanowy
24 h
E. coli
Acinetobacter lwofii
Dodatni
Ujemny
Utlenianie/fermentacja dekstrozy (bez
oleju)
24 h
P. aeruginosa
A. lwofii
Utlenianie na powierzchni
Brak reakcji
Woda peptonowa (indol)
24 h
Deaminaza fenyloalaniny/chlorek żelaza
24 h
E.
K.
E.
P.
Dodatni
Ujemny
Ujemny
Dodatni
Salmonella-Shigella agar lub agar z cytrynianem deoksycholanu
24 h
E. coli
S. typhimurium
S. flexneri
Bez wzrostu
Bezbarwne kolonie
Bezbarwne kolonie
Bezbarwne kolonie
Bulion seleninowy
24 h
S. typhimurium
E. coli
Wzrost po przesianiu
Brak wzrostu po przesianiu
Agar cytrynianowy Simmonsa (inkubacja z luźna˛ zakre˛tka˛)
48 h
E. coli
K. pneumoniae
Brak wzrostu
Wzrost, kolor niebieski
Agar z solami żółci i cytrynianem tiosiarczanowym
24 h
Vibrio spp. (nieaglutynuja˛ce)
Żółte kolonie
Staphylococcus spp.
E. coli
C. albicans
Wzrost
Wzrost
Brak wzrostu
Brak wzrostu
Brak wzrostu
Bacteroides fragilis
Wzrost
Agar Thayer-Martina
24 h, CO2
Bulion tioglikolanowy
24 h
21
coli
pneumoniae
coli
mirabilis
Tabela 3 cd.
Podłoże
Inkubacja
Organizm wskaźnikowy
Oczekiwany wynik
Trójcukrowy agar żelazowy (głe˛bokość
co najmniej 2,5 cm; inkubacja z luźna˛
zakre˛tka˛)
24 h
S. typhimurium
S. flexneri
A. lwofii
A/A gaza + H2S
K/A gaza + H2S
K/A gaza
Brak reakcji
Podłoże z mocznikiem
24 h
E. coli
P. mirabilis
Ujemny
Dodatni (różowy)
Voges-Proskauer (patrz Czerwień metylowa/Voges-Proskauer)
a
A/A: punkt kwaśny; K/A: punkt zasadowy.
podstawowych należy wcześniej schłodzić. W przypadku stałych podłoży do
oznaczenia pH należy użyć powierzchniowej elektrody lub rozmie˛kczyć
podłoże w wodzie destylowanej. Jeśli pH różni sie˛ od zalecanego wie˛cej niż
o 0,2 jednostki, należy je skorygować kwasem lub zasada˛, lub przygotować
nowa˛ partie˛.
2. Kontrola sterylności. Testy sterylności powinny być przeprowadzane rutynowo dla podłoży, do których po sterylizacji w autoklawie dodano krew lub inne
składniki. 3–5% próbek należy poddać inkubacji w temperaturze 35°C przez
2 dni. Pozostałe schłodzić. Jeśli na płytce pojawia˛ sie˛ wie˛cej niż dwie kolonie,
należy odrzucić cała˛ badana˛ partie˛.
3. Kontrola jakości. Laboratorium powinno mieć zapas zestawów szczepów
wzorcowych do monitorowania jakości podłoży. Lista zalecanych szczepów
wzorcowych została przedstawiona w tabeli 2. Szczepy te moga˛ być uzyskane
w trakcie rutynowej pracy lub pochodzić z komercyjnych czy też oficjalnych
źródeł. Rekomendacje dotycza˛ce utrzymania i wykorzystania szczepów
wzorcowych opisane zostały na str. 24.
Lista testów przeprowadzanych dla powszechnie używanych podłoży przedstawiona została w tabeli 3.
Procedury poste˛powania przy ocenie jakości nowych partii podłoża:
1. Przygotować lekko me˛tna˛ zawiesine˛ szczepów kontrolnych, porównuja˛c ja˛ ze
wzorcem standardowego roztworu siarczanu baru używanego w zmodyfikowanej metodzie Kirby-Bauera (McFarland 0,5) (patrz str. 125) i użyć jedno
oczko ezy jako inoculum.
2. Inkubować przez rutynowo stosowany okres i odczytać zgodnie z przyje˛tymi
zasadami.
3. Właściwie zapisać wyniki.
Barwniki i odczynniki
Zalecenia dotycza˛ce testowania niektórych odczynników przedstawiono w tabeli 4. Testy powinny być przeprowadzane:
– za każdym razem przy przygotowywaniu nowej partii roztworu roboczego;
– co tydzień (niezbe˛dne w przypadku zimnego barwnika Ziehl-Neelsena:
klasyczny ma kilkumiesie˛czny termin przydatności).
Odczynniki i barwniki powinny być dyskwalifikowane, jeśli:
– termin ważności określony przez producenta jest przekroczony;
– widoczne sa˛ oznaki psucia (zme˛tnienie, osad, zmiana barwy).
22
Antygeny i surowice odpornościowe
do diagnostyki
W celu otrzymania możliwie najlepszych wyników badań z użyciem antygenów
i surowic odpornościowych należy:
• Zawsze przestrzegać instrukcji producenta.
• Przechowywać w zalecanej temperaturze. Niektóre odczynniki serologiczne
nie toleruja˛ zamrażania.
Tabela 4. Testy jakości powszechnie stosowanych odczynników
Gatunek użyty do testowania
Odczynnik lub barwnik
Wzrost
Brak wzrostu
Podłoże
Kra˛żek z bacytracyna˛
S. pyogenes (strefa zahamo- E. faecalis
wania)
Agar z krwia˛
Katalaza
S. aureus
E. faecalis
Agar tryptozowo-sojowy
Osocze do koagulazy
β-Glukuronidaza (PGUA)a
S. aureus
E. coli
S. epidermidis
K. pneumoniae
Barwienie metoda˛ Grama
Staphylococcus spp.
E. coli
Preparaty z mieszanki
szczepów
ONPGb
E. coli
S. typhimurium
Kra˛żek z optochina˛
S. pneumoniae (strefa zahamowania)
Pseudomonas aeruginosa
Streptococcus mitis
Trójcukrowy agar żelazowy lub agar Kliglera
Agar z krwia˛
E. coli
Kra˛żek z tellurydem
E. faecalis (brak strefy zahamowania)
(strefa zahamowania)
Agar z krwia˛
Czynnik V (kra˛żek lub pasek)
Czynnik XV (kra˛żek lub pasek)
Haemophilus parainfluenzae Haemophilus influenzae
H. influenzae
Barwienie metoda˛ Ziehl-Neelsena
Mycobacterium tuberculosis
Oksydaza
Mieszana, niekwasooporna Preparat z rozmazem
flora
z plwocinyc
a
Kwas 4-nitrofenylo-β-D-glukopiranozydouronowy (PGUA).
o-Nitrofenylo-β-D-galaktopiranozyd.
c
Przygotować wymazy od pacjentów zdrowych i chorych. Utrwalić w cieple, owina˛ć każdy papierem i przechowywać
w chłodziarce.
b
• Unikać powtarzanych zamrożeń i rozmrożeń. Przed zamrożeniem podzielić surowice˛ na odpowiednie porcje, wystarczaja˛ce do wykonania kilku
testów.
• Wyrzucić, jeśli upłyna˛ł termin ważności podany przez producenta.
• Do testu aglutynacji z surowicami odpornościowymi należy używać zawsze
świeżych, czystych, zidentyfikowanych hodowli.
• Zawsze, w każdej serii badań, wykonać test z surowica˛ kontrolna˛ o znanej
reaktywności. Surowica może pochodzić od pacjenta lub z komercyjnego
źródła.
• Jeśli to możliwe, aktywność surowicy powinna być wyrażana w jednostkach
mie˛dzynarodowych (International Units, IU) na mililitr.
• Pary surowic, pobranych od jednego pacjenta w ostrej fazie choroby i w fazie zdrowienia, powinny być badane z użyciem odczynników z tej samej
partii.
• Diagnostyke˛ serologiczna˛ kiły prowadzić zgodnie z przyje˛tymi krajowymi
i mie˛dzynarodowymi procedurami.
• Każda partia testów serologicznych powinna zawierać:
– surowice˛ ujemna˛ (kontrola swoistości);
23
– surowice˛ słabo dodatnia˛ (kontrola czułości);
– surowice˛ silnie dodatnia˛ (kontrola miareczkowania), która powinna być
przygotowana w rozcieńczeniu odpowiadaja˛cym jej mianu uzyskanemu
w ostatnio wykonywanym teście.
• Zawsze zapisywać wszystkie miana surowic kontrolnych.
Oznaczanie wrażliwości na antybiotyki
Zalecane jest rutynowe stosowanie zmodyfikowanej metody Kirby-Bauera (str.
125). W celu uniknie˛cia błe˛dów, należy przestrzegać poniższych zasad:
• Kra˛żki powinny mieć właściwa˛ średnice˛ (6,35 mm).
• Kra˛żki powinny zawierać właściwe ste˛żenie antybiotyku (tabela 24, str. 126).
• Zapas kra˛żków powinien być przechowywany w zamrażarce (–20°C).
• Zestaw podre˛czny powinien być przechowywany nie dłużej niż 1 miesia˛c
w chłodziarce (2 – 8°C).
• Do przeprowadzania badania jakości należy używać tylko agaru Mueller-Hintona.
• Właściwe pH (7,2 – 7,4) gotowego podłoża jest bardzo istotne w przypadku
niektórych antybiotyków.
• Ge˛stość inoculum powinna być standaryzowana, określona na podstawie
wzorca zme˛tnienia (str. 127).
• Pomiar wielkości strefy powinien być dokładny.
• Uzyskana średnica strefy zahamowania wzrostu powinna być interpretowana według wartości granicznych podanych w tabeli. Średnica strefy
dla szczepów kontrolnych powinna zgadzać sie˛ z zakresami podanymi w tabeli
24 (str. 126).
• Trzy standardowe szczepy kontrolne, to1:
– Staphylococcus aureus (ATCC 25923; NCTC 6571);
– Escherichia coli (ATCC 25922; NCTC 10418);
– Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853; NCTC 10622).
• Badania kontrolne z wykorzystaniem wymienionych szczepów powinny być
przeprowadzane:
– dla każdej nowej partii kra˛żków;
– dla każdej nowej partii podłoży;
– raz w tygodniu, równolegle do antybiogramów wykonywanych rutynowo.
• W celu zapisu i interpretacji wyników kontroli jakości, zalecane jest stosowanie
wykresu przedstawionego na ryc. 16 (str. 137).
Pozyskiwanie i przechowywanie
szczepów kontrolnych
Wybór szczepów i źródło ich pochodzenia
Należy wybrać szczepy, których maksymalna liczba morfologicznych, metabolicznych i serologicznych cech może być identyfikowana możliwie najmniejsza˛
liczba˛ testów; zalecane szczepy kontrolne zebrano w tabeli 2.
1
Wymienione szczepy moga˛ być uzyskane z: American Type Culture Collection (ATCC), 10801
University Boulevard, Manassas, VA 20110, USA; lub National Collection of Type Cultures (NCTC),
PHLS Central Public Health Laboratory, 61 Colindale Avenue, London NW9 5HT, England.
24
Szczepy te można uzyskać z naste˛puja˛cych źródeł:
– prawidłowo zidentyfikowane izolaty z próbek klinicznych;
– oficjalne kolekcje szczepów;
– komercyjni producenci;
– referencyjne laboratoria;
– inne źródła z zewne˛trzna˛ kontrola˛ jakości.
Przechowywanie szczepów
Długoterminowe przechowywanie szczepów
Metody długoterminowego przechowywania szczepów pozwalaja˛ na kilkumiesie˛czne lub nawet kilkuletnie przerwy mie˛dzy przesiewami. Najlepszymi
metodami sa˛: liofilizacja (suchy lód), przechowywanie w zamrażarce lub
w ciekłym azocie, w temperaturze –70°C lub niższej. Metody alternatywne
opisano poniżej.
Glicerol w temperaturze –20°°C
1.
2.
3.
4.
5.
Wzrost czystych hodowli na odpowiednim stałym podłożu.
Wyrosłe kolonie zebrać eza˛.
Zawiesić niewielka˛ ilość materiału w sterylnym neutralnym glicerolu.
Umieścić 1 – 2 ml porcje w zakre˛canych pojemnikach lub w fiolkach.
Przechowywać w temperaturze –20°C. Unikać powtarzania zamrożeń i rozmrożeń. Przesiewać co 12 – 18 miesie˛cy.
Olej mineralny w temperaturze pokojowej1
1. Przygotować probówki ze skosem agarowym zawieraja˛cym wycia˛g z serca.
Dla wymagaja˛cych mikroorganizmów dodać świeża˛ lub ogrzana˛ krew.
2. Wysterylizować olej mineralny (liquid petrolatum) w suchym gora˛cym
powietrzu (170°C przez godzine˛).
3. Posiać szczep na skosy agarowe.
4. Jeśli widoczny jest wzrost hodowli, dodać sterylny olej mineralny na wysokość
około 1 cm ponad poziom agaru.
5. Konieczne przesiewy uzyskuje sie˛ przez zebranie hodowli spod warstwy oleju.
6. Przechowywać w temperaturze pokojowej. Przesiewać co 6 – 12 miesie˛cy.
Przechowywanie hodowli w temperaturze pokojowej (stosowane tylko dla
niewymagaja˛cych bakterii, takich jak gronkowce i Enterobacteriaceae)
1. Przygotować probówki z wysokim słupkiem agaru, bez we˛glowodanu.
Zalecany jest agar tryptozowo-sojowy (trawiony kazeina˛ agar sojowy).
2. Posiać szczepy wkłuwaja˛c je w agar.
3. Inkubować przez noc w temperaturze 35°C.
4. Zamkna˛ć probówke˛ zakre˛tka˛ lub korkiem. W celu uszczelnienia zanurzyć
zakre˛tke˛ lub korek w płynnej parafinie.
5. Przechowywać w temperaturze pokojowej. Przesiewać raz w roku.
1
Morton H.E., Pulaski E.J.: The preservation of bacterial cultures. Journal of Bacteriology, 1938,
38: 163 – 183.
25
Przechowywanie szczepów na agarze cysteinowo-tryptozowym (CTA) (dla
Neisseria i paciorkowców)
Przygotować probówki zawieraja˛ce podstawowe podłoże CTA.
Posiać wkłuwaja˛c bakterie w podłoże.
Inkubować przez noc w temperaturze 35°C.
Zamkna˛ć probówke˛ zakre˛tka˛ lub korkiem. W celu uszczelnienia zanurzyć
zakre˛tke˛ lub korek w płynnej parafinie.
5. W przypadku Neisseria, przechowywać w temperaturze 35°C i przesiewać co
2 tygodnie. W przypadku paciorkowców, przechowywać w temperaturze
pokojowej i przesiewać co miesia˛c.
1.
2.
3.
4.
Podłoża z wycia˛giem mie˛snym dla bakterii beztlenowych
1.
2.
3.
4.
Posiać szczepy.
Inkubować przez noc w temperaturze 35°C.
Zamkna˛ć probówke˛ zakre˛tka˛ lub korkiem.
Przechowywać w temperaturze pokojowej i przesiewać co 2 miesia˛ce.
Krótkoterminowe przechowywanie szczepów
Hodowle szczepów kontrolnych, aktualnie wykorzystywane do badań rutynowych, moga˛ być przygotowywane w poniższy sposób.
Szybko rosna˛ce mikroorganizmy
1. Posiać na skos agarowy tryptozowo-sojowy w zakre˛canych probówkach.
3. Przechowywać w chłodziarce. Przesiewać co 2 tygodnie.
Paciorkowce
1. Posiać na skos agarowy z krwia˛ w zakre˛canych probówkach.
3. Przechowywać w chłodziarce. Przesiewać co 2 tygodnie.
Meningokoki i Haemophilus
1. Posiać na skos lub płytke˛ z agarem czekoladowym.
3. Przechowywać w temperaturze pokojowej. Przesiewać 2 razy w tygodniu.
Gonokoki
1. Posiać na agar czekoladowy.
2. Inkubować przez noc w temperaturze 35°C. Przesiewać co 2 dni.
3. Zaste˛pować szczepy kontrolne nowymi klinicznymi izolatami.
26
Rola referencyjnych laboratoriów
Poniższe rodzaje materiałów do badań powinny być przesyłane do regionalnych
lub centralnych laboratoriów referencyjnych:
– materiały badane w kierunku rzadko izolowanych drobnoustrojów lub wymagaja˛ce zastosowania wysoko specjalistycznych testów (np.: wirusologia,
diagnostyka serologiczna chorób pasożytniczych);
– pojedyncze duplikaty materiałów do badań, w celu kontroli wydawanych przez
laboratorium wyników;
– materiały wymagaja˛ce w przyszłości badań potwierdzaja˛cych, różnicuja˛cych,
oznaczania grup ba˛dź typów patogenów o dużym znaczeniu dla zdrowia
publicznego (np.: Salmonella, Shigella, Vibrio cholerae, Brucella, meningokoki i pneumokoki).
Referencyjne laboratoria powinny dostarczać zestawy szczepów kontrolnych
oraz, na potrzeby szkoleń, standardowe surowice i odczynniki używane w laboratorium referencyjnym.
Jeśli laboratorium nie jest obje˛te programem zewne˛trznej kontroli jakości,
referencyjne laboratorium jest zobowia˛zane do przygotowywania ślepych, kodowanych próbek i hodowli, które służa˛ do kontroli jakości pracy laboratorium
w zakresie izolacji i hodowli.
Zewne˛trzna kontrola jakości
W cze˛ści tej omówiono elementy podlegaja˛ce ocenie w programie zewne˛trznej
kontroli jakości (określanym jako ,,program testowania biegłości’’).
Cele
Celem programu kontroli jakości jest:
– zagwarantowanie lekarzom i społeczeństwu dobrej jakości diagnostyki laboratoryjnej;
– ocena i porównanie wiarygodności wyników laboratoryjnych w skali kraju;
– identyfikacja powszechnie popełnianych błe˛dów;
– motywacja do przestrzegania ujednoliconych procedur;
– motywacja do używania standardowych odczynników;
– podje˛cie czynności administracyjnych (ła˛cznie z cofnie˛ciem licencji) wobec
laboratoriów nie spełniaja˛cych standardów;
– motywacja do wprowadzenia wewne˛trznych programów jakości.
Zasady kontroli
Zewne˛trzna kontrola jakości polega na wysyłaniu kodowanych próbek do
uczestnicza˛cych w niej laboratoriów. Powyższe próbki powinny być wła˛czone do
badań rutynowych, traktowane i badane dokładnie w ten sam sposób, jak próbki
kliniczne.
Kontrole˛ należy prowadzić zgodnie z poniższymi zaleceniami:
– powinna być przeprowadzana co najmniej 4 razy w roku;
– powinna obejmować co najmniej 3 próbki;
– czas na przygotowanie sprawozdania powinien być krótki, np. 2 tygodnie od
otrzymania materiału do badań;
27
– instrukcje i formularze dotycza˛ce sprawozdania powinny być doła˛czone do
każdego zestawu próbek, a raport powinien być przygotowany w dwóch
kopiach i przesłany w ściśle ustalonym terminie.
Hodowle
Hodowle powinny być wła˛czone do identyfikacji i oznaczania wrażliwości na
określona˛ liczbe˛ antybiotyków; może to być czysta hodowla lub mieszanina
dwóch lub wie˛cej szczepów.
Hodowle powinny należeć do co najmniej 3 pierwszych z poniższych 6 grup:
1. Bakterie o dużym znaczeniu dla zdrowia publicznego, które sa˛ rzadko
izolowane w rutynowej diagnostyce, np.: Corynebacterium diphtheriae,
Salmonella paratyphi A.
UWAGA: Brucella i Salmonella typhi nie powinny być wykorzystywane
w programach kontroli jakości, ponieważ moga˛ wywoływać poważne,
przypadkowe zakażenia.
2. Nietypowe biotypy, które sa˛ cze˛sto identyfikowane nieprawidłowo, np.:
H2S-dodatnie Escherichia coli, laktozoujemne E. coli, ureazoujemne Proteus.
3. Nowe lub oportunistyczne patogeny, np.: Yersinia enterocolitica, Vibrio
parahaemolyticus, Burkholderia, Pseudomonas cepacia.
4. Mieszane hodowle Shigella, Citrobacter, E. coli i Klebsiella moga˛ zostać
wykorzystane w celu oceny zdolności laboratorium do izolacji patogenów
spośród wielu mikroorganizmów komensalnych.
5. Mieszane hodowle niepatogennych mikroorganizmów moga˛zostać wykorzystane w celu oceny zdolności rozpoznawania próbek ujemnych.
6. Bakterie o specyficznym wzorze oporności, np.: metycylinooporny S. aureus
(MRSA).
Surowice
Program kontroli jakości powinien obejmować także badania serologiczne
stosowane w poniższych zakażeniach:
– kiła,
– różyczka,
– bruceloza,
– infekcje paciorkowcowe,
– dur brzuszny.
Ocena i przedstawienie wyników
Gdy wszystkie obje˛te programem kontroli laboratoria dostarcza˛ swoje wyniki,
należy przesłać im zestaw prawidłowych odpowiedzi. W cia˛gu miesia˛ca do
laboratoriów powinny zostać wysłane sprawozdania z analiza˛ wyników. Każde
laboratorium oceniane jest według punktacji. Laboratorium powinno mieć
nadany, sobie tylko znany numer. W ten sposób może porównać własne rezultaty
z wynikami innych laboratoriów, które pozostaja˛ anonimowe.
28
Cze˛ść I
Badania bakteriologiczne
29
Krew
Wprowadzenie
Hodowle z krwi prowadzone sa˛ w celu izolacji i identyfikacji bakterii lub innych
możliwych do wyhodowania mikroorganizmów (drożdże, grzyby nitkowate).
Obecność powyższych drobnoustrojów we krwi określa sie˛ mianem bakteriemii
lub fungemii, która zazwyczaj jest stanem patologicznym. U zdrowych osób krew
jest jałowa. Istnieje jednak kilka wyja˛tków: okresowa bakteriemia, która pojawia
sie˛ krótko po ekstrakcji ze˛ba lub po innych zabiegach stomatologicznych
i chirurgicznych w obre˛bie zakażonych błon śluzowych, po bronchoskopii lub po
cewnikowaniu pe˛cherza. Opisany typ bakteriemi dotyczy zwykle bakterii komensalnych i zazwyczaj przemija samoistnie dzie˛ki fagocytozie zachodza˛cej w wa˛trobie i śledzionie.
Sepsa jest terminem klinicznym, określaja˛cym bakteriemie˛ z objawami klinicznymi cie˛żkiej infekcji, takimi jak: dreszcze, gora˛czka, złe samopoczucie i spadek
ciśnienia te˛tniczego. Skrajna˛ postacia˛ sepsy jest wstrza˛s. Wstrza˛s może być
wywołany toksynami produkowanymi przez Gram-ujemne pałeczki lub Gram-dodatnie ziarenkowce.
Kiedy i u kogo może wysta˛pić bakteriemia
Bakteriemia jest cecha˛ niektórych chorób zakaźnych, np.: brucelozy, leptospirozy
i duru brzusznego. Przewlekła bakteriemia wyste˛puje w zakażeniach łożyska
naczyniowego, np.: w zapaleniu wsierdzia (endocarditis), zakażonym te˛tniaku
i w zakrzepowym zapaleniu żył (thrombophlebitis).
Przejściowa bakteriemia cze˛sto towarzyszy zlokalizowanym infekcjom, takim
jak: zapalenie stawów (arthritis), odleżyny, zapalenie pe˛cherzyka żółciowego
(cholecystitis), zapalenie jelita cienkiego i okre˛żnicy (enterocolitis), zapalenie
opon mózgowo-rdzeniowych (meningitis), zapalenie szpiku (osteomyelitis),
zapalenie otrzewnej (peritonitis), zapalenie płuc (pneumonia), odmiedniczkowe
zapalenie nerek (pyelonephritis) oraz zakażenia ran pourazowych i chirurgicznych. Może pojawić sie˛ w wyniku różnych interwencji chirurgicznych, lecz
u zdrowych osób zwykle uste˛puje samoistnie.
Bakteriemia i fungemia moga˛ być pochodzenia jatrogennego i wysta˛pić w wyniku
wprowadzenia mikroorganizmów droga˛ dożylna˛: przez skażony płyn podawany
dożylnie, cewnik lub miejsce wkłucia. Obydwa typy infekcji moga˛ wysta˛pić
u osób przyjmuja˛cych dożylnie narkotyki oraz u osób w immunosupresji, do
których zalicza sie˛ pacjentów zakażonych ludzkim wirusem upośledzenia
odporności — z zespołem nabytego upośledzenia odporności (HIV/AIDS). Sa˛one
cze˛sto wynikiem zakażeń ,,oportunistycznymi’’ mikroorganizmami i moga˛ mieć
poważne konsekwencje. W tabeli 5 przedstawiono najcze˛stsze przyczyny bakteriemii i fungemii.
30
CZE˛ŚĆ I
Pobieranie próbek krwi
Czas pobrania próbki
Jeśli to możliwe, krew powinna zostać pobrana przed zastosowaniem antybiotyków. Najlepiej przed wysta˛pieniem dreszczy lub szczytu temperatury.
Zaleca sie˛ pobranie dwu lub korzystniej trzech próbek krwi w około godzinnych
odste˛pach (lub krótszych, jeśli nie można opóźniać rozpocze˛cia leczenia). Rzadko
wskazane jest pobranie wie˛cej niż trzech próbek. Zalety powtarzanych hodowli
z krwi, to:
– zmniejszone prawdopodobieństwo przeoczenia przejściowej bakteriemii;
– potwierdzenie patogennej roli ,,saprofitycznych izolatów (np.: Staphylococcus
epidermidis) przez wykazanie ich obecności w próbkach z kilku wkłuć.
Tabela 5. Cze˛ste przyczyny bakteriemii i fungemii
Gram-ujemne mikroorganizmy
Gram-dodatnie mikroorganizmy
Escherichia coli
Klebsiella spp.
Enterobacter spp.
Proteus spp.
Salmonella typhi
Salmonella spp., inne niż S. typhi
Bacteroides fragilis (beztlenowe)
Brucella spp.
Burkholderia (Pseudomonas) pseudomallei
(w niektórych regionach)
S. epidermidis
α-Hemolizuja˛ce (zielenieja˛ce paciorkowce)
E. faecalis (grupa D)
S. pyogenes (grupa A)
S. agalactiae (grupa B)
Listeria monocytogenes
Peptostreptococcus spp. (beztlenowe)
Candida albicans i inne drożdżopodobne
grzyby (np. Cryptococcus neoformans)
Ważne jest pobranie próbek krwi przed wprowadzeniem antybiotykoterapii
empirycznej. Jeśli to konieczne, wybór antybiotyków może zostać zmodyfikowany po uzyskaniu wyników antybiogramu.
Obje˛tość próbki krwi
Ponieważ liczba bakterii w mililitrze krwi jest zwykle mała, ważne jest pobranie
właściwej obje˛tości krwi: 10 ml z wkłucia u dorosłych; 2 – 5 ml moga˛ być
wystarczaja˛ce u dzieci, u których zwykle bakteriemia osia˛ga wyższe wartości;
u niemowla˛t i noworodków cze˛sto można uzyskać maksymalnie 1 – 2 ml. Każda
próbka powinna być posiana do dwóch butelek: pierwszej do optymalnej hodowli
ściśle tlenowych mikroorganizmów, drugiej dla szczepów beztlenowych.
Dezynfekcja skóry
Skóra w miejscu wkłucia powinna być starannie przygotowana, z użyciem
bakteriobójczego preparatu dezynfekuja˛cego: 2% roztworu jodyny, 10% roztworu
poliwidonu jodyny, 70% alkoholu lub 0,5% roztworu chlorheksydyny w 70%
alkoholu. Przed pobraniem krwi środek dezynfekuja˛cy powinien odparować
z powierzchni skóry. W celu uniknie˛cia ewentualnych podrażnień przy stosowaniu jodyny skóre˛ należy przetrzeć 70% alkoholem.
31
KREW
Nawet po starannym przygotowaniu skóry niektóre bakterie moga˛ przetrwać
w głe˛bszych warstwach i przedostać sie˛ do krwi, np.: S. epidermidis, Propionibacterium acnes, przetrwalniki Clostridium.
Pseudobakteriemia (fałszywie dodatnie hodowle z krwi) może być efektem użycia
skażonych roztworów dezynfekuja˛cych, strzykawek lub igieł.
Powtarzalne izolacje nie wyste˛puja˛cych powszechnie mikroorganizmów (np.:
Burkholderia (Pseudomonas) cepacia, Pantoea (Enterobacter) agglomerans lub
Serratia spp.) z jednego szpitala wzbudzaja˛ podejrzenie zakażenia szpitalnego
i wymagaja˛ szczegółowych badań. Inna˛ przyczyna˛ skażenia próbki jest kontakt
igły z niesterylnymi probówkami (lub roztworami), jeśli ta sama strzykawka
została wcześniej użyta do pobrania krwi do badań biochemicznych lub odczynu
opadania krwinek czerwonych (OB — odczyn Biernackiego — przyp. tłum.).
Antykoagulant
Zalecane jest użycie jako środka przeciwkrzepliwego polianetosulfonianu sodu
(sodium polyanethol sulfonate — SPS), ponieważ hamuje on jednocześnie
aktywność przeciwbakteryjna˛ osocza i fagocytów. Jeśli natychmiast po pobraniu
krew zostanie dodana do wystarczaja˛cej obje˛tości (50 ml) bulionu i dokładnie
wymieszana w celu uniknie˛cia tworzenia sie˛ skrzepów, zastosowanie antykoagulantu nie jest konieczne. Każdy szpital i wie˛kszość ośrodków zdrowia
powinna być wyposażona w butelki z podłożem do posiewu krwi. Jeśli płynne
podłoże jest niedoste˛pne, krew należy przesłać do laboratorium w probówce
zawieraja˛cej sterylny roztwór antykoagulantu (cytrynian, heparyna lub SPS).
W laboratorium próbka krwi natychmiast po otrzymaniu powinna zostać
w warunkach aseptycznych przeniesiona do butelki z podłożem. Jeśli krew
pobrana jest bez antykoagulantu, skrzep w laboratorium może zostać w aseptycznych warunkach przeniesiony do bulionu, a surowica wykorzystana do wykonania
niektórych testów serologicznych (np.: odczyn Widala).
Podłoża do posiewu krwi
Wybór podłoży płynnych
Bulion do posiewu z krwi i bulion tryptozowo-sojowy (TSB) powinny umożliwić
wzrost wszystkich bakterii o znaczeniu klinicznym.
Obje˛tość bulionu
Optymalnie krew powinna być wymieszana z bulionem w stosunku 1:10 (5 ml
krwi w 50 ml podłoża), co zmniejsza ste˛żenie antybiotyku i redukuje aktywność
przeciwbakteryjna˛ ludzkiego osocza.
Butelki z podłożem do posiewu krwi
Należy używać butelek z podłożem do posiewu krwi (125 ml), z podwójna˛
nakre˛tka˛, której druga˛ warstwe˛ stanowi gumowy kra˛żek. Po napełnieniu butelki
32
CZE˛ŚĆ I
50 ml podłoża odkre˛cić nakre˛tke˛ o pół obrotu. Nakryć zamknie˛cie kwadratowym
fragmentem folii aluminiowej i umieścić butelke˛ w autoklawie w 120°C na
20 minut. Natychmiast po autoklawowaniu, gdy butelka i podłoże sa˛ jeszcze
gora˛ce, delikatnie dokre˛cić nakre˛tke˛, bez usuwania folii aluminiowej (w innym
przypadku nakre˛tka nie be˛dzie sterylna). Podczas stygnie˛cia podłoża wytwarza sie˛
cze˛ściowa próżnia, która ułatwi wprowadzenie próbki krwi przez gumowa˛
warstwe˛.
Tuż przed wprowadzeniem materiału do butelki należy starannie zdezynfekować
gumowa˛ cze˛ść nakre˛tki.
Przed wydaniem gotowej butelki z podłożem i przed jej użyciem powinno sie˛
sprawdzić przejrzystość zawartości. Podłoże, które wykazuje zme˛tnienie, nie
powinno zostać użyte.
Jeśli podejrzewa sie˛ obecność bakterii tlenowych (Pseudomonas, Neisseria) lub
drożdży, w laboratorium po otrzymaniu próbki należy zdezynfekować gumowa˛
cze˛ść nakre˛tki i przekłuć ja˛ sterylna˛ igła˛ z bawełniana˛ zatyczka˛. Igła może zostać
usunie˛ta w chwili, gdy ciśnienie wewna˛trz butelki osia˛gnie wartość ciśnienia
atmosferycznego. Komercyjne butelki do posiewu krwi zawieraja˛ dwutlenek
we˛gla stymuluja˛cy wzrost. W krajach, gdzie powszechnie wyste˛puje bruceloza,
zalecane jest stosowanie, umożliwiaja˛cego wzrost Brucella spp., dwufazowego
podłoża, złożonego z bulionu oraz stałej warstwy agaru na jednej z gładkich
powierzchni naczynia (Castaneda bottle). Do hodowli wie˛kszości szczepów
B. abortus wymagana jest obecność dwutlenku we˛gla.
Prowadzenie hodowli z krwi
Czas inkubacji
Butelki do posiewu krwi powinny być inkubowane w 35 – 37°C i kontrolowane
dwukrotnie w cia˛gu dnia (co najmniej przez pierwsze 3 dni) w celu oceny cech
mikrobiologicznych wzrostu. Jałowe posiewy zwykle zawieraja˛ warstwe˛ osadu
krwi, pokryta˛ jasnożółtym przezroczystym bulionem. Dowodem wzrostu sa˛:
– kłaczkowaty osad na powierzchni warstwy krwi,
– jednolite lub podpowierzchniowe zme˛tnienie,
– hemoliza,
– koagulacja bulionu,
– kożuszek na powierzchni,
– wytwarzanie gazu,
– białe ziarna na powierzchni lub w głe˛bszej warstwie krwi.
Kiedy tylko pojawi sie˛ wzrost, butelke˛ należy otworzyć w warunkach aseptycznych, pobrać sterylna˛ eza˛ lub pipeta˛ Pasteura niewielka˛ ilość bulionu i przygotować rozmaz barwiony metoda˛ Grama w celu oceny obecności mikroorganizmów.
Jednocześnie należy wykonać przesiew eza˛ na odpowiednie podłoża:
– dla Gram-ujemnych pałeczek: agar MacConkeya, agar Kliglera, podłoże
ruch-indol-ureaza (MIU), cytrynianowy agar Simmonsa;
– dla małych Gram-ujemnych pałeczek: agar z krwia˛;
– dla gronkowców: agar z krwia˛, agar z mannitolem;
– dla paciorkowców: agar z krwia˛, z kra˛żkiem z optochina˛, bacytracyna˛
i telurynem, agar z krwia˛ barania˛ do testu CAMP, agar z żółcia˛ i eskulina˛.
33
KREW
W rutynowych posiewach krwi inkubacja dłuższa niż 7 dni nie jest konieczna.
W niektórych przypadkach inkubacja może być przedłużona o kolejne 7 dni, na
przykład przy podejrzeniu zakażenia pałeczkami Brucella lub innymi mikroorganizmami o wysokich wymaganiach odżywczych, w przypadku zapalenia
wsierdzia lub jeśli pacjent jest w trakcie antybiotykoterapii.
Próbki krwi z niewidocznym wzrostem
Niektóre mikroorganizmy moga˛ rosna˛ć bez zme˛tnienia lub widocznych zmian
w podłożu. Inne, jak na przykład pneumokoki, wykazuja˛ tendencje˛ do autolizy
i szybko gina˛. Z tego powodu niektóre laboratoria prowadza˛ rutynowe przesiewy
na agar czekoladowy po 18 – 24 godzinach inkubacji. Próbki z niewidocznym
wzrostem moga˛ być opracowywane w siódmym dniu inkubacji przez przeniesienie kilku kropel dobrze zmieszanej hodowli krwi (z użyciem sterylnych pipet
Pasteura) do probówki z podłożem tioglikolanowym, która˛ inkubuje sie˛ i obserwuje przez kolejne 3 dni.
Antybiogram
Przy podejrzeniu obecności gronkowców lub Gram-ujemnych pałeczek można
oszcze˛dzaja˛c czas wykonać bezpośredni, niestandaryzowany antybiogram, używaja˛c dodatnich próbek jako inoculum. Sterylna˛ wymazówke˛ należy zanurzyć we
wstrza˛śnie˛tym podłożu i odsa˛czaja˛c nadmiar płynu, posiać na podłoże Mueller-Hintona jak w metodzie standardowej (patrz str. 126). Wste˛pny odczyt może być
wykonany po 6 – 8 godzinach inkubacji. W 95% przypadków rezultaty uzyskane
ta˛ metoda˛ sa˛ zgodne ze standaryzowanym testem.
Zanieczyszczenia
Zanieczyszczenia hodowli krwi można unikna˛ć przez staranne przygotowanie
skóry i dokładne przestrzeganie procedur aseptycznych w czasie posiewu
i przesiewów. Jednakże nawet w idealnych warunkach 3 – 5% posiewów krwi jest
,,skażonych’’ bakteriami ze skóry (S. epidermidis, P. acnes, Clostridium spp.,
dyfteroidy) lub ze środowiska (Acinetobacter spp., Bacillus spp.).
Powyższe mikroorganizmy moga˛ być w niektórych sytuacjach patogenne,
wywołuja˛c np. zapalenie wsierdzia. Rzeczywista˛ infekcje˛ należy podejrzewać
w poniżej wymienionych sytuacjach:
– jeżeli ten sam organizm wyhodowano z dwóch butelek tej samej próbki krwi;
– jeżeli ten sam organizm rośnie w hodowli wie˛cej niż jednej próbki;
– jeżeli wzrost jest szybki (w cia˛gu 48 godzin);
– jeżeli różne izolaty jednego gatunku wykazuja˛ ten sam biotyp i wzór
lekowrażliwości.
Wszystkie wyniki hodowli powinny być przedstawiane lekarzowi ła˛cznie
z wynikami próbek prawdopodobnie zanieczyszczonych. Jednakże dla tych
ostatnich nie należy wykonywać antybiogramu, a jedynie umieścić na wyniku
odpowiedni komentarz, np. Propionibacterium acnes (flora skóry), Staphylococcus epidermidis (prawdopodobnie zanieczyszczenie). Jest to istotne dla
nawia˛zania dobrej współpracy mie˛dzy lekarzami a personelem laboratorium.
34
CZE˛ŚĆ I
Identyfikacja dwóch lub wie˛cej drobnoustrojów z krwi prawdopodobnie wskazuje
na wieloczynnikowa˛ bakteriemie˛, która może wyste˛pować u wyniszczonych
pacjentów, ale może być również rezultatem skażenia próbki. ,,Beztlenowcowa’’
bakteriemia cze˛sto wywołana jest przez kilka patogenów, np. w cie˛żkiej,
piorunuja˛cej bakteriemii, zwia˛zanej z poważnym urazem lub zabiegiem chirurgicznym na jelicie grubym, wyste˛puje jeden lub kilka patogenów beztlenowych
z jednym lub kilkoma patogenami tlenowymi.
35
Płyn mózgowo-rdzeniowy
Wprowadzenie
Badanie płynu mózgowo-rdzeniowego jest ważne w diagnostyce bakteryjnego
i grzybiczego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych i musi być traktowane jako
badanie nadrze˛dne, wymagaja˛ce właściwej uwagi personelu laboratoryjnego.
Prawidłowy płyn mózgowo-rdzeniowy jest jałowy i przejrzysty, zwykle zawiera
trzy lub mniej leukocytów w 1 mm3, nie zawiera erytrocytów. Jego chemiczny
i cytologiczny skład zmienia sie˛ w stanach zapalnych opon mózgowo-rdzeniowych i mózgu, np. w zapaleniu mózgu (encephalitis) lub opon mózgowo-rdzeniowych (meningitis). W rozdziale omówione zostanie jedynie badanie
mikrobiologiczne, choć ocena liczby białych krwinek w płynie mózgowo-rdzeniowym ma także istotne znaczenie.
Najcze˛stsze, zależnie od wieku pacjenta, przyczyny zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych, zostały wymienione w tabeli 6, należy jednak pamie˛tać, że
czynniki te moga˛ współistnieć.
Podczas wykonywania przez lekarza punkcji le˛dźwiowej lub komorowej do
dwóch sterylnych probówek należy pobrać około 5 – 10 ml płynu mózgowo-rdzeniowego. Ze wzgle˛du na niebezpieczeństwo jatrogennego bakteryjnego
zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych, konieczna jest dokładna dezynfekcja
skóry. Cze˛ść próbki płynu mózgowo-rdzeniowego jest przeznaczona do przeprowadzenia badań biochemicznych i cytologicznych, pozostała˛ obje˛tość płynu
wykorzystuje sie˛ do badań mikrobiologicznych. Ponieważ komórki szybko
ulegaja˛ rozpadowi, próbka powinna zostać niezwłocznie dostarczona do laboratorium i opracowana. Każde opóźnienie może być przyczyna˛ nieprawidłowej oceny
liczby komórek, nie odzwierciedlaja˛cej klinicznego stanu pacjenta.
Tabela 6. Cze˛ste przyczyny bakteryjnego i grzybiczego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych
U niemowla˛t (do 2 miesia˛ca życia)
Escherichia coli
Inne Enterobacteriaceae: Salmonella spp., Citrobacter spp.
Streptococcus agalactiae (grupa B)
W innych grupach wiekowych
Haemophilus influenzae (otoczkowy typ b)a
Listeria monocytogenes b
Cryptococcus neoformans b
Staphylococcus spp.c
a
Rzadko powyżej 5. roku życia.
U pacjentów z niedoborem odporności (ła˛cznie z pacjentami z zespołem nabytego
niedoboru odporności — AIDS).
c
Zwia˛zane z zabiegami neurochirurgicznymi i drenami pooperacyjnymi.
b
36
CZE˛ŚĆ I
Ocena makroskopowa
Wygla˛d płynu mózgowo-rdzeniowego powinien być oceniony i opisany jako:
klarowny, mglisty, me˛tny, ropny, żółty (zwia˛zany z hemoliza˛ lub żółtaczka˛ ja˛der
podkorowych), z domieszka˛ krwi, z włóknami lub warstwa˛ fibryny.
Badanie mikroskopowe
Przygotowanie próbki
Jeśli w ocenie makroskopowej stwierdza sie˛ ropny płyn mózgowo-rdzeniowy
(bardzo me˛tny), to badanie można przeprowadzić bez odwirowania. W pozostałych przypadkach płyn mózgowo-rdzeniowy powinien zostać odwirowany
w sterylnej probówce (najlepiej o obje˛tości 15 ml) w 10 000 g przez 5 – 10 minut.
Usuna˛ć supernatant, używaja˛c sterylnej pipety Pasteura z dopasowanym gumowym kapturkiem, i przenieść do innej probówki do testów biochemicznych i/lub
serologicznych. Osad użyć do wykonania dalszych testów mikrobiologicznych.
Mikroskopia bezpośrednia
Do badania mikroskopowego użyć kropli osadu umieszczonej mie˛dzy szkiełkiem
podstawowym i nakrywkowym, oceniaja˛c obecność:
– leukocytów (wieloja˛drzaste neutrofile lub limfocyty),
– erytrocytów,
– bakterii,
– grzybów.
Przy podejrzeniu obecności drożdżaków Cryptococcus neoformans na szkiełku
podstawowym należy zmieszać pobrany eza˛ osad z tuszem chińskim, nakryć
szkiełkiem nakrywkowym i ogla˛dać preparat, poszukuja˛c typowych, otoczkowych, sferycznych form grzybów.
W regionach, w których wyste˛puje śpia˛czka afrykańska, konieczne jest uważne
poszukiwanie aktywnego ruchu wyposażonych w witke˛ świdrowców z rodzaju
Trypanosoma.
Wolno żyja˛ce w wodzie ameby (Naegleria fowleri), które dostaja˛ sie˛ do
ośrodkowego układu nerwowego przez nos, wywołuja˛ rzadkie i zazwyczaj
śmiertelne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych. Moga˛ być widoczne w preparacie bezpośrednim w postaci aktywnie poruszaja˛cych sie˛ ogranizmów, wielkościa˛ zbliżonych do neutrofilów.
Barwienie preparatów metoda˛ Grama
Czynniki wywołuja˛ce zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych sa˛ cze˛sto widoczne
w preparatach barwionych metoda˛ Grama, sta˛d badanie to jest bardzo istotne.
Preparaty należy wysuszyć na powietrzu, utrwalić łagodnie podgrzewaja˛c
i wybarwić metoda˛ Grama. Ogla˛dać pod powie˛kszeniem ×1000 (w immersji)
przez co najmniej 10 minut lub do chwili stwierdzenia obecności bakterii.
W tabeli 7 przedstawiono ważne obserwacje diagnostyczne zwia˛zane z różnymi
formami zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych.
37
PŁYN MÓZGOWO-RDZENIOWY
Tabela 7. Cechy płynu mózgowo-rdzeniowego w zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych
Typ zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych
Badana cecha
Bakteryjne
Gruźlicze
Segmentowe polimorficzne neutrofile
Bardzo niskie:
0,28 – 1,1 mmol/l
Monocyty (młode neutrofile)
Niskie:
1,1 – 2,2 mmol/l
Monocyty
Monocyty
Niskie:
1,1 – 2,2 mmol/l
Prawidłowe:
3,6 – 3,9 mmol/l
Ste˛żenie białka
Podwyższone
Podwyższone
Podwyższone
Nieco podwyższone we
wczesnej fazie zakażenia
Preparat barwiony
Zwykle widoczne ba- Rzadko dodatni
kterie (Gram)
(kwasooporne)
Zwykle dodatni (tusz
chiński)
Ujemny
Leukocytoza
Ste˛żenie glukozy
Grzybicze
Wirusowe (,,aseptyczne’’)
Tabela 8. Wybór podłoża dla płynu mózgowo-rdzeniowego w zależności od wyników barwienia metoda˛ Gramaa
Obserwacja
Gram-ujemne
pałeczki
Noworodki
a
b
Gram-dodatnie
ziarenkowce
Inne grupy
Inne grupy
Noworodki
wiekowe
wiekowe
Agar z krwia˛b
+
+
Agar z krwia˛ z S. aureusb
Agar czekoladowy
+
+
(+)
Agar MacConkeya
Bulion tryptozowo-sojowy
+
+
+
+
+
+z
kra˛żkiem
z optochina˛
Gramujemne
ziarenkowce
Gramdodatnie
pałeczki
Brak
mikroorganizmów
+
+
+
+
(+)
(+)
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ = użyć; (+) = ewentualnie użyć.
Inkubacja w atmosferze wzbogaconej CO2 (eksykator).
Barwienie bakterii kwasoopornych
(metoda Ziehl-Neelsena)
Pomimo niskiej czułości metody, przy podejrzeniu gruźliczego zapalenia opon
mózgowo-rdzeniowych, zalecane jest barwienie rozmazu z osadu metoda˛ Ziehl-Neelsena. Barwiony preparat należy starannie ogla˛dać przez co najmniej
15 minut. Jeśli wynik jest ujemny, naste˛pnego dnia powtórzyć badanie, wykonuja˛c naste˛pny preparat z próbki.
Hodowle
Po stwierdzeniu obecności bakterii w preparacie barwionym metoda˛ Grama
należy wykonać posiew na odpowiednie podłoża (tabela 8). Jeśli nie wykazano
obecności drobnoustrojów, należy wykonać posiew na podłoża o szerokim
spektrum wzrostu, takie jak agar z krwia˛z posianym Staphylococcus aureus, który
umożliwia wzrost H. influenzae. Płytki zawieraja˛ce agar z krwia˛ i agar
czekoladowy powinny być inkubowane w 35°C w powietrzu atmosferycznym
wzbogaconym w dwutlenek we˛gla. Wszystkie podłoża inkubować przez 3 dni
i codziennie obserwować.
Przy podejrzeniu gruźliczego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych należy
wykonać posiew z osadu na co najmniej 3 podłoża Löwensteina-Jensena
i inkubować przez 6 tygodni. Przez pierwsze 2 – 3 dni probówki powinny być
inkubowane w pozycji poziomej z odkre˛cona˛ o pół obrotu nakre˛tka˛. Wzrost
38
CZE˛ŚĆ I
oceniać w cotygodniowych odste˛pach. Po zaobserwowaniu jakiegokolwiek
wzrostu, najlepiej w bakteriologicznie bezpiecznych komorach, należy przygotować preparat, wysuszyć, utrwalić ciepłem i wybarwić metoda˛ Ziehl-Neelsena.
Obecność kwasoopornych pra˛tków jest równoznaczna z diagnoza˛ gruźlicy.
Wszystkie izolaty powinny zostać przesłane do laboratorium referencyjnego
w celu potwierdzenia diagnozy i określenia lekowrażliwości.
Gdy na podstawie barwienia tuszem chińskim lub objawów klinicznych podejrzewa sie˛ zakażenie Cryptococcus neoformans, należy wykonać posiewy z osadu
do dwóch probówek z agarem Sabouraud i inkubować w 35°C do miesia˛ca.
C. neoformans rośnie także na płytkach zawieraja˛cych agar z krwia˛, które, jeśli to
wskazane, powinny być inkubowane w 35°C przez tydzień.
Wste˛pna identyfikacja
Wzrost na agarze MacConkeya sugeruje obecność Enterobacteriaceae, która
naste˛pnie powinna być potwierdzona z użyciem metod i podłoży zalecanych dla
patogenów jelitowych.
Kolonie Gram-dodatnich ziarenkowców ze strefa˛ brzeżnej hemolizy typu β moga˛
wskazywać na obecność S. agalactiae (paciorkowce grupy B), która powinna
zostać potwierdzona w odwrotnym teście CAMP (str. 117).
Płaskie kolonie z wkle˛sła˛ cze˛ścia˛ centralna˛ i niewielka˛ zielona˛ strefa˛ hemolizy
typu α to prawdopodobnie S. pneumoniae. Dla potwierdzenia należy na agarze
z krwia˛, zawieraja˛cym ge˛sto posiane czyste kolonie badanego szczepu, umieścić
6-milimetrowy kra˛żek z optochina˛. Po całonocnej inkubacji pneumokoki wykaża˛
14-milimetrowa˛ lub wie˛ksza˛ strefe˛ zahamowania wzrostu wokół kra˛żka. Najlepsze rezultaty uzyskuje sie˛ po inkubacji na agarze zawieraja˛cym krew barania˛
w atmosferze wzbogaconej w dwutlenek we˛gla. Jeśli odczyt pierwszej hodowli na
agarze z krwia˛ nie jest jednoznaczny, należy przesiać szczep i powtórzyć badanie.
Kolonie H. influenzae rosna˛ tylko na agarze czekoladowym oraz jako kolonie
satelitarne w pobliżu gronkowcowych posiewów na agarze z krwia˛. Dalsza
identyfikacja może być przeprowadzona w teście aglutynacji szkiełkowej przy
użyciu surowicy odpornościowej H. influenzae typ b.
Gram-ujemne dwoinki rosna˛ce na agarze z krwia˛lub agarze czekoladowym, które
daja˛ szybko dodatni test oksydazowy, moga˛ być uznane za meningokoki.
Potwierdzenie i identyfikacja grup serologicznych N. meningitidis (A, B, C) sa˛
oparte na odczynie aglutynacji szkiełkowej z użyciem właściwych surowic
odpornościowych. Ujemny odczyn aglutynacji nie wyklucza meningokoków,
ponieważ istnieja˛ co najmniej cztery dodatkowe serogrupy. W tej sytuacji dla
izolowanych szczepów należy określić zdolność do rozkładu we˛glowodanów,
a hodowle przesłać do referencyjnego laboratorium centralnego. Wste˛pne wyniki
powinny być przedstawiane lekarzowi na każdym etapie identyfikacji (barwienie
metoda˛Grama, wzrost, aglutynacja itp.), z komentarzem, że zostanie przygotowany raport końcowy.
Kolonie Gram-dodatnich pałeczek z brzeżna˛ strefa˛ β-hemolizy na agarze z krwia˛
moga˛ wskazywać na Listeria monocytogenes. Zalecane jest wykonanie naste˛puja˛cych testów potwierdzenia: dodatnia reakcja z katalaza˛, ruch w podłożu
płynnym lub w MIU, wzrost i czarne przebarwienie na agarze z żółcia˛ i eskulina˛.
39
PŁYN MÓZGOWO-RDZENIOWY
Oznaczanie lekowrażliwości
W przypadku Gram-ujemnych pałeczek i gronkowców należy zastosować
standardowa˛ metode˛ kra˛żkowa˛ (Kirby-Bauera).
Niepotrzebne jest oznaczanie lekowrażliwości dla szczepów Listeria monocytogenes, S. agalactiae lub N. meningitidis, ponieważ w tej grupie oporność na
ampicyline˛ i benzylopenicyline˛ jest wyja˛tkowo rzadka.Wszystkie szczepy pneumokoków powinny mieć oznaczona˛na agarze z krwia˛wrażliwość na chloramfenikol i benzylopenicyline˛. W ostatnim przypadku zalecany jest test kra˛żkowy
z oksacylina˛ (1 µg) (patrz str. 84, ,,Zakażenia dolnych dróg oddechowych’’).
Szczepy H. influenzae powinny mieć oznaczona˛ wrażliwość na chloramfenikol na
agarze czekoladowym lub wzbogaconym krwia˛. Wie˛kszość ampicylinoopornych
szczepów wytwarza β-laktamazy, których obecność można wykazać wykonuja˛c
szybkie testy rekomendowane do badań skriningowych dla β-laktamazododatnich
gonokoków (str. 92).
40
Mocz
Wprowadzenie
Mocz jest materiałem najcze˛ściej pobieranym do badań. Sprawia także najwie˛cej
problemów, zwia˛zanych z właściwym pobraniem, wyborem metod hodowli
i interpretacja˛ wyników. Podobnie jak w przypadku innych materiałów, uzupełniaja˛ce informacje dostarczone przez lekarza pozwalaja˛ laboratorium na uzyskanie możliwie najlepszych wyników posiewu.
Najcze˛stsza˛ lokalizacja˛ zakażeń układu moczowego jest pe˛cherz moczowy
(cystitis) i cewka moczowa. Sta˛d infekcja droga˛ wste˛puja˛ca˛ może dotrzeć do
moczowodów (ureteritis), a naste˛pnie obja˛ć nerke˛ (pyelonephritis). Kobiety sa˛
bardziej predysponowane do zakażeń układu moczowego niż me˛żczyźni, trudniejsze w ich przypadku jest także prawidłowe pobranie próbki moczu.
Zarówno u kobiet, jak i me˛żczyzn zakażenie układu moczowego może przebiegać
bezobjawowo, ostro lub przewlekle. Bezobjawowe infekcje moga˛ być zdiagnozowane przez posiew. Ostre zakażenie obserwowane jest cze˛ściej u kobiet
(w różnym wieku); pacjenci zwykle leczeni sa˛ ambulatoryjnie i rzadko poddawani hospitalizacji. Przewlekłe zakażenie u me˛żczyzn, podobnie jak i u kobiet
w każdym wieku, zwykle skojarzone jest z choroba˛ podstawowa˛ (np.: odmiedniczkowe zapalenie nerek, choroba prostaty, wady wrodzone układu moczowo-płciowego) i wia˛że sie˛ z cze˛stsza˛hospitalizacja˛. Bezobjawowe, ostre i przewlekłe
zakażenia układu moczowego to trzy różne jednostki chorobowe, dlatego wyniki
badań laboratoryjnych cze˛sto wymagaja˛ różnej interpretacji.
Bezobjawowe odmiedniczkowe zapalenie nerek u kobiet może pozostać nierozpoznane, cze˛sto diagnozowane jest dopiero po wykonaniu dokładnego ilościowego badania mikrobiologicznego moczu. Wyste˛puja˛ce powszechnie przewlekłe zapalenie prostaty cze˛sto jest przyczyna˛ nawracaja˛cych zakażeń układu
moczowego.
Niezależnie od typu najcze˛stszym czynnikiem etiologicznym zakażenia układu
moczowego sa˛ bakterie jelitowe, w tym izolowana znacznie cze˛ściej niż inne
patogeny Escherichia coli. U około 10% pacjentów moga˛ być obecne dwa
patogeny jednocześnie odpowiedzialne za proces chorobowy. Obecność trzech
i wie˛cej różnych drobnoustrojów w posiewie moczu zdecydowanie wskazuje na
niewłaściwe pobranie materiału do badania lub zanieczyszczenie próbki. Obecność licznych patogenów obserwowana jest u pacjentów z założonym na stałe
cewnikiem moczowym.
Pobieranie materiału do badania
W badaniu mikrobiologicznym moczu trudno przecenić znaczenie prawidłowego
pobrania próbek moczu, transportu do laboratorium oraz badania wste˛pnego
i posiewu. Laboratorium jest odpowiedzialne za dostarczenie lekarzowi sterylnych, szklanych lub plastikowych kubków, słoików czy innych odpowiednich
pojemników o szerokim wlocie. Powinny one zostać wysterylizowane gora˛cym
suchym powietrzem w autoklawie, naste˛pnie szczelnie zamknie˛te, a wieczka
przykryte folia˛ aluminiowa˛.
41
MOCZ
Próbka moczu może zostać pobrana z wykorzystaniem metod chirurgicznych, np.:
przez nakłucie nadłonowe pe˛cherza moczowego, cystoskopie˛ lub cewnikowanie.
W innym przypadku laboratorium powinno dopilnować, aby mocz został pobrany
ze środkowego strumienia po dokładnym umyciu okolicy cewki moczowej,
zwłaszcza u kobiet i dzieci. Ponieważ mocz sam jest dobra˛ pożywka˛ dla
drobnoustrojów, posiew powinien zostać wykonany w cia˛gu 2 godzin od pobrania
lub przechowywany w chłodziarce w 4°C do czasu dostarczenia do laboratorium
i posiany nie później niż 18 godzin od pobrania.
Jeśli to możliwe, do posiewu należy użyć moczu pobranego rano. Zaleca sie˛
poprosić pacjenta w przeddzień wieczorem o powstrzymanie sie˛ od oddania
moczu do chwili pobrania próbki.
Pacjentki powinny:
1. Umyć dokładnie re˛ce woda˛ z mydłem i wytrzeć w czysty re˛cznik.
2. Rozchylić wargi sromowe, łechtaczke˛ i wargi sromowe przemyć starannie
sterylnym płatkiem gazy i ciepła˛ woda˛ z mydłem, w kierunku od przodu do
tyłu. Nie powinno sie˛ używać środków do dezynfekcji.
3. Spłukać dokładnie łechtaczke˛ i wargi sromowe ciepła˛ woda˛ i osuszyć
sterylnym płatkiem gazy. Podczas tej czynności wargi sromowe powinny
pozostawać rozchylone, pacjentka nie powinna dotykać umytej powierzchni
palcami.
4. Oddać niewielka˛ ilość moczu. Naste˛pnie zebrać wie˛kszość pozostałego moczu
do sterylnego pojemnika, zamykaja˛c pokrywke˛ zaraz po pobraniu próbki. Jest
to próbka ze środkowego strumienia moczu.
5. Zanieść do piele˛gniarek zamknie˛ty pojemnik, który powinien zostać niezwłocznie dostarczony do laboratorium.
Pacjenci powinni:
1. Umyć dokładnie re˛ce woda˛ z mydłem i wytrzeć w czysty re˛cznik.
2. Odsuna˛ć napletek (jeśli pacjent nie jest obrzezany) i umyć żoła˛dź sterylnym
płatkiem gazy i ciepła˛ woda˛ z mydłem. Nie powinno sie˛ używać środków do
dezynfekcji.
3. Spłukać dokładnie żoła˛dź ciepła˛ woda˛ i osuszyć sterylnym płatkiem gazy.
Podczas tej czynności pacjent nie powinien dotykać palcami umytej powierzchni.
4. Nasuna˛ć napletek i oddać niewielka˛ ilość moczu. Trzymaja˛c nasunie˛ty
napletek pacjent powinien zebrać wie˛kszość pozostałego moczu do sterylnego
pojemnika, zamykaja˛c pokrywke˛ zaraz po pobraniu. Jest to próbka ze
środkowego strumienia moczu.
5. Zanieść do piele˛gniarek zamknie˛ty pojemnik, który powinien zostać niezwłocznie dostarczony do laboratorium.
Dla pacjentów leża˛cych obowia˛zuje ta sama procedura, z wyja˛tkiem konieczności
skorzystania z pomocy piele˛gniarki lub, jeśli to konieczne, wykonania przez nia˛
całej procedury przygotowania pacjenta przed oddaniem moczu.
W obydwu sytuacjach powinny zostać podje˛te starania, aby właściwie pobrać
mocz do sterylnego pojemnika oraz aby niezwłocznie przesłać do laboratorium
próbke˛ wraz z informacjami o pacjencie, rozpoznaniem klinicznym, z zachowaniem wymaganych procedur.
42
CZE˛ŚĆ I
Niemowle˛ta i dzieci
Uzyskanie właściwie pobranej próbki moczu w przypadku chorych leża˛cych
i nie współpracuja˛cych niemowla˛t oraz dzieci może stanowić problem.
Należy podać dziecku wode˛ lub inny napój do wypicia. Umyć narza˛dy płciowe zewne˛trzne. Dziecko można posadzić na kolanach matki, piele˛gniarki
lub innej osoby z personelu medycznego, która powinna zache˛cić dziecko do
oddania jak najwie˛kszej ilości moczu do sterylnego pojemnika. Pojemnik należy
zamkna˛ć i dostarczyć do laboratorium, gdzie niezwłocznie podje˛ta zostanie
diagnostyka.
Hodowla i interpretacja
Wszystkie próbki moczu dostarczone do laboratorium medycznego powinny być
od razu posiane lub umieszczone w chłodziarce w 4°C do momentu wykonania
badania. Procedura badania obejmuje naste˛puja˛ce etapy:
1. Barwienie preparatów metoda˛ Grama.
2. Testy przesiewowe w kierunku znamiennej bakteriurii.
3. Hodowle próbek moczu, w których wykazano obecność drobnoustrojów
w badaniach przesiewowych i wszystkich próbek uzyskanych podczas
cystoskopii, przez nakłucie nadłonowe (suprapubic bladder puncture — SBP)
i cewnikowanie.
4. Badanie lekowrażliwości izolatów bakteryjnych o znaczeniu klinicznym.
Przygotowanie preparatów i barwienie metoda˛ Grama jest ważnym elementem
diagnostyki laboratoryjnej. Używaja˛c sterylnej pipety Pasteura (jedna dla jednej
próbki) należy nanieść na szkiełko krople˛ wstrza˛śnie˛tego, nie odwirowanego
moczu. Pozostawić krople˛ do wyschnie˛cia, bez rozmazywania, utrwalić przez
podgrzanie i wybarwić. Ogla˛dać używaja˛c olejku immersyjnego (w powie˛kszeniu
× 600 lub wie˛cej) — poszukiwać bakterii, polimorficznych leukocytów i komórek
płaskonabłonkowych.
Jedna lub wie˛cej komórek bakteryjnych w polu widzenia w olejku immersyjnym
zwykle wskazuje na obecność 105 lub wie˛cej bakterii w mililitrze próbki.
Obecność jednego lub wie˛cej leukocytów w polu widzenia w olejku immersyjnym
jest kolejna˛ wskazówka˛ zakażenia układu moczowego. W niezakażonych próbkach moczu bakterie i leukocyty wyste˛puja˛w niewielkiej liczbie lub nie stwierdza
sie˛ ich wcale. W próbkach pochodza˛cych od pacjentek wykazanie licznych
komórek płaskonabłonkowych, bez lub z obecnościa˛ bakterii, wskazuje na
zanieczyszczenie flora˛ pochwowa˛ i konieczność powtórnego badania z ocena˛
liczby bakterii w polu widzenia. Jeśli konieczny jest szybki wynik badania,
lekarzowi powinna być dostarczona wste˛pna ocena barwionych preparatów
z informacja˛ o prowadzonej hodowli.
Metody badań przesiewowych
Brak leukocytów i bakterii w preparatach moczu barwionych metoda˛ Grama,
pochodza˛cych z próbek pobranych według powyżej opisanych zasad, wyklucza
infekcje˛. ,,Ujemna’’ próbka moczu w starannie wykonanym badaniu mikroskopowym nie musi być poddana hodowli. Alternatywnym prostym i skutecznym
testem przesiewowym jest test paskowy na obecność esterazy leukocytowej
43
MOCZ
(redukcji azotanów). Paski zanurza sie˛ w próbce moczu zgodnie z instrukcja˛
zawarta˛ w ulotce. Różowe zabarwienie jest dodatnim wynikiem i wskazuje na
obecność esterazy leukocytowej i/lub bakteriurie˛ rze˛du 105 w 1 ml. Próbki
dodatnie w testach przesiewowych należy jak najszybciej poddać hodowli, aby
zapobiec przerostowi przez nieznacza˛ce szczepy. Jeśli paski nie wykaża˛ różowego zabarwienia, badanie przesiewowe interpretowane jest jako ujemne i hodowla
nie jest konieczna. Testy paskowe nie sa˛ wystarczaja˛co czułe, aby wykryć
bakteriurie˛ mniejsza˛ niż 105 komórek w 1 ml moczu.
Posiew ilościowy i wste˛pna identyfikacja
Zalecane sa˛ dwie metody posiewu ilościowego i wste˛pnej identyfikacji: metoda
z użyciem kalibrowanej ezy oraz metoda z użyciem zanurzonego papierowego
filtra paskowego.
Metoda z użyciem kalibrowanej ezy
Zalecane jest użycie kalibrowanej plastikowej lub platynowej ezy, za pomoca˛
której należy przenieść 1 µl moczu na podłoże do hodowli (agar MacConkeya
z fioletem krystalicznym i nieselektywny agar z krwia˛).
1. Wstrza˛sna˛ć delikatnie mocz, a naste˛pnie przechylić i 1-mikrolitrowa˛ eza˛
dotkna˛ć powierzchni w taki sposób, aby zawiesić w niej płyn. Nigdy nie
zanurzać oczka ezy w moczu.
2. Umieścić 1 µl moczu na podłożu agarowym z krwia˛i rozmazać, tworza˛c prosta˛
linie˛ do środka płytki (1), naste˛pnie ge˛stym zygzakiem, pod ka˛tem w prawo,
przez pocza˛tkowa˛ linie˛ (2) i na koniec skośnym zygzakiem, przecinaja˛cym
dwa poprzednie pasma (3) (ryc. 3).
3. Posiać na podłoże MacConkeya w ten sam sposób.
4. Inkubować płytki przez noc w 35°C.
Agar z krwia˛ i podłoże MacConkeya można zasta˛pić innymi nieselektwnymi
podłożami (np.: CLED1, agar z fioletem krystalicznym i laktoza˛).
Metoda pasków bibułowych
Metoda pasków bibułowych Leigh&Williams 2 polega na absorpcji określonej
ilości moczu, który naste˛pnie jest przenoszony na płytke˛ z właściwym podłożem
agarowym.
Paski o długości 7,5 cm i szerokości 0,6 cm moga˛ być przygotowane na miejscu
z użyciem specjalnego typu bibuły (patrz ryc. 4). Sa˛ oznaczone ołówkiem z jednej
strony — 1,2 cm od końca. Metoda pasków bibułowych przed wprowadzeniem do
rutynowych badań powinna zostać porównana z metoda˛ z użyciem kalibrowanej
ezy.
Bibułowe paski należy przygotować w odpowiedniej ilości, umieścić we
właściwym pojemniku i autoklawować. Sterylne paski sa˛ komercyjnie doste˛pne.
1
CLED: z niedoborem cystyny, laktozy i elektrolitów; Cystine-Lactose-Electrolyte Deficient.
Leigh D.A., Williams J.D.: Metoda wykorzystywana do oznaczenia znamiennej bakteriurii
w szerokiej grupie pacjentów. Journal of Clinical Pathology, 1964, 17: 498 – 503.
2
44
CZE˛ŚĆ I
Ryc. 3. Posiew bakterii na płytki hodowlane.
1,2 cm
0,6 cm
6,3 cm
WHO 91125
Ryc. 4. Bibułowy pasek stosowany w metodzie Leigh & Williamsa.
CFU — colony-forming units (jednostki tworza˛ce kolonie)
Ryc. 5. Odciski zanurzonych w moczu bibułowych pasków na płytce agarowej i przeliczenie
liczby kolonii na liczbe˛ żywych komórek bakterii w 1 ml.
Dla każdej badanej próbki moczu wyja˛ć z pojemnika sterylny pasek. Oznaczony
koniec zanurzyć do wyznaczonej linii w dokładnie wstrza˛śnie˛tej próbce moczu.
Pasek natychmiast wycia˛gna˛ć, nadmiar moczu zostanie wchłonie˛ty.
Obszar poniżej oznaczenia, który zagina sie˛ na kształt litery ,,L’’, należy umieścić
na 2 – 3 sekundy na płytce z agarem brolacynowym1 lub agarze z fioletem
krystalicznym i laktoza˛. Na jednej płytce można posiać kilka pasków, dziela˛c
powierzchnie˛ na maksymalnie 16 prostoka˛tów (ryc. 5). Należy zapewnić możliwość identyfikacji każdego prostoka˛ta na podstawie numeru lub nazwiska
pacjenta. Wycia˛gna˛ć drugi pasek z pojemnika i dokładnie powtórzyć procedure˛,
wykonuja˛c kolejne odciski identycznie jak pierwsze. Po naniesieniu duplikatu
1
Agar laktozowo-cystynowy z błe˛kitem bromotymolowym.
45
MOCZ
odcisków płytke˛ inkubować w 35 – 37°C, a naste˛pnie zliczyć wyrosłe
kolonie z powierzchni każdego odcisku paska. Posługuja˛c sie˛ ryc. 5, na podstawie
średniej liczby kolonii każdej pary pasków, można określić liczbe˛ bakterii w 1 ml
moczu.
Natychmiast po wykonaniu powyższej procedury, używaja˛c sterylnej ezy, posiać
próbki moczu na pół płytki agaru MacConkeya (z fioletem krystalicznym).
Hodowla na agarze z krwia˛ ułatwia szybka˛ identyfikacje˛ Gram-dodatnich
ziarenkowców. Płytki należy inkubować przez noc w temperaturze 35 – 37°C
i naste˛pnego dnia ocenić wzrost. Do identyfikacji użyć izolowanych kolonii
o podobnym wygla˛dzie. Jeśli istnieje taka potrzeba, inoculum konieczne do
oznaczenia lekowrażliwości szczepu metoda˛ dyfuzyjno-kra˛żkowa˛ można przygotować z każdej z płytek (str. 112). W ten sposób naste˛pnego dnia doste˛pne be˛da˛
zarówno wyniki identyfikacji, jak i lekowrażliwości.
Interpretacja wyników posiewu ilościowego
moczu
Przez wiele lat warunkiem rozpoznania zakażenia układu moczowego było
wykazanie obecności co najmniej 105 jednostek tworza˛cych kolonie (CFU
— colony-forming units) w 1 ml odpowiednio pobranego moczu ze środkowego
strumienia. Założenie to zostało zakwestionowane; według niektórych ekspertów
obecność 104 CFU lub mniej może świadczyć o infekcji. Inni twierdza˛, że
obecność polimorficznych leukocytów odgrywa istotna˛ role˛ w patologii i klinicznej manifestacji zakażenia układu moczowego. Nie można zdefiniować precyzyjnie minimalnej liczby bakterii w 1 ml moczu, która jednoznacznie świadczy
o ZUM. Ogólne zasady sporza˛dzania raportów przedstawiono poniżej.
Kategoria 1: mniej niż 104 CFU w 1 ml. W raporcie prawdopodobnie brak
ZUM. (Wyja˛tki: jeśli mniej niż 104 CFU w 1 ml moczu pobranego bezpośrednio z pe˛cherza moczowego przez nakłucie nadłonowe lub cystoskopie˛; u kobiet z objawami zakażenia lub
leukocyturia˛ należy przeprowadzić identyfikacje˛ i wykonać antybiogram.)
Kategoria 2: 104 – 105 CFU w 1 ml. Jeśli pacjent bez objawów, powtórzyć
badanie moczu. Jeśli pacjent zgłasza objawy zakażenia układu
moczowego, przeprowadzić identyfikacje˛ i wykonać antybiogram
jednego lub dwu różnych obecnych w moczu typów kolonii
bakteryjnych. Powyższa liczba bakterii przemawia za zakażeniem
układu moczowego u pacjentów z objawami lub z leukocyturia˛.
Jeśli liczba bakterii, jakość próbki moczu lub charakter zgłaszanych objawów wzbudzaja˛ wa˛tpliwości, należy powtórzyć badanie.
Raport powinien zawierać wartość CFU.
Kategoria 3: wie˛cej niż 105 CFU w 1 ml. Przedstawić wynik lekarzowi,
przeprowadzić identyfikacje˛ i wykonać antybiogram jednego lub
dwu różnych obecnych w moczu typów kolonii bakteryjnych.
Powyższa liczba bakterii zdecydowanie wskazuje na zakażenie
układu moczowego u wszystkich pacjentów, również u kobiet bez
objawów zakażenia.
Jeśli w próbkach moczu kategorii 2 lub 3 obecne sa˛ wie˛cej niż dwa różne typy
bakterii, należy przedstawić wynik jako: ,,Prawdopodobnie materiał zanieczyszczony. Prosze˛ dostarczyć świeża˛ próbke˛ moczu ze środkowego strumienia’’.
46
CZE˛ŚĆ I
Identyfikacja
Identyfikacja powinna zostać przeprowadzona możliwie najszybciej. Jeśli masywna infekcja dróg moczowych wywołana jest przez E. coli, do identyfikacji
czerwonych kolonii na podłożu agarowym MacConkeya należy użyć szybkiego
testu.
Test β -glukuronidazowy do szybkiej identyfikacji
E. coli 1
Test określa zdolność drobnoustroju do wytwarzania enzymu β-glukuronidazy.
Enzym hydrolizuje kwas 4-nitrofenylo-β-D-glukopyranozydouronowy (PGUA),
produkt reakcji kwasu glukuronowego i p-nitrofenolu. Pojawienie sie˛ żółtego
zabarwienia wskazuje na reakcje˛ dodatnia˛.
Procedura
1. Przygotować ge˛sta˛ mleczna˛ zawiesine˛ bakterii w małej probówce zawieraja˛cej
0,25 ml fizjologicznego roztworu soli. Zawiesina powinna zostać przygotowana z kolonii rosna˛cych na podłożu agarowym MacConkeya.
2. Rozpuścić 300 mg kwasu 4-nitrofenylo-β-D-glukopyranozydouronowego
(PGUA) i 100 mg wycia˛gu drożdży (Oxoid L21)2 w 20 ml buforu fosforanowego (bufor Tris, pH 8,5). Uzyskać pH 8,5 ± 0,1. Dodać 0,25 ml podłoża
do każdej z przygotowanych sterylnych probówek. Zamkna˛ć probówki.
Oznaczyć probówki jako PGUA i wpisać date˛.
3. Zawiesić w jednej z probówek z PGUA badana˛ ge˛sta˛ zawiesine˛ bakterii.
Inkubować probówke˛ przez 4 godziny w 35°C. Pojawienie sie˛ żółtego
zabarwienia wskazuje na obecność β-glukuronidazy (wynik dodatni); jeśli nie
pojawia sie˛ zmiana zabarwienia, wynik jest ujemny. Obecność żółtego
pigmentowania wskazuje na brak wiarygodności testu; w takich przypadkach
test należy powtórzyć.
Szczepy kontrolne:
Escherichia coli dodatni (żółty) wynik
Shigella flexneri ujemny (bezbarwny) wynik
Tabletki PGUA sa˛ doste˛pne komercyjnie.
Oznaczanie lekowrażliwości
Antybiogram (str. 112) powinien być wykonany tylko dla istotnych, według
przedstawionych powyżej kryteriów, czystych hodowli zawieraja˛cych kolonie
o jednakowej morfologii. Oznaczanie wrażliwości ma zazwyczaj wie˛ksze
znaczenie dla pacjentów hospitalizowanych lub z nawracaja˛cymi zakażeniami
dróg moczowych w wywiadzie. Szczepy uzyskane w posiewach od pacjenta
z ZUM wyste˛puja˛cym po raz pierwszy moga˛ nie wymagać wykonania antybiogramu.
1
Kilian M., Borrow P.: Rapid diagnosis of Enterobacteriaceae. 1. Detection of bacterial glycosidases.
Acta Pathologica et Microbiologica Scandinavica, Section B, 1976, 84: 245 – 251.
2
Doste˛pny z Oxoid Ltd, Wade Road, Basingstoke, Hampshire, RG24 8PW, England.
47
Kał
Wprowadzenie
Zakażenia bakteriami jelitowymi, wywołuja˛cymi biegunke˛, czerwonke˛ i gora˛czki
jelitowe, stanowia˛ ważny problem zdrowotny na świecie. Infekcje biegunkowe sa˛
druga˛ po chorobach sercowo-naczyniowych, a wśród dzieci najcze˛stsza˛ przyczyna˛ zgonu. W krajach rozwijaja˛cych sie˛ z powodu biegunek rocznie umiera
1,5 miliona dzieci w wieku od 1 roku do 4 lat. Ryzyko zgonu w tej grupie
wiekowej jest 600-krotnie wyższe niż w krajach rozwinie˛tych. W niektórych
krajach rozwijaja˛cych sie˛ biegunki wyste˛puja˛ u dzieci dziesie˛ć lub wie˛cej razy
w cia˛gu roku.
Dzieci ulegaja˛c zakażeniom licznymi patogenami, cze˛sto bez wysta˛pienia
biegunki, wydalaja˛ z kałem potencjalnie chorobotwórcze szczepy. Prowadzone
obserwacje wykazały, że aktywna immunizacja przez wielokrotna˛ ekspozycje˛
oraz przedłużony okres karmienia piersia˛ moga˛ zapobiegać zachorowaniom
i zabezpieczać przed wysta˛pieniem biegunek. Na uwage˛ zasługuja˛ trudności
w ustaleniu czynnika etiologicznego biegunki w hodowli z pojedynczej próbki
kału.
Ze wzgle˛du na wzrost cze˛stości zakażeń HIV/AIDS i stosowanie chemioterapii
immunosupresyjnej, biegunka pojawiaja˛ca sie˛ u pacjentów z niedoborem odporności stanowi coraz poważniejsze wyzwanie. Zakażenia te wyste˛puja˛ w późniejszym okresie choroby, chorzy z HIV/AIDS sa˛ cze˛sto leczeni do końca życia,
a uzyskanie poprawy jest trudne. Lista bakterii jelitowych wywołuja˛cych
biegunke˛ u pacjentów z HIV/AIDS jest długa i obejmuje: Campylobacter,
Salmonella, Shigella oraz mykobakterie. Ocenia sie˛, że salmonelozy u pacjentów
z HIV/AIDS, w porównaniu do osób niezakażonych, wyste˛puja˛ 20-krotnie
cze˛ściej, a 5-krotnie cze˛ściej dochodzi u nich do bakteriemii. W Zairze 40%
pacjentów z HIV/AIDS zgłaszało przewlekła˛ biegunke˛, a u 84% pacjentów
z biegunka˛ utrzymuja˛ca˛ sie˛ dłużej niż miesia˛c wykryto zakażenie HIV.
Czynniki etiologiczne i objawy kliniczne
Rodzaj Salmonella obejmuje ponad 2000 serotypów. Wiele z nich może
wywoływać infekcje zarówno u ludzi, jak i u zwierza˛t domowych. U ludzi
zakażenie prowadzi do rozwoju nieżytu żoła˛dka i jelit, duru brzusznego
i bakteriemii z zaje˛ciem lub bez zaje˛cia innych narza˛dów. Nieżyt żoła˛dka i jelit
wywołany przez Salmonella zaczyna sie˛ zwykle nudnościami, wymiotami,
kolkowym bólem brzucha i biegunka˛ 8 – 48 godzin od spożycia skażonego
pokarmu. Bez leczenia objawy utrzymuja˛ sie˛ zazwyczaj 3 – 5 dni. Leczenie
przeciwbakteryjne nie przyspiesza usta˛pienia objawów klinicznych, a może
przedłużyć okres rekonwalescencji i bezobjawowego stanu nosicielstwa. W niepowikłanych przypadkach zakażeń wykonanie antybiogramu i leczenie przeciwbakteryjne nie sa˛zalecane. Zastosowanie antybiotyków jest wskazane w przypadku wysta˛pienia bakteriemii. Niektórzy pacjenci staja˛c sie˛ bezobjawowymi
nosicielami Salmonella spp. moga˛ wydalać bakterie z kałem i moczem przez rok
lub dłużej. Dodatnie posiewy z kału uzyskuje sie˛ przez okres dłuższy niż rok
u około 3% pacjentów z durem brzusznym i u 0,2 – 0,6% pacjentów z zakażeniem
innym serotypem Salmonella.
48
CZE˛ŚĆ I
Zakażenie Shigella spp. może przebiegać w różny sposób: od bezobjawowych
infekcji przez biegunke˛ bez gora˛czki do czerwonki o cie˛żkim przebiegu. Objawy
obejmuja˛ kolkowe bóle brzucha, nieefektywne i bolesne parcie (tenesmus) oraz
cze˛ste oddawanie małej obje˛tości podbarwionych krwia˛stolców. Shigella spp. jest
główna˛ przyczyna˛ czerwonki bakteryjnej, przed enteroinwazyjnymi i enterokrwotocznymi E. coli. Wiele przypadków choroby o średnim nasileniu nie
wymaga leczenia przyczynowego. Jednakże w cie˛żkich zakażeniach lub gdy
istnieje ryzyko rozwoju wtórnego rozsiewu w organizmie, wskazane jest
zastosowanie antybiotykoterapii po wcześniejszym określeniu lekowrażliwości,
koniecznym ze wzgle˛du na duża˛ w wielu krajach oporność na powszechnie
stosowane antybiotyki. Znane sa˛ cztery grupy Shigella, obejmuja˛ce 39 serotypów
i podtypów. Grupa A (S. dysenteriae), grupa B (S. flexneri), obejmuja˛ca liczne
serotypy grupa C (S. boydii) oraz grupa D (S. sonnei), do której należy tylko jeden
serotyp. Najcze˛ściej izolowanymi gatunkami Shigella w krajach rozwijaja˛cych sie˛
sa˛ S. dysenteriae i S. flexneri, podczas gdy w krajach rozwinie˛tych wyste˛puje
głównie S. sonnei.
Zidentyfikowano co najmniej sześć różnych klas Escherichia coli wywołuja˛cych
biegunki: enteropatogenne E. coli (EPEC), enterotoksyczne E. coli (ETEC),
enterokrwotoczne i produkuja˛ce werotoksyne˛ E. coli (EHEC lub VTEC),
enteroinwazyjne E. coli (EIEC), enteroadhezyjne E. coli (EAEC) oraz enteroagregacyjne E. coli (EAggEC). Cztery z powyższych klas sa˛ cze˛sta˛ przyczyna˛
chorób biegunkowych w krajach rozwijaja˛cych sie˛. Jednakże identyfikacja
szczepów wymaga przeprowadzenia testów serologicznych, testów toksyczności
na hodowlach komórkowych, oceny patogeniczności na zwierze˛tach oraz zastosowania sond genetycznych, które pozostaja˛ poza zakresem możliwości
laboratorium średniego stopnia referencyjności. Wste˛pna identyfikacja najcze˛ściej wyste˛puja˛cego serotypu O157:H7 szczepów VTEC możliwa jest na podstawie charakterystycznie ujemnego testu z sorbitolem. Test ten jednak jest
ujemny także w przypadku E. fergusonii i E. hermanii. Sorbitoloujemne szczepy
E. coli wymagaja˛ wie˛c dodatkowej identyfikacji przez serotypowanie z użyciem
surowicy odpornościowej E. coli O157. Wykazanie wytwarzania werotoksyny
wskazuje na szczep VTEC.
Cholera jest typowym przykładem toksycznej infekcji. Wszystkie objawy sa˛
zwia˛zane z utrata˛ płynów, spowodowana˛ działaniem wytwarzanej w jelitach
enterotoksyny Vibrio cholerae. Stolec jest obfity, wodnisty i nie zawiera komórek
zapalnych. Głównym celem leczenia jest uzupełnianie utraty płynów, a leczenie
przeciwbakteryjne ma znaczenie jedynie drugoplanowe.
V. cholerae rozprzestrzenia sie˛ bardzo szybko. Na podstawie różnic w antygenach
somatycznych O wyróżnia sie˛ kilka serotypów, a serotyp O1 wyste˛puje w dwóch
odmianach, określanych jako ,,klasyczna’’ i ,,El Tor’’. Do 1992 roku uważano, że
tylko serotyp O1 V. cholerae (klasyczny lub El Tor) może wywołać epidemie˛
cholery, a pozostałe serogrupy odpowiedzialne sa˛ za sporadyczne przypadki
cholery i zakażenia pozajelitowe. W 1992 roku na wschodnim wybrzeżu Indii
wybuchła epidemia, która szybko rozprzestrzeniła sie˛ na sa˛siednie kraje. Ta
epidemia była wywołana V. cholerae należa˛cym do wcześniej nieznanej
serogrupy O139 Bengal. V. cholerae O139 izolowano dotychczas w 10 krajach
południowo-wschodniej Azji, ale serotyp ten wydaje sie˛ zanikać.
V. parahaemolyticus i kilka innych gatunków Vibrio (V. fluvialis, V. hollisae,
V. mimicus) i Aeromonas (A. hydrophila, A. sobria, A. caviae) wywołuja˛ zatrucia
pokarmowe lub nieżyty żoła˛dkowo-jelitowe u osób spożywaja˛cych surowe lub
niedogotowane owoce morza.
49
KAŁ
W wie˛kszości regionów świata Campylobacter jejuni i C. coli okazały sie˛
głównymi patogenami jelitowymi, które sa˛ izolowane równie cze˛sto jak Salmonella i Shigella spp. Badania przeprowadzone wśród dzieci w Afryce i Azji
wykazały, że cze˛stość zakażeń wynosi od 19 do 38%, a bezobjawowe nosicielstwo
dotyczy od 9 do 40% badanych. Choroba może mieć różny przebieg, od
samoograniczaja˛cego sie˛, krótkotrwałego zapalenia jelita cienkiego po piorunuja˛ce zapalenie jelita cienkiego i okre˛żnicy, z cie˛żka˛ biegunka˛, kolka˛ brzuszna˛,
gora˛czka˛ i bólami mie˛śniowymi. Stolce sa˛ pocza˛tkowo śluzowe i płynne,
a naste˛pnie moga˛ zmienić sie˛ w chlustaja˛ce, wodniste, zawieraja˛ce krew i rope˛.
Objawy wycofuja˛ sie˛ zwykle po tygodniu.
U około 25% pacjentów dochodzi do nawrotu, który zwykle ma łagodniejszy
przebieg. Infekcja uste˛puje zazwyczaj samoistnie, bez antybiotykoterapii, sta˛d
określanie lekowrażliwości izolowanych szczepów nie jest konieczne.
Arcobacter butzleri, traktowane dotychczas jako rosna˛ce w niskiej temperaturze
Campylobacter, zostały ostatnio uznane za przyczyne˛ biegunek wyste˛puja˛cych
u dzieci w krajach rozwijaja˛cych sie˛.
Wyste˛powanie u ludzi infekcji wywołanych Yersinia enterocolitica obserwowano
głównie w północnej Europie, Japonii i Stanach Zjednoczonych. Wie˛kszość
izolowanych patogenów pochodziła od dzieci ze sporadycznie wyste˛puja˛ca˛
biegunka˛.
Clostridium difficile jest główna˛ przyczyna˛ biegunki poantybiotykowej. Może
wywołać różne postacie choroby, od średnio nasilonej biegunki do potencjalnie
śmiertelnego pseudobłoniastego zapalenia okre˛żnicy. Rozpoznanie rzekomo
błoniastego colitis jest możliwe na podstawie badania kolonoskopowego, a potwierdzenie laboratoryjne w tym przypadku nie jest konieczne. W diagnostyce
laboratoryjnej doste˛pne sa˛ komercyjne testy, w tym hodowla, test aglutynacji
lateksowej wykrywaja˛cy białka komórkowe, testy ELISA wykrywaja˛ce cytotoksyny i/lub enterotoksyny, hodowle komórkowe do oceny toksyczności cytotoksyn. Wielu pacjentów szpitalnych, zwłaszcza leczonych antybiotykami o szerokim spektrum działania, wydala bakterie z kałem przy braku objawów. Dlatego też
hodowla bez wykazania obecności toksyn ma ograniczona˛wartość diagnostyczna˛.
Rotawirusy sa˛ jedynym niebakteryjnym czynnikiem opisanym w tym miejscu.
Inne wirusy moga˛ także być przyczyna˛ biegunek, ale rotawirus wyste˛puje
podobnie cze˛sto zarówno w krajach rozwijaja˛cych sie˛, jak i w krajach rozwinie˛tych. Infekcje zwykle pojawiaja˛ sie˛ u dzieci mie˛dzy 6. a 18. miesia˛cem
życia, cze˛ściej w chłodnych miesia˛cach roku. Rozpoznanie może być potwierdzone laboratoryjnie na podstawie testu immunoenzymatycznego (ELISA) lub
prostszego i bardziej praktycznego testu aglutynacji lateksowej. Odczynniki
potrzebne do wykonania powyższych badań sa˛komercyjnie doste˛pne, lecz drogie.
Właściwe ukierunkowanie diagnostyki
laboratoryjnej
Laboratorium ściśle współpracuja˛ce ze szpitalem lub klinika˛ w krajach rozwijaja˛cych sie˛ może szybko zostać obcia˛żone nadmierna˛ liczba˛ próbek do badań.
W wie˛kszości przypadków czerwonki bakteryjnej i biegunek wykonanie posiewu
nie jest konieczne do podje˛cia efektywnego leczenia, ponieważ pacjenci wymagaja˛ jedynie nawodnienia, a nie antybiotykoterapii. W niektórych przypadkach (np.
50
CZE˛ŚĆ I
pacjenci z durem brzusznym) do podje˛cia właściwego leczenia wyniki hodowli sa˛
niezbe˛dne. Problem, jak najlepiej wykorzystać ograniczone możliwości (diagnostyki laboratoryjnej — przyp. tłum.) jest wcia˛ż rozważany.
Cze˛sto najważniejsze staja˛ sie˛ aspekty zdrowia publicznego, sta˛d laboratorium
jest zobligowane do dostarczania danych dotycza˛cych powszechnie wyste˛puja˛cych w danym regionie patogenów i ich wrażliwości na antybiotyki, a także
powinno uczestniczyć w badaniu epidemiologicznym. Konieczna jest ścisła
współpraca klinicystów z laboratorium. Utworzenie przez laboratorium wartościowej bazy danych jest możliwe na podstawie systematycznie przeprowadzanych, randomizowanych badań, szpitalnych lub klinicznych pacjentów z biegunka˛. Badanie proporcjonalnej cze˛ści pacjentów umożliwia ograniczenie liczby
próbek, z jednoczesna˛pełna˛diagnostyka˛każdej z nich. Jeśli badania wykonuje sie˛
u określonych, pojedynczych chorych (np. u co dwudziestego pia˛tego), wyniki
można wykorzystać do oszacowania cze˛stości wyste˛powania infekcji w całej
populacji pacjentów. W szczególnych grupach pacjentów lub o szczególnej porze
roku, w sytuacji pojawienia sie˛ typowego zespołu objawów, laboratorium może
ukierunkować diagnostyke˛ na określony problem.
Laboratorium podejmuje decyzje˛ o ewentualnym ograniczeniu diagnostyki do
pewnych patogenów jelitowych. Yersinia enterocolitica wyste˛puje wyja˛tkowo
rzadko w regionach tropikalnych. Jeśli nie obserwuje sie˛ wyste˛powania określonego patogenu w danym regionie, laboratorium może zrezygnować z wykonywania wykrywaja˛cych go testów. W wyniku laboratorium powinno uwzgle˛dnić
fakt wykrywania tylko określonych patogenów. Jeśli wykonywane sa˛ badania
jedynie w kierunku Salmonnella i Shigella, w wyniku nie można napisać ,,brak
patogenów’’. Należy umieścić informacje˛: ,,nie wykazano obecności Salmonella
i Shigella spp.’’
Pobieranie i przesyłanie próbek kału
Próbki powinny być pobierane we wczesnym okresie biegunki, ponieważ w tym
czasie liczba patogenów w kale jest najwyższa, oraz, jeśli to możliwe, przed
rozpocze˛ciem ewentualnej antybiotykoterapii. Próbke˛ należy pobrać rano i dostarczyć ja˛ do laboratorium do południa, tak by można było wykonać badanie tego
samego dnia. Uformowany stolec należy odrzucić. Najlepszym materiałem do
badań jest świeży kał. Jeżeli jednak pobranie kału nie jest możliwe lub gdy
transport materiału do laboratorium jest zbyt długi, można pobrać wymaz
z odbytu.
Procedura pobierania kału do badania
Przygotować dla pacjenta dwie drewniane szpatułki i odpowiedniej wielkości
pojemnik ze szczelnym zamknie˛ciem (np.: czysty szklany kubek, plastikowe lub
pokryte warstwa˛ wosku tekturowe pudełko, specjalny pojemnik z łopatka˛
przymocowana˛ do wieczka). Nie wolno używać butelek po lekach.
Poinstruować pacjenta, aby oddał stolec na papier toaletowy lub do basenu,
a naste˛pnie przeniósł cze˛ść do pojemnika za pomoca˛ szpatułek.
Próbka powinna zawierać co najmniej 5 g stolca i fragmenty z widoczna˛ krwia˛,
śluzem lub ropa˛, jeśli sa˛ obecne w kale. Materiał nie powinien być zanieczyszczony moczem. Po umieszczeniu próbki pojemnik szczelnie zamkna˛ć.
51
KAŁ
Pacjenta należy poinformować, aby dostarczył materiał do badania natychmiast
po pobraniu. Jeśli dostarczenie próbki do laboratorium w cia˛gu 2 godzin nie jest
możliwe, należy niewielka˛ ilość materiału (ła˛cznie ze śluzem, krwia˛ i pasmami
nabłonka, jeśli sa˛ obecne) podzielić i umieścić w dwu lub trzech pojemnikach
z podłożem transportowym (Cary-Blair, Stuart lub Amies) lub w 33 mmol/l buforu
fosforanowo-glicerolowego. W przypadku cholery i zakażeń innymi Vibrio spp.,
doskonałym (i wzbogaconym) podłożem transportowym jest alkaliczna woda
peptonowa. Patogeny moga˛ przetrwać w takich warunkach przez okres do
tygodnia w temperaturze pokojowej, chociaż zalecane jest przechowywanie
takich próbek w chłodziarce.
Procedura pobierania wymazów z odbytu
1. Zwilżyć bawełniana˛ wymazówke˛ sterylna˛ woda˛. Umieścić za zwieraczem
odbytu, obrócić i wyja˛ć. Sprawdzić, czy widoczna jest wystarczaja˛ca ilość
materiału, jeśli nie, powtórzyć czynność. Liczba wymazów uzależniona jest od
rodzaju prowadzonych badań.
2. Jeśli materiał zostanie zbadany w cia˛gu 1 – 2 godzin, umieścić wymazówke˛
w pustej, sterylnej probówce z zatyczka˛ z waty lub zakre˛tka˛. Jeśli wymazówka
musi być przechowywana dłużej niż przez 2 godziny, należy umieścić ja˛
w podłożu transportowym.
Badanie wizualne próbek kału
1. Obejrzeć próbke˛, zwracaja˛c uwage˛ na:
– konsystencje˛ (uformowany, nieuformowany, płynny),
– kolor (biały, żółty, bra˛zowy lub czarny),
– obecność nietypowych elementów (np. śluz, krew).
2. Umieścić niewielka˛ ilość kału lub wymazu z odbytu razem ze śluzem (jeśli jest
obecny) w kropli 0,05% roztworu błe˛kitu metylenowego na czystym szkiełku
i dokładnie wymieszać.
3. Przykryć szkiełkiem nakrywkowym zabarwiona˛ zawiesine˛ uważaja˛c, aby nie
powstały pe˛cherzyki powietrza. Poczekać 2 – 3 minuty. Ogla˛dać preparat pod
mikroskopem w dużym powie˛kszeniu (obiektyw × 100).
4. Zwrócić uwage˛ na komórki jednoja˛drzaste lub o polimorficznych ja˛drach;
pomina˛ć zdegenerowane komórki.
Badanie wysie˛ku komórkowego biegunkowego kału może dostarczyć wskazówek
pozwalaja˛cych na identyfikacje˛ czynników wywołuja˛cych:
– zlepy leukocytów wieloja˛drzastych (> 50 komórek w polu widzenia), makrofagi i erytrocyty sa˛ typowe dla zakażeń pałeczkami Shigella;
– mniejsza liczba wieloja˛drzastych leukocytów (< 20 komórek w polu widzenia)
obecna jest w salmonelozach i w zakażeniach inwazyjnymi szczepami E. coli.
W czerwonce pełzakowej wie˛kszość komórek jest zdegenerowana (cienie
komórek). W około 50% przypadków biegunki wywołanej przez Campylobacter spp. obecne sa˛ leukocyty i erytrocyty;
– w przypadku cholery, zakażeń wywołanych przez enterokrwotoczne i enteropatogenne E. coli oraz biegunek wirusowych obecne sa˛ nieliczne leukocyty
(2 – 5 komórek w polu widzenia).
52
CZE˛ŚĆ I
Podłoża transportowo-wzbogacaja˛ce
i posiew próbek kału
Podłoża transportowo-wzbogacaja˛ce sa˛ powszechnie stosowane do izolacji
Salmonella spp. i Vibrio cholerae z kału. W przypadku Salmonella spp. zalecane
sa˛ buliony zawieraja˛ce selenin F lub tetrationian, natomiast dla Vibrio cholerae
stosowana jest alkaliczna woda peptonowa (APW, alkaline peptone water).
Podłoża takie nie sa˛ zalecane w hodowli Shigella spp., Campylobacter spp.,
Yersinia enterocolitica i Clostridium difficile.
Procedura posiewu na podłoża wzbogacaja˛ce
1. Przygotować zawiesine˛ kału zawieszaja˛c około 1 g próbki w probówce
zawieraja˛cej 1 ml sterylnego fizjologicznego roztworu soli. Jeśli próbka jest
płynna, nie trzeba dodawać roztworu soli. Wymazy z odbytu, świeże lub
w podłożu Cary’ego-Blaira, wytrza˛sna˛ć w 1 ml fizjologicznego roztworu soli.
Przed wyrzuceniem wymazówki odcisna˛ć reszte˛ płynu na ściance probówki.
2. Eza˛ dodać trzy lub wie˛cej oczek zawiesiny do odpowiedniego podłoża
wzbogacaja˛cego.
3. Inkubować bulion z seleninem F przez 18 godzin, APW przez 6 – 8 godzin.
W niektórych laboratoriach dwa lub trzy oczka zawiesiny pocza˛tkowej w APW
sa˛ przesiewane do świeżego APW i inkubowane przez kolejne 6 – 8 godzin.
4. Przesiać hodowle z bulionu eza˛ na płytki z selektywnym i nieselektywnym
podłożem.
V. cholerae szybko rośnie w APW i przez 6 – 8 godzin przerasta inne mikroorganizmy. Po dłuższej inkubacji, powyżej 8 godzin, pozostałe bakterie moga˛ zdominować V. cholerae. Szczepy nie-V. cholerae O1 rosna˛ szybciej niż V. cholerae O1 i,
jeśli obecne sa˛ jednocześnie dwa serotypy, moga˛ przerosna˛ć cała˛ płytke˛.
Podłoża do hodowli patogenów jelitowych
Dla Shigella spp., Salmonella spp. i Y. enterocolitica zalecane sa˛ podłoża
stosowane do posiewu ogólnego o niskiej selektywności oraz podłoża o średniej
lub wysokiej selektywności. Agar MacConkeya z fioletem krystalicznym jest
zalecany jako podłoże podstawowe. W przypadku Y. enterocolitica agar MacConkeya należy inkubować przez dzień w 35°C, a naste˛pnie, przez kolejny dzień,
w temperaturze pokojowej (22 – 29°C).
Agar ksylozo-lizyno-deoksycholanowy (XLD) jest rekomendowany jako podłoże
o średniej lub wysokiej selektywności do izolacji Shigella spp. i Salmonella spp.
Agar deoksycholanowo-cytrynianowy (DCA), agar Hektoen dla pałeczek jelitowych (HEA) lub agar Salmonella-Shigella (SS agar) moga˛ być stosowane
alternatywnie. Shigella dysenteriae typ 1, S. sonnei i enteroinwazyjne E. coli nie
rosna˛ dobrze na agarze SS. Jednakże agar SS może być wykorzystany do izolacji
Y. enterocolitica z zastosowaniem zasad izolacji opisanych dla agaru MacConkeya. Wiele laboratoriów do izolacji Salmonella typhi i innych gatunków
Salmonella stosuje agar siarczanowo-bizmutowy.
Dla Campylobacter spp. stosowanych jest kilka podłoży selektywnych (Blaser,
Butzler, Skirrow), zawieraja˛cych różne dodatki antybakteryjne. Można również
53
KAŁ
zastosować podstawowy agar z krwia˛ zawieraja˛cy 5 – 10% krwi baraniej
z dodatkiem cefalosporyny (15 µg/ml), wankomycyny (10 µg/ml), amfoterycyny B (2 µg/ml) i 0,05% siarczanu żelaza–metadwusiarczanu sodu–pirogronianu
sodu (FBF).
Dla Vibrio spp. konieczne sa˛ selektywne podłoża, aczkolwiek wiele szczepów
może rosna˛ć na agarze MacConkeya. Agar zawieraja˛cy cytrynian tiosiarczanowy,
sole żółci i sacharoze˛ (TCBS) jest podłożem selektywnym dla V. cholerae O1
i nie-O1 oraz dla V. parahaemolyticus, ale drogim. Podłoże selektywne,
zawieraja˛ce telluryn, taurocholan i żelatyne˛ (TTG), nie jest komercyjnie doste˛pne.
Prostymi, niedrogimi podłożami, które moga˛ być przygotowywane we własnym
zakresie i stosowane z bardzo dobrym efektem, sa˛: agar z zasadowym ekstraktem
mie˛snym (MEA) i zasadowy agar z solami żółci (BSA).
Izolacja Clostridium difficile przed wprowadzeniem agaru cefoksytyno-cykloseryno-fruktozowego (CCFA) była trudna. W przypadku lecytynazo- i lipazoujemnych C. difficile zalecane jest stosowanie podłoży agarowych, zawieraja˛cych
żółtko jaja; inne laseczki wyste˛puja˛ce w jelicie, takie jak C. perfringens,
C. bifermentans i C. sordelli, sa˛ lecytynazododatnie.
Wste˛pna izolacja
Próbka powinna być badana i hodowana natychmiast po dostarczeniu do
laboratorium, co daje najwyższy wskaźnik izolacji Shigella spp. i Campylobacter
spp. Jeśli nie jest to możliwe, próbka powinna być przechowywana w temperaturze 4°C.
Do posiewu na podłoża o wysokiej selektywności powinna być użyta ge˛sta
zawiesina kału, a na podłoża o niskiej selektywności — mniej ge˛sta. W wielu
laboratoriach wymaz z odbytu posiewany jest bezpośrednio na podłoża, należy
jednak uważać, aby nie doszło do przerośnie˛cia płytki.
Procedura posiewu na podłoża
do wste˛pnej izolacji
1. Posiać eza˛ na wysoko selektywne podłoża trzy oczka zawiesiny kału, a jedno
na podłoże o niskiej selektywności. Inoculum umieścić centralnie na płytce
agarowej, a naste˛pnie rozprowadzić w góre˛, w dół i w poprzek płytki,
jak zilustrowano na ryc. 6. Procedura ta umożliwia uzyskanie maksymalnej
liczby pojedynczych kolonii. Drobne kolonie pojawia˛ sie˛ peryferycznie na
płytce.
2. Po inokulacji inkubować płytki agarowe. W celu izolacji Salmonella, Shigella
i Yersinia spp. oraz V. cholerae płytki inkubować w cieplarce w warunkach
tlenowych (bez CO2) w 35°C, w przypadku Campylobacter spp. w 42°C
w środowisku mikroaerofilnym z 10% CO2, a płytki z Clostridium difficile
w 35°C w środowisku beztlenowym.
Warunki inkubacji Campylobacter
Płytki do izolacji Campylobacter spp. powinny być inkubowane w 42 – 43°C
w środowisku mikroaerofilnym, zawieraja˛cym 5% O2, 10% CO2 i 85% N2.
54
CZE˛ŚĆ I
Powyższa temperatura hamuje wzrost naturalnej flory jelitowej, nie wpływaja˛c na
wzrost bakterii z rodzaju Campylobacter. Podczas izolacji gatunków nie toleruja˛cych podwyższonej temperatury, inkubacja powinna być prowadzona
w 35 – 37°C.
Ryc. 6. Posiew bakterii na płytke˛.
• Odpowiednie warunki wzrostu dla Campylobacter spp. sa˛ uzyskiwane na kilka
sposobów. Wybór metody zależy od zakresu i obcia˛żenia praca˛ danego
laboratorium oraz relatywnych kosztów.
• Eksykator zapewnia atmosfere˛ zawieraja˛ca˛ ok. 17 – 19% O2 i 2 – 3% CO2. Nie
sa˛ to optymalne warunki wzrostu Campylobacter spp. i nie wszystkie szczepy
w nich wyrosna˛. Według niektórych źródeł inkubacja w 42°C podłoży
z dodatkiem FBP wpływa korzystnie na skuteczność izolacji. Dodatek FBP
inaktywuja˛c nadtlenki i nadtlenek wodoru poprawia tolerancje˛ tlenu przez
Campylobacter spp. Ujemna˛ strona˛metody jest dłuższa inkubacja i zahamowanie wzrostu niektórych wrażliwych na tlen Campylobacter spp.
• Inna prosta i niedroga metoda wykorzystuje technike˛ wspólnych hodowli.
Płytki z szybko rosna˛cymi fakultatywnie beztlenowymi bakteriami inkubowane
sa˛ z płytkami do izolacji Campylobacter spp. w zamknie˛tym pojemniku lub
plastikowym woreczku. Przy wzroście fakultatywnie beztlenowych bakterii
zawartość tlenu maleje, a CO2 rośnie. Ujemna˛ strona˛ metody jest zwykle
dłuższy czas inkubacji potrzebny do wzrostu Campylobacter spp.
• Komercyjnie doste˛pna jest specjalnie przystosowana do izolacji Campylobacter spp. saszetka z generatorem wodoru i CO2 oraz katalizatorem. Saszetke˛
należy umieścić w anaerostacie używaja˛c każdorazowo przy otwarciu pojemnika nowej saszetki. Aby uzyskać maksymalna˛skuteczność izolacji, w słoju nie
należy umieszczać wie˛cej niż sześciu płytek.
• Zestaw do inkubacji w plastikowym woreczku jest także doste˛pny komercyjnie.
W skład zestawu wchodzi plastikowy woreczek, za każdym razem opróżniany
dwu- lub trzykrotnie re˛cznie ba˛dź za pomoca˛ próżniocia˛gu, a naste˛pnie
każdorazowo wypełniany 5% O2, 10% CO2 i 85% N2.
• System opróżnianego i wypełnianego anaerostatu bez katalizatora. Pojemnik
jest dwukrotnie opróżniany do uzyskania ciśnienia 38 cm (15 mm Hg)
i wypełniany za każdym razem mieszanina˛ 10% H2 i 90% N2.
55
KAŁ
Wste˛pna identyfikacja izolowanych szczepów
Identyfikacja odbywa sie˛ na podstawie testów zarówno biochemicznych, jak
i serologicznych, których zakres zależy od możliwości laboratorium. Schemat
identyfikacji ważnych bakterii jelitowych przedstawiony jest na ryc. 7a-c.
Na płytce Petriego, zawieraja˛cej pierwszy posiew, należy oznaczyć na dnie dobrze
odgraniczone kolonie o typowym wygla˛dzie. Wybrane kolonie zostana˛ poddane
dalszej identyfikacji. Jeśli w posiewie widoczne sa˛ różne typy kolonii, należy
przeprowadzić identyfikacje˛ każdej z nich.
Małe i bezbarwne kolonie niefermentuja˛cych laktozy bakterii, takich jak
Salmonella spp. i Shigella spp., rosna˛na podłożu agarowym MacConkeya, agarze
SS i DCA. Kolonie Proteus spp. moga˛ być mylone z Salmonella spp. i Shigella
spp., zwłaszcza na podłożu MacConkeya ze wzgle˛du na ich wygla˛d, typowy
dla bakterii laktozoujemnych. Fermentuja˛ce laktoze˛ mikroorganizmy, takie
jak E. coli i Enterobacter/Klebsiella spp., wytwarzaja˛ małe różowe i czerwone kolonie na podłożu agarowym MacConkeya, DCA i agarze SS. Na agarze
XLD Salmonella spp. i Shigella spp. wytwarzaja˛ małe czerwone kolonie,
z czarnym środkiem w przypadku wie˛kszości szczepów Salmonella. Kolonie
z czarnym centrum moga˛ tworzyć na tym podłożu również niektóre szczepy
Proteus spp. Na agarze bizmutowo-siarkowym Salmonella typhi wytwarzaja˛
czarne kolonie z metalicznym połyskiem, dobrze widocznym w przypadku
odgraniczonych kolonii. Yersinia enterocolitica rośnie na agarze MacConkeya
i agarze SS w postaci małych, bladych kolonii, najszybszy wzrost naste˛puje
w temperaturze 22 – 29°C.
Salmonella i Shigella spp.
Do wste˛pnych badań szczepów Salmonella spp. i Shigella spp. zalecane sa˛ trzy
różne podłoża:
– bulion z mocznikiem, lekko buforowany (UREA),
– podłoże ruch-indol-lizyna (MIL),
– agar Kliglera (KIA).
Procedura posiewu i odczytu UREA
1. Używaja˛c do posiewu ezy zebrać z płytki 2 – 3 nie fermentuja˛ce laktozy
kolonie i przenieść do probówki zawieraja˛cej UREA.
2. Inkubować probówki przez 2 – 4 godziny w 35°C i obserwować ewentualna˛
zmiane˛ zabarwienia na różowe (ureazododatnie). Odrzucić ureazododatnie
probówki.
3. Przesiać materiał z probówek zawieraja˛cych szczepy ureazoujemne na MIL
i KIA (patrz poniżej) i inkubować wszystkie probówki, ła˛cznie z ureazoujemnymi, przez noc w 35°C, w warunkach tlenowych.
Procedura posiewu i odczytu MIL i KIA
1. Posiać materiał do podłoża MIL przez nakłucie prosta˛ igła˛ (eza˛) na głe˛bokość
2 mm od dna probówki. Wyja˛ć igłe˛ w tej samej linii.
56
CZE˛ŚĆ I
Gram-ujemne pałeczki wzgle˛dnie
beztlenowe fermentuja˛ce cukry
oksydazoujemne
▼
Laktoza
+
–
▼
▼
Siarkowodór
Siarkowodór
+
Citrobacter
freundii
+
–
+
▼
▼
▼
Lizyna
Lizyna
Fenyloalanina
–
+
▼
▼
▼
▼
▼
Ureaza
Indol
Indol
Ornityna
Lizyna
+
–
–
+
–
+
–
+
–
+
–
–
▼
Indol
+
–
Citrobacter
koseri
Enterobacter
aerogenes
Indol
+
– Escherichia
coli
▼
Klebsiella
pneumoniae
Klebsiella
oxytoca
+
–
▼
Proteus
vulgaris
Enterobacter
cloacae
Proteus
mirabilis
▼
Morganella
morgani
+
Providencia
stuartii
+
Indol
+
Edwardsiella
tarda
+
▼
Trehaloza
–
+
–
▼
Yersinia
enterocolitica
+
Ruch
Mannitol
–
–
▼
Providencia
rettgeri
▼
Ornityna
Salmonella
wie˛kszość serotypów
Ureaza
▼
Sorbitol
Salmonella
typhi
+
–
▼
Arabinoza
+
Serratia
liquifaciens
–
Salmonella
paratyphi A
Providencia
alcalifaciens
–
▼
Hafnia
– alvei
▼
Ornityna
Shigella
sonnei
Shigella
serotyp A, B, C
Serratia
marcescens
Ryc. 7a. Schemat wste˛pnej identyfikacji cze˛sto wyste˛puja˛cych Enterobacteriaceae.
2. Posiać materiał na podłoże KIA nakłuwaja˛c słupek agaru prosta˛ igła˛
i prowadza˛c zygzakiem po powierzchni skosu.
3. Opisać wszystkie probówki numerem próbki i inkubować przez noc w temperaturze 35°C.
4. Obserwować probówki UREA w kierunku opóźnionej reakcji rozkładu
mocznika (patrz powyżej). Odrzucić hodowle z reakcja˛ ureazododatnia˛.
5. Obserwować podłoża MIL w kierunku obecności ruchu, reakcji rozkładu
lizyny i wytwarzania indolu. Ruchliwe mikroorganizmy rozprzestrzenia˛ sie˛
w podłożu poza linie˛ nakłucia i widoczny be˛dzie rozsiany wzrost. Bakterie
niezdolne do ruchu be˛da˛ rosły jedynie w kanale wkłucia. Na dodatnia˛ reakcje˛
lizynowa˛ wskazuje odczyn zasadowy (kolor fioletowy) na dnie podłoża, na
reakcje˛ ujemna˛ odczyn kwaśny (kolor żółty) spowodowany jedynie fermentacja˛ glukozy. Aby wykazać obecność indolu, należy dodać do podłoża 3 – 4
krople odczynnika Kovacsa. Czerwony i różowy kolor wskazuja˛ na reakcje˛
dodatnia˛, natomiast kolor jasnożółty świadczy o ujemnym wyniku testu.
6. Obserwować podłoże KIA. Wszystkie Enterobacteriaceae fermentuja˛ glukoze˛
z wytworzeniem kwasu i gazu lub tylko kwasu, który jest odpowiedzialny za
żółte zabarwienie podłoża. Powstaja˛cy gaz powoduje powstanie pe˛cherzyków
i pe˛knie˛ć na powierzchni agaru, który, jeśli powstaje duża ilość gazu, może
unieść sie˛ w probówce (np. w przypadku Enterobacter spp.). Jeśli równocześnie fermentacji ulega laktoza, zarówno słupek agarowy, jak i skos staja˛sie˛ żółte
z powodu kwaśnego pH (np. w przypadku E. coli). Jeśli nie zachodzi
fermentacja laktozy (np. Shigella spp. i Salmonella spp.), słupek agaru jest
żółty, a skos pozostaje czerwony. Zaczernienie wzdłuż linii wkłucia lub
w całym agarze wskazuje na obecność siarkowodoru. Należy zanotować
rezultaty i przeprowadzić wste˛pna˛ identyfikacje˛ mikroorganizmu, wykorzystuja˛c schemat przedstawiony w tabeli 10 i 11.
57
KAŁ
Gram-dodatnie tworza˛ce spory laseczki,
niektóre gatunki nie tworza˛ce spor,
wzgle˛dnie beztlenowe lub
katalazoujemne
+
–
Podwójna strefa hemolizy
+
Indol
–
Clostridium
perfringens
Indol
+
–
Ureaza
Ruch
+
–
C. sordelli
+
Wzrost
mgławicowy
+
–
C. tetani
+
–
Propionibacterium
acnes
+
Redukcja
azotanu
–
Małe (1 µm) przezroczyste
kolonie ziarenko-pałeczek
–
Charakterystyczna
Mannitol
fluorescencja
+
–
C. ramosum
Laktoza
C. clostridioforme
–
C. sphenoides
+
+
Eubacterium
lentum
C. bifermentans
+
–
C. difficili
+
Laktoza
Katalaza
15% H2O2
+
Wzrost
mgławicowy
–
Redukcja
azotanu
–
+
Wzrost
mgławicowy
Actinomyces
viscosus
+
–
+
–
C. septicum
C. tertium
C. sporogenes
C. novyi typ A
,,Beztlenowe pałeczki
Gram-dodatnie nie
tworza˛ce spor,
niemożliwe do
zidentyfikowania’’
(obejmuje Lactobacillus,
Bifidobacterium i inne
– gatunki Eubacterium)
–
Actinomyces species
(kolonie ,,ze˛bów
trzonowych’’)
Propionibacterium
species
Ryc. 7b. Schemat wste˛pnej identyfikacji Gram-dodatnich pałeczek beztlenowych.
Szczepy Salmonella sa˛ oksydazoujemne, ruchliwe i indoloujemne. Nie hydrolizuja˛ mocznika i — z wyja˛tkiem S. paratyphi A — wytwarzaja˛ dekarboksylaze˛
lizyny. Na agarze KIA obserwowany jest żółty słupek, czerwony skos, H2S i gaz,
z wyja˛tkiem S. typhi, która nie wytwarza gazu, i wie˛kszości szczepów S. paratyphi A, które sa˛ H2S-ujemne. Jeśli powyższe kryteria sa˛ spełnione, zanotować:
,,izolacja Salmonella (identyfikacja wste˛pna)’’.
Szczepy Shigella sa˛ oksydazoujemne, nieruchliwe, nie wytwarzaja˛ dekarboksylazy lizyny i nie hydrolizuja˛ mocznika. Na KIA obserwowany jest zasadowy
(czerwony) skos i kwaśny (żółty) słupek, bez H2S i bez gazu, z wyja˛tkiem S. flexnerii serotyp 6 (warianty Newcastle i Manchester) i S. boydii serotyp 14, które
wytwarzaja˛ gaz. Z wyja˛tkiem S. dysenteriae serotyp 1 bakterie wytwarzaja˛
katalaze˛. Jeśli powyższe kryteria sa˛ spełnione, zanotować: ,,izolacja Shigella
(wste˛pna identyfikacja)’’.
Wzrost małych, bladych, czy też bezbarwnych koloni na podłożu MacConkeya
lub agarze SS po całonocnej inkubacji może wskazywać na obecność Yersinia
enterocolitica. Typowe kolonie należy posiać na KIA i inkubować w temperaturze
25°C przez noc. Inne kolonie, prawdopodobnie chorobotwórczych szczepów,
posiać na dwa podłoża UREA i dwa podłoża MIL, inkubować równolegle po
jednej z probówek w temperaturze 25°C i w temperaturze 35°C. Typowe szczepy
Yersinia enterocolitica na podłożu KIA zakwaszaja˛ słupek, nie ma gazu i H2S.
58
CZE˛ŚĆ I
Wzrost na agarze
z żółcia˛ i eskulina˛
–
▼
Wrażliwe na kanamycyne˛ (Km)
i wankomycyne˛ (Vm)
Wrażliwe na kanamycyne˛ (Km)
i wankomycyne˛ (Vm)
Km-oporne
Vm-oporne
Porphyromonas
Prevotella
▼
▼
▼
▼
Km-oporne
Vm-wrażliwe
▼
+
▼
Km-wrażliwe
Vm-oporne
Km-oporne
Vm-oporne
Km-oporne
Vm-oporne
▼
Grupa
Grupa
Fusobacterium
mortiferum/varium
Kolonie z pigmentem
lub fluoryzuja˛ce
na czerwono
+
–
Prevotella
Ureaza
▼
+
–
▼
▼
Katalaza
Indol
+
–
+
–
Fusobacterium nucleatum
F. necrophorum
inne gatunki Fusobacterium
Kolonie, bardzo małe
przezroczyste
▼
Bilophila
wadsworthia
Bacteroides
ureolyticus
▼
+
–
▼
▼
Nierozpuszczalne
w żółci
Fusobacterium
species
+
–
▼
▼
Katalaza
Campylobacter
species
+
–
▼
▼
Bilophila
wadsworthia
Suterella
wadsworthensis
WHO 01.50
Ryc. 7c. Schemat wste˛pnej identyfikacji Gram-ujemnych pałeczek beztlenowych.
Jeśli szczep jest ruchliwy i ureazododatni w temperaturze 25°C oraz nieruchliwy
i słabo ureazododatni lub ureazoujemny w temperaturze 35°C, zanotować:
,,izolacja Yersinia (wste˛pna identyfikacja)’’.
Vibrio cholerae i V. parahaemolyticus
Szczepy Vibrio rosna˛ na agarze MacConkeya w postaci bladych, nie fermentuja˛cych laktozy kolonii. Na agarze TCBS V. cholerae tworza˛ średniej wielkości,
wypukłe, gładkie, żółte kolonie, w odróżnieniu od V. parahaemolyticus, których
kolonie sa˛ duże, płaskie i niebieskozielone.
Niektóre szczepy V. cholerae, z powodu opóźnionej fermentacji sacharozy, moga˛
również na podłożu TCBS tworzyć zielone lub bezbarwne kolonie. Na podłożu
TTGA kolonie sa˛ ciemne w centrum, z powodu redukcji tellurynu, oraz otoczone
strefa˛ zme˛tnienia, zwia˛zana˛ z aktywnościa˛ żelatynazy. Na podłożu BSA i MEA
kolonie V. cholerae sa˛ bezbarwne, zwykle płaskie i dobrze odgraniczone;
zazwyczaj łatwo je odróżnić od kolonii Enterobacteriaceae w ukośnym oświetleniu lub podczas badania w świetle dziennym padaja˛cym pod ka˛tem. Dla
podejrzanych kolonii należy wykonać test na obecność oksydazy i test śluzowy.
59
KAŁ
Tabela 9. Morfologia kolonii powszechnie wyste˛puja˛cych bakterii jelitowych na różnicuja˛cych i selektywnych
podłożach
Gatunki
Agar
MacConkeya
z fioletem
krystalicznym
Agar XLD
Agar SS
Escherichia coli
Różowoczerwone
Duże, płaskie, żółte, nieprzejrzyste
Różowoczerwone
zahamowanie
wzrostu
Shigella spp.
Bezbarwne
Czerwone
Bezbarwne
Salmonella spp.
Bezbarwne
DCA
HEA
Różowe,
otoczone Duże, łososioworóstrefa˛ precypitacji
żowe lub pomarańczowe, otoczone
strefa˛ precypitacji
Bezbarwne lub jasnobra˛zowe
Bezbarwne z czar- Bezbarwne lub jasnonym
centrum
bra˛zowe z czarnym
lub bez
centrum lub bez
Różowe, zahamo- Duże, blade, śluzowanie wzrostu
we, z różowym centrum
Bezbarwne, z sza- Duże, bezbarwne lub
roczarnym cenjasnobra˛zowe
z
trum lub bez
czarnym centrum
lub bez
Zielone, wilgotne, wypukłe
Niebieskozielone z
czarnym centrum
lub bez
Duże, łososiowopomarańczowe
Enterobacter/
/Klebsiella spp.
Czerwone z czarnym centrum
lub bez
Różowe, śluzo- Żółte, śluzowe
we
Proteus/
/Providencia
spp.
Bezbarwne, zahamowane
pełzanie
Czerwone, niektóre
Proteus spp. maja˛ czarne centrum
Yersinia
enterocolitica
Bezbarwne
Żółte, nieregular- Bezbarwne
ne
Bezbarwne
Łososiowe
Brak lub
wzrost
Brak lub słaby wzrost
Brak lub słaby wzrost
Enterococcus spp. Brak wzrostu
słaby Brak wzrostu
Niebieskozielone lub
łososiowe z czarnym centrum lub
bez
XLD: deoksycholan ksylozo-lizynowy; DCA: cytrynian deoksycholowy; SS: Salmonella-Shigella; HEA: hektoen jelitowy.
Tabela 10. Interpretacja reakcji pałeczek Enterobacteriaceae na agarze żelazowym
Kliglera (KIA)
Reakcja
Słupek kwaśny (żółty) i skos zasadowy (czerwony)
Kwaśne całe podłoże (słupek i skos żółte)
Zasadowe całe podłoże (słupek i skos czerwone)
Pe˛cherzyki gazu w słupku lub pe˛knie˛cia
w podłożu
Zaczernienie w słupku
Interpretacja
Tylko fermentacja glukozy
Fermentacja glukozy i laktozy
Brak fermentacji glukozy i laktozy
Bakterie wytwarzaja˛ce gaz
Wytwarzanie siarkowodoru (H2S)
Procedura testu na oksydaze˛
1. Na papierowym filtrze w szalce Petriego umieścić 2 – 3 krople odczynnika do
testu na oksydaze˛ (1% tetrametylo-parafenylenodiamina).
2. Platynowa˛ (nie niklowo-chromowa˛) eza˛, czysta˛ drewniana˛ szpatułka˛ lub
wykałaczka˛ zebrać niewielka˛ liczbe˛ świeżych kolonii z agaru MacConkeya.
Rozprowadzić bakterie na nawilżonej cze˛ści papierowego filtra.
3. O reakcji dodatniej świadczy ciemnofioletowe zabarwienie papierka w cia˛gu
10 sekund. Spośród Gram-ujemnych pałeczek oksydazododatnie sa˛ Vibrio,
Aeromonas, Plesiomonas, Pseudomonas i Alcaligenes; wszystkie Enterobacteriaceae sa˛ oksydazoujemne. Odczynnik do testu na oksydaze˛ powinien być
regularnie testowany za pomoca˛ dodatnich i ujemnych szczepów kontrolnych.
60
CZE˛ŚĆ I
Tabela 11. Wzory typowych reakcji pałeczek Enterobacteriaceae na agarze Kliglera
(KIA)
Reakcja
Fermentacja cukru(ów)
Gatunek bakterii
Kwaśny słupek1
Kwaśny skos1
Gaz w słupku
Brak H2S
Glukoza: kwas i gaz
Laktoza: kwas i gaz
Escherichia coli
Klebsiella
Enterobacter
Citrobacter diversus
Serratia liquefaciens
Kwaśny słupek
Zasadowy skos2
Gaz w słupku
Wytwarzanie H2S
Glukoza: kwas i gaz
Laktoza: brak fermentacji
Salmonella
Proteus
Citrobacter freundii*
Kwaśny słupek
Zasadowy skos
Brak gazu w słupku
Brak H2S
Glukoza: tylko kwas
Shigella
Yersinia
Serratia marcescens*
Providencia stuartii
Providencia rettgeri*
Kwaśny słupek
Zasadowy skos
Gaz w słupku
Brak H2S
Glukoza: kwas i gaz
Salmonella paratyphi A
Hafnia alvei
Serratia marcescens*
Morganella morgani
Oboje˛tny/zasadowy słupek2
Zasadowy skos
Brak gazu
Brak H2S
Brak fermentacji cukrów
Alcaligenes
Pseudomonas
Acinetobacter
1
Kwaśne pH powstałe w wyniku rozkładu cukru, obserwowane na podstawie żółtego
zabarwienia podłoża (przyp. tłum.).
2
Zasadowe lub oboje˛tne pH w wyniku braku rozkładu cukru, obserwowane na podstawie
niezmienionego, różowego koloru podłoża (przyp. tłum.).
* Reakcje atypowe.
Procedura testu śluzowego
1. Umieścić na szkiełku krople˛ 0,5% roztworu dezoksycholanu sodu i wymieszać
z mała˛ liczba˛ kolonii pobranych z podłoża MacConkeya.
2. Wskaźnikiem dodatniej reakcji jest zmiana charakteru zawiesiny w cia˛gu
60 sekund: z me˛tnej w śluzowata˛; obecność śluzowych włókien może być
wykazana za pomoca˛ ezy, która˛zanurza sie˛ w zawiesinie i odsuwa od szkiełka.
Niektóre szczepy Aeromonas moga˛ wykazywać słaba˛ i opóźniona˛ o około
60 sekund reakcje˛.
Jeśli powyższe testy sa˛ dodatnie, przenieść cze˛ść kolonii na KIA i po całonocnej
inkubacji obserwować w kierunku obecności żółtego zabarwienia słupka, zasadowego skosu, braku wytwarzania gazu i H2S. Jeśli wysta˛pia˛ ww. cechy, zanotować:
,,izolacja Vibrio cholerae (wste˛pna identyfikacja)’’.
Campylobacter jejuni i Campylobacter coli
Płytki Campylobacter należy ogla˛dać po 48 – 72 godzinach inkubacji. Zalecane
jest wykonanie testu na oksydaze˛, ogla˛danie preparatu natywnego w ciemnym
polu widzenia lub w mikroskopie fazowo-kontrastowym oraz preparatu barwionego metoda˛ Grama. Jeśli mikroskop z ciemnym polem widzenia lub
fazowo-kontrastowy nie jest doste˛pny, morfologie˛ komórek można określić na
podstawie preparatu barwionego metoda˛ Grama, używaja˛c obok fioletu krystalicznego 0,3% fuksyny karbolowej. Campylobacter spp. sa˛ oksydazododatnie,
61
KAŁ
wykazuja˛ruch, w preparacie widoczne sa˛jako lekko lub spiralnie zagie˛te pałeczki
(kształt skrzydeł mewy lub ,,S’’). Jeśli wysta˛pia˛ ww. cechy, zanotować: ,,izolacja
Campylobacter (wste˛pna identyfikacja)’’.
Clostridium difficile
Kolonie C. difficile na podłożu CCFA sa˛ duże, żółte, ze szklista˛ podstawa˛. Na
agarze z krwia˛ w środowisku beztlenowym kolonie moga˛ wykazywać różna˛
morfologie˛, dlatego niezbe˛dna jest identyfikacja bakterii na podstawie innych
cech. Typowe kolonie na tym podłożu sa˛ szare, nieprzejrzyste, bez cech hemolizy
po 24 – 48 godzinach, tylko niekiedy zielononiebieskie z powodu α-hemolizy.
Po 48 – 72 godzinach inkubacji może pojawić sie˛ wyraźne szare zabarwienie
z białym centrum. Z doświadczenia wynika jednak, że mimo różnic w morfologii
kolonii C. difficile jest łatwo rozpoznawany na podstawie charakterystycznego
zapachu, przypominaja˛cego odchody końskie. Jeśli kolonie sa˛ lecytynazoi lipazoujemne, a ponadto wykazuja˛ żółtozielona˛ fluorescencje˛ w świetle lampy
Wooda, należy zanotować: ,,izolacja Clostridium difficile (wste˛pna identyfikacja)’’.
Końcowa identyfikacja mikrobiologiczna
Przed wydaniem wyniku należy sprawdzić czystość hodowli i potwierdzić
identyfikacje˛ za pomoca˛ dodatkowych testów biochemicznych.
1. Pobrać z płytki dobrze odgraniczone od innych kolonie i przesiać na bulion
odżywczy w celu wykonania testów biochemicznych, na skos agarowy do
testów serologicznych oraz na płytke˛ MacConkeya w celu potwierdzenia
czystości hodowli.
2. Wykonać dodatkowe testy biochemiczne zgodnie z tabelami. Wyniki odczytać
po całonocnej inkubacji i zidentyfikować izolowane szczepy.
Identyfikacja Shigella i Salmonella może niekiedy stanowić problem, ponieważ
niektóre szczepy różnia˛ sie˛ wynikami reakcji biochemicznych, a także moga˛
wykazywać obecność antygenów wspólnych z innymi Gram-ujemnymi bakteriami. Nieruchliwe, laktozoujemne, nie wytwarzaja˛ce gazu szczepy E. coli sa˛
cze˛sto trudne do odróżnienia od szczepów Shigella, a ponadto identyfikacja może
być skomplikowana w zwia˛zku z faktem wywoływania czerwonki bakteryjnej
przez niektóre z tych szczepów.
Salmonella
Jeśli wyniki wste˛pnych testów wskazuja˛ na obecność szczepów Salmonella,
należy posiać szczepy na podłoże z ornityna˛, podłoże Simmonsa z cytrynianem,
ONPG i wode˛ peptydowa˛ wzbogacona˛ mannitolem, ramnoza˛, trehaloza˛ lub
ksyloza˛. Obserwować reakcje po całonocnej inkubacji i zidentyfikować szczepy
według schematu przedstawionego w tabeli 12. Jeśli wyniki wskazuja˛ na hodowle˛
Salmonella, przeprowadzić identyfikacje˛ serologiczna˛.
62
CZE˛ŚĆ I
H2S KIA
Indol
Lizyna
Ornityna
Cytrynian
ONPG
Ureaza
Mannitol
Trehaloza
Ramnoza
Ksyloza
Salmonella (wie˛kszość serotypów)
S. choleraesuis
S. arizonae
S. typhi
S. paratyphi A
Edwardsiella tarda
Proteus spp.
Ruch
mgławicowy
Tabela 12. Biochemiczne reakcje biotypów Salmonella i innych pałeczek
–
–
–
+
+
+
–
–
+
+
+
+
–
–
–
–
–
–
+
d
+
+w
d–
+
+
+
–
–
–
–
+
–
–/+
+
+
+
–
+
–
–
+
+
–
+
+
–
+/–
d
+
–
–
–
+
v
–
+
–
–
–
+
–
–
–
–
–
–
d
+
+
+
+
+
–
+
–
–
+
+
+
–
+
+
+
+
–
+
–
+
–
+
+
+
–
–
+
+
Skróty: +: > 95% dodatnich; d: 26 – 74% dodatnich; d–: 5 – 25% dodatnich; –: < 5% dodatnich; v: zmienne wyniki; w: słaba reakcja.
H2S/KIA: wytwarzanie siarkowodoru na agarze Kliglera; Lizyna: dekarboksylaza lizyny; Ornityna: dekarboksylaza ornityny;
Cytrynian: agar cytrynianowy Simmonsa; ONPG: β-galaktozydaza.
Ruch
Indol
Lizyna
Ureaza
VP
Cytrynian
Ornityna
Fenyloalanina
ONPG
Sacharoza
Ksyloza
Shigella sonnei
Shigella, inne gatunki
E. coli, nieaktywne szczepy
Providencia
Morganella
Hafnia alvei
Serratia marcescens
Plesiomonas shigelloides
Oksydaza
Tabela 13. Biochemiczne reakcje biotypów Shigella i innych pałeczek
–
–
–
–
–
–
–
–
+
–
–
–
+
d+
+
+
+
+
–
d
d+
+
+
–
–
–
+
–
–
d
–
–
+
+
–
+
–
–
–
v
+
–
d–
–
–
–
–
–
–
–
d+
+
–
–
–
–
–
+
–
d–
+
–
–
+
–
d–
–
+
+
+
+
+
–
–
–
+
d+
–
–
–
–
d+
–
d
d–
d–
+
+
–
+
–
–
d–
d
–
d–
+
–
–
–
–
d
–
–
+
–
–
–
Skróty: +: > 95% dodatnich; d+: 75 – 95% dodatnich; d: 26 – 74% dodatnich; d–: 5 – 25% dodatnich; –: < 5% dodatnich; Lizyna:
dekarboksylaza lizyny; VP: Voges-Proskauera; Cytrynian: agar cytrynianowy Simmonsa; Ornityna: dekarboksylaza ornityny;
Fenyloalanina: deaminaza fenyloalaniny; ONPG: β-galaktozydaza.
Tabela 14. Biochemiczne reakcje gatunków i serotypów Shigella
Dekarboksylaza
ornityny
Fermentacja:
laktoza/sacharoza
Fermentacja:
mannitol
Katalaza
Glukoza: gaz
Shigella dysenteriae
Serotyp 1 (shigae)
Serotyp 2 (schmitzii)
Serotypy 3 – 10
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
+
+
–
–
–
Shigella flexneri
Serotyp 1 – 5, X i Y
Serotyp 6 Newcastle
Serotyp 6 Manchester
Serotyp 6 Boyd 88
–
–
–
–
–
–
–
–
+
–
+
+
+
+
+
+
–
+
+
–
Shigella boydii
Serotyp 1 – 13, 15
Serotyp 14
–
–
–
–
–
–
–
–
–
+
Shigella sonnei
+
+ (opóźniona)
+
+
–
63
KAŁ
Shigella
Jeśli wyniki wste˛pnych testów wskazuja˛ na pałeczki Shigella, należy posiać
badany szczep na podłoża z ornityna˛, fenyloalanina˛i ONPG oraz wode˛ peptonowa˛
z sacharoza˛ i ksyloza˛. Obserwować reakcje po całonocnej inkubacji i zidentyfikować izolaty według schematu przedstawionego w tabeli 13. Jeśli wyniki
wskazuja˛ na hodowle˛ Shigella, przeprowadzić identyfikacje˛ serologiczna˛.
Do rodzaju Shigella należa˛ cztery gatunki: S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii
i S. sonnei. Zwykle oznaczane sa˛ jako podgrupy, odpowiednio A, B, C i D.
Niektóre serotypy można wste˛pnie zidentyfikować i podzielić na biotypy na
podstawie reakcji biochemicznych.
Wśród S. dysenteriae (podgrupa A) wyróżnia sie˛ 10 serotypów. Serotyp 1 jest
katalazoujemny i wytwarza toksyne˛ Shiga. Pozostałe serotypy sa˛ katalazododatnie. Wie˛kszość szczepów nie fermentuje mannitolu i laktozy.
Wśród S. flexneri (podgrupa B) wyróżnia sie˛ 8 serotypów. Wie˛kszość szczepów
fermentuje mannitol, nie fermentuje sacharozy ani laktozy. Należa˛cy do serotypu 6 szczep Newcastle nie fermentuje mannitolu, ale wytwarza gaz z glukozy;
szczep Manchester wytwarza kwas i gaz z glukozy oraz mannitolu; szczep
Boyd 88 rozkłada glukoze˛ i mannitol do kwasu, bez wytwarzania gazu.
Wśród S. boydii (podgrupa C) wyróżnia sie˛ 15 serotypów. Fermentuja˛ one
mannitol, nie fermentuja˛ laktozy.
Wśród S. sonnei (podgrupa D) wyróżnia sie˛ jeden serotyp, wykazuja˛cy dwie fazy
reakcji: I i II. Fermentuje mannitol. Wykazuje dodatnia˛ reakcje˛ ONPG, ale
fermentacja laktozy i sacharozy zachodzi później niż po 24 godzinach (patrz
tabela 14).
Jeśli wyniki wste˛pnych testów wskazuja˛ na obecność szczepów Yersinia, należy
posiać szczep na podłoża z ornityna˛, Voges-Proskauera, ONPG, cytrynianowe
podłoże Simmonsa oraz wode˛ peptonowa˛ wzbogacona˛ sacharoza˛, ramnoza˛,
melibioza˛, sorbitolem lub celobioza˛. Obserwować reakcje po jednodniowej
inkubacji i zidentyfikować izolaty według schematu przedstawionego w tabeli 15.
Jeśli wyniki wskazuja˛ na hodowle˛ Y. enterocolitica, wydać wynik: ,,Yersinia
enterocolitica’’.
Ornityna
VP 25°C
Cytrynian
Sacharoza
Ramnoza
Melibioza
Sorbitol
Celobioza
enterocolitica
frederiksenii
intermedia
kristensenii
pseudotuberculosis
Ureaza
Y.
Y.
Y.
Y.
Y.
MIL
Tabela 15. Biochemiczne reakcje Yersinia enterocolitica i innych niepatogennych gatunków Yersinia
+/v/–
+/+/–
+/+/–
+/d/–
+/–/–
+
+
+
+
+
+
+
+
+
–
v
+
+
–
–
–
d
+
–
–
v
+
+
–
–
–
+
+
–
+
–
–
+
–
+
+*
+
+
+
–
+
+
+
+
–
Skróty: +: > 95% dodatnich; d: 26 – 74% dodatnich; –: < 5% dodatnich; v: zmienny wynik; MIL: podłoże ruch-indol-lizyna; VP 25°C:
inkubacja w 25°C na agarze Voges-Proskauera; Cytrynian: agar cytrynianowy Simmonsa.
* Z wyja˛tkiem biotypu 5.
64
CZE˛ŚĆ I
Vibrio cholerae
Jeśli wyniki wste˛pnych testów wskazuja˛ na obecność szczepów Vibrio, należy
wykonać posiew na podłoże z ornityna˛, agar cytrynianowy Simmonsa oraz wode˛
peptonowa˛z sacharoza˛ i inkubować przez noc. Jeśli jedna z opisanych reakcji jest
ujemna, wykonać posiew na podłoże Voges-Proskauera i przeprowadzić test na
hydrolize˛ eskuliny, fermentacje˛ mannitolu, arabinozy i arbutyny. Obserwować
reakcje po całonocnej inkubacji i zidentyfikować izolaty według schematu
przedstawionego w tabeli 16.
V. parahaemolyticus
+
K/A
+/+/+
+
V. fluvialis
V. furnissii
+
+
K/A
K/AG
+/d/–
+/–/–
–
–
V. hollisae
Aeromonas hydrophila
+
+
K/A
A/AG
+/+/–
+/+/+
–
–
–
d
+
+
+
–
+
+
–
–
–
–
–
–
+
d+
–
+
+
+
+
+
+
+
+
–
–
–
+
–
+
+
+
–
+
Komentarz
+
+
Eskulina
+/+/+
+/+/+
Arabinoza
Ornityna
K/A
v/A
Mannitol
MIL
+
+
Sacharoza
KIA
słupek/skos
Vibrio cholerae
V. mimicus
Cytrynian
Oksydaza
Tabela 16. Reakcje biochemiczne przecinkowców wyste˛puja˛cych w kale
słaby wzrost
Arb+/VP+
A. caviae
+
A/A
+/+/–
–
+
+
+
+
d
Arb–/VP–
A. veronii biotyp sobria
Plesiomonas shigelloides
+
+
A/AG
K/A
+/+/+
+/+/+
–
+
+
–
+
–
+
–
–
–
–
+
Arb–/VP+
Arb–/VP–
Skróty: +: > 95% dodatnich; d+: 75 – 95% dodatnich; d: 26 – 74% dodatnich; –: < 5% dodatnich; KIA: agar Kliglera; MIL: podłoże
ruch-indol-lizyna; Ornityna: dekarboksylaza ornityny; Eskulina: hydroliza eskuliny; K: odczyn zasadowy; A: odczyn kwaśny; G:
gaz; Arb: fermentacja arbutyny; VP: Voges-Proskauer.
Jeśli doste˛pna jest swoista surowica anty-Vibrio cholerae serogrupy O1, należy wykonać szybki test aglutynacji szkiełkowej. W przypadku makroskopowej aglutynacji, opisać: ,,Vibrio cholerae O1’’. Jeśli surowica nie jest doste˛pna
lub identyfikacja nie jest pewna, przesłać szczep do referencyjnego laboratorium.
Różnicowanie V. cholerae O1 na biotypy klasyczny i El Tor nie jest niezbe˛dne do
leczenia lub monitorowania, powinno jednak zostać przeprowadzone dla niektórych izolatów (tabela 17).
Tabela 17. Różnice biotypów Vibrio cholerae
Biotyp
Klasyczny
Hemaglutynacja
Polimyksyna B (50 j.)
Voges-Proskauer
Hemoliza
Reakcja ujemna, brak wzrostu*
Wrażliwy
Reakcja ujemna, brak wzrostu*
Reakcja ujemna, brak wzrostu
* Moga˛ wysta˛pić odchylenia od normy.
65
El Tor
Reakcja dodatnia, wzrost*
Oporny
Reakcja dodatnia, wzrost*
Zmienne
KAŁ
Test hemaglutynacji pośredniej
1. Przez wielokrotne odwirowanie przygotować w fizjologicznym roztworze soli
2,5% zawiesine˛ kurzych lub bydle˛cych krwinek czerwonych.
2. Na szkiełku zaznaczyć ołówkiem kilka pól i eza˛ nanieść na każde z nich oczko
(3 mm) zawiesiny krwinek czerwonych.
3. W każdej z przygotowanych zawiesin krwinek umieścić niewielka˛ liczbe˛
bakterii pobranych z agaru lub skosu KIA, dobrze wymieszać.
W przypadku szczepów biotypu El Tor, aglutynacja pojawia sie˛ w cia˛gu
30 – 60 sekund. Znane szczepy hemaglutynuja˛ce (El Tor) i nie hemaglutynuja˛ce
powinny być użyte jako kontrola dla każdej z nowo przygotowanych zawiesin
krwinek. Świeżo izolowane szczepy klasycznych biotypów daja˛ zwykle ujemny
wynik testu, jednak w przypadku starych szczepów laboratoryjnych wynik ten nie
zawsze jest ujemny.
Test wrażliwości na polimiksyne˛ B
1. Na podłożu Mueller-Hintona lub na agarze z wycia˛giem mie˛snym rozprowadzić oczko hodowli szczepów inkubowanej przez noc w wodzie
peptonowej.
2. Umieścić kra˛żek zawieraja˛cy 50 jednostek polimiksyny B w centrum hodowli.
3. Umieścić płytke˛ w chłodziarce na 1 godzine˛.
4. Inkubować płytke˛ przez noc w temperaturze 36°C.
Zidentyfikowane szczepy biotypu klasycznego i El Tor powinny być zawsze
wła˛czane do grupy szczepów kontrolnych. Klasyczne szczepy sa˛ wrażliwe na
polimiksyne˛ B, dlatego zawsze obserwuje sie˛ wyraźna˛ strefe˛ zahamowania
wzrostu wokół kra˛żka. Szczepy El Tor sa˛ niewrażliwe i strefa zahamowania nie
jest widoczna.
Campylobacter jejuni i Campylobacter coli
W laboratoriach klinicznych doste˛pnych jest tylko kilka testów do identyfikacji
gatunków i podgatunków Campylobacter. Ze wzgle˛du na temperature˛ wzrostu
Campylobacter spp. można podzielić na dwie grupy: gatunki ciepłolubne, które
rosna˛ w temperaturze 42 – 43°C, i gatunki nieciepłolubne, które rosna˛ w temperaturze 15 – 25°C.
Do gatunków ciepłolubnych należa˛: Campylobacter jejuni podgatunek jejuni,
C. coli, C. lari, C. upsaliensis i niektóre szczepy C. hyointestinalis. C. lari
i C. hyointestinalis sa˛ oporne, natomiast C. jejuni, C. coli i C. upsaliensis sa˛
wrażliwe na kwas nalidyksowy; C. jejuni podgatunek jejuni, C. coli, C. lari sa˛
oporne, natomiast C. hyointestinalis i C. upsaliensis sa˛ wrażliwe na cefalotyne˛.
Różnicowanie mie˛dzy tymi grupami odbywa sie˛ na podstawie zdolności do
hydrolizy hipuranu i wytwarzania siarkowodoru na agarze Kliglera.
Do gatunków nieciepłolubnych należa˛: C. jejuni podgatunek doylei, C. fetus
i Arcobacter butzleri. C. jejuni podgatunek doylei nie rośnie w temperaturze 15°C
ani w temperaturze 25°C; C. fetus rośnie dobrze w 25°C, ale nie rośnie w 15°C;
A. butzleri rośnie w obydwu temperaturach. A. butzleri jest oporny na cefalotyne˛,
a C. jejuni podgatunek doylei i C. fetus sa˛ na nia˛ wrażliwe (tabela 18).
66
CZE˛ŚĆ I
Tabela 18. Identyfikacja biochemiczna gatunków Campylobacter izolowanych z kału
Wzrost w temperaturze
Campylobacter jejuni
subsp. jejuni
C. jejuni subsp. doylei
C. coli
C. lari
C. upsaliensis
C. fetus subsp. fetus
C. hyointestinalis
Arcobacter butzleri d
H2S/KIA
Hydroliza
hipuranua
Redukcja
azotanu
Wrażliwość
Kwas
Cefalotynac
nalidyksowyb
15°C
25°C
42°C
–
–
+
–
+
+
S
R
–
–
–
–
–
–
+
–
–
–
–
+
+
+
–
+
+
+
–
v
–
–
+
–
–
–
+
–
d
–
–
–
–
–
–
–
+
+
+
+
+
+
S
S
R
S
R
R
v
S
R
R
S
S
S
R
Skróty: +: > 95% dodatnich; d+: 75 – 95% dodatnich; d: 26 –7 4% dodatnich d–: 5 – 25% dodatnich; –: < 5% dodatnich; v: reakcja
zmienna; S: wrażliwy; R: oporny; H2S/KIA: agar Kliglera.
a
Jedynie kolor ciemnej purpury jest dowodem na reakcje dodatnia˛.
b
Kra˛żek zawieraja˛cy 30 µg kwasu nalidyksowego.
c
Kra˛żek zawieraja˛cy 30 µg cefalotyny.
d
Katalazoujemne lub słabo dodatnie; agar Kliglera.
Identyfikacja serologiczna
Salmonella
Nazewnictwo i klasyfikacja pałeczek Salmonella kilkakrotnie ulegały zmianom
i nadal poddawane sa˛pod dyskusje˛. Zgodnie z obecnym nazewnictwem wszystkie
serotypy Salmonella należa˛ do jednego gatunku, który podzielony jest na sześć
podgrup (zwanych także podgatunkami), do których zaliczany jest dawny rodzaj
Arizona. Podgrupa 1 odpowiada typowym pałeczkom Salmonella i obejmuje
m.in.: Salmonella typhi, S. paratyphi A, S. enteritidis, S. typhimurium, S. choleraesuis. Podgrupa ta obejmuje około 2000 serotypów, które moga˛ być różnicowane na podstawie wzoru antygenów (antygeny O, H, Vi). Serotypy należa˛ce
do podgrupy 1 sa˛nazywane w sposób sugeruja˛cy przynależność do rzeczywistych
gatunków: Salmonella podgrupa 1 serotyp typhimurium jest nazywana po prostu
S. typhimurium. Ponad 99% izolowanych od ludzi pałeczek Salmonella należy do
podgrupy 1.
Ważnymi antygenami w serotypowaniu Salmonella sa˛ antygeny somatyczne
O i antygeny rze˛skowe H. Antygeny O wyste˛puja˛ zarówno u ruchliwych, jak
i u nieruchliwych szczepów, sa˛ odporne na gotowanie; antygeny H wyste˛puja˛
jedynie u ruchliwych pałeczek i sa˛ wrażliwe na gotowanie. Wie˛kszość gatunków
Salmonella wykazuje dwufazowa˛ ruchliwość i może wytwarzać dwie formy
antygenów określanych jako antygeny fazy I i II. W obu fazach szczepy maja˛ ten
sam antygen O, lecz różnia˛ sie˛ forma˛ antygenu H. Do identyfikacji serotypu
konieczne jest określenie specyficzności antygenu H obu faz. Nie zawsze jest to
możliwe, dlatego niekiedy, dla potwierdzenia obecności fazy latencji, konieczne
jest jej zahamowanie.
Antygeny O oznaczone sa˛ cyframi arabskimi. Antygeny H fazy I oznaczone sa˛
małymi literami rzymskimi, a antygeny H fazy II cyframi arabskimi. Na przykład,
wzór antygenowy S. typhimurium to 1,4,[5],12:i:1,2, gdzie antygeny O to 1,4,5
i 12; antygeny H fazy I to ,,i’’, a fazy II to 1 i 2. Nawiasy oznaczaja˛, że antygen
może być nieobecny, a podkreślenie wskazuje, że antygen zwia˛zany jest
z lizogenna˛ konwersja˛ wywołana˛ przez bakteriofagi. Taka zmiana we wzorze
67
KAŁ
antygenów możliwa jest jedynie w obecności bakteriofaga i może stanowić jedyna˛
różnice˛ mie˛dzy niektórymi serotypami.
Gatunki Salmonella podzielono na grupy na podstawie obecności określonych
antygenów O. Wspomniany podział jest także określany jako schemat Kauffmanna-White’a. Duże litery rzymskie określaja˛ grupy O. W oryginalnym schemacie
grupy oznaczone były literami A, B, C, D i E; stopniowo poszerzono zakres grup
od A do Z, z czterema podgrupami C, trzema D, czterema E i dwiema G. Grupy
O określane sa˛ na podstawie obecności naste˛puja˛cych antygenów O:
Grupa:
Antygen:
A
2
Ba C1 C2
4;5 6;7 6;8
D E1 F
9 3;10 11
Istnieja˛ inne różnice w strukturze antygenowej: zmiana w wygla˛dzie kolonii
od gładkich do szorstkich w zależności od obecności lub braku antygenu Vi. Obecność antygenu Vi hamuje aglutynacje˛ w swoistej surowicy anty-O.
Antygen Vi jest zwykle wykrywany w świeżo izolowanych szczepach i szybko
tracony podczas ich przechowywania. Antygen ten jest ważny w identyfikacji
szczepów S. typhi, cze˛sto nie ulegaja˛cych aglutynacji w heterogennej surowicy
anty-H.
Procedura identyfikacji antygenu somatycznego O
Bezpośredni test aglutynacji szkiełkowej
1. Przed rozpocze˛ciem badania umieścić roztwór soli i odczynniki w temperaturze pokojowej.
2. Umieścić krople˛ roztworu soli na czystym szkiełku mikroskopowym.
3. Za pomoca˛ sterylnej ezy pobrać niewielka˛ ilość materiału z hodowli na skosie agarowym i rozprowadzić w kropli soli uzyskuja˛c jednolita˛, me˛tna˛ zawiesine˛.
4. Pod lupa˛ lub pod mikroskopem w niewielkim powie˛kszeniu (× 10) obejrzeć
zawiesine˛ bakterii, aby wykluczyć autoaglutynacje˛ zawiesiny w soli.
5. Pobrać eza˛ 10 µl poliwalentnej surowicy odpornościowej O Salmonella (A-I
i Vi) i umieścić ja˛ na szkiełku tuż obok zawiesiny bakterii.
6. Wymieszać surowice˛ z zawiesina˛ bakterii i przechylać szkiełko do przodu i do
tyłu przez 1 minute˛. Obserwować tworzenie sie˛ grudek ogla˛daja˛c szkiełko
w dobrym świetle. Pojawienie sie˛ w tym czasie wyraźnych grudek jest
wynikiem dodatnim.
7. Jeśli wynik jest dodatni, powtórzyć badanie z monowalentna˛ surowica˛
odpornościowa˛.
Niektóre pałeczki Salmonella maja˛ antygen powierzchniowy Vi i żywe lub
nieinaktywowane termicznie nie ulegaja˛ aglutynacji z surowica˛ odpornościowa˛ grupy C1 (O:6,7) lub grupy D (O:9). Aby zapobiec otrzymaniu nieprawidłowego wyniku, w celu usunie˛cia antygenu Vi, zawiesine˛ należy podgrzać w gotuja˛cej sie˛ wodzie, schłodzić, oddzielić bakterie przez wirowanie, ponownie
zawiesić w świeżym fizjologicznym roztworze soli i przeprowadzić test z ta˛
sama˛ surowica˛.
a
Wszystkie szczepy Salmonella podgrupy B zawieraja˛ antygen 4, tylko niektóre antygen 5.
68
69
Salmonella
paratyphi B
ujemny
Salmonella
serotyp
paratyphi B
dodatni
D-winian
Salmonella
species
dodatni
H:1,2
dodatni
Salmonella
species
H:1,2
ujemny
Test z anty-H:1,2
Agar do oceny
ruchu
z anty-H:i
Salmonella
typhimurium
H:i
dodatni
H:1,2
dodatni
anty-H:b
Test z anty-H:i
Test z anty-H:1,2
Agar do oceny
ruchu
z anty-H:1,2
Agar do oceny
ruchu
z anty-H:b
H:i
dodatni
wszystkie
ujemne
Salmonella
enteritidis
dodatni
anty-H:m
dodatni
anty-grupa D
Salmonella
species
ujemny
ujemny
Salmonella
typhi
dodatni
anty-H:d
Salmonella
species
Ryc. 8. Identyfikacja serologiczna gatunku Salmonella.
Salmonella
paratyphi A
dodatni
anty-H:a
dodatni
anty-grupa A
dodatni
WHO 01.51
Salmonella
species
ujemny
ujemny
Test z poliwalentna˛ surowica˛
anty-Salmonella A-I + Vi
Biochemiczna identyfikacja:
obydwa
jeden lub
dodatnie obydwa ujemne
anty-grupa D
+ anty-Vi*
dodatni
* Jeśli reakcja aglutynacji zachodzi jedynie z surowica˛ anty-Vi, należy zagotować zawiesine˛ bakterii i powtórzyć badanie z surowica˛ O:D.
Salmonella
species
H:1,2 ujemny
H:1,2
dodatni
H:b
dodatni
Test z anty-H:b; anty-H:1,2; H:i
dodatni
anty-grupa B
ujemny
dodatni
Salmonella typhi
gatunek Salmonella
CZE˛ŚĆ I
KAŁ
Procedura identyfikacji antygenu H
Wste˛pna identyfikacja antygenu rze˛skowego H może być przeprowadzona
w teście bezpośredniej aglutynacji, jak opisano powyżej dla antygenu somatycznego O. Niekiedy konieczne jest zwie˛kszenie ekspresji ruchu badanych szczepów
przez kilkakrotne kolejne przesiewy na półpłynne podłoża odżywcze (,,swarm
agar’’, patrz niżej). Surowice odpornościowe do wykonania testu z tymi
antygenami sa˛ doste˛pne komercyjnie. Mimo to, jeśli identyfikacja obu faz
rze˛skowych jest niezbe˛dna do klasyfikacji, wymagana jest faza zahamowania.
Cze˛sto konieczna jest także inwersja faz z użyciem przeznaczonych do tego celu
surowic1.
1. Przygotować półpłynne podłoża odżywcze zawieraja˛ce 0,2 – 0,4% agaru.
Umieścić po 1 ml podłoża w probówkach.
2. Zasta˛pić korki probówek korkami z waty.
3. Upłynnić agar w gotuja˛cej sie˛ wodzie i umieścić probówki z płynnym agarem
w łaźni wodnej w temperaturze 45°C na 30 minut.
4. Opisać każda˛probówke˛ numerem próbki i surowicy anty-H (H:b, H:i i H:1,2).
Również probówke˛ kontrolna˛.
5. Dodać 10 µl heterogennej surowicy H każdej fazy inwersji do odpowiednich
agarów, delikatnie wstrza˛sna˛ć probówki i pozostawić agar do skrzepnie˛cia
w skosie.
6. Sporza˛dzić ge˛sta˛ zawiesine˛ izolowanych kolonii w roztworze fizjologicznym
soli, posiać eza˛, nakłuwaja˛c skos, i inkubować przez noc.
7. Z hodowli uzyskanej na skosie pobrać eza˛ materiał i rozprowadzić równomiernie w kropli roztworu fizjologicznego soli.
8. Eza˛ o obje˛tości 10 µl pobrać krople˛ jednej z heterogennych surowic odpornościowych H i umieścić ja˛ na szkiełku, tuż obok zawiesiny
bakterii.
9. Wymieszać surowice˛ z zawiesina˛ bakterii, przechylaja˛c szkiełko do przodu
i do tyłu przez 1 minute˛. Obserwować tworzenie sie˛ grudek, ogla˛daja˛c
szkiełko w dobrym świetle. Pojawienie sie˛ w tym czasie wyraźnych grudek
świadczy o dodatnim wyniku.
10. Jeśli to konieczne, należy powtórzyć test aglutynacji z innymi heterogennymi
surowicami i zidentyfikować serotyp, wykorzystuja˛c schemat przedstawiony
na str. 69.
Salmonella typhi
Dla potwierdzenia identyfikacji biochemicznej należy przeprowadzić testy
z surowicami odpornościowymi Vi, O grupy D (O:D) i H:d. Z powodu obecności
antygenu Vi hodowle aglutynuja˛ce w surowicy Vi moga˛ nie aglutynować
w surowicy O:D. Należy usuna˛ć antygen Vi, podgrzewaja˛c zawiesine˛ w temperaturze 100°C przez 20 minut, i powtórnie przeprowadzić test z surowica˛ O:D.
Po uzyskaniu aglutynacji w surowicach Vi, O:D i H:d zanotować: ,,Salmonella
typhi’’. Jeśli wynik jest dodatni jedynie w surowicy O:D, zanotować: ,,Salmonella,
grupa D’’.
1
Doste˛pne w Statens Serum Institut, 5 Artillerivej, 2300 Copenhagen S, Denmark.
70
CZE˛ŚĆ I
Dla potwierdzenia identyfikacji biochemicznej należy przeprowadzić test z surowica˛odpornościowa˛Salmonella grupy A. Jeśli wynik jest dodatni, przeprowadzić
test z surowica˛ H:a i w przypadku uzyskania dodatniego wyniku zanotować:
,,Salmonella paratyphi A’’. Jeśli wynik z surowica˛ H:a jest ujemny, zanotować:
,,Salmonella grupa A’’. Jeśli nie wykazano ruchu, można rozważyć obecność
S. flexneri typ 6 lub S. boydii typ 13 lub 14 i przeprowadzić test z surowica˛
odpornościowa˛ Shigella B i D.
Inne serotypy Salmonella
Jeśli wyniki powyżej opisanych testów wskazuja˛ na obecność typowych pałeczek
Salmonella, należy przeprowadzić testy z surowicami odpornościowymi Salmonella O grup A, B, C, D i E.
• Jeśli dodatni wynik wskazuje na grupe˛ B, wykonać test z surowica˛ H:b, H:i
i H:1,2. Jeśli uzyskamy wynik dodatni z surowica˛ H:b, identyfikowanym
mikroorganizmem może być S. wien lub S. paratyphi B. S. wien można odróżnić
od S. paratyphii B w odczynie alutynacji z surowica˛ H:1,w i H:2 (jeśli sa˛
doste˛pne). S. wien aglutynuje w surowicy H:1,w, a S. paratyphi w H:2.
• Jeśli wynik z surowica˛ H:i lub H:1,2 jest dodatni, wywołać inwersje˛ fazy
i przeprowadzić test z heterogenna˛ surowica˛ H. Jeśli wynik jest dodatni,
zanotować: ,,S. typhimurium’’. Jeśli wynik jest ujemny, zanotować: ,,Salmonella grupa B’’.
• Jeśli wynik z surowica˛ C jest dodatni, zanotować: ,,Salmonella grupa C’’.
• Jeśli wynik z surowica˛D jest dodatni, przeprowadzić testy z surowicami Vi, H:d
i H:m. Jeśli wynik z surowica˛ Vi lub H:d jest dodatni, zanotować: ,,Salmonella
typhi’’. Jeśli wynik z surowica˛ H:m jest dodatni, zanotować: ,,Salmonella
enteritidis’’. Jeśli testy z surowicami Vi, H:d i H:m sa˛ ujemne, zanotować:
,,Salmonella grupa D’’.
• Jeśli identyfikacja biochemiczna wskazuje na szczep Salmonella, ale testy ze
wszystkimi surowicami grup O sa˛ ujemne, zanotować: ,,Prawdopodobnie
gatunek Salmonella’’ i przesłać do Centralnego Laboratorium Referencyjnego.
Shigella
Pałeczki Shigella można podzielić na serogrupy i serotypy na podstawie
szkiełkowych i probówkowych odczynów aglutynacji ze swoistymi surowicami
odpornościowymi O. Odczyn aglutynacji szkiełkowej zwykle wystarcza, jeśli
wynik badania jest jednoznaczny. Zawiesina antygenu powinna być przygotowana z nieselektywnego podłoża, np. z agaru odżywczego lub KIA, i uważnie
obserwowana w celu wykluczenia autoaglutynacji przed dodaniem surowicy.
Testy z surowicami odpornościowymi Shigella
grupy A, B, C i D
• Jeśli pojawi sie˛ aglutynacja z surowica˛ grupy A, zanotować: ,,Shigella
dysenteriae’’. Przeprowadzić test z surowica˛ S. dysenteriae typ 1. Jeśli jest
dodatni, zanotować: ,,S. dysenteriae typ 1’’.
71
KAŁ
• Jeśli pojawi sie˛ aglutynacja z surowica˛ grupy B, zanotować: ,,Shigella
flexneri’’.
• Jeśli pojawi sie˛ aglutynacja z surowica˛ grupy C, zanotować: ,,Shigella boydii’’.
• Jeśli pojawi sie˛ aglutynacja z surowica˛ grupy D, zanotować: ,,Shigella sonnei’’.
Czasami szczepy Shigella z powodu obecności antygenu K moga˛ nie ulegać
aglutynacji w homologicznych surowicach. Podgrzanie zawiesiny szczepów
w roztworze fizjologicznym soli w łaźni wodnej przez 20 minut i ponowne
przeprowadzenie testu może znieść hamuja˛cy wpływ antygenu K.
Niektóre Gram-ujemne mikroorganizmy moga˛ mieć antygeny wspólne ze
szczepami Shigella i dawać fałszywie dodatnie wyniki aglutynacji z surowicami
do typowania Shigella. Dobrze znanym przykładem bakterii daja˛cych krzyżowa˛
reakcje˛ sa˛ szczepy Plesiomonas shigelloides i Shigella sonnei fazy I oraz Hafnia
i Shigella flexneri serotyp 4a; najważniejsza jest jednak krzyżowa reakcja
z niektórymi odpowiedzialnymi za biegunke˛ szczepami E. coli.
Y. enterocolitica ma kilka antygenów somatycznych O, które zostały wykorzystane do podziału gatunku na 17 serogrup. Wie˛kszość zakażeń u ludzi w Kanadzie,
Europie i Japonii wywołana jest przez serotyp O3. Infekcje wywołane przez
serotyp O9 opisywano głównie w Skandynawii, infekcje wywołane przez serotyp
O8 wyste˛puja˛ prawie wyła˛cznie w USA. Istnieje krzyżowa reakcja serologiczna
mie˛dzy Y. enterocolitica O9 i Brucella spp.
72
Zakażenia górnych dróg
oddechowych
Wprowadzenie
Górne drogi oddechowe obejmuja˛ obszar od krtani do nozdrzy, w skład którego
wchodza˛: jama ustna, gardło i jama nosowo-gardłowa oraz przylegaja˛ce jamy
zatok i ucho środkowe.
Zakażenia wyste˛puja˛ce w górnych drogach oddechowych, to:
– zapalenie gardła, niekiedy z zapaleniem migdałków, prowadza˛ce do ,,bolesnego gardła’’,
– zapalenie jamy nosowo-gardłowej,
– zapalenie ucha środkowego,
– zapalenie zatok,
– zapalenie nagłośni.
Spośród wymienionych infekcji zdecydowanie najcze˛ściej wyste˛puje zapalenie
gardła; nie leczone zakażenia moga˛ mieć poważne konsekwencje. W niniejszym
opracowaniu zostanie omówione tylko zapalenie gardła.
Wie˛kszość przypadków zapalenia gardła ma etiologie˛ wirusowa˛i samoograniczaja˛cy sie˛ przebieg. Jednakże około 20% infekcji wywołanych jest przez bakterie
i zwykle wymaga leczenia odpowiednimi antybiotykami. Lekarz opieraja˛c sie˛
tylko na badaniu fizykalnym rzadko może rozróżnić zakażenie wirusowe
i bakteryjne, dlatego najlepiej, jeśli leczenie jest oparte na wyniku badania
mikrobiologicznego.
Diagnostyka bakteriologiczna zapalenia gardła jest skomplikowana ze wzgle˛du na
obecność licznej, mieszanej flory fizjologicznej złożonej z tlenowych i beztlenowych bakterii. Flora naturalna przewyższa zwykle liczebnie patogenna˛, rola
mikrobiologa polega wie˛c na rozróżnieniu komensali od patogenów. Jeśli to
możliwe, w wyniku badania należy uwzgle˛dnić tylko bakterie patogenne.
Flora fizjologiczna gardła
W skład naturalnej flory gardła wchodzi tak duża liczba gatunków, że pełna
identyfikacja i uwzgle˛dnienie wszystkich w wyniku nie jest konieczne, zwłaszcza
gdy w posiewie zaobserwowano:
• paciorkowce zielenieja˛ce (α-hemolizuja˛ce) i pneumokoki,
• niepatogenne Neisseria spp.,
• Moraxella (wcześniej Branhamella) catarrhalis (może być również patogenem
układu oddechowego),
• gronkowce (S. aureus, S. epidermidis),
• dyfteroidy (z wyja˛tkiem C. diphtheriae),
• Haemophilus spp.,
• drożdże (Candida spp.) w ograniczonej liczbie,
• różne bezwzgle˛dnie beztlenowe ziarenkowce Gram-dodatnie, pałeczki Gram-ujemne, kre˛tki i formy nitkowate.
73
ZAKAŻENIA GÓRNYCH DRÓG ODDECHOWYCH
U osób starszych, o obniżonej odporności lub niedożywionych, zwłaszcza
po antybiotykoterapii, gardło może być skolonizowane przez pałeczki Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Klebsiella spp. i in.) oraz Gram-ujemne
pałeczki niefermentuja˛ce (Acinetobacter spp. i Pseudomonas spp.). Równie
cze˛sto u takich pacjentów dochodzi do namnażania sie˛ w gardle szczepów S.
aureus lub Candida spp. i innych gatunków drożdżopodobnych grzybów.
Wymienione mikroorganizmy moga˛ wywoływać zapalenie gardła jedynie u pacjentów w okresie granulocytopenii, zaleca sie˛ jednak uwzgle˛dnienie w wyniku
informacji o izolacji takich szczepów, ponieważ ich obecność może wskazywać
na infekcje˛ (czy też ryzyko infekcji) dolnych dróg oddechowych (np.: zapalenie
płuc) lub bakteriemie˛. Dla kolonizuja˛cych gardło mikroorganizmów zwykle nie
nastawia sie˛ antybiogramu.
Bakteryjne czynniki zapalenia gardła
Streptococcus pyogenes (grupa A wg Lancefielda) jest z pewnościa˛ najcze˛stsza˛
przyczyna˛ bakteryjnego zapalenia gardła i migdałków. Zakażenie wyste˛puje
najcze˛ściej u małych dzieci (5 – 12 lat). Jeśli zapaleniu gardła towarzyszy
charakterystyczna wysypka, chorobe˛ określa sie˛ mianem gora˛czki płoniczej.
U dzieci podczas paciorkowcowej infekcji gardła może dojść do zaje˛cia jamy
nosowo-gardłowej z towarzysza˛ca˛ ropna˛ wydzielina˛ z nosa.
Nie należa˛ce do grupy A β-hemolizuja˛ce paciorkowce (np. grupa B, C i G) rzadko
sa˛ przyczyna˛ bakteryjnego zapalenia gardła i ich izolacje˛ należy odnotować
w wyniku. Nieodpowiednio leczone infekcje gardła wywołane przez S. pyogenes
moga˛ mieć konsekwencje w postaci gora˛czki reumatycznej i — rzadziej
— kłe˛buszkowego zapalenia nerek. Dokładna identyfikacja i ukierunkowane
leczenie przeciw S. pyogenes maja˛ na celu zapobieganie pojawieniu sie˛ gora˛czki
reumatycznej.
Corynebacterium diphtheriae wywołuje błonice˛, chorobe˛ wyste˛puja˛ca˛ endemicznie w wielu krajach. Tam, gdzie przerwano realizacje˛ programów
szczepień, choroba może przyja˛ć rozmiary epidemii. Typowy dla C. diphtheriae
przebieg infekcji (z kilkoma wyja˛tkami) charakteryzuje sie˛ obecnościa˛ szarawobiałych nalotów w miejscu zakażenia (gardło, migdałki, nos lub krtań). Błonica
jest cie˛żka˛ choroba˛, w której diagnoza stawiana jest na podstawie objawów.
Lekarz może zlecić dodatkowo wykonanie posiewu w kierunku maczugowców
błonicy.
W niektórych krajach coraz cze˛ściej rozpoznawane jest gonokokowe zapalenie
gardła, którego cze˛stość wyste˛powania staje sie˛ porównywalna do rzeża˛czkowego
zapalenia szyjki macicy i cewki moczowej. Posiew wymazów z gardła powinien
być wykonywany na wyraźne polecenie lekarza z użyciem właściwego podłoża
selektywnego (zmodyfikowane podłoże Thayer-Martina).
Martwicze, wrzodzieja˛ce zapalenie gardła (angina Vincenta) jest rzadkim stanem,
charakteryzuja˛cym sie˛ wyste˛powaniem martwiczych owrzodzeń gardła z tworzeniem błon rzekomych lub bez błon rzekomych. W miejscu infekcji obecna jest
liczna, bezwzgle˛dnie beztlenowa flora mieszana z przewaga˛ Gram-ujemnych
bakterii nitkowatych i spiralnych, należa˛cych głównie do Fusobacterium spp.
i Treponema vincenti. Bakterie te należa˛ do fizjologicznej flory jamy ustnej,
jednak ich duża liczba widoczna w barwionym metoda˛ Grama preparacie
74
CZE˛ŚĆ I
z wrzodzieja˛cych zmian powinna zostać odnotowana jako ,,kompleks wrzecionowcowo-kre˛tkowy’’. Rozpoznanie mikroskopowe nie wymaga potwierdzenia
w hodowli beztlenowej, która jest trudna i czasochłonna. Obecność kompleksu nie
wyklucza potrzeby poszukiwania innych patogenów, zwłaszcza S. pyogenes.
C. albicans i inne gatunki Candida obecne w niewielkiej liczbie uznawane sa˛ za
element flory fizjologicznej jamy ustnej, jednak w pewnych stanach chorobowych, np. u niedożywionych wcześniaków, u dorosłych z niedoborami odporności
(np. pacjenci z HIV/AIDS) lub u pacjentów otrzymuja˛cych antybiotykoterapie˛,
ich liczba wzrasta, prowadza˛c do wysta˛pienia kandydozy jamy ustnej. Zakażone
powierzchnie — je˛zyk, migdałki, gardło i błona śluzowa policzków — moga˛ być
intensywnie czerwone, pokryte białymi plamkami lub zlewaja˛ca˛ sie˛ szarobiała˛
błona˛ (pleśniawka). Potwierdzeniem kandydozy jest obecność w preparacie
bezpośrednim barwionym metoda˛ Grama licznych, drożdżopodobnych grzybów,
tworza˛cych niekiedy długie, przypominaja˛ce grzybnie˛ nici.
Posiewy z górnych dróg oddechowych moga˛ być przesyłane do laboratorium
nie tylko w celu zdiagnozowania infekcji, ale także w celu wykrycia obecności potencjalnie patogennych szczepów u zdrowych ludzi — ,,nosicieli’’.
Takie badania powinny być wykonywane w ramach dobrze prowadzonego
nadzoru epidemiologicznego. W górnych drogach oddechowych wyste˛puje
nosicielstwo:
• Staphylococcus aureus. Badania wymazów z nosa pacjentów i personelu
szpitalnego w kierunku nosicielstwa jest zalecane podczas ustalania źródła
zakażenia metycylinoopornym S. aureus (MRSA).
• Neisseria meningitidis. Nawet poza okresem epidemii nosicielstwo meningokoków może być bardzo cze˛ste (20% i wie˛cej). Identyfikacja nosicieli rzadko
jest konieczna i nie ma potrzeby wykonywania badań w tym kierunku przed
zaleceniem profilaktyki antybiotykowej u rodziny i u osób z bliskiego kontaktu
pacjenta z zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych.
• Streptococcus pyogenes. Nosicielstwo niewielkiej liczby tych bakterii może
być powszechne, zwłaszcza wśród dzieci szkolnych (20 – 30%).
• Corynebacterium diphtheriae. Wysoki odsetek nosicielstwa wyste˛puje w populacjach nie szczepionych. W takich społecznościach uzasadnione może być
wykonywanie identyfikacji i leczenie nosicielstwa u osób z otoczenia pacjenta
z potwierdzona˛ błonica˛. Nosicielstwo jest rzadkie w krajach, w których
właściwie realizowany jest program szczepień.
Pobieranie i przesyłanie próbek
Najlepiej, jeśli materiał pobierany jest przez lekarza lub przez inna˛ osobe˛
wykwalifikowana˛. Pacjent powinien siedzieć twarza˛ do źródła światła. Należy
przytrzymać je˛zyk szpatułka˛ i sterylna˛ wymazówka˛ energicznie pobrać wymaz z każdego migdałka, z tylnej ściany gardła i z innych zmienionych zapalnie miejsc (wymazówke˛ należy wcześniej zwilżyć jałowym fizjologicznym roztworem soli — przyp. tłum.). Należy uważać, aby nie dotkna˛ć
je˛zyka lub błony śluzowej policzków. Najlepiej, jeśli zostana˛ pobrane po dwa
wymazy z każdego miejsca. Jeden może być wykorzystany do przygotowania
preparatu bezpośredniego, a drugi należy umieścić w szklanej lub plastikowej
probówce i przesłać do laboratorium. Można także obydwa wymazy przesłać do
laboratorium. Jeśli posiew pobranego materiału nie może być wykonany w cia˛gu
4 godzin, wymazówki należy umieścić w podłożu transportowym (np. Amies lub
Stuart).
75
Charakterystyczny dla wrzodzieja˛cego zapalenia gardła (angina Vincenta) kompleks wrzecionowcowo-kre˛tkowy oraz grzyby Candida sa˛ najlepiej widoczne
w preparacie barwionym metoda˛ Grama, który powinien być wykonany na
zlecenie lekarza. Barwienie metoda˛ Grama jest nieprzydatne w wykrywaniu
paciorkowców czy Neisseria spp. Preparat bezpośredni jest także niewystarczaja˛co specyficzny i czuły w wykrywaniu maczugowca błonicy, chyba że
materiał został pobrany bardzo starannie i zbadany przez doświadczonego
mikrobiologa. Przy braku wskazań klinicznych lub bez zlecenia lekarza nie ma
potrzeby wykonywania preparatów bezpośrednich z gardła.
Hodowla i identyfikacja
Hodowla Streptococcus pyogenes
Natychmiast po dostarczeniu do laboratorium materiał musi zostać posiany
wymazówka˛ na jedna˛ czwarta˛ płytki agarowej z krwia˛ i rozsiany eza˛ na pozostała˛
cze˛ść płytki. Agar z krwia˛ powinien być przygotowany z podstawowego podłoża
agarowego bez glukozy (lub z mała˛zawartościa˛ glukozy), np. z agaru tryptozowo-sojowego (TSA). Kwaśny rozkład glukozy przez S. pyogenes hamuje wytwarzanie hemolizyn. Do przygotowania podłoży można wykorzystać krew
każdego gatunku (świeżo pobrana˛) w ste˛żeniu 5%. Płytki należy wypełnić
4 – 5 mm warstwa˛ podłoża. Preferowana jest krew wołowa, ponieważ ulega
hemolizie pod wpływem pewnych komensalnych pałeczek Haemophilus spp. i nie
daje hemolizy w obecności zymogennego wariantu Enterococcus faecalis.
Można poprawić rozpoznawanie β-hemolizuja˛cych kolonii i przyspieszyć ich
wste˛pna˛ identyfikacje˛, umieszczaja˛c na płytce w strefie pierwszego posiewu
kra˛żek z kotrimoksazolem (taki, jakiego używa sie˛ podczas określania lekowrażliwości) i specjalny kra˛żek o niskiej zawartości bacytracyny. Ponieważ
S. pyogenes w odróżnieniu od wielu innych bakterii jest oporny na kotrimoksazol,
kra˛żek ułatwia obserwacje˛ β-hemolizy. Inkubacja w eksykatorze pozwala na
wykrycie wie˛kszości β-hemolizuja˛cych paciorkowców. Prostym sposobem nasilaja˛cym hemolize˛ jest głe˛bokie, pionowe nakłucie agaru eza˛, które przyspiesza
wzrost kolonii pod powierzchnia˛. Po 18 godzinach i ponownie po 48 godzinach
inkubacji w 35 – 37°C odczytać płytki z krwia˛, poszukuja˛c małych (0,5 – 2 mm)
kolonii, otoczonych stosunkowo duża˛ strefa˛ wyraźnej hemolizy. Po wykonaniu
preparatu barwionego metoda˛ Grama i potwierdzeniu obecności Gram-dodatnich
ziarenkowców bakterie należy identyfikować w kierunku S. pyogenes. Dla
potrzeb klinicznych wste˛pna identyfikacja oparta jest na ocenie wrażliwości na
niskie ste˛żenie bacytracyny. W tym celu wykorzystuje sie˛ specjalnie przygotowane kra˛żki różnicuja˛ce, zawieraja˛ce 0,02 – 0,05 IU bacytracyny. Zwykłe kra˛żki
wykorzystywane do antybiogramów zawieraja˛ 10 IU i sa˛ nieprzydatne do
identyfikacji. Obecność β-hemolizuja˛cych paciorkowców ze strefa˛ zahamowania
wzrostu wokół kra˛żka świadczy o izolacji S. pyogenes. Jeśli w pierwszym
posiewie hemolizuja˛ce kolonie sa˛ liczne, obecność lub brak strefy zahamowania
wzrostu sa˛ wyraźnie widoczne już na pierwszej posianej płytce zawieraja˛cej agar
z krwia˛. Jeśli kolonie sa˛ mniej liczne, należy z pierwszej płytki pobrać jedna˛ lub
dwie kolonie, posiać je na 1/5 kolejnej płytki w celu uzyskania cia˛głego wzrostu
i na każdym posianym polu umieścić kra˛żek z bacytracyna˛. Strefy zahamowania
wzrostu należy odczytać po całonocnej inkubacji.
76
CZE˛ŚĆ I
W niektórych laboratoriach wste˛pna identyfikacja potwierdzana jest serologicznie
przez wykazanie obecności specyficznych polisacharydów ściany komórkowej.
Test może być przeprowadzony z użyciem klasycznej metody precypitacji lub
— szybciej — z użyciem komercyjnych przeciwciał w teście szybkiej koaglutynacji szkiełkowej lub w teście aglutynacji lateksowej. Jeśli istnieje taka
potrzeba, β-hemolizuja˛ce paciorkowce oporne na bacytracyne˛ można identyfikować wykorzystuja˛c do tego celu proste testy (patrz tabela 19).
Obecność S. pyogenes w posiewie z gardła powinna zostać określona w wyniku
w sposób półilościowy (nieliczne, +, ++ lub +++). Masywny wzrost S. pyogenes
na całej powierzchni płytki jest charakterystyczny dla materiałów pobranych od
pacjentów z paciorkowcowym zapaleniem gardła. Hodowle od nosicieli wykazuja˛
zwykle wzrost mniej niż 20 kolonii na płytce. Obecność nawet nielicznych kolonii
β-hemolizuja˛cych paciorkowców powinna zostać potwierdzona i zanotowana.
Tabela 19. Różnicowanie β -hemolizuja˛cych paciorkowców
S. pyogenes
S. agalactiae
E. faecalis
var. zymogenesa
Inne
Grupa Lancefield
A
B
D
C, G, F
Hemoliza
Strefa wokół różnicuja˛cego kra˛żka z bacytracyna˛
Agar z żółcia˛ i z eskulina˛
(wzrost i zaczernienie)
Odwrotny test CAMP
Wrażliwość na kotrimoksazole
Test PYRf
β
+
b
β
0c
β
0c
β
0d
0
0
+
0
0
0
+
0
0
0
0
+
+
0
+
0
Gatunki
a
b
c
d
e
f
E. faecalis var. zymogenes wykazuja˛ce β-hemolize˛ tylko na agarze z krwia˛ końska˛.
5% niehemolizuja˛cych.
5% dodatnich.
10% dodatnich.
Kra˛żek jak w teście Kirby-Bauera.
PYR: pirolidonylo-β-naftylamid.
Hodowla Corynebacterium diphtheriae
Mimo że maczugowiec błonicy dobrze rośnie na zwykłym agarze z krwia˛, lepszy
wzrost uzyskuje sie˛ przy posiewie na jedno z dwóch specjalnych podłoży:
• Skoagulowana surowica Löfflera lub podłoże jajeczne Dorseta. Jakkolwiek
nieselektywne, obydwa te podłoża umożliwiaja˛ obfity wzrost maczugowca
błonicy po jednodniowej inkubacji. Ponadto morfologia komórek jest bardziej
,,typowa’’: nieregularnie wybarwione, krótkie lub długie, lekko zakrzywione
pałeczki wykazuja˛ce metachromatyczne ziarnistości i ułożone w kształt V lub
równoległych palisad. Metachromatyczne ziarnistości sa˛ wyraźniej widoczne
po wybarwieniu błe˛kitem metylenowym lub barwieniu Alberta niż po zabarwieniu metoda˛ Grama.
• Selektywny agar tellurynowy z krwia˛. Podłoże to ułatwia izolacje˛, jeśli
maczugowce sa˛ nieliczne, jak np. w przypadku nosicieli. Na tym podłożu
kolonie maczugowców błonicy sa˛ szarawe lub czarne, a pełny wzrost pojawia
sie˛ po 48 godzinach. Charakterystyczne kolonie, zawieraja˛ce w preparacie
barwionym metoda˛ Grama pałeczki o morfologii podobnej do maczugowców,
należy przesiać na płytke˛ z agarem z krwia˛ i określić ich czystość oraz
77
,,typowa˛’’ morfologie˛. Należy pamie˛tać, że kolonie C. diphtheriae najcze˛ściej
wyste˛puja˛cego biotypu mitis, wytwarzaja˛ na agarze z krwia˛ wyraźna˛ strefe˛
β-hemolizy.
Wste˛pny wynik identyfikacji C. diphtheriae może zostać wydany już na tym
etapie. Wynik ten powinien zostać potwierdzony lub wykluczony za pomoca˛
prostych testów biochemicznych oraz przez wykazanie zdolności szczepu do
wytwarzania toksyn. Badanie immunogenności jest wykonywane na świnkach
morskich lub za pomoca˛ testu toksygenności in vitro (próba Eleka) i powinno być
przeprowadzane w centralnych laboratoriach, w pozostałych identyfikacja jest
oparta na szybkich testach biochemicznych. C. diphtheriae jest katalazoi azotanododatni. Nie hydrolizuje mocznika. Z glukozy i maltozy, ogólnie nie
z sacharozy, wytwarza kwas bez gazu. Test fermentacji glukozy może być
przeprowadzony na podłożu Kliglera. Aktywność ureazy można wykryć na
podłożu MIU, a redukcje˛ azotanu na bulionie azotanowym, w ten sam sposób, jak
dla Enterobacteriaceae. Do oceny fermentacji maltozy i sacharozy można użyć
jako bazy wody peptonowej Andrade’a z końcowym 1% ste˛żeniem każdego
wodorowe˛glanu. Wyniki zwykle odczytuje sie˛ po 24 godzinach, choć konieczna
może okazać sie˛ reinkubacja przez noc. Należy podkreślić, że diagnostyka
laboratoryjna ma na celu potwierdzenie klinicznie rozpoznanej błonicy. Nie
należy zwlekać z rozpocze˛ciem terapii do czasu otrzymania wyników z laboratorium. Wie˛cej informacji na temat izolacji i identyfikacji C. diphtheriae znaleźć
można w podre˛czniku Guidelines for laboratory diagnosis of diphtheria1.
Badanie lekowrażliwości
Rutynowe badanie lekowrażliwości szczepów izolowanych z gardła zazwyczaj
nie jest wymagane, a nawet może okazać sie˛ myla˛ce. W wie˛kszości bakteryjnych
zakażeń gardła czynnikami etiologicznymi sa˛ S. pyogenes i C. diphtheriae,
a lekiem z wyboru w antybiotykoterapii sa˛ benzylopenicylina i erytromycyna.
W przypadku błonicy wskazane jest również leczenie antytoksyna˛.
1
Begg N.: Manual for the menagement and control of diphtheria in the European region.
Copenhagen, WHO Regional Office for Europe, 1994.
78
Zakażenia dolnych dróg
oddechowych
Wprowadzenie
Zakażenia dolnych dróg oddechowych wyste˛puja˛ poniżej poziomu krtani, np.
w tchawicy, oskrzelach lub tkance płucnej (zapalenie tchawicy, zapalenie
oskrzeli, ropień płuca, zapalenie płuc). Czasami w zapaleniu płuc zakażeniem
obje˛ta jest przyległa błona pokrywaja˛ca płuca, w konsekwencji pojawia sie˛
zgrubienie opłucnej (zapalenie opłucnej) i płyn w jamie opłucnej (wysie˛k
opłucnej).
Specyficzna˛ forma˛ zakażenia dolnych dróg oddechowych jest gruźlica płucna,
która wyste˛puje powszechnie w wielu krajach. Pacjent kaszla˛c może uwalniać
aerozol zawieraja˛cy pra˛tki gruźlicy (Mycobacterium tuberculosis), które moga˛
zostać zainhalowane przez innych ludzi. Taka forma choroby (,,czynna’’ gruźlica)
szybko szerzy sie˛ z osoby na osobe˛ i dlatego zaliczana jest do niebezpiecznych
chorób zakaźnych.
Wielu pacjentów z zakażeniem dolnych dróg oddechowych odkrztusza ropna˛
(zawieraja˛ca˛ rope˛) wydzieline˛, która zwykle ma zielony lub żółtawy kolor; taka
plwocina może być posiewana, badana makroskopowo i mikroskopowo.
W niektórych zakażeniach plwociny jest bardzo niewiele lub nie obserwuje sie˛ jej
wcale: choroba legionistów (wywołana przez Legionella pneumophila), zapalenie
płuc wywołane przez Mycoplasma pneumoniae (,,pierwotne atypowe zapalenie
płuc’’) i zapalenie płuc wywołane przez chlamydie. Choroby te wymagaja˛
specjalnych metod diagnostycznych (serologia, izolacja na specjalnych podłożach) i nie be˛da˛ omawiane w niniejszym opracowaniu. Poza gruźlica˛ płuc (patrz
poniżej) wie˛kszość badań mikrobiologicznych plwociny dotyczy pacjentów
z infekcjami dróg oddechowych, u których wyste˛puje ropna plwocina.
Najcze˛stsze postacie kliniczne zakażeń
Ostre i przewlekłe zapalenie oskrzeli
U pacjentów z ostrym zapaleniem oskrzeli (rozwijaja˛cym sie˛ najcze˛ściej po ostrej
infekcji wirusowej, takiej jak typowe przezie˛bienie czy grypa) zwykle nie
wykonuje sie˛ posiewu plwociny, chyba że stan kliniczny pacjenta sie˛ nie
poprawia.
Przewlekłe zapalenie oskrzeli jest długotrwaja˛ca˛ choroba˛ upośledzaja˛ca˛ funkcje˛
układu oddechowego, która przebiega z okresowymi zaostrzeniami. Wie˛kszość
pacjentów codziennie wykrztusza szara˛, śluzowa˛ plwocine˛; w trakcie choroby
wyste˛puja˛ epizody pogorszenia stanu pacjenta i wykrztuszania wyraźnie ropnej
plwociny. Jest to tak zwane zaostrzenie przewlekłego zapalenia oskrzeli.
W próbkach plwociny cze˛sto obecne sa˛ typowe patogeny układu oddechowego
(Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae lub — rzadziej — Moraxella (Branhamella) catarrhalis).
79
ZAKAŻENIA DOLNYCH DRÓG ODDECHOWYCH
Ropień płuca
Ropień płuca może uformować sie˛ w naste˛pstwie aspiracji ciała obcego,
zawartości żoła˛dka lub wydzieliny górnych dróg oddechowych (jama ustna lub
gardło). Ten stan niekiedy jest określany terminem ,,aspiracyjnego zapalenia
płuc’’. Można podja˛ć próbe˛ hodowli z odkrztuszonej plwociny (która zwykle ma
wyja˛tkowo brzydki zapach), lecz — jeśli obecny jest ropień (uwidoczniony
w badaniu radiologicznym) — materiałem do badań powinna być zawarta w nim
ropa, która˛ należy wykorzystać do badania mikroskopowego i posiewu. Niestety
brak jest wytycznych dotycza˛cych sposobu jej uzyskania, choć jedna˛z możliwości
jest bezpośrednia biopsja i usunie˛cie ropy. Cze˛stym i ważnym czynnikiem
etiologicznym sa˛ bakterie beztlenowe, takie jak Prevotella melaninogenica
(wcześniej Bacteroides melaninogenicus) i Peptostreptococcus spp., pochodza˛ce
z flory jamy ustnej i gardła. Należy pobrać rope˛, dostarczyć do laboratorium
i opracować zgodnie ze standardowymi metodami hodowli bakterii beztlenowych
z ropy (patrz str. 104 i str. 117).
Zapalenie płuc oraz zapalenie oskrzeli i płuc
Ostre płatowe zapalenie płuc zwykle dotyczy pojedynczego płata płuca. Prawie
zawsze wywoływane jest przez S. pneumoniae. Ta postać zapalenia pojawia sie˛
epidemicznie. Przyczyna˛ rzadziej wyste˛puja˛cej podobnej formy zapalenia płuc
jest Klebsiella pneumoniae.
Klasyczna postać zapalenia płuc rozwija sie˛ u niewielu pacjentów zakażonych
S. pneumoniae lub K. pneumoniae, cze˛stsza˛ forma˛ choroby jest zapalenie oskrzeli
i płuc z plamkami naciekowymi i zapalnymi (określanymi jako ,,konsolidacja’’),
rozproszonymi w jednym lub cze˛ściej w obu płucach.
Z zapaleniem oskrzeli i płuc zwia˛zanych jest wiele różnych czynników wirusowych i bakteryjnych. Poza S. pneumoniae i niekiedy H. influenzae, przyczyna˛
zapalenia oskrzeli i płuc, zwłaszcza podczas epidemii grypy lub odry, jest
Staphylococcus aureus. Cze˛sto także stwierdza sie˛ obecność Gram-ujemnych
pałeczek (szczególnie E. coli i K. pneumoniae) oraz Pseudomonas aeruginosa.
Zakażenia te wyste˛puja˛ powszechnie na oddziałach intensywnej terapii, zwłaszcza w trakcie stosowania antybiotyków o szerokim spektrum działania lub przy
prowadzeniu wentylacji mechanicznej i sa˛ efektem nadmiernego zużycia antybiotyków oraz niewłaściwego monitorowania wczesnych objawów infekcji
u pacjentów.
W przypadku wysta˛pienia wysie˛ku w jamie opłucnej płyn należy zbadać
mikroskopowo i wykonać posiew zgodnie z procedura˛ opisana˛ dla ropy
i wysie˛ków.
Gruźlica płuc
Plwocina pacjentów z gruźlica˛ płuc zwykle nie jest wyraźnie ropna, niemniej
ropny charakter nie jest przeciwwskazaniem do jej wykorzystania w diagnostyce
gruźlicy. Wybarwione preparaty (metoda˛ Ziehl-Neelsena) należy obejrzeć w mikroskopie w celu szybkiej identyfikacji pacjentów z obecnościa˛ kwasoopornych
80
CZE˛ŚĆ I
bakterii w plwocinie1. Po wykonaniu preparatu plwocina powinna zostać poddana
procedurze dekontaminacji (patrz str. 85) w celu zniszczenia możliwie najwie˛kszej liczby niepra˛tkowych drobnoustrojów i zachowania żywych pra˛tków gruźlicy
do posiewu na podłoże Löwensteina-Jensena.
Ponieważ procedury bakteriologicznej diagnostyki ropnych infekcji dróg oddechowych, takich jak zapalenie oskrzeli i zapalenia płuc, zasadniczo różnia˛ sie˛
od procedur stosowanych w gruźlicy, zostana˛ one omówione oddzielnie. Lekarz
w skierowaniu do laboratorium musi jasno określić kierunek badań:
• bakterie ropotwórcze (H. influenzae, S. pneumoniae i in.),
• pra˛tki gruźlicy (M. tuberculosis),
• obydwa typy bakterii.
Pobieranie próbek plwociny
Pobieranie odpowiednich próbek plwociny jest sztuka˛ sama˛ w sobie i zostało
opisane w innych opracowaniach2. Badanie źle pobranej próbki plwociny może
dać fałszywe wyniki z powodu zanieczyszczenia próbki bakteriami wchodza˛cymi
w skład naturalnej flory jamy ustnej i gardła; ,,plwocina’’ zawieraja˛ca śline˛
i cza˛stki pożywienia nie powinna być badana.
Próbke˛ plwociny należy pobrać do sterylnego pojemnika z szerokim wlotem oraz
z bezpiecznym, szczelnym zamknie˛ciem i niezwłocznie przesłać do laboratorium.
Opóźnione przesłanie plwociny po pobraniu może spowodować przerost próbki
zanieczyszczaja˛cymi ja˛ bakteriami i prowadzi do otrzymania myla˛cych wyników
barwienia i hodowli. Z tego powodu nie zaleca sie˛ przesyłania próbek do
laboratorium poczta˛. Wyja˛tek stanowia˛ próbki pobrane do badań w kierunku
gruźlicy, które moga˛ być przesyłane do lokalnych lub regionalnych laboratoriów.
Należy ściśle przestrzegać lokalnych i państwowych przepisów, dotycza˛cych
przesyłania zakaźnego (patogennego) materiału.
Opracowanie plwociny w laboratorium
(w zakażeniach niegruźliczych)
Po pobraniu plwocina musi zostać natychmiast opracowana lub umieszczona
w chłodziarce.
Ocena makroskopowa
Należy odnotować ocene˛ makroskopowa˛ plwociny. Możliwe opisy obejmuja˛:
ropna, zielona
ropna, żółta
śluzowo-ropna (tj. cze˛ściowo śluzowa i cze˛ściowo ropna)
1
Patrz Manual of basic techniques for a health laboratory, 2nd ed. Geneva, World Health
Organization, 2003.
2
Specimen collection and transport for microbiological investigation. Alexandria, WHO Regional
Office for the Eastern Mediterranean, 1995 (WHO Regional Publicatinos, Eastern Mediterranean
Series 8).
Manual of basic techniques for a health laboratory, 2nd ed. Geneva World Health Organization, 2003.
Technical guide for sputum examination for tuberculosis by direct microscopy. Bulletin of the
International Union Against Tuberculosis and Lung Disease, 4th ed. 1996.
81
podbarwiona krwia˛
podbarwiona krwia˛, z zielonymi kłaczkami
*szara, śluzowa
*szara, spieniona
*biała, śluzowa
*biała, spieniona
*biała, śluzowa z cza˛stkami pożywienia
*wodnista (tj. obecna tylko ślina)
*wodnista z cza˛stkami pożywienia
Próbki oznaczone gwiazdkami nie powinny być badane w kierunku zakażeń
niegruźliczych.
Preparat barwiony metoda˛ Grama należy przygotować z próbki ropnej lub
śluzowo-ropnej plwociny.
Jeśli nie obserwuje sie˛ śladów ropy (np. w próbce szarej, śluzowej plwociny),
barwienie metoda˛ Grama może wykazać jedynie obecność dużych komórek
nabłonka płaskiego, cze˛sto pokrytych masa˛ przylegaja˛cych bakterii. Jest to
wskazówka, że próbka zawiera głównie wydzieline˛ jamy ustnej lub gardła i nie
powinno sie˛ prowadzić hodowli, której wyniki be˛da˛niewiarygodne czy też bardzo
myla˛ce. Zaleca sie˛ rezygnacje˛ z hodowli w przypadku, gdy próbka zawiera mniej
niż 10 neutrofilów wieloja˛drzastych na 1 komórke˛ nabłonka1.
U wielu pacjentów z ostra˛ infekcja˛ oddechowa˛ (np. zapalenie płuc) i ropna˛
plwocina˛ natychmiastowe wykonanie preparatu barwionego metoda˛ Grama może
pomóc klinicyście w wyborze antybiotykoterapii. Możliwe wyniki to:
• Gram-dodatnie dwoinki otoczone pusta˛ przestrzenia˛ z powodu niezabarwionych otoczek (podejrzenie S. pneumoniae);
• małe Gram-ujemne krótkie pałeczki (prawdopodobnie H. influenzae);
• Gram-ujemne dwoinki, widoczne wewna˛trz- i zewna˛trzkomórkowo (podejrzenie Moraxella catarrhalis);
• Gram-dodatnie ziarenkowce w skupiskach, przypominaja˛cych grona (podejrzenie S. aureus);
• Gram-ujemne pałeczki (podejrzenie obecności Enterobacteriaceae lub Pseudomonas spp.);
• duże Gram-dodatnie drożdżopodobne komórki cze˛sto z grzybnia˛ (wskazuja˛ na
obecność Candida spp.).
Procedury hodowli i interpretacja
Jeśli mikroskopowo próbka przedstawia akceptowalna˛ jakość plwociny, wybrać
fragment ropnego materiału (lub najbardziej przypominaja˛cego ropny) używaja˛c
sterylnej wymazówki lub ezy i posiać na różne podłoża hodowlane.
1
Heinemann H.S., Radano R.R.: Acceptability and cost savings of selective sputum microbiology in
a community teaching hospital. Journal of Clinical Microbiology, 1979, 10: 567 – 573.
82
CZE˛ŚĆ I
Sugerowany zestaw podłoży obejmuje:
• agar z krwia˛ z rozmazem S. aureus, ułatwiaja˛cym satelitarny wzrost H. influenzae i z kra˛żkiem zawieraja˛cym optochine˛, umieszczonym w centrum
rozsiewu,
• agar czekoladowy,
• agar MacConkeya.
Płytki z agarem z krwia˛ i z agarem czekoladowym należy inkubować w 35 – 36°C
w atmosferze wzbogaconej dwutlenkiem we˛gla (np. eksykator), a płytke˛
MacConkeya w powietrzu atmosferycznym.
Jeśli w barwionym preparacie obecne sa˛ skupiska Gram-dodatnich ziarenkowców, przypominaja˛ce kształtem winogrona, zaleca sie˛ wykorzystanie dodatkowo
płytki agarowej z mannitolem (MSA). Obecność Gram-dodatnich drożdżopodobnych struktur może być wskazaniem do posiewu na podłoże Sabouraud (dla
którego konieczna jest inkubacja przez co najmniej 3 dni w 35 – 37°C). Posiew na
podłoża MSA i Sabouraud nie musi być wykonywany rutynowo dla wszystkich
próbek plwociny.
Posiewy powinny być odczytywane po całonocnej inkubacji (18 godzin),
a reinkubacja przez dodatkowe 24 godziny jest wskazana, jeśli wzrost jest słabszy
niż oczekiwany na podstawie obserwacji mikroskopowych lub gdy obecne sa˛
bardzo drobne kolonie.
Typowe wyniki obserwacji przedstawiono poniżej:
• Płaskie, jasne kolonie z wgłe˛bionymi środkami i strefa˛ zielonej (α-) hemolizy
oraz strefa˛ zahamowania wzrostu wokół kra˛żka z optochina˛ moga˛ wskazywać
na S. pneumoniae. Jeśli odczyt testu z kra˛żkiem z optochina˛ w pierwszym
posiewie nie jest rozstrzygaja˛cy, należy powtórzyć test na przesiewie. Nie
można zapominać, że w fizjologicznej florze jamy ustnej i gardła wyste˛puja˛
inne α-hemolizuja˛ce szczepy (wspólnie nazywane paciorkowcami zielenieja˛cymi).
• Drobne, kropelkowe kolonie rosna˛ce na płytce agarowej z krwia˛ w postaci
niehemolizuja˛cych kolonii satelitarnych i znacznie wie˛ksze kolonie na płytce
agaru czekoladowego lub agaru z krwia˛ sugeruja˛ obecność H. influenzae.
Kolonie te najcze˛ściej sa˛ liczne, zwykle ponad 20 na płytce. Niektóre
laboratoria dla potwierdzenia identyfikacji wykonuja˛ testy z czynnikami
wzrostu X i V, które jednak wymagaja˛ uważnej kontroli. Serologiczne
typowanie szczepów izolowanych z układu oddechowego najcze˛ściej nie jest
przydatne, ponieważ wie˛kszość z nich jest ,,szorstka’’ i nie podlega typowaniu.
• Kruche, suche, szarobiałe kolonie na płytkach agaru z krwia˛ lub agaru
czekoladowego, które można przesuwać w całości za pomoca˛ ezy, moga˛
wskazywać na M. catarrhalis. Jeśli istnieje potrzeba, można przeprowadzić
testy rozkładu cukrów (wszystkie wyniki testów ujemne), ale wie˛kszość
laboratoriów ich nie wykonuje. Drobnoustroje Moraxella sa˛silnie oksydazododatnie, a wygla˛d ich kolonii i obraz mikroskopowy sa˛bardzo charakterystyczne.
Jakkolwiek morfologicznie Moraxella przypomina Neisseria spp., do różnicowania można użyć testu z trójmaślanem glicerolu, który jest hydrolizowany
przez Moraxella.
• Średniej wielkości, złotoszare kolonie tworzone sa˛ przez S. aureus. Testy
koagulazowy i test fermentacji mannitolu sa˛ dodatnie, choć szkiełkowy odczyn
koagulacji (odczyn ,,zwia˛zanej’’ koagulazy) jest czasami ujemny. Jeśli istnieje
sprzeczność mie˛dzy wygla˛dem kolonii i testem szkiełkowym, należy przeprowadzić probówkowy test koagulazy (,,wolna’’ koagulaza).
83
• Kolonie na agarze MacConkeya sugeruja˛ obecność Enterobacteriaceae lub
Pseudomonas spp. lub Acinetobacter spp.
• Białawe, okra˛głe, matowe kolonie na agarze z krwia˛ i agarze czekoladowym
moga˛ wskazywać na Candida albicans, który be˛dzie również rosna˛ć po 3 – 4
dniach na podłożu Sabouraud.
Warto podkreślić, że pojedyncze kolonie każdego z powyższych organizmów
pochodza˛z flory naturalnej układu oddechowego lub sa˛wynikiem kolonizacji (np.
bakterie jelitowe, grzyby). Ponieważ nie maja˛ wpływu na poste˛powanie z pacjentem, nie należy uwzgle˛dniać ich w wyniku lub, jeżeli zostana˛ uwzgle˛dnione,
zaznaczyć, że jest to flora kolonizuja˛ca.
Badanie lekowrażliwości należy wykonywać tylko dla drobnoustrojów dominuja˛cych w hodowli, natomiast nie ma takiej potrzeby w przypadku szczepów
obecnych w posiewie jedynie w niewielkiej liczbie.
Interpretacje˛ niektórych uzyskiwanych wyników przedstawiono w tabeli 20.
Tabela 20. Interpretacja wyników testów wrażliwości dla bakterii o wyższych wymaganiach odżywczycha
Średnica strefy (mm)
Oporny
Średnio wrażliwy
Wrażliwy
2 19b
—
1 20
Tetracyklina (30 µg)
2 18
19 – 22
1 22
Erytromycyna (15 µg)
2 15
16 – 20
1 21
Chloramfenikol (30 µg)
2 20
—
1 21
Kotrimoksazol (25 µg)
2 15
16 – 18
1 19
Tetracyklina (30 µg)
2 14
15 – 18
1 19
Erytromycyna (15 µg)
Kotrimoksazol (25 µg)
2 13
2 10
14 – 22
11 – 15
1 23
1 16
S. pneumoniae (podłoże Mueller-Hintona z 5% krwi baraniej, inkubacja
w 5% CO2)
Oksacylina (1 µg) (dla benzylopenicyliny)
M. catarrhalis (podłoże Mueller-Hintona)
a
b
National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Performance standards for
antimicrobial susceptibility testing. M100-S8. Vol 18, 1998.
Oporny lub średnio wrażliwy.
W badaniu lekowrażliwości pałeczek Enterobacteriaceae i gronkowców należy
wykorzystać standaryzowana˛ metode˛ dyfuzyjno-kra˛żkowa˛ (Kirby-Bauera). Wrażliwość szczepów S. pneumoniae na tetracykline˛, chloramfenikol, erytromycyne˛
i benzylopenicyline˛ powinna być oceniana na agarze Mueller-Hintona, wzbogaconym 5% krwia˛ bydle˛ca˛. Można również użyć zwykłego agaru z krwia˛.
Wrażliwość na benzylopenicyline˛ lepiej oznaczyć używaja˛c kra˛żka zawieraja˛cego 1 µg oksacyliny, który wykazuje wie˛ksza˛ zgodność z wartościami MIC dla
benzylopenicylin; jest również bardziej stabilny. Kra˛żki zawieraja˛ce benzylopenicyline˛ moga˛ szybko ulegać dezaktywacji w wyższych temperaturach, co powoduje uzyskanie niewiarygodnych wyników.
84
CZE˛ŚĆ I
Dla szczepów H. influenzae należy określić zdolność wytwarzania β-laktamaz,
np. za pomoca˛ testu z nitrocefina˛. Nie wytwarzaja˛ce β-laktamaz H. influenzae
rzadko wykazuja˛ oporność na ampicyline˛. W zwia˛zku z powyższym nie zaleca sie˛
oznaczania wrażliwości metoda˛ dyfuzyjno-kra˛żkowa˛.
Izolaty M. catarrhalis powinny być badane w kierunku wytwarzania β-laktamaz.
Dodatkowo można oznaczyć wrażliwość na tetracykline˛ i erytromycyne˛.
Dla Candida albicans należy ocenić wrażliwość na wszystkie leki przeciwgrzybicze.
Wie˛kszość laboratoriów przedstawia półilościowe wyniki hodowli bakteryjnych
na podłożach stałych, które można określić jako:
(+) = kilka kolonii
+
= słaby wzrost
++ = średnio intensywny wzrost
+++ = intensywny wzrost.
Hodowla Mycobacterium tuberculosis
Poza przygotowaniem preparatu bezpośredniego barwionego metoda˛ dla bakterii
kwasoopornych, zawsze gdy istnieje kliniczne podejrzenie choroby, materiał
(zwykle, choć nie zawsze, plwocina) należy posiać w kierunku M. tuberculosis.
Niektórzy pacjenci z podejrzeniem gruźlicy płuc moga˛ nie odkrztuszać plwociny.
Wytwarzana przez nich niewielka ilość plwociny jest natychmiast połykana.
W takiej sytuacji lekarz powinien pobrać próbke˛ soku żoła˛dkowego na czczo
(zwykle wcześnie rano) i zneutralizowana˛ wodorowe˛glanem sodu (100 mg)
przesłać do laboratorium. Sok żoła˛dkowy należy traktować w ten sam sposób jak
plwocine˛. Wykonywanie posiewów w kierunku pra˛tków gruźlicy wszystkich
pobranych próbek plwociny jest drogie i (chociaż pozwala zdiagnozować
pacjentów bez podejrzenia gruźlicy) nie zalecane rutynowo.
Procedura przygotowania próbki do badania
Plwocina pochodza˛ca od pacjentów z infekcja˛ gruźlicza˛ cze˛sto zawiera fragmenty
tkanki płucnej, które, jeśli sa˛obecne, należy pobrać na posiew. Plwocina gruźlicza
wykrztuszana jest przez jame˛ ustna˛i gardło, dlatego zanieczyszczenie próbki flora˛
fizjologiczna˛ gardła jest nieuniknione. Bakterie zanieczyszczaja˛ce próbke˛ musza˛
zostać zniszczone, aby nie doszło do przerostu podłoża Löwensteina-Jensena.
Procedura przygotowania próbki (zage˛szczenie–trawienie–dekontaminacja) obowia˛zuje w przypadku każdej próbki pobranej z miejsca wyste˛powania flory
fizjologicznej. Szeroko stosowane sa˛ trzy procedury z użyciem:
– wodorotlenku sodu (NaOH) (Petroff);
– wodorotlenku sodu N-acetyl-L-cysteiny (NALC-NaOH);
– Zephiranu i fosforanu trójsodowego.
Procedura z użyciem wodorotlenku sodu (Petroff)
Procedura ta pozwala na eliminacje˛ zanieczyszczaja˛cych mikroorganizmów,
a ponadto umożliwia upłynnienie niekiedy śluzowej plwociny. Wodorotlenek
85
sodu jest toksyczny również dla pra˛tków, dlatego w trakcie wykonywania metody
należy upewnić sie˛, że:
– końcowe ste˛żenie NaOH nie przekracza 2%;
– pra˛tki gruźlicze nie sa˛ eksponowane na wodorotlenek sodu dłużej niż przez
30 minut, wliczaja˛c czas wirowania.
1. Wymieszać równe obje˛tości plwociny i 4% wodorotlenku sodu 40 g/l
(uprzednio poddanego sterylizacji w autoklawie) w sterylnej, szczelnej,
50-mililitrowej szklanej butelce lub plastikowej stożkowatej probówce wirówkowej.
2. Inkubować w temperaturze pokojowej (25 – 30°C) przez 15 minut, delikatnie
wstrza˛sać mieszanine˛ w mechanicznym mieszadle przez 5 minut. W gora˛cym
klimacie potrzebne może być schłodzenie lub skrócenie czasu reakcji do
10 – 15 minut.
3. Odwirować lub uzupełnić mieszanine˛ do 50 ml destylowana˛woda˛lub buforem
fosforanowym (pH 6,8), hamuja˛c działanie NaOH.
4. Po 15 minutach odwirować w 3000 g przez 15 minut. Ostrożnie zlać
supernatant do pojemnika wypełnionego odpowiednim środkiem dezynfekuja˛cym (na bazie fenolu lub aldehydu glutarowego). Zneutralizować osad
wkraplaja˛c 2 mol/l roztworu HCl zawieraja˛cego 2% czerwień fenolowa˛,
poła˛czyć, wstrza˛saja˛c do chwili, gdy kolor zmieni sie˛ trwale z czerwonego na
żółty. Alternatywnie: dodać krople˛ roztworu wskaźnikowego, a naste˛pnie
dodawać po kropli HCl cia˛gle mieszaja˛c.
5. Jeśli posiew na podłoże be˛dzie wykonywany natychmiast, zawiesić zneutralizowany osad w 1 – 2 ml sterylnego 0,85% NaCl lub sterylnej wody
destylowanej. W innym przypadku zawiesić osad w 1 – 2 ml sterylnej frakcji
V albumin bydle˛cych.
Procedura z użyciem wodorotlenku sodu
N-acetyl-L-cysteiny
Niższe ste˛żenie NaOH w obecności czynników mukolitycznych, takich jak
N-acetyl-L-cysteina (NALC), jest mniej agresywne wobec pra˛tków gruźlicy.
Zarówno czas inkubacji, jak i temperatura nie maja˛tak kluczowego znaczenia, jak
w przypadku procedury z NaOH. Krótki, nie przekraczaja˛cy 24 godzin, czas
przechowywania aktywnego roztworu NALC-NaOH wymaga przeprowadzenia
procedury w cia˛gu jednego dnia.
1. Poła˛czyć równe obje˛tości roztworu cytrynianu sodu (29 g dwuwodzianu
cytrynianu sodu na litr wody destylowanej) oraz 4% wodorotlenku sodu
(40 g/l) i autoklawować mieszanine˛. Roztwór może być przechowywany
w temperaturze pokojowej.
2. Tuż przed użyciem dodać 0,5 g NALC do 100 ml roztworu zawieraja˛cego
NaOH i cytrynian sodu.
3. W zależności od liczby próbek przeznaczonych do dekontaminacji przygotować 2,5 g NALC w 500 ml roztworu NaOH i cytrynianu sodu lub 5 g NALC
w 1000 ml roztworu NaOH i cytrynianu sodu. Odczynniki sa˛ przydatne do
badania przez 24 godziny.
4. Do próbki umieszczonej w sterylnej, szczelnej, 50-mililitrowej szklanej butelce lub plastikowej stożkowej probówce wirówkowej dodać
równa˛ obje˛tość aktywnego roztworu NALC-NaOH. Ostrożnie dokre˛cić
86
CZE˛ŚĆ I
zakre˛tke˛, odwrócić probówke˛ i wstrza˛sać delikatnie, nie dłużej niż 30
sekund.
5. Pozostawić na 15 minut w temperaturze pokojowej (20 – 25°C).
6. Uzupełnić mieszanine˛ do 50 ml woda˛ destylowana˛ lub 67 mmol/l buforem
fosforanowym (pH 6,8) w celu zahamowania działania NaOH. Ostrożnie zlać
supernatant do pojemnika wypełnionego odpowiednim środkiem dezynfekuja˛cym (na bazie fenolu lub aldehydu glutarowego).
7. Jeśli posiew na podłoże be˛dzie wykonywany natychmiast, zawiesić osad
w 1 – 2 ml sterylnego 0,85% NaCl lub sterylnej wody destylowanej. W innym
przypadku zawiesić osad w 1 – 2 ml sterylnej frakcji V albumin bydle˛cych.
Procedura z użyciem fosforanu trójsodowego
Pra˛tki moga˛ przeżyć mimo przedłużonego poddawania ich tej łagodnej procedurze. Dlatego czas inkubacji i temperatura nie sa˛ restrykcyjne.
1. Przygotować roztwór 1 kg trójfosforanu sodu (Na3 PO4 ·12H 2O) w 4 litrach
gora˛cej wody destylowanej, dodać 7,5 ml 17% chlorku benzylidenu (Zephiran), dobrze wymieszać i przechowywać w temperaturze pokojowej.
2. Wymieszać równe obje˛tości plwociny (do 10 ml) z roztworem Zephiranu
i fosforanu trójsodowego w 50-mililitrowej, sterylnej, szczelnej, szklanej
probówce wirówkowej. Dokre˛cić zakre˛tke˛ i wytrza˛sać energicznie przez
30 minut.
3. Odstawić mieszanine˛ na dodatkowe 30 minut.
4. Odwirować w 3000 g przez 15 minut. Ostrożnie zlać supernatant do pojemnika
wypełnionego odpowiednim środkiem dezynfekuja˛cym (na bazie fenolu lub
aldehydu glutarowego) i ponownie zawiesić osad w 20 ml neutralizuja˛cego
buforu fosforanowego, pH 6,61.
5. Odwirować ponownie w 3000 g przez 15 minut. Zlać supernatant, a osad posiać
na podłoże.
Hodowla
1. Posiać 3 krople (około 0,1 ml) osadu na co najmniej trzy probówki z podłożem
Löwensteina-Jensena lub inne.
2. Sprawdzać regularnie wskaźnik zanieczyszczenia inkubowanych podłoży
i notować liczbe˛ zanieczyszczonych płytek.
Wskaźnik zanieczyszczenia powinien wynosić 3 – 5%. Wyższy wskaźnik (ponad
5%) zanieczyszczonych hodowli na podłożu Löwensteina-Jensena zwykle wskazuje na niewystarczaja˛ca˛ skuteczność procedury dekontaminacji. Wskaźnik
zanieczyszczenia < 3% sugeruje, że procedura dekontaminacji została przeprowadzona zbyt intensywnie i obecne w próbce pra˛tki moga˛ nie wyrosna˛ć.
1
Przygotowanie neutralizuja˛cego buforu fosforanowego 67 mmol/l.
Roztwór podstawowy:
A. Rozpuścić 9,47 g nieuwodnionego fosforanu sodu w 1 litrze wody destylowanej.
B. Rozpuścić 9,07 g nieuwodnionego fosforanu potasu w 1 litrze wody destylowanej.
Dla buforu o pH 6,8: zmieszać 50 ml roztworu podstawowego A z 50 ml roztworu podstawowego B.
Dla buforu o pH 6,6: zmieszać 37,5 ml roztworu podstawowego A z 62,5 ml roztworu
podstawowego B.
Sprawdzić pH. Jeśli potrzeba, dodać roztworu A, aby podnieść pH, lub roztworu B, aby
obniżyć pH.
87
Interpretacja hodowli M. tuberculosis
Probówki z podłożem Löwensteina-Jensena powinny być inkubowane przez
2 – 3 dni w 35 – 37°C w pozycji poziomej, z odkre˛cona˛ o pół obrotu nakre˛tka˛.
Naste˛pnie hodowle należy inkubować w temperaturze 37°C przez 6 tygodni
i obserwować wzrost w cotygodniowych odste˛pach czasu. Podczas tej kilkutygodniowej obserwacji każdy pojawiaja˛cy sie˛ wzrost bakterii powinien zostać
odnotowany. Przygotować preparat barwiony metoda˛ Ziehl-Neelsena. Jeśli
mikroorganizmy nie sa˛ kwasoopornymi bakteriami, hodowle˛ można uznać za
zanieczyszczona˛.
Typowe ludzkie szczepy Mycobacterium tuberculosis maja˛ ,,szorstkie, twarde
i płowożółte’’ kolonie, czasem widoczne już po 2 – 3 tygodniach inkubacji (rzadko wcześniej). Kolonie szczepów bydle˛cych (M. bovis) sa˛ zwykle gładkie
i białawokremowe. Inne, zwykle niepatogenne gatunki mykobakterii moga˛rosna˛ć
szybciej (niekiedy już po kilku dniach), wytwarzaja˛c — lub nie — pigmenty
(czerwony, żółty lub pomarańczowy). Jeśli szczep tworzy kolonie o typowym
wygla˛dzie i barwienie Ziehl-Neelsena preparatu z hodowli potwierdza obecność
kwasoopornych pra˛tków, w wyniku należy podać: ,,Mycobacterium spp., prawdopodobnie M. tuberculosis’’; izolaty należy przesłać do referencyjnego laboratorium krajowego lub lokalnego w celu potwierdzenia identyfikacji i oznaczenia
lekowrażliwości izolowanych szczepów.
Podstawowe zasady bezpieczeństwa
Z plwocina˛ należy zawsze poste˛pować bardzo uważnie i używać szczelnych
pojemników na próbki. Jest to bardzo ważne, zwłaszcza gdy konieczne jest
przesłanie próbek poczta˛. Zaleca sie˛, aby wszystkie procedury poste˛powania
z plwocina˛ (nawet jeśli na skierowaniu nie ma informacji o gruźlicy) były
przeprowadzane w bakteriologicznie bezpiecznych warunkach. Zaleca sie˛, aby
laboratorium przeprowadzaja˛ce badania próbek prawdopodobnie zawieraja˛cych
pra˛tki gruźlicy spełniało wymagania bezpieczeństwa biologicznego przynajmniej
na poziomie 21.
Szczególna˛ uwage˛ należy zachować podczas otwierania, zamykania i wstrza˛sania
butelek oraz podczas wirowania materiału. Tworzenie skażonego aerozolu może
być niebezpieczne dla personelu, dlatego należy przestrzegać właściwych
procedur medycyny pracy2.
Pocztowy transport hodowli M. tuberculosis do referencyjnego laboratorium
krajowego wymaga szczególnej ostrożności z powodu ryzyka ewentualnego
wypadku lub uszkodzenia pojemnika. Należy używać jedynie pojemników
i materiałów wysyłkowych uznanych za bezpieczne i dostosowanych do wymagań poczty.
1
Manual of basic techniques for a health laboratory, 2nd ed. Geneva, World Health Organization,
2003.
2
Laboratory services in tuberculosis control Part I: Organization and management. Geneva, World
Health Organization, 1998 (niepublikowane dokumenty WHO/TB/98.258).
88
CHOROBY PRZENOSZONE DROGA˛ KONTAKTÓW SEKSUALNYCH
Choroby przenoszone droga˛
kontaktów seksualnych
Wprowadzenie
W cia˛gu ostatnich dwudziestu lat ogromnie wzrosła liczba drobnoustrojów
przenoszonych droga˛ kontaktów seksualnych oraz zwia˛zanych z nimi objawów
klinicznych. W tabeli 21 wymienione zostały wybrane mikroorganizmy przenoszone droga˛ płciowa˛ i wywoływane przez nie choroby. Diagnostyka niektórych
z nich stanowi ważne wyzwanie dla klinicznego laboratorium mikrobiologicznego. Diagnostyka laboratoryjna jest istotnym elementem w poste˛powaniu
z pacjentem, w kontroli takich chorób, jak rzeża˛czka czy kiła, i ma znaczenie nie
tylko dla pacjenta, ale także dla jego partnera seksualnego.
W rozdziale zostanie krótko przedstawiona identyfikacja najcze˛ściej pojawiaja˛cych sie˛ mikroorganizmów przenoszonych droga˛ seksualna˛, wyste˛puja˛cych
Tabela 21. Wybrane mikroorganizmy przenoszone droga˛ płciowa˛ i towarzysza˛ce im
objawy
Czynnik etiologiczny
Objaw
Zapalenie gruczołu przedsionkowego wie˛kszego (Bartholina),
zapalenie szyjki macicy, zapalenie kosmówkowo-owodniowe, zapalenie spojówek, uogólniona infekcja gonokokowa
(zapalenie stawów, skóry, pochewek ście˛gnistych), zapalenie
endometrium, zapalenie naja˛drzy, bezpłodność, zapalenie
gardła, przedpokwitaniowe zapalenie pochwy, zapalenie torebki wa˛troby, zapalenie odbytu, zapalenie prostaty, zapalenie jajowodów, zapalenie cewki moczowej
Chlamydia trachomatis Zapalenie gruczołu przedsionkowego wie˛kszego (Bartholina),
(serotypy D – K)
zapalenie szyjki macicy, zapalenie spojówek u noworodków,
zapalenie endometrium, zapalenie naja˛drzy, zapalenie płuc
u noworodków, bezpłodność, zapalenie ucha środkowego
u niemowla˛t, zapalenie narza˛dów miednicy, zapalenie torebki
wa˛troby, przedpokwitaniowe zapalenie pochwy, zapalenie
odbytu, zespół Reitera, zapalenie jajowodów, zapalenie cewki
moczowej
Chlamydia trachomatis Ziarniniak weneryczny
(serotypy L1, L2, L3)
Treponema pallidum
Kiła
Haemophilus ducreyi
Wrzód mie˛kki
Calymmatobacterium
granulomatis
Ziarniniak pachwinowy (donovanosis)
Mobiluncus spp.
Bakteryjna waginoza
Ludzki (alfa) wirus opryszczki (HSV1 i HSV2)
Opryszczka narza˛dów płciowych oraz warg i jamy ustnej,
zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, opryszczka noworodków, zapalenie odbytu
Wirus cytomegalii (CMV) Zakażenie wrodzone
Ludzki
Papillomavirus Rak szyjki macicy, kłykciny wirusowe
(HPV)
Ludzki wirus nabytego Zespół nabytego niedoboru odporności (AIDS) oraz choroby
niedoboru odporności
towarzysza˛ce AIDS
(HIV)
Wirus zapalenia wa˛troby
typu B (HBV)
Wirusowe zapalenie wa˛troby typu B
Gardnerella vaginalis
Zapalenie cewki moczowej, zapalenie pochwy
Candida albicans
Zapalenie żołe˛dzi i napletka, zapalenie sromu i pochwy
89
w próbkach pochodza˛cych z żeńskich i me˛skich dróg moczowo-płciowych.
Czynniki wirusowe i bakteryjne, takie jak: Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis i Mobiluncus spp., nie zostana˛ tu omówione. W celu uzyskania
bardziej szczegółowych informacji, odsyłamy czytelnika do odnośnych publikacji
WHO1.
Zapalenie cewki moczowej u me˛żczyzn
Zapalenie cewki moczowej u me˛żczyzn klinicznie charakteryzuje sie˛ wydzielina˛
z cewki i/lub zaburzeniami w oddawaniu moczu, cze˛sto jednak wyste˛puja˛
bezobjawowe infekcje wywołane przez Neisseria gonorrhoeae lub Chlamydia
trachomatis. Nieleczone gonokokowe lub chlamydialne zapalenie cewki moczowej może rozwina˛ć sie˛ w zapalenie naja˛drzy. U homoseksualnych me˛żczyzn
moga˛ wyste˛pować infekcje odbytu i jamy ustnej wywołane przez N. gonorrhoeae
i C. trachomatis.
W celu ustalenia poste˛powania z pacjentem zapalenia cewki moczowej powinny
być podzielone na gonokokowe i niegonokokowe (NGU). Blisko połowa
przypadków NGU wywołana jest przez C. trachomatis, jednak etiologia wie˛kszości nawracaja˛cych zakażeń nie została w pełni wyjaśniona. Zgodnie z badaniami
przyczyna˛ zapalenia cewki moczowej może być zakażenie Ureaplasma urealyticum, a w 1 – 3% przypadków NGU Trichomonas vaginalis. Notowano również
infekcje wywołane przez ludzki Herpesvirus. Czynniki bakteryjne, takie jak:
gronkowce, pałeczki Enterobacteriaceae, Acinetobacter spp. i Pseudomonas spp.,
moga˛ być izolowane z cewki zdrowych me˛żczyzn, lecz nie udowodniono ich
udziału w zapaleniu cewki moczowej.
Badanie próbki w kierunku obecności C. trachomatis nie jest przedmiotem
niniejszego opracowania. Poza izolacja˛ na hodowlach komórkowych bardziej
doste˛pne stały sie˛ ostatnio niehodowlane metody wykrywania chlamydii za
pomoca˛ testów immunoenzymatycznych, immunofluorescencji i amplifikacji
kwasu nukleinowego (PCR). Powyższe metody nadal sa˛ zbyt drogie.
W celu pobrania do badania wydzieliny z cewki moczowej należy wprowadzić do
cewki wymazówke˛ o małej średnicy lub sterylna˛ eze˛ bakteryjna˛ i przed jej
wycia˛gnie˛ciem delikatnie przekre˛cić. Ropna˛ wydzieline˛ można pobrać bezpośrednio na wymazówke˛ lub eze˛ do posiewu. Ważny jest rodzaj użytej wymazówki.
Do hodowli N. gonorrhoeae zalecana jest wymazówka bawełniana z we˛glem
aktywnym lub z alginianem wapnia, a także wymazówka z dakronu. Jeśli do
pobierania materiału te specjalne, przygotowywane komercyjnie, wymazówki nie
sa˛ doste˛pne i użyto zwykłych wymazówek z waty, próbke˛ należy natychmiast
posiać. W przypadku zapalenia cewki moczowej masaż prostaty nie zwie˛ksza
odstetka izolacji gonokoków lub chlamydii.
Wymazy odbytnicze należy pobrać wymazówka˛ wprowadzaja˛c ja˛ do kanału
odbytu na głe˛bokość 4 – 5 cm. Próbki z tylnej ściany gardła i krypt migdałków
należy pobrać wymazówka˛ i natychmiast posiać.
1
Van Dyck E., Meheus A.Z., Piot P.: Laboratory diagnosis of sexually transmitted diseases. Geneva,
World Health Organization, 1999.
90
CZE˛ŚĆ I
Najlepiej, jeśli próbki w kierunku obecności N. gonorrhoeae posiewane sa˛ na
podłoże hodowlane bezpośrednio po pobraniu. Posiane płytki należy umieścić
w eksykatorze lub w atmosferze zawieraja˛cej 5 – 10% dwutlenku we˛gla, o wysokiej wilgotności. Jeśli natychmiastowy posiew i inkubacja sa˛ niemożliwe, należy
użyć podłoża transportowego, takiego jak Amies lub Stuart. Czas transportu
powinien być możliwie najkrótszy, maksymalnie do 12 godzin, w temperaturze
otoczenia do 30°C. Należy unikać schłodzenia.
Badanie bezpośrednie i interpretacja
W wie˛kszości badań wykazano, że obecność czterech lub wie˛cej wieloja˛drzastych
(PMN) leukocytów w polu widzenia w immersji olejowej zdecydowanie wskazuje
na zapalenie cewki moczowej u me˛żczyzn. Opisane kryterium jest szczególnie
użyteczne dla lekarza, który musi podja˛ć decyzje˛ o rozpocze˛ciu leczenia pacjenta
ze słabo nasilonymi objawami.
W wie˛kszości przypadków rzeża˛czki u kobiet wydzielina jest ropna, a w rozmazie
z cewki moczowej widoczne sa˛ liczne wieloja˛drzaste leukocyty (> 10 w polu
widzenia w immersji olejowej). Jakkolwiek nie zawsze jest tak w przypadku
NGU, które daje mniej nasilona˛ reakcje˛ zapalna˛. Rozmazy z wie˛cej niż 4 PMN
leukocytami w polu widzenia i bez wewna˛trzkomórkowych Gram-ujemnych
dwoinek wskazuja˛ na NGU.
Cienka˛ warstwe˛ materiału należy nanieść wymazówka˛ na szkiełko podstawowe,
preparat utrwalić temperatura˛ i wybarwić błe˛kitem metylenowym lub metoda˛
Grama. Obecność Gram-ujemnych wewna˛trzkomórkowych dwoinek w wieloja˛drzastych leukocytach w preparacie bezpośrednim z cewki moczowej wskazuje na
rzeża˛czke˛.
Nie zaleca sie˛ wykonywania barwionych metoda˛ Grama preparatów z próbek
pobranych z cewki moczowej u kobiet bez objawów zakażenia, ze ślepych
wymazów odbytniczych lub z próbek z jamy ustnej. Jednakże badanie mikroskopowe ropnego materiału otrzymanego w anoskopii ma wysoka˛ wartość
diagnostyczna˛.
Hodowla Neisseria gonorrhoeae
Posiane płytki z modyfikowanym podłożem agarowym Thayer-Martina (MTM)1
(lub agarem New York City (NYC))2 należy inkubować w 35°C w wilgotnej
1
Modyfikowany agar Thayer-Martina przygotowuje sie˛ przez dodanie w 50°C mieszaniny antybiotyków i IsoVitaleX lub równoważnego suplementu do agaru czekoladowego przygotowanego
z agaru GC lub agaru Columbia, stanowia˛cego podstawowe podłoże. Komercyjnie doste˛pna z wielu
źródeł jest mieszanina zawieraja˛ca 3 lub 4 antybiotyki; mieszanina VCN zawiera wankomycyne˛,
kolistyne˛ i nystatyne˛: VCNT zawiera również trimetoprim.
Końcowe ste˛żenie antybiotyków w przygotowanym podłożu:
– wankomycyna: 3 µg/ml
– nystatyna:
12,5 IU/ml
– kolistyna:
7,5 µg/ml
– mleczan trimetoprimu: 5 µg/ml
2
Modyfikowane podłoże New York City przygotowuje sie˛ przez dodanie do 500 ml bazowego
sterylnego agaru GC schłodzonego do 50°C naste˛puja˛cych dodatków:
– 50 ml krwi końskiej lizowanej przez dodanie 5 ml/l saponiny,
– sterylny autolizat drożdżowy,
– zestaw antybiotyków zawieraja˛cy: wankomycyne˛, kolistyne˛, amfoterycyne˛ i trimetoprim.
Składniki doste˛pne sa˛ komercyjnie z Oxoid Ltd. Wade Rd, Basingstoke, Hants RG24 8PW, England.
91
atmosferze wzbogaconej dwutlenkiem we˛gla (eksykator) i obserwować codziennie przez dwa dni. Laboratoria przeprowadzaja˛ce duża˛ liczbe˛ badań próbek
w kierunku N. gonorrhoeae, poza selektywnym MTM, stosuja˛ cze˛sto nieselektywny agar czekoladowy wzbogacony dodatkiem IsoVitaleX lub innym, ponieważ 3 – 10% gonokoków może wykazywać wrażliwość na ste˛żenia wankomycyny
użyte w podłożu selektywnym.
Kolonie gonokoków po 24 godzinach moga˛ być jeszcze niewidoczne. Pojawiaja˛
sie˛ po 48 godzinach jako szare lub białe, nieprzezroczyste, uniesione i opalizuja˛ce
kolonie różnych rozmiarów i morfologii.
Identyfikacja Neisseria gonorrhoeae
Wste˛pna identyfikacja N. gonorrhoeae izolowanych z materiałów pobranych
z dróg moczowo-płciowych oparta jest na dodatniej reakcji oksydazowej
i obecności Gram-ujemnych dwoinek widocznych w preparacie barwionym
metoda˛ Grama. W celu potwierdzenia identyfikacji można przeprowadzić testy
rozkładu we˛glowodanów lub inne, stosuja˛c metody i podłoża omówione szczegółowo w innych opracowaniach1.
Badanie wrażliwości na antybiotyki
Istnieje geograficzne zróżnicowanie wrażliwości N. gonorrhoeae na benzylopenicyline˛. W niektórych regionach, takich jak Afryka podsaharyjska czy południowo-wschodnia Azja, wie˛kszość szczepów gonokokowych wykazuje zdolność
do produkcji β-laktamaz. Przenoszona chromosomalnie, niezwia˛zana z wytwarzaniem β-laktamaz oporność na benzylopenicyline˛ staje sie˛ coraz cze˛stsza
w wielu krajach. Metoda dyfuzji kra˛żkowej nie jest jednak przydatna do
wykrywania takich szczepów.
Na obszarach, gdzie w zakażeniach gonokokowych stosowane sa˛ benzylopenicylina, ampicylina i amoksycylina, szczepy N. gonorrhoeae (szczególnie w razie
niepowodzenia terapii) powinny być rutynowo badane w kierunku wytwarzania
β-laktamaz jednym z zalecanych testów, takich jak test z nitrocefina˛2. Do testu
z nitrocefina˛ należy w małej probówce przygotować ge˛sta˛ zawiesine˛ z kilku
kolonii i 0,2 ml fizjologicznego roztworu soli; naste˛pnie do zawiesiny dodać
0,025 ml nitrocefiny, mieszać przez minute˛. Szybka zmiana koloru z żółtego na
różowy lub czerwony jest dowodem na wytwarzanie β-laktamazy przez badany
szczep.
Rutynowe badanie wrażliwości N. gonorrhoeae na antybiotyki metoda˛dyfuzyjno-kra˛żkowa˛ nie jest zalecane.
1
2
Odczynnik Nitrocefin jest doste˛pny w firmie Oxoid Ltd, Wade Road, Basingstoke, Hants RG24
8PW, England; zawiera 1 mg nitrocefiny (SR112) i fiolke˛ rozpuszczalnika (SR112A). Test
probówkowy może być zasta˛piony testem kra˛żkowym z użyciem kra˛żka nasyconego nitrocefina˛ (kra˛żek cefinazowy doste˛pny z BD Diagnostic Systems, 7 Loveton Circle, Sparks, MD 21152,
USA).
92
CZE˛ŚĆ I
Próbki z żeńskich narza˛dów płciowych
Flora pochwy kobiety przed menopauza˛ składa sie˛ głównie z laseczek kwasu
mlekowego i różnych fakultatywnie tlenowych i beztlenowych bakterii.
Nieprawidłowa wydzielina z pochwy może być wynikiem:
– zapalenia pochwy: Gardnerella vaginalis, Candida albicans;
– bakteryjnej waginozy: przerost bakterii beztlenowych i Mobiluncus spp.;
– zapalenia szyjki macicy: Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis.
Inne bakterie, takie jak Enterobacteriaceae, nie sa˛ udowodniona˛ przyczyna˛
zapalenia pochwy. Zapalenie pochwy u dziewczynek przed okresem pokwitania
może być wywołane przez N. gonorrhoeae lub C. trachomatis.
Bakteryjna waginoza (niespecyficzne zapalenie pochwy) jest stanem charakteryzuja˛cym sie˛ obfita˛, brzydko pachna˛ca˛ wydzielina˛, z towarzysza˛cym znacza˛cym wzrostem Mobiluncus spp. i różnych bezwzgle˛dnych beztlenowców oraz
spadkiem liczby pochwowych laseczek kwasu mlekowego. Minimalnym warunkiem rozpoznania bakteryjnej waginozy jest obecność co najmniej trzech
z naste˛puja˛cych objawów: nieprawidłowa wydzielina z pochwy, pH pochwy
> 4,5, komórki wskaźnikowe (komórki nabłonkowe z tak licznie przylegaja˛cymi
bakteriami, że niewidoczne staja˛ sie˛ obrysy komórki) i rybi, aminopodobny
zapach po dodaniu do wydzieliny pochwowej kropli 10% wodorotlenku potasu.
Zapalenie cewki moczowej może być wywołane także przez N. gonorrhoeae
i C. trachomatis.
Zakażenia wste˛puja˛ce N. gonorrhoeae, C. trachomatis, beztlenowymi i wzgle˛dnie
beztlenowymi bakteriami moga˛ powodować zapalenie narza˛dów miednicy
(pelvic inflammatory disease — PID) i w konsekwencji niemożność donoszenia
cia˛ży lub cia˛że˛ pozamaciczna˛.
Bakteryjne zakażenia narza˛dów płciowych podczas cia˛ży, w tym zakażenia
N. gonorrhoeae i C. trachomatis, moga˛ być przyczyna˛ powikłań, takich jak:
przedwczesny poród, przedwczesne pe˛knie˛cie pe˛cherza płodowego, zapalenie
błon płodowych, poporodowe zapalenie błony śluzowej macicy u matki i zapalenie spojówek, zapalenie płuc oraz zespół zakażenia owodni u noworodka.
Na specjalne zlecenie materiały pobrane z szyjki macicy i pochwy można
posiewać w kierunku S. aureus (zespół szoku toksycznego), S. agalactiae
(paciorkowiec grupy B, zakażenia noworodków), Listeria monocytogenes (zakażenia noworodków) i Clostridium spp. (poronienie septyczne).
Jakkolwiek infekcje C. trachomatis i ludzkim Herpesvirus sa˛ powszechne, ich
diagnostyka laboratoryjna wymaga drogiego sprze˛tu oraz odczynników i nie
be˛dzie tutaj omawiana.
Wszystkie próbki powinny być pobierane podczas badania we wziernikach.
Wziernik przed użyciem można zwilżyć ciepła˛ jałowa˛woda˛, nie można natomiast
używać antyseptyków i kremów do badania ginekologicznego, ponieważ moga˛
one działać letalnie na gonokoki.
93
Do badania w kierunku obecności drożdży, G. vaginalis i bakteryjnej waginozy
próbki wydzieliny pochwowej można pobrać wymazówka˛ z tylnego sklepienia
pochwy. Próbki do hodowli gonokoków i chlamydii powinny być pobrane z błony
śluzowej szyjki macicy. Po założeniu wzierników bawełniana˛wymazówka˛należy
usuna˛ć czop śluzowy. Wymazówke˛ do pobierania materiału (patrz str. 90) należy
wprowadzić do kanału szyki macicy i obracać przez co najmniej 10 sekund przed
wycia˛gnie˛ciem.
Próbki z cewki moczowej, odbytu i z jamy ustnej pobiera sie˛ w podobny sposób
jak u me˛żczyzn.
W każdym przypadku zapalenia narza˛dów miednicy (PID) należy pobrać
przynajmniej próbki z szyjki macicy w kierunku N. gonorrhoeae. Pobieranie
materiału z jajowodu jest bardziej wiarygodne, ale w wie˛kszości regionów
najlepsza˛ doste˛pna˛ próbka˛ jest aspirat z zagłe˛bienia odbytniczo-macicznego
(jamy Douglasa).
U dzieci z cie˛żkim noworodkowym zapaleniem spojówek należy wymazówka˛lub
eza˛ pobrać wydzieline˛ z worka spojówkowego.
Z wyja˛tkiem próbek badanych w kierunku C. trachomatis, do transportu
wymazów z szyjki i pochwy najbardziej odpowiednie sa˛ podłoża transportowe
Amies i Stuart.
Badanie bezpośrednie i interpretacja
Bezpośrednie badanie wydzieliny z pochwy jest metoda˛ z wyboru w diagnostyce zapalenia pochwy, lecz mniej przydatna˛ w diagnostyce zapalenia szyjki
macicy.
Preparat bezpośredni przygotowywany jest na szkiełku podstawowym, na którym
w fizjologicznym roztworze soli umieszcza sie˛ próbke˛ materiału pobranego
z pochwy, a naste˛pnie nakrywa szkiełkiem nakrywkowym. Zapewnia to rozdzielenie komórek, które w innym przypadku moga˛ sklejać sie˛ w grudki. Preparat
należy ogla˛dać pod powie˛kszeniem × 400 poszukuja˛c typowych ruchliwych
T. vaginalis, pa˛czkuja˛cych drożdży i komórek wskaźnikowych (,,clue cells’’).
C. albicans może tworzyć pseudogrzybnie, obserwowane niekiedy w materiale
z pochwy. Komórki wskaźnikowe sa˛ obecne u wie˛kszości kobiet z bakteryjna˛
waginoza˛. Ziarnisty lub brudny wygla˛d cytoplazmy komórek nabłonkowych jest
mniej obiektywnym kryterium niż utrata granic komórki. Badanie mikroskopowe
preparatów bezpośrednich z szyjki macicy nie jest zalecane.
W diagnostyce bakteryjnej waginozy metoda˛ z wyboru jest przygotowanie preparatów barwionych metoda˛ Grama. Preparat należy wykonać delikatnie przetaczaja˛c wymazówke˛ po szkiełku podstawowym. Prawidłowy rozmaz z pochwy
zawiera głównie laseczki kwasu mlekowego (duże, Gram-dodatnie) oraz mniej
niż 5 leukocytów w polu widzenia. W rozmazach pochodza˛cych od kobiet z waginoza˛ bakteryjna˛ obserwuje sie˛ pokryte małymi Gram-ujemnymi pałeczkami
komórki wskaźnikowe (,,clue cells’’) oraz mieszana˛ flore˛: liczne małe Gram-ujemne i Gram-zmienne pałeczki, ziarenko-pałeczki, cze˛sto także Gram-ujemne
zakrzywione pałeczki, nie stwierdza sie˛ natomiast wie˛kszych, Gram-dodatnich
laseczek. W polu widzenia widoczne sa˛ jedynie nieliczne (< 5) leukocyty. Obraz
ten jest czułym i swoistym wskaźnikiem bakteryjnej waginozy.
94
CZE˛ŚĆ I
Duża liczba leukocytów (> 10 komórek w polu widzenia) w bezpośrednim
preparacie z pochwy barwionym metoda˛ Grama wskazuje na rze˛sistkowice˛ lub
zapalenie szyjki macicy.
Barwienie Grama nie jest szczególnie przydatne w diagnostyce zakażeń gonokokowych u kobiet. Badanie oparte na poszukiwaniu Gram-ujemnych wewna˛trzkomórkowo zlokalizowanych dwoinek w barwionych metoda˛ Grama preparatach
bezpośrednich z szyjki macicy ma czułość 50 – 70% i swoistość 50 – 90%, co
wskazuje na niewielka˛ wartość tej metody diagnostycznej w populacji o niskiej
cze˛stości wyste˛powania rzeża˛czki. Obecność Gram-ujemnych wewna˛trzkomórkowych dwoinek widocznych w preparatach z szyjki macicy powinna zostać
odnotowana bez określenia, że sa˛ to N. gonorrhoeae lub gonokoki. Można w ten
sposób unikna˛ć nadinterpretacji rozmazów z szyjki macicy, które cze˛sto zawieraja˛
Gram-ujemne ziarenko-pałeczki oraz dwubiegunowo zabarwione pałeczki.
Głównym celem wykonywania preparatów bezpośrednich z szyjki macicy jest
potwierdzenie rozpoznania śluzowo-ropnego zapalenia szyjki macicy: obecność
wie˛cej niż 10 wieloja˛drzastych leukocytów w polu widzenia wskazuje na rozpoznanie zakażenia, wywołanego zwykle przez N. gonorrhoeae i/lub C. trachomatis.
Badanie preparatów bezpośrednich ze spojówek barwionych metoda˛ Grama jest
czuła˛ i swoista metoda˛ diagnostyczna˛ rzeża˛czkowego zapalenia spojówek.
Obecność wewna˛trzkomórkowych Gram-ujemnych dwoinek potwierdza rozpoznanie.
Hodowla
Próbki z szyjki macicy, odbytu, cewki moczowej, spojówek i z zagłe˛bienia
odbytniczo-macicznego moga˛ być posiewane w kierunku N. gonorrhoeae metoda˛
opisana˛ na str. 91, 92. Badanie próbek należy rozpocza˛ć natychmiast po ich
dostarczeniu do laboratorium lub — korzystniej — jeszcze w klinice. U kobiet,
w odróżnieniu od me˛żczyzn, posiewy maja˛ kluczowe znaczenie w diagnostyce
infekcji gonokokowych. Czułość pojedynczego posiewu u kobiet wynosi
80 – 90%. Jest mniejsza w przypadku próbek pobranych w okresie okołoporodowym.
W diagnostyce bakteryjnej waginozy nie zaleca sie˛ prowadzenia hodowli w kierunku G. vaginalis lub beztlenowców, ponieważ sa˛ one wykrywane u 20 – 40%
kobiet bez infekcji pochwy. Obecność G. vaginalis w wydzielinie z pochwy nie
jest wystarczaja˛cym wskazaniem do leczenia; leczone powinny być tylko
pacjentki spełniaja˛ce wszystkie kryteria diagnostyczne bakteryjnej waginozy.
W porównaniu z badaniem mikroskopowym hodowla zwie˛ksza wykrywalność
C. albicans o 50 – 100%. Ponieważ posiew w kierunku Candida jest dodatni nawet
przy niewielkiej liczbie grzybów, która może wyste˛pować u 10 – 30% kobiet bez
objawów zapalenia pochwy, tylko obfity wzrost C. albicans stanowi dowód
kandydiazy pochwy. W zwia˛zku z tym nie zaleca sie˛ rutynowego prowadzenia
hodowli. Podobnie, poza preparatem bezpośrednim nie zaleca sie˛ posiewu
w kierunku G. vaginalis, który najcze˛ściej wykrywa jedynie bezobjawowe
nosicielstwo.
95
Próbki z owrzodzeń narza˛dów płciowych
Owrzodzenia narza˛dów płciowych sa˛ cze˛stym problemem w wielu rozwijaja˛cych
sie˛ krajach. Ich diagnostyka i leczenie sa˛ wyzwaniem zarówno dla lekarzy, jak
i dla laboratorium. Powszechne sa˛ infekcje mieszane. Zmiany owrzodzeniowe
narza˛dów płciowych moga˛ być wywołane przez różne czynniki przenoszone
droga˛ kontaktów seksualnych:
– ludzki Herpesvirus,
– Treponema pallidum,
– Haemophilus ducreyi,
– Calymmatobacterium granulomatis, wywołuja˛cy ziarniniaka pachwiny (donovanosis),
– Chlamydia trachomatis serotypy L1, L2, L3.
W wielu rozwijaja˛cych sie˛ krajach wirus opryszczki jest najcze˛stsza˛ przyczyna˛
owrzodzeń narza˛dów płciowych i zagrażaja˛cych życiu powikłań u pacjentów
z niedoborami odpornościowymi oraz u noworodków kobiet z infekcja˛. Diagnostyka laboratoryjna zakażenia nie be˛dzie tu omawiana.
Kiła jest wcia˛ż najpoważniejsza˛ choroba˛ weneryczna˛, która może prowadzić do
cie˛żkich późnych naste˛pstw oraz kiły wrodzonej. Mimo że testy serologiczne
odgrywaja˛ ważna˛ role˛ w diagnostyce wszystkich stadiów kiły, w tym miejscu
zostanie omówione tylko badanie w ciemnym polu widzenia. Techniki i interpretacja testów serologicznych w diagnostyce kiły zostały szczegółowo przedstawione w innych opracowaniach1.
Wrzód mie˛kki jest główna˛ postacia˛ owrzodzeń narza˛dów płciowych w wielu
rozwijaja˛cych sie˛ regionach. Objawy kliniczne obejmuja˛ bolesne, ropne owrzodzenie(a), z towarzysza˛cym bolesnym, cze˛sto ropnym, zapalnym obrze˛kiem
pachwinowych we˛złów chłonnych. Nie obserwowano wyste˛powania późnych
konsekwencji zakażenia. Kliniczne różnicowanie z innymi owrzodzeniami
narza˛dów płciowych jest trudne. Wrzód mie˛kki zwie˛ksza ryzyko zakażenia HIV.
Ziarniniak pachwiny charakteryzuje sie˛ żywoczerwonym, ziarniniakowym
owrzodzeniem narza˛dów płciowych. Obrze˛k zapalny we˛złów chłonnych jest
rzadki.
Chlamydiowy ziarniniak limfatyczny charakteryzuje sie˛ pachwinowa˛i/lub udowa˛
limfadenopatia˛ i rzadziej obecnościa˛ małych, samoistnie goja˛cych sie˛ owrzodzeń.
Diagnostyka oparta jest na testach serologicznych i izolacji C. trachomatis
serotypów L1, L2, L3.
Pobieranie próbek
Treponema pallidum: Nałożyć re˛kawiczki chirurgiczne. Ścisna˛ć owrzodzenie
mie˛dzy dwoma palcami i, używaja˛c gazików, oczyścić powierzchnie˛ zmiany
roztworem fizjologicznym soli. Obecne strupki usuna˛ć. Zetrzeć pierwsze krople
krwi (jeśli sie˛ pojawia˛) i dotykaja˛c czystym szkiełkiem podstawowym powierzchni zmiany pobrać próbke˛ surowiczego wysie˛ku. Natychmiast nałożyć na krople˛
1
Van Dyck E., Meheus A.Z., Piot P.: Laboratory diagnosis of sexually transmitted disease. Geneva,
96
CZE˛ŚĆ I
wysie˛ku czyste szkiełko nakrywkowe. Alternatywnie próbka może być pobrana ze
zmiany lub powie˛kszonego we˛zła chłonnego za pomoca˛ sterylnej igły i strzykawki. Preparat powinien być niezwłocznie odczytany w ciemnym polu widzenia
przez doświadczonego mikrobiologa.
Haemophilus ducreyi: Próbke˛ należy pobrać wymazówka˛ z podstawy owrzodzenia i posiać bezpośrednio na podłoże. Materiał można również uzyskać z powie˛kszonych zapalnie we˛złów chłonnych pachwinowych, lecz wyhodowanie
H. ducreyi z takiego materiału jest mniej prawdopodobne. Przydatność podłoży
transportowych dla H. ducreyi nie została dostatecznie oceniona.
Przy podejrzeniu ziarniniaka pachwiny należy wykonać biopsje˛ tkanki leża˛cej pod
powierzchnia˛ aktywnie ziarninuja˛cej zmiany. Przygotować świeże preparaty ze
zmiażdżonych fragmentów materiału biopsyjnego. Alternatywnie jeden z preparatów może zawierać zeskrobiny z powierzchni zmiany.
Badanie bezpośrednie
Wykazanie kre˛tków w materiale ze zmiany jest metoda˛ z wyboru w diagnostyce
kiły pierwotnej. Mimo iż T. pallidum można wybarwić (np. azotanem srebra), ze
wzgle˛du na wie˛ksza˛ czułość i swoistość zalecana jest mikroskopia w ciemnym
polu widzenia. Do badania potrzebny jest mikroskop wyposażony w dobre źródło
światła i kondensor. Kondensor ciemnego pola widzenia przesłania padaja˛ce
prosto promienie światła, przepuszczaja˛c jedynie promienie peryferyczne (odbijane przez takie obiekty, jak kre˛tki).
Należy umieścić kilka kropel olejku immersyjnego na kondensorze mikroskopu
z ciemnym polem widzenia. Obniżyć nieco kondensor, tak by poziom olejku był
poniżej podstawy. Umieścić szkiełko pod mikroskopem i podnosić kondensor do
chwili uzyskania dobrego kontaktu mie˛dzy olejkiem i spodem szkiełka. Unikać
utworzenia sie˛ pe˛cherzyków powietrza w olejku.
Ryc. 9. Obraz T. pallidum pod mikroskopem w ciemnym polu widzenia.
97
Do uzyskania obrazu użyć obiektywu o najmniejszym powie˛kszeniu (× 10).
Reguluja˛c pokre˛tłem kondensora, skierować światło centralnie na pole i ustawić
ostrość podnosza˛c i obniżaja˛c kondensor do momentu uzyskania najmniejszej
średnicy światła. Jeśli to konieczne, ponownie ustawić światło w centrum.
Naste˛pnie, używaja˛c obiektywu × 40, ustawić ostrość i uważnie ogla˛dać preparat.
Kontrast be˛dzie lepszy przy mikroskopowaniu w ciemności. Unikać jasnego
światła dziennego.
T. pallidum jest biały, świeca˛cy na ciemnym tle (ryc. 9). Jego identyfikacji
dokonuje sie˛ na podstawie typowej morfologii, rozmiaru i ruchliwości. Jest
cienkim (0,25 – 0,3 µm) mikroorganizmem, długości 6 – 16 µm, z 8 – 14 regularnymi, ściśle skre˛conymi, wyraźnymi spiralami. Wykazuje szybkie, raczej
gwałtowne ruchy. Stosunkowo wolno obraca sie˛ wzdłuż długiej osi (jak
korkocia˛g). Rotacji towarzyszy intensywne zginanie (skre˛canie). Można zaobserwować wydłużanie i skracanie komórki (przypominaja˛cej elastyczna˛, rozpre˛żaja˛ca˛ sie˛ spirale˛). W skomplikowanych skre˛tach moga˛ pojawiać sie˛ zniekształcenia.
Jeżeli mikroorganizm przylega lub jest otoczony przez cie˛ższy obiekt, w wyniku
nasilonych ruchów dochodzi do odkształcenia zwojów. Inne niekiłowe kre˛tki
moga˛ być luźno skre˛cone, cienkie i nieregularne; poruszaja˛ sie˛ inaczej (nie jak
korkocia˛g), ruchem bardziej wija˛cym, z zaznaczonym zgie˛ciem i cze˛sta˛relaksacja˛
skre˛tów.
Wykazanie kre˛tków z charakterystyczna˛ dla T. pallidum morfologia˛ i ruchem
stanowi potwierdzenie rozpoznania pierwszo- i drugorze˛dowej kiły. Pacjenci
z pierwotna˛ zmiana˛ kiłowa˛, z dodatnim wynikiem badania w ciemnym polu
widzenia moga˛ być seronegatywni. Zwykle do serokonwersji dochodzi w cia˛gu
kilku tygodni.
Niepowodzenie w wykazaniu drobnoustrojów nie wyklucza kiły. Ujemne wyniki
moga˛ świadczyć o tym, że:
• Obecna była niewystarczaja˛ca liczba drobnoustrojów (pojedyncze badanie
w ciemnym polu widzenia ma czułość nie wie˛ksza˛ niż 50%).
• Pacjent otrzymał już antybiotyki.
• Zmiana ulega naturalnemu wygojeniu.
• Zmiana nie była owrzodzeniem kiłowym.
Niezależnie od wyników badania w ciemnym polu widzenia zawsze należy pobrać
krew do badań serologicznych.
W diagnostyce ziarniniaka pachwiny w utrwalonych acetonem preparatach
wybarwionych metoda˛ Giemsy wewna˛trz histiocytów widoczne sa˛ typowe,
otoczkowe laseczki. Diagnostyka tej choroby opisana jest szczegółowo w innych
źródłach1.
W diagnostyce wrzodu mie˛kkiego nie zaleca sie˛ barwienia rozmazów metoda˛
Grama, ponieważ zarówno czułość, jak i specyficzność wynosza˛ mniej niż 50%.
W diagnostyce chlamydiowego ziarniniaka limfatycznego nie zaleca sie˛ stosowania barwienia metoda˛Giemsy. Materiał z owrzodzenia powinien być także badany
w ciemnym polu widzenia w kierunku T. pallidum.
1
98
CZE˛ŚĆ I
Hodowla
Z owrzodzeń narza˛dów płciowych niekiedy izolowane sa˛ gonokoki, ale ich
znaczenie w takich próbkach jest niejasne. Poza H. ducreyi nie udowodniono, aby
inny gatunek bakterii — zarówno wzgle˛dnie tlenowy, jak i bezwzgle˛dnie
beztlenowy — wywoływał owrzodzenia narza˛dów płciowych.
Próbki, które maja˛ zostać zbadane w kierunku H. ducrei, należy posiać bezpośrednio na wybiórcze, wzbogacone podłoże agarowe1. Podłoże użyte do posiewu
musi być świeże (do tygodnia od przygotowania). Płytki należy inkubować
w 33 – 35°C w eksykatorze ze zwilżona˛ lignina˛ na dnie. Po 48 – 72 godzinach
inkubacji pojawiaja˛ sie˛ małe, nieśluzowe, żółtoszare, półprzezroczyste lub
przezroczyste kolonie, które nienaruszone można przesuwać po powierzchni
płytki. Czułość pojedynczej hodowli w izolacji H. ducreyi wynosi 70 – 80%.
Wste˛pna diagnoza H. ducreyi może być przeprowadzona na podstawie morfologii
kolonii na podłożu selektywnym i wykazania małych, Gram-ujemnych pleomorficznych ziarenko-pałeczek, cze˛sto w pojedynczych łańcuchach (paciorki),
równoległych łańcuchach (,,ławica ryb’’) lub w skupiskach. Mimo że wzrost
H. ducreyi jest zależny od heminy, wie˛kszość klinicznych izolatów nie rośnie na
podłożach wykrywaja˛cych zależność wzrostu od czynników X i V. Obecnie
prawie wszystkie szczepy izolowane w krajach rozwijaja˛cych sie˛ wytwarzaja˛
β-laktamazy.
1
Agar Mueller-Hintona wzbogacony 5% sterylna˛ krwia˛ końska˛ podgrzana˛ do 75°C, 1% IsoVitaleX
i 3 g/ml wankomycyny.
99
Ropne wydzieliny, rany i ropnie
Wprowadzenie
Jednym z najcze˛ściej obserwowanych objawów chorób zakaźnych jest wytwarzanie ropnej (czasami surowiczo-ropnej) wydzieliny powstaja˛cej w wyniku
inwazji bakterii do tkanki, narza˛du lub jamy ciała. Zakażenia te moga˛ być
stosunkowo łagodne (nieszkodliwy ,,pryszcz’’) lub wywoływać liczne ropnie
zlokalizowane w jednym lub wielu miejscach. Wysie˛k składa sie˛ z białych
krwinek, głównie wieloja˛drzastych leukocytów, zakażaja˛cych drobnoustrojów
oraz mieszaniny płynu ustrojowego i fibryny. W niektórych sytuacjach wysie˛k
może być widoczny jako warstwa na powierzchni narza˛du, na przykład na
powierzchni mózgu w bakteryjnym zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych.
W innych przypadkach wysie˛k może być otoczony warstwa˛ włóknika i siecia˛
komórek tkanki (np. czyrak mnogi lub podskórny ,,czyrak’’), a niekiedy zwia˛zany
jest z otwarta˛ rana˛, z której wycieka ge˛sty płyn lub ropa.
Zarówno anatomiczna lokalizacja wysie˛ku, jak i mikroorganizmy zwia˛zane
z wymienionymi infekcjami moga˛ sie˛ znacznie różnić. Wpływ na tworzenie
wysie˛ku moga˛ mieć wszystkie bakterie wchodza˛ce w skład flory fizjologicznej,
a także grzyby, szczególnie te, które maja˛ zdolność namnażania sie˛ w tkankach.
W infekcjach wirusowych rzadko dochodzi do powstania ropnej wydzieliny.
Mikrobiolog powinien, uwzgle˛dniaja˛c różnorodna˛ lokalizacje˛ i etiologie˛ ropnych
zakażeń, przeprowadzić właściwe badania makroskopowe i mikroskopowe
z posiewem na odpowiednie podłoża, które umożliwia˛ izolacje˛ najważniejszych
patogennych drobnoustrojów. Możliwie najszybciej po uzyskaniu czystych
hodowli należy przeprowadzić identyfikacje˛ oraz określić wrażliwość na antybiotyki.
Współpraca mie˛dzy klinicysta˛ i mikrobiologiem ma zasadnicze znaczenie
w diagnostyce i leczeniu pacjentów z ropnymi zakażeniami. Mikrobiolog musi
współpracować z lekarzem, zapewniaja˛c właściwe pobieranie próbek i szybki
transport do laboratorium w celu natychmiastowego i właściwego prowadzenia
badań.
Postacie kliniczne i najcze˛stsze czynniki
etiologiczne
Próbki chirurgiczne
Próbki chirurgiczne moga˛ być uzyskane przez nakłucie zlokalizowanego ropnia
lub w innej procedurze chirurgicznej. Chirurg powinien pobrać kilka małych
reprezentatywnych próbek z tkanki i każdego ropnego wysie˛ku. Jeśli to możliwe,
należy unikać wymazów. Materiał powinien być pobrany za pomoca˛ igły
i strzykawki. Jeśli konieczne jest użycie wymazówki, należy pobrać możliwie
dużo wysie˛ku i w odpowiednich pojemnikach przesłać do laboratorium. W chwili
otrzymania próbki laboratorium musi, uwzgle˛dniaja˛c dostarczone informacje,
zaplanować hodowle˛ drobnoustrojów prawdopodobnie obecnych w danej próbce.
100
CZE˛ŚĆ I
Poniżej przedstawiono kilka przykładów stanów klinicznych i drobnoustrojów
obecnych w różnych typach próbek chirurgicznych:
• Jama otrzewnej zawiera prawdopodobnie Gram-ujemne bakterie jelitowe,
Gram-ujemne pałeczki beztlenowe (Bacteroides fragilis) i laseczki.
• Otorbiony ropień może zawierać każdy typ drobnoustrojów, jeden lub kilka
gatunków: Gram-dodatnie ziarenkowce i Gram-ujemne laseczki sa˛ izolowane
najcze˛ściej. W zależności od lokalizacji należy również uwzgle˛dnić bakterie
beztlenowe i pełzaki.
• We˛zły chłonne cze˛sto wła˛czone sa˛ w infekcje układowe. Sa˛ powie˛kszone,
cze˛sto dość twarde i gromadza˛ ropny wysie˛k. Jeśli we˛zeł jest chełbocza˛cy,
zawarty płyn może zostać zaaspirowany przez lekarza. Biopsje we˛złów
chłonnych i aspiraty pobrane od dzieci należy hodować w kierunku Mycobacterium tuberculosis i innych pra˛tków. Poza hodowla˛ w kierunku gronkowców,
ziarenkowców i Gram-ujemnych bakterii jelitowych we˛zły chłonne stanowia˛
dobry materiał do diagnostyki układowych i podskórnych grzybic (histoplazmoza, sporotrychoza).
• Skóra i tkanka podskórna sa˛ pierwotnym miejscem powstawania ropni
i zakażeń ran. Zgodnie z ogólna˛zasada˛, ropnie podskórne wywoływane sa˛przez
gronkowce. Otwarte, sa˛cza˛ce sie˛ zmiany skórne cze˛sto wyste˛puja˛ w zakażeniach β-hemolizuja˛cymi paciorkowcami i/lub gronkowcami, jak np. w liszajcu.
Innym rodzajem zmian skórnych, powstaja˛cych cze˛sto w wyniku zakażeń
szpitalnych, wymagaja˛cych interwencji chirurgicznej, sa˛ owrzodzenia odleżynowe i odleżyny. Bakterie, które sa˛ komensalami skóry lub wchodza˛
w skład flory jelitowej, moga˛ namnażać sie˛ w zewne˛trznych warstwach
owrzodzenia i sa˛odpowiedzialne za nieprzyjemny zapach i wygla˛d. Najcze˛ściej
izolowanymi drobnoustrojami z biopsji tkanki sa˛ laseczki; można je również
obserwować w posiewach z powierzchownego wysie˛ku. Nie zawsze możliwa
jest ocena udziału tych drobnoustrojów w powstawaniu owrzodzenia odleżynowego, ale warunkiem zagojenia sie˛ rany jest utrzymywanie czystego
i suchego owrzodzenia bez bakterii. Czasami drobnoustroje z odleżyny moga˛
przenikać do krwi, wywołuja˛c poważne powikłania.
• Oparzenia, szczególnie drugiego i trzeciego stopnia, sprzyjaja˛ infekcjom
wywołanym przez różne gatunki bakterii. Bardzo ważne jest dokładne
chirurgiczne opracowanie rany przeprowadzone przed pobraniem materiału do
hodowli. Najcze˛ściej izolowane bakterie to gronkowce i Pseudomonas aeruginosa.
• Wysie˛ki. Czasami surowiczy lub ropny płyn może być pobrany z jamy ciała,
która normalnie zawiera niewielka˛ ilość sterylnego płynu, np. worek osierdziowy, jama opłucnej, kaletka lub staw. Aspiracja igłowa w aseptycznych
warunkach dostarczy laboratorium materiału, z którego można wyizolować
i zidentyfikować zakażaja˛cy mikroorganizm. Zazwyczaj przyczyna˛ zakażenia
sa˛ bakterie, moga˛ wyste˛pować również grzyby i wirusy. Infekcje wywołane sa˛
najcze˛ściej przez jeden gatunek, ale pojawiaja˛ sie˛ także mieszane tlenowo-beztlenowe zakażenia. Z aspiratów z jamy opłucnej można uzyskać pneumokoki, paciorkowce, H. influenzae, beztlenowe paciorkowce lub beztlenowe
Gram-ujemne pałeczki (Prevotella i Porphyromonas) oraz M. tuberculosis.
Rany penetruja˛ce
Każde uszkodzenie spowodowane przedmiotem, który przebija skóre˛, zawiera
prawdopodobnie mieszanine˛ mikroorganizmów; drobnoustroje należa˛ głównie do
flory skóry lub naturalnej flory mikrobiologicznej gleby i wody. Rany penetruja˛ce
101
ROPNE WYDZIELINY, RANY I ROPNIE
z uszkodzeniem jelit stanowia˛ jeszcze poważniejsze zagrożenie, ponieważ
w infekcji może współuczestniczyć flora jelitowa.
Rany penetruja˛ce i cie˛te moga˛ być spowodowane ostrymi i te˛pymi narze˛dziami.
Powstaja˛ cze˛sto z użyciem metalu, szkła, drewna itp., w sposób przypadkowy lub
umyślny (np. dźgnie˛cie nożem lub rany postrzałowe). Te˛żec rozwijaja˛cy sie˛
w wyniku rany penetruja˛cej jest dla nieszczepionych osób choroba˛ zagrażaja˛ca˛
życiu. Botulizm przyranny może pozostać nie rozpoznany, jeśli lekarz i mikrobiolog nie sa˛ świadomi takiej możliwości. Te˛żec i botulizm sa˛ rozpoznawane na
podstawie objawów klinicznych, a laboratoryjne potwierdzenie powinno być
przeprowadzone przez centralne laboratorium referencyjne. Ludzie pracuja˛cy ze
zwierze˛tami lub produktami zwierze˛cymi sa˛ narażeni na zakażenie sporami
Bacillus anthracis, które moga˛ wnikna˛ć przez małe rany lub uszkodzenia skóry,
wytwarzaja˛c typowa˛ dla wa˛glika postać czarnej krosty. Wyste˛puja˛cy także
w glebie Clostridium perfringens może wnikna˛ć do rany penetruja˛cej i wywołać
zgorzel gazowa˛.
Zadrapania i ugryzienia przez zwierze˛ta wyste˛puja˛ cze˛sto zarówno w obszarach
miejskich, jak i wiejskich. Ugryzienia moga˛ pochodzić od domowych, hodowlanych lub dzikich zwierza˛t. W pierwszej kolejności i niezwłocznie należy
rozpatrzyć wścieklizne˛. Po wykluczeniu tej możliwości należy rozważyć inne
czynniki etiologiczne. Diagnostyka wścieklizny jest zbyt specjalistyczna, aby
została omówiona w tym opracowaniu1.
Jama ustna zwierza˛t zawiera heterogenna˛ flore˛, w skład której wchodza˛ tlenowe
i beztlenowe bakterie, grzyby, pierwotniaki i wirusy. Infekcje z powodu
ugryzienia lub zadrapania wywołane sa˛ zwykle przez bakterie. Klasycznym
przykładem jest zakażenie Pasteurella multocida, które cze˛sto towarzyszy
ugryzieniom przez psa lub kota, gdy rana nie została właściwie oczyszczona
i leczona. Ugryzienia przez człowieka moga˛ niekiedy wywoływać poważne
mieszane zakażenia tlenowymi i beztlenowymi bakteriami.
Szpitalne zakażenia ran
Jednym z głównych założeń w opiece i leczeniu hospitalizowanych pacjentów jest
zasada nieszkodzenia (,,primum non nocere’’ — przyp. tłum.) w przebiegu
diagnozowania i terapii. Niestety 5 – 10% hospitalizowanych pacjentów nabywa
infekcje w szpitalu. Zakażenia szpitalne generuja˛ koszty, zwykle można ich
unikna˛ć lub znacznie ograniczyć ich wyste˛powanie. Wiele nabytych w szpitalu
infekcji pojawia sie˛ na oddziałach chirurgicznych. Współczynnik pooperacyjnych
zakażeń ran różni sie˛ w zależności od szpitala, a w obre˛bie szpitala wydaje sie˛
wyższy u pacjentów poddanych operacjom jamy brzusznej, klatki piersiowej lub
zabiegom ortopedycznym. Zakażenia ran chirurgicznych moga˛ pojawiać sie˛
krótko po zabiegu lub kilka dni później. Zakażenie może być ograniczone do
miejsca przecie˛cia lub obejmować całe miejsce operowane. Głównym czynnikiem etiologicznym zakażeń jest Staphylococcus aureus (zwykle oporny na
benzylopenicyline˛, a obecnie również metycylinooporny), przed E. coli i innymi
bakteriami jelitowymi. Beztlenowe bakterie z jelita grubego pacjenta moga˛
zakazić operowane miejsca, wywołuja˛c cie˛żka˛ mieszana˛ infekcje˛, dość cze˛sto
wyste˛puja˛ca˛ w szpitalach, w których opieka nad ranami pooperacyjnymi
1
Meslin F.-X., Kaplan M.M., Koprowski H. (eds.): Laboratory techniques in rabies, 4th ed. Geneva,
102
CZE˛ŚĆ I
i programy profilaktyki zakażeń sa˛ słabo rozwinie˛te. Bacteroides fragilis
i rzadziej Clostridium perfringens moga˛ przenikna˛ć do krwi, staja˛c sie˛ przyczyna˛
uogólnionego, cze˛sto śmiertelnego zakażenia pooperacyjnego.
Po zabiegu stomatologicznym lub chirurgicznym w obre˛bie jamy ustnej może
rozwina˛ć sie˛ rzadka infekcja, w której kanał przetoki prowadzi od wewna˛trz na
powierzchnie˛ skóry twarzy lub szyi, a wydzielina zawiera ,,siarkowe’’ ziarna
promienicy.
Nie jest możliwe w tym miejscu szczegółowe opisanie procedury pobierania próbek z każdego typu rany, ropnia itd. Wydaje sie˛ oczywiste, że to zadanie wymaga bliskiej współpracy mie˛dzy laboratorium i lekarzem. W wielu przypadkach istnieje tylko jedna możliwość pobrania próbki; zazwyczaj nie ma możliwości pobrania kolejnych. Z tego powodu pobieranie,
transport i przechowywanie próbek maja˛ najwie˛ksze znaczenie i wymagaja˛
ścisłego przestrzegania zaleceń. Możliwie najszybciej po pobraniu próbke˛
należy przesłać do laboratorium, gdzie powinna zostać natychmiast opracowana. Po wste˛pnym badaniu i założeniu hodowli pozostała˛ cze˛ść materiału
należy odpowiednio opisać i zachować w warunkach schłodzenia do chwili
uzyskania pewności, że nie ma potrzeby wykonania dodatkowych testów
laboratoryjnych.
Ropień
Jeśli zostanie wykryty ropień lub mnogie ropnie, lekarz prowadza˛cy lub
chirurg i mikrobiolog powinni skonsultować sie˛ w sprawie dalszego poste˛powania. Technika pobierania ropy i fragmentów ściany ropnia jest procedura˛
chirurgiczna˛. Do pobrania możliwie najwie˛kszej obje˛tości materiału ropnego
należy użyć igły i strzykawki, a naste˛pnie przenieść aseptycznie pobrany materiał
do sterylnego pojemnika. Jeśli taki pojemnik nie jest doste˛pny, próbke˛ należy
zatrzymać w strzykawce z zatknie˛ta˛ igła˛ i cała˛ strzykawke˛ przesłać do laboratorium (metoda ta nie jest obecnie polecana z powodu ryzyka ekspozycji na
zakażenie — przyp. tłum.). Materiał powinien natychmiast zostać poddany
obróbce w laboratorium; zarówno hodowle tlenowe jak i beztlenowe można
założyć z jednej próbki.
Ze wzgle˛du na potencjalna˛ konieczność śródoperacyjnego pobrania próbki
w czasie zabiegów, w których przypadkowo stwierdza sie˛ obecność jednego lub
wie˛cej otorbionych ropni w narza˛dach, klatce piersiowej, jamie brzusznej lub
miednicy, w sterylnym chirurgicznym wyposażeniu powinny znaleźć sie˛ zestawy
do pobierania materiału. Za dostarczenie odpowiednich zestawów odpowiedzialne jest laboratorium. W przypadku obecności obfitej ropy należy unikać
pobierania próbek wymazówka˛. Użycie wymazówek uzasadnione jest do pobierania bardzo małych ilości ropy lub z miejsc wymagaja˛cych zachowania ostrożności, np. z oka. Gdy dostarczone zostana˛ fragmenty tkanek ze ścian ropnia, technik
laboratoryjny powinien zmiażdżyć tkanke˛, używaja˛c jako rozpuszczalnika niewielkiej ilość sterylnego bulionu lub rozdrobnić tkanke˛ na bardzo małe kawałki
używaja˛c sterylnych nożyczek. Należy przygotować hodowle tlenowe i beztlenowe w sposób opisany na str. 107.
103
Zakażone skaleczenia, rany dra˛ża˛ce,
rany pooperacyjne, oparzenia
i owrzodzenia odleżynowe
Nie można sformułować standardowej procedury pobierania próbek. Należy
jednak przestrzegać pewnych podstawowych zasad otrzymywania możliwie
najlepszych próbek do badań laboratoryjnych. Po starannym oczyszczeniu
miejsca chirurg powinien odnaleźć zbiornik ropy, martwicze tkanki, rozpoznać
obecność gazu (trzeszczenie) lub inne nieprawidłowe objawy. Fragmenty zaje˛tych tkanek, które zostana˛ użyte do hodowli, powinny zostać pobrane na sterylna˛
gaze˛. Rope˛ lub inny wysie˛k należy pobrać starannie i umieścić w sterylnej
probówce. W razie potrzeby można użyć wymazówek.
Kanały przetoki lub rany drenuja˛ce
we˛złów chłonnych
Jeśli przetoki lub we˛zły chłonne wykazuja˛ objawy samoistnego drenowania,
należy, używaja˛c sterylnej pipety Pasteura wyposażonej w gumowy balonik,
starannie pobrać materiał i umieścić go w sterylnej probówce. Jeśli wydzielina nie
jest widoczna, chirurg powinien pobrać ropny materiał za pomoca˛ strzykawki
i igły. Wymazówki należy stosować tylko wtedy, gdy nie sa˛ doste˛pne pipety
Pasteura.
Wysie˛ki
Nieprawidłowe zbieranie sie˛ płynu w jamie ciała, takiej jak jama opłucnej, staw
lub przestrzeń otrzewnowa, wymaga interwencji chirurgicznej z aspiracja˛
nagromadzonego materiału do sterylnego pojemnika, a naste˛pnie dostarczenia go
do laboratorium w celu wykonania badania mikrobiologicznego i cytologicznego.
W przypadku cia˛głego gromadzenia sie˛ ropy należy założyć otwarty dren,
konieczny do aseptycznego pobrania płynu, w celu wykonania posiewu i innych
badań.
Ocena makroskopowa
Próbki ropy lub wydzieliny z rany pobrane na wymazówki sa˛ trudne do oceny
makroskopowej, szczególnie gdy zostały zanurzone w podłożu transportowym.
Kolor, konsystencja i zapach próbek ropy, otrzymanych w strzykawce lub
w sterylnym pojemniku, powinny być oceniane uważnie przez doświadczonego
mikrobiologa.
Kolor
Ropa może mieć kolor od zielonożółtego do bra˛zowoczerwonego. Czerwony
kolor spowodowany jest domieszka˛ krwi lub hemoglobiny. Aspirat z pierwotnego
ropnia wa˛troby wywołanego pełzakiem ma galaretowata˛ konsystencje˛ i barwe˛ od
żółtobra˛zowej do ciemnobra˛zowej. Ropa z ran pooperacyjnych lub urazowych
104
CZE˛ŚĆ I
(oparzeń) może mieć zabarwienie niebieskozielone z powodu obecności piocyjaniny, wytwarzanej przez Pseudomonas aeruginosa.
Konsystencja
Konsystencja może być różna: od me˛tnego do bardzo ge˛stego i lepkiego
płynu. Wysie˛ki aspirowane ze stawów, jamy opłucnej lub worka osierdziowego sa˛ zwykle płynne, z możliwa˛ gradacja˛ od surowiczego wysie˛ku do typowej ropy.
Ropa organizuja˛ca sie˛ w drenowanym kanale przetoki na szyi powinna zostać
zbadana w kierunku obecności małych żółtych ziaren ,,siarkowych’’, które sa˛
skupiskami promieniowców Actinomyces israelii. Obecność siarkowych ziaren
wskazuje na promienice˛ szyjno-twarzowa˛. Małe różnokolorowe ziarenka (białe,
czarne, czerwone lub bra˛zowe) sa˛typowe dla mycetoma, ziarniniakowych guzów,
które zwykle sa˛ zlokalizowane na kończynach dolnych (np. stopa madurska)
i charakteryzuja˛ sie˛ licznymi ropniami i przetokami. Kolorowe ziarenka odpowiadaja˛ zarówno nitkowatym bakteriom, jak i grzybni.
Ropa z gruźliczych ,,ropni zimnych’’ (ze ska˛pymi objawami zapalenia) porównywana jest z mie˛kkim serem i nazywana ,,serowacieja˛ca˛’’ lub ,,serowata˛ ropa˛’’.
Zapach
Nieprzyjemny zapach jest jedna˛z cech charakterystycznych dla beztlenowych lub
mieszanych tlenowo-beztlenowych zakażeń, ale w pewnych okolicznościach
może nie wyste˛pować. Wste˛pna ocena na podstawie zapachu i morfologii
komórek w preparacie barwionym metoda˛ Grama powinna być niezwłocznie
przedstawiona klinicyście w celu ułatwienia empirycznego wyboru właściwego
antybiotyku. Jest ona także pomocna w podje˛ciu decyzji o konieczności hodowli
beztlenowej.
Z każdej próbki należy wykonać i obejrzeć preparat barwiony metoda˛ Grama.
W niektórych przypadkach lub na polecenie lekarza należy przygotować preparat
bezpośredni barwiony metoda˛ Ziehl-Neelsena.
Barwienie preparatów metoda˛ Grama
Za pomoca˛ ezy nanieść na czyste szkiełko podstawowe najbardziej ropna˛ cze˛ść
próbki. Jeśli doste˛pny jest tylko wymaz, szkiełko należy najpierw wysterylizować
w ogniu nad palnikiem Bunsena i pozostawić do wystygnie˛cia. Bawełniana˛
wymazówke˛ należy delikatnie przetoczyć po powierzchni szkiełka, bez pocierania lub nadmiernego wyciskania. Pozostawić szkiełko do wyschnie˛cia na
powietrzu lub umieścić w cieplarce. Utrwalić przez ogrzanie, wybarwić i ogla˛dać
preparat w immersji (obiektyw × 100). Poszukiwać starannie i odnotować
obecność i liczbe˛ (używaja˛c znaków +):
– wieloja˛drzastych granulocytów (komórki ropy);
105
– Gram-dodatnich ziarenkowców ułożonych w skupiska, sugeruja˛cych gronkowce;
– Gram-dodatnich ziarenkowców w łańcuchach, sugeruja˛cych paciorkowce lub
enterokoki;
– Gram-ujemnych pałeczek podobnych do pałeczki okre˛żnicy (Escherichia coli,
Klebsiella etc.), innych Enterobacteriaceae (Proteus, Serratia etc.), niefermentuja˛cych pałeczek (Pseudomonas spp.) lub bezwzgle˛dnych beztlenowców
(Bacteroides spp.);
– dużych prostych Gram-dodatnich pałeczek z kwadratowymi biegunami, sugeruja˛cych Clostridium perfringens, główna˛ przyczyne˛ zgorzeli gazowej lub
Bacillus anthracis, przyczyne˛ wa˛glika;
– ge˛stej i wielokształtnej mieszaniny bakterii, zawieraja˛cej paciorkowce, Gram-dodatnie i Gram-ujemne pałeczki o różnym kształcie, również wrzecionowce;
taki obraz sugeruje ,,mieszana˛ flore˛ beztlenowa˛’’, która˛ tak należy opisać;
– Candida lub innych komórek grzybów, które widoczne sa˛ jako owalne, Gram-dodatnie, pa˛czkuja˛ce komórki, cze˛sto tworza˛ce rozgałe˛zione pseudogrzybnie.
Ziarenka siarki z promienicy (aktynomykozy) i ziarenka grzybni należy rozdrobnić, wybarwić metoda˛ Grama i poszukiwać Gram-dodatnich cienkich rozgałe˛zień
i fragmentów nici.
Zgodnie z zaleceniem lub gdy prawdopodobne jest grzybicze lub pasożytnicze
zakażenie, należy przygotować niebarwiony preparat. Jeśli ropa jest ge˛sta, oczko
ezy zmieszać z fizjologicznym roztworem soli. Podczas badania w kierunku
grzybów do rozjaśnienia próbki użyć kropli 10% wodorotlenku potasu. Nałożyć
szkiełko nakrywkowe i w powie˛kszeniu obiektywu × 10 – × 40 poszukiwać
zwłaszcza:
– aktywnie ruchomych pełzaków w aspiracie z ropnia wa˛troby;
– komórek grzybów drożdżopodobnych Histoplasma capsulatum (ła˛cznie z afrykańska˛ odmiana˛ var. duboisii), Blastomyces dermatitidis (w regionach
endemicznych), Candida spp.;
– grzybni i filamentacyjnych form bakterii w rozdrobnionych ziarenkach ze
zmian w stopie madurskiej;
– pasożytów, takich jak mikrofilarie, skoleksów i haczyków Echinococcus, jaj
Schistosoma, Fasciola lub Paragonimus.
Barwienie kwasooporne (Ziehl-Neelsena)
Barwienie Ziehl-Neelsena powinno być wykonywane na zlecenie lekarza.
Przygotowanie barwionego w ten sposób preparatu zaleca sie˛ także, gdy w ropie
nie sa˛ widoczne bakterie lub gdy w barwieniu metoda˛ Grama obserwuje sie˛
,,maczugowcowe’’, słabo Gram-dodatnie pałeczki. Obecność pra˛tków gruźlicy
należy podejrzewać zwłaszcza w ropnym wysie˛ku z jamy opłucnej, stawów, ropni
kości lub we˛złów chłonnych. Niegruźlicze (tak zwane atypowe) kwasooporne
pra˛tki znajdowane sa˛ także w ropniach pośladków, w miejscu głe˛bokiej iniekcji
domie˛śniowej. Takie ropnie wywołane sa˛ cze˛sto przez szybko rosna˛ce pra˛tki
należa˛ce do grupy Mycobacterium fortuitum-chelonei. W tropikach wydzielina
zeskrobana z podstawy martwiczego owrzodzenia skóry zlokalizowanego na
nodze lub ramieniu może wykazywać obecność wolno rosna˛cych pra˛tków
106
CZE˛ŚĆ I
kwasoopornych M. ulcerans (owrzodzenie Buruli). M. marinum jest innym
gruźliczopodobnym pra˛tkiem, który może być izolowany z przewlekłych,
wrzodzieja˛cych zmian guzkowych na re˛kach, ramionach i innych eksponowanych
powierzchniach skóry u pływaków i rybaków.
Hodowla
Jeśli w badaniu mikroskopowym widoczne sa˛bakterie lub grzyby, materiał należy
posiać na odpowiednie podłoża. Niezależnie od wyników badania mikroskopowego, wszystkie próbki ropy lub wysie˛ków powinny być posiewane na co
najmniej trzy podłoża hodowlane:
– agar z krwia˛ do izolacji gronkowców i paciorkowców;
– agar MacConkeya do izolacji Gram-ujemnych pałeczek;
– podłoże płynne, które może posłużyć jako podłoże wzbogacone zarówno dla
tlenowców, jak i beztlenowców, np. podłoże tioglikolanowe lub bulion
z wycia˛giem mie˛snym.
Obje˛tość inoculum powinna być uzależniona od wyniku badania mikroskopowego
i waha sie˛ od jednego oczka ezy do kilku kropel. Jeśli w barwieniu metoda˛ Grama
widoczne sa˛ liczne mikroorganizmy, próbka powinna przed posianiem zostać
rozcieńczona w małej ilości sterylnego podłoża płynnego. Jeśli do posiewu
używana jest wymazówka, materiał należy nanieść na niewielki obszar płytki,
a naste˛pnie rozsiać eza˛ na pozostałej powierzchni. Jeśli wymazówka jest sucha
należy ja˛ najpierw zwilżyć mała˛ ilościa˛ sterylnego bulionu lub fizjologicznego
roztworu soli. W każdym przypadku technika posiewu powinna umożliwić
uzyskanie pojedynczych kolonii do identyfikacji i antybiogramu.
Przed posiewem płytke˛ zawieraja˛ca˛ agar z krwia˛ należy suszyć w cieplarce przez
20 minut, minimalizuja˛c w ten sposób ryzyko przerośnie˛cia przez rozprzestrzeniaja˛cy sie˛ Proteus spp. Posiane płytki powinny być inkubowane w 35°C
w eksykatorze. Rutynowo podłoża należy inkubować dwa dni i obserwować
codziennie wzrost. Jeśli prowadzona jest hodowla mikroorganizmów o wysokich
wymaganiach odżywczych, konieczna be˛dzie dłuższa inkubacja (1 – 2 tygodnie
lub wie˛cej). Jeśli wzrost pojawia sie˛ na podłożu płynnym, należy wykonać
preparat barwiony metoda˛ Grama i hodowle przesiać na odpowiednie podłoża. Na
zlecenie lub jeśli na taka˛ konieczność wskazuje wynik badania mikroskopowego,
można zastosować specjalne dodatkowe podłoża hodowlane:
• Jeśli uwidoczniono gronkowce, pomocny w uzyskaniu czystego wzrostu
i wste˛pnego rozróżnienia mie˛dzy S. aureus i innymi ziarenkowcami jest agar
z mannitolem.
• Jeśli zaobserwowano paciorkowce, ich identyfikacja może być przyspieszona
przez umieszczenie na linii pierwszego posiewu różnicuja˛cego kra˛żka z bacytracyna˛.
• Jeśli zaobserwowano drożdże lub grzyby, próbka powinna być także wsiana do
dwóch probówek z agarem Sabouraud, jedna do inkubacji w 35°C, druga
w temperaturze pokojowej, obydwie obserwowane przez miesia˛c (do izolacji
Candida spp. wystarczy agar z krwia˛).
• Jeśli w preparacie barwionym metoda˛ Ziehl-Neelsena uwidoczniono kwasooporne pra˛tki, materiał należy posiać do 3 probówek z podłożem Löwensteina-Jensena. Próbke˛ zawieraja˛ca˛ również niekwasooporne pra˛tki przed posiewem należy dekontaminować. Szybko rosna˛ce bakterie, takie jak M. fortuitum,
moga˛ gina˛ć w procesie dekontaminacji; wyrastaja˛ one na agarze z krwia˛
i agarze MacConkeya w cia˛gu 3 – 7 dni. Rozgałe˛zione, nitkowate, cze˛ściowo
107
kwasooporne pałeczki w ropie z jamy opłucnej lub z ropnia mózgu, które
wyrastaja˛ na agarze z krwia˛ w cia˛gu kilku dni, to prawdopodobnie Nocardia
asteroides.
• Ropa od pacjentów z zapaleniem stawów, zapaleniem opłucnej, zapaleniem kości
lub tkanki podskórnej, zwłaszcza od dzieci do 5 roku życia, powinna być także
posiana na płytke˛ z agarem czekoladowym w celu wykrycia H. influenzae.
• Hodowla w ściśle beztlenowych warunkach jest istotna, gdy w preparacie
barwionym metoda˛ Grama obecna jest mieszana flora beztlenowa lub gdy
próbka charakteryzuje sie˛ typowym zgniłym zapachem. Hodowla na agarze
z krwia˛ w warunkach beztlenowych jest konieczna do uzyskania wzrostu
Actinomyces. Posiew w kierunku beztlenowców prowadzony jest również na
zlecenie klinicysty, który podejrzewa zgorzel gazowa˛. Metody diagnostyki
w zakażeniach bakteriami beztlenowymi opisano na str. 113 – 118.
Identyfikacja
Z wyja˛tkiem zanieczyszczeń ze środowiska lub ze skóry (takich jak Staphylococcus epidermidis) wszystkie drobnoustroje izolowane z ran, ropy lub wysie˛ków
powinny być traktowane jako znacza˛ce i należy je zidentyfikować. Pełna
identyfikacja nie zawsze jest konieczna, zwłaszcza w przypadku flory mieszanej.
Bakterie i grzyby izolowane z ropy i wysie˛ków moga˛ należeć do prawie każdej
grupy lub gatunku. Zostana˛ tu podane tylko zasady identyfikacji gronkowców,
cze˛sto zwia˛zanych z procesami ropnymi (ropotwórczych) i dwóch innych
patogenów, Pasteurella multocida i Bacillus anthracis, rzadko izolowanych z ran
lub zakażeń skóry, ale bardzo istotnych ze wzgle˛du na sposób poste˛powania
z pacjentem. W standardowych podre˛cznikach mikrobiologii klinicznej można
znaleźć pełny opis metod identyfikacji. W każdym przypadku pierwszym etapem
powinno być uważne badanie dobrze odgraniczonych kolonii, pobranie pojedynczej kolonii każdego typu, przygotowanie preparatu barwionego metoda˛ Grama
i obserwacja mikroorganizmów pod mikroskopem.
Gronkowce
Gronkowce sa˛ bakteriami najcze˛ściej zwia˛zanymi z wytwarzaniem ropy. Rosna˛
dobrze w warunkach tlenowych na agarze z krwia˛ i po całonocnej inkubacji
wytwarzaja˛nieprzezroczyste białe lub kremowe kolonie o średnicy 1 – 2 mm. Jako
jedyne rosna˛ na podłożu z dużym ste˛żeniem soli, takim jak MSA. Moga˛ być
różnicowane z paciorkowcami na podstawie morfologii i zdolności wytwarzania
katalazy. Wytwarzanie katalazy można wykazać przez dodanie kropli 3%
nadtlenku wodoru do kolonii umieszczonych na czystym szkiełku. Pojawienie sie˛
pe˛cherzyków tlenu jest wskaźnikiem produkcji katalazy.
Dla potrzeb klinicznych gronkowce można podzielić na takie, które wytwarzaja˛
koagulaze˛, i takie, które jej nie wytwarzaja˛. Koagulazododatnie gronkowce należa˛
do S. aureus, gatunku o najwie˛kszym znaczeniu klinicznym. Spośród wielu
koagulazoujemnych szczepów zostana˛ tu omówione tylko dwa — S. epidermidis
i S. saprophyticus.
Mimo że S. aureus należy do komensalnej flory mikrobiologicznej nosa (40%
zdrowych dorosłych to nosiciele), skóry i przewodu pokarmowego, szczepy tego
108
CZE˛ŚĆ I
gatunku sa˛ odpowiedzialne za liszajec, czyraki, ropnie, zakażenia ran, zakażenia
owrzodzeń i oparzeń, zapalenie szpiku, zapalenie gruczołu sutkowego (ropień
piersi), ropniak opłucnej, ropne zapalenie mie˛śnia, zespół szoku toksycznego
i inne typy ropnych zakażeń.
S. epidermidis jest również cze˛stym komensalem skóry, nosa i innych błon
śluzowych, wykazuje niska˛ chorobotwórczość. Jednakże jego obecność w ropie
nie zawsze powinna być lekceważona i uznawana za zanieczyszczenie ze skóry.
Mimo niskiej infekcyjności S. epidermidis może wywoływać zakażenia skórne
w miejscu wprowadzenia cewnika założonego na stałe, wenflonu lub innych ciał
obcych. Zakażenia S. epidermidis, ucia˛żliwe zwłaszcza w kardiochirurgii i w chirurgii ortopedycznej, zwia˛zane sa˛ z wszczepianiem protez (sztuczne zastawki
serca lub protezy bioder).
S. saprophyticus jest cze˛sta˛ przyczyna˛ zakażeń dróg moczowych u młodych
kobiet, zajmuja˛c w niektórych populacjach druga˛ pozycje˛ po E. coli.
Cechy różnicuja˛ce trzy główne gatunki Staphylococcus podane sa˛ w tabeli 22.
Schemat wste˛pnej identyfikacji gronkowców przedstawiono na rycinie 10.
Gram-dodatnie ziarenkowce
w nieregularnych skupiskach
nie wykazuja˛ce ruchu, nie tworza˛ce spor,
tlenowe lub wzgle˛dnie beztlenowe,
katalazododatnie, zwykle oksydazoujemne,
fermentuja˛ce cukry
▼
Koagulaza
+
–
Staphylococcus
aureus
Agar z trehaloza˛,
mannitolem
i fosfataza˛
▼
Kwas
Bez kwasu
▼
Fosfataza
alkaliczna
Staphylococcus
epidermidis
+
–
Staphylococcus
schleiferi
Oporne na
nowobiocyne˛
▼
+
–
Staphylococcus
saprophyticus
Dekarboksylaza
ornityny
▼
–
+
▼
Ureaza
Staphylococcus
lugdunensis
–
+
Hemoliza
Staphylococcus
warneri/hominis
▼
–
+
Staphylococcus
koagulazoujemne
Staphylococcus
haemolyticus
Ryc. 10. Schemat wste˛pnej identyfikacji gatunku Staphylococcus.
109
Tabela 22. Różnicowanie klinicznie ważnych szczepów Staphylococcus
S. aureus
Wytwarzanie koagulazy
Rozkład mannitolu
S. epidermidis
S. saprophyticus
Tak
Kwaśny (żółty)
Nie
Nie
Oboje˛tny (czerwo- Kwaśny (żółty)
ny)
Pigmentacja koloniia
Szare, kremowe Białe
Białe
lub żółte
Wrażliwość in vitro na nowo- Wrażliwy
Wrażliwy
Opornyb
biocyne˛
Agar z DNaza˛
Tak
Nie
Nie
a
Wyste˛puja˛ wyja˛tki.
Strefa zahamowania mniejsza niż 16 mm, w standaryzowanym teście dyfuzyjno-kra˛żkowym
z 5-mikrogramowym kra˛żkiem.
b
Ze wzgle˛du na znaczenie testu koagulazowego w identyfikacji S. aureus, został on
tutaj szczegółowo opisany. Koagulaza jest enzymem powoduja˛cym krzepnie˛cie
osocza krwi. Gronkowcowa koagulaza wyste˛puje w dwóch formach: zwia˛zanej
koagulazy lub inaczej czynnika aglutynuja˛cego (clumping factor), który wykrywany jest w teście szkiełkowym, oraz wolnej koagulazy, wykrywanej w teście
probówkowym.
• Test szkiełkowy. Na czystym szkiełku utworzyć zawiesine˛ z jednej lub kilku
kolonii gronkowców i kropli fizjologicznego roztworu soli. Zawiesina powinna
być dość ge˛sta. Zanurzyć czysta˛ eze˛ w osoczu i użyć jej do wymieszania osocza
z zawiesina˛ bakterii. Obserwować tworzenie sie˛ kłaczków przez 10 sekund.
Fałszywie ujemne wyniki testu szkiełkowego pojawiaja˛ sie˛ w przypadku około
10% szczepów S. aureus. Jeśli test szkiełkowy jest ujemny dla izolatu, który
wydaje sie˛ patogenny na innej podstawie (pigment, informacje kliniczne),
należy zbadać szczep w teście probówkowym.
• Test probówkowy. Umieścić kilka kropel (0,5 ml) osocza w sterylnej probówce 12 × 75 mm i dodać dwie krople czystej hodowli w bulionie. Zawiesine˛
o porównywalnej ge˛stości można także przygotować bezpośrednio z kolonii
pobranych z agaru z krwia˛. Inkubować probówki w 35°C przez 4 – 18 godzin,
a naste˛pnie obserwować obecność skrzepu.
Osocze używane w teście koagulazowym może być świeżym ludzkim lub
króliczym osoczem z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA). Powinno
być przechowywane w niewielkich porcjach (1 ml) w chłodziarce, a jego przydatność należy kontrolować równolegle z hodowlami S. aureus i S. epidermidis.
Pasteurella multocida
Pasteurella multocida to Gram-ujemne pałeczki najcze˛ściej odpowiedzialne za
cie˛żkie zakażenia u ludzi, wyste˛puja˛ce po ugryzieniach przez zwierze˛ta. Bakteria
ta jest komensalem wchodza˛cym w skład normalnej flory jamy ustnej wielu
zwierza˛t. Rany po ugryzieniach zakażone P. multocida moga˛ dawać objawy
rozległego zapalenia tkanki podskórnej, które może przebiegać z zaje˛ciem
stawów. Opisywano także zapalenia szpiku, bakteriemie, a nawet zapalenia opon
mózgowo-rdzeniowych.
P. multocida powinna być poszukiwana zwłaszcza w wydzielinie z ran powstałych po ugryzieniu przez zwierze˛. Jest bardzo mała˛, Gram-ujemna˛, nieruchliwa˛ziarenko-pałeczka˛. Rośnie dobrze na agarze z krwia˛w 35°C, ale wzrost ulega
całkowitemu zahamowaniu w obecności soli żółciowych, zawartych w podłożach
110
CZE˛ŚĆ I
selektywnych do hodowli bakterii jelitowych, np. agar MacConkeya. Po całonocnej inkubacji kolonie na agarze z krwia˛ sa˛ małe, niehemolizuja˛ce, półprzezroczyste i śluzowe (dzie˛ki obecności otoczki w formie wirulentnej).
Biochemiczna identyfikacja oparta jest na naste˛puja˛cych cechach:
– fermentacja glukozy bez gazu; P. multocida rośnie na agarze Kliglera
z zakwaszeniem słupka;
– test oksydazowy jest słabo dodatni;
– test na wytwarzanie katalazy dodatni;
– redukcja azotanu do azotynu (0,1% azotan potasu w bulionie odżywczym);
– test na wytwarzanie ureazy ujemny;
– wytwarzanie indolu — test w bulionie tryptozowo-sojowym (TSB) lub MIU po
48 godzinach inkubacji;
– wysoka wrażliwość na benzylopenicyline˛ w kra˛żkowym teście wrażliwości.
Bacillus anthracis
Do rodzaju Bacillus należa˛ liczne gatunki tlenowych, tworza˛cych spory, Gram-dodatnich laseczek, powszechnie wyste˛puja˛cych w glebie. Gatunek B. anthracis
wywołuje ważne dla zdrowia publicznego zakażenia skóry. Inne gatunki
izolowane z ran lub ropy sa˛ zwykle zanieczyszczeniem lub w wie˛kszości
mikroorganizmami oportunistycznymi.
B. anthracis jest znacza˛cym patogenem bydła, owiec, kóz i innych domowych
zwierza˛t. Zakażenie wyste˛puje także u dzikich zwierza˛t. Wa˛glik może zakażać
człowieka, a przypadki infekcji wyste˛puja˛ zwłaszcza w Afryce i Azji u osób
pracuja˛cych i żyja˛cych w bliskim kontakcie z żywym inwentarzem. Do zakażenia
ludzi może dojść również przez produkty odzwierze˛ce, zawieraja˛ce spory
wa˛glika, takie jak: wełna, skóry, futro i kości.
Najcze˛stsza˛postacia˛ zakażenia ludzi jest wa˛glik skórny, z którego może rozwina˛ć
sie˛ sepsa i zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych. Spory przechodza˛ przez
uszkodzona˛ skóre˛ i wytwarzaja˛ zmiane˛ pe˛cherzykowa˛ z martwiczym centrum,
otoczona˛ przez rozległy obrze˛k (,,czarna krosta’’). W preparatach sporza˛dzonych
z płynu pe˛cherzykowego widoczne sa˛ duże Gram-dodatnie, kwadratowo zakończone, otoczkowe pałeczki bez spor.
B. anthracis rośnie w warunkach tlenowych. Na agarze z krwia˛ wytwarza duże,
płaskie, szarawe kolonie, do 5 mm średnicy, o nieregularnych brzegach i szorstkiej, przypominaja˛cej kłe˛bowisko nici strukturze powierzchni (głowa Meduzy).
Na tym etapie ważne jest różnicowanie wysoce patogennych B. anthracis od
ogólnie niechorobotwórczych gatunków saprofitycznych.
Wste˛pne różnicowanie powinno być oparte na takich cechach, jak: brak hemolizy, wrażliwość na benzylopenicyline˛ oraz brak ruchu u B. anthracis. Saprofityczne gatunki Bacillus wykazuja˛ ruch i sa˛ silnie hemolityczne. Powyższe
trzy cechy moga˛ stanowić podstawe˛ wste˛pnej identyfikacji. W celu przeprowadzenia ostatecznej identyfikacji czyste hodowle izolatów należy przesłać
niezwłocznie do centralnego laboratorium weterynaryjnego lub innego referencyjnego ośrodka.
B. anthracis jest wysoce zakaźnym drobnoustrojem, z tego wzgle˛du próbki
i hodowle powinny być przesyłane ze szczególnym zachowaniem zasad ostrożności, aby unikna˛ć skażenia środowiska i zakażeń personelu laboratoryjnego.
111
Zastosowanie antybiotyków w leczeniu pacjentów z ranami, ropniami lub
wysie˛kami nie zawsze jest konieczne. Odpowiednie chirurgiczne nacie˛cie, drenaż
i opracowanie rany sa˛ najcze˛ściej ważniejsze niż antybiotykoterapia.
Wynik antybiogramu powinien być doste˛pny w cia˛gu 48 godzin od otrzymania
próbki.
Rutynowo badanie lekowrażliwości nie powinno być wykonywane dla bakterii
o znanej wrażliwości, takich jak paciorkowce, Pasteurella i Actinomyces, które
w wie˛kszości sa˛ wrażliwe na benzylopenicyliny.
W przypadku Enterobacteriaceae, niefermentuja˛cych Gram-ujemnych pałeczek
i gronkowców, lekowrażliwość należy określić z zastosowaniem testu dyfuzyjno-kra˛żkowego dla aktualnie zalecanych antybiotyków. Wrażliwość na nowe
i drogie antybiotyki powinna być oznaczana (lub raportowana) tylko na specjalne
zlecenie lub gdy szczep wykazuje oporność na inne leki przeciwbakteryjne.
Problem stanowi lekooporność, zarówno S. aureus, jak i S. epidermidis. Ponad
80% szczepów, także pozaszpitalnych, wytwarza β-laktamazy i wykazuje
oporność na benzylopenicyline˛ i ampicyline˛. Zakażenia wywołane przez szczepy
oporne na benzylopenicyline˛ sa˛ cze˛sto leczone stabilnymi wobec β-laktamaz
penicylinami z grupy metycyliny (oksacylina, kloksacylina itp.). W antybiogramie zalecane jest użycie kra˛żka z oksacylina˛ (1 µg). Kra˛żki z oksacylina˛ sa˛
stabilne i skutecznie wykrywaja˛ oporność na cała˛ grupe˛ (szczepy oporne na
wszystkie antybiotyki β-laktamowe określane sa˛jako oksacylino- lub metycylinooporne, tzw. MR — przyp. tłum.). Oporność ma cze˛sto charakter heterogenny, np.
obejmuje tylko cze˛ść populacji bakterii. Niejednorodna oporność gronkowców
jest łatwiej identyfikowana w niskich temperaturach, z tego powodu temperatura
inkubacji nie powinna przekraczać 35°C. Szczepy o heterogennej oporności
w strefie zahamowania wzrostu wokół kra˛żka, wykazuja˛ mgławicowy wzrost lub
tworza˛ liczne drobne kolonie, które cze˛sto bywaja˛ traktowane jako zanieczyszczenie. Jeśli pojawia sie˛ taki wzrost, konieczne jest przygotowanie preparatu
barwionego metoda˛ Grama w celu wykluczenia zanieczyszczenia.
Heterooporne szczepy sa˛ klinicznie oporne na wszystkie antybiotyki β-laktamowe, w tym penicyliny, cefalosporyny i karbapenemy. Z tego powodu dla
gronkowców nie należy oznaczać wrażliwości na cefalosporyny. Istnieje także
pełna krzyżowa oporność mie˛dzy benzylopenicylina˛ i ampicylina˛. Nie należy
wie˛c określać wrażliwości gronkowców na ampicyline˛.
112
Zakażenia bakteriami beztlenowymi
Wprowadzenie
W niniejszym opracowaniu opisane sa˛ bakterie beztlenowe i najcze˛ściej wywoływane przez nie infekcje. Zakażenia beztlenowcami moga˛ dotyczyć praktycznie
każdej tkanki i moga˛ być zlokalizowane w każdym miejscu, jeśli zaistnieja˛
odpowiednie warunki.
Wie˛kszość zakażeń bakteriami beztlenowymi wywołana jest przez endogenne
szczepy, które w stanie zdrowia wchodza˛ w skład normalnej flory ciała,
wywołuja˛c infekcje w przypadku zakłócenia równowagi w ilościowym składzie flory fizjologicznej lub w wyniku przemieszczenia sie˛ bakterii do innego
regionu anatomicznego. Egzogenne bakterie beztlenowe, najcze˛ściej Clostridium tetani, C. botulinum, rzadziej C. perfringens oraz inne gatunki laseczek, moga˛ zakażać rany i sa˛ przyczyna˛ odpowiednio te˛żca, botulizmu
przyrannego lub zgorzeli gazowej. Ropień, który może być zlokalizowany
praktycznie w każdym narza˛dzie, bakteriemia, zapalenie jamy otrzewnej, ropniak
opłucnej, zapalenie tkanki podskórnej i zapalenie wyrostka robaczkowego to
tylko kilka przykładów chorób, w których bardzo ważna˛ role˛ odgrywaja˛ bakterie
beztlenowe. W zwia˛zku z powyższym, ważne jest, aby mikrobiolog wiedział,
kiedy i jak należy prowadzić hodowle w kierunku bakterii beztlenowych
z określonej próbki klinicznej.
Podział bakterii ze wzgle˛du na wymagania
tlenowe
Być może zbyt uproszczony, lecz dobrze funkcjonuja˛cy podział bakterii o znaczeniu klinicznym oparty jest na wymaganiach tlenowych i wyróżnia:
• Bezwzgle˛dnie tlenowe bakterie wymagaja˛ce do uzyskania energii tlenu gazowego; nie rosna˛ przy braku tlenu. Przykładami bezwzgle˛dnych tlenowców sa˛:
Micrococcus spp. i Nocardia asteroides.
• Bezwzgle˛dnie beztlenowe bakterie prowadza˛ce przemiany metaboliczne
bez udziału tlenu, który dla wielu z nich jest toksyczny. Energie˛ uzyskuja˛ w reakcjach fermentacji, z wytworzeniem cuchna˛cych produktów
końcowych. Przykładami mikroorganizmów należa˛cych do tej grupy sa˛
takie bakterie beztlenowe, jak Bacteroides fragilis i Peptostreptococcus
magnus.
• Wzgle˛dnie beztlenowe bakterie, które do wzrostu i wytwarzania energii nie
wymagaja˛ bezwzgle˛dnie tlenu; moga˛ zarówno wykorzystywać tlen, jak i rosna˛ć
w warunkach beztlenowych. Sa˛najbardziej rozpowszechnione, zwykle adaptuja˛ sie˛ do środowiska, uzyskuja˛c energie˛ potrzebna˛ do wzrostu i namnażania
najbardziej efektywnym sposobem. Przykładami wzgle˛dnie beztlenowych
bakterii sa˛ E. coli i S. aureus.
Oprócz wyżej wymienionych istnieja˛ bakterie mikroaerofilne, które najlepiej
rosna˛ w atmosferze z obniżonym ste˛żeniem tlenu. Przykładem bakterii mikroaerofilnej jest Campylobacter jejuni.
113
ZAKAŻENIA BAKTERIAMI BEZTLENOWYMI
Diagnostyka zakażeń bakteriami
beztlenowymi
Za blisko 80% diagnozowanych zakażeń beztlenowych odpowiedzialne sa˛ cztery
najwie˛ksze grupy beztlenowców. Należa˛ do nich: Bacteroides, Prevotella
i Porphyromonas spp., Peptostreptococcus spp. oraz Clostridium spp. Najcze˛ściej
spotykane gatunki z każdego rodzaju to: Bacteroides fragilis, Peptostreptococcus
magnus i Clostridium perfringens. Specyficzne metody izolacji i identyfikacji
tych trzech rodzajów i gatunków powinny służyć jako model izolacji i wste˛pnej
identyfikacji innych klinicznie ważnych bakterii beztlenowych.
Pobieranie próbek i transport do laboratorium
Procedury pobierania materiału zostały opisane we wcześniejszych rozdziałach.
Ponieważ beztlenowce sa˛ bardzo wrażliwe na tlen atmosferyczny i wysychanie,
przy pobieraniu próbek należy unikać stosowania zwykłych wymazówek. Próbki
do hodowli beztlenowców należy uważnie pobierać z miejsca aktywnej infekcji.
W niektórych przypadkach może być konieczna pomoc chirurga. Dotyczy to
szczególnie aspiracji ropy, pobierania tkanek i/lub próbek ropy z zakażonych ran,
ropniaków lub dra˛ża˛cych ropni.
Próbke˛ należy umieścić w sterylnym, szczelnie zamknie˛tym pojemniku lub, jeśli
to niemożliwe, niezwłocznie przesłać do laboratorium cały zaaspirowany materiał
w strzykawce, z igła˛ osłonie˛ta˛ zatyczka˛ lub gumowym korkiem.
Przygotowanie warunków beztlenowych
do inkubacji hodowli
Istnieja˛różne metody wytwarzania środowiska beztlenowego. Jedna˛z nich, prosta˛
i niedroga˛, jest użycie anaerostatu z cienkiego szkła lub poliwe˛glanu o obje˛tości
2,5 – 3,5 litrów, wyposażonego w nieprzepuszczaja˛ca˛ powietrza pokrywe˛, która˛
można łatwo usuna˛ć czy wymienić. Po włożeniu płytek Petriego w anaerostacie
należy umieścić komercyjnie doste˛pne, jednorazowe saszetki wytwarzaja˛ce
beztlenowa˛ atmosfere˛ i zamkna˛ć pokrywe˛. Jednorazowe saszetki wytwarzaja˛ce
warunki beztlenowe maja˛ forme˛ płaskich, zapiecze˛towanych kopert, które po
dodaniu wody (lub bez — przyp. tłum.) uwalniaja˛ wodór i dwutlenek we˛gla.
Opisane zestawy wymagaja˛ katalizatora palladowego przytwierdzonego do spodu
pokrywy słoja. Podczas używania katalizator ulega inaktywacji i wymaga
wymiany w regularnych, zalecanych przez producenta odste˛pach czasu. Jednorazowe paski wskaźnikowe redox, które w warunkach beztlenowych zmieniaja˛
kolor z niebieskiego (lub czerwonego) na bezbarwny, sa˛ szeroko doste˛pne
komercyjnie.
Probówki z płynnym podłożem do hodowli bakterii beztlenowych, takim jak
podłoże tioglikolanowe lub bulion z wycia˛giem mie˛snym, nie musza˛ być
inkubowane w beztlenowych warunkach, ponieważ wchodza˛ce w ich skład
substancje wytwarzaja˛ środowisko beztlenowe. Jeśli obje˛tość podłoża jest
wystarczaja˛ca (10 – 12 ml w probówce o standardowej średnicy 15 mm) i jest ono
świeżo przygotowane, warunki beztlenowe uzyskuje sie˛ w dolnej cze˛ści probówki. Nie zużyte w dniu przygotowania podłoża powinny być zregenerowane przez
114
CZE˛ŚĆ I
15-minutowe ogrzewanie w łaźni wodnej probówek z poluzowana˛ zakre˛tka˛,
w celu wyeliminowania rozpuszczonego tlenu; po ogrzaniu należy dokre˛cić
nakre˛tke˛ i pozostawić do wystygnie˛cia.
Podłoża do hodowli bakterii beztlenowych
Hodowle w kierunku bakterii beztlenowych powinny być prowadzone na zlecenie
lekarza, jeśli próbka ma cuchna˛cy zapach lub jeśli wyniki barwienia metoda˛
Grama sugeruja˛ obecność beztlenowych mikroorganizmów, np.: obecność mieszanej, polimorficznej flory Gram-dodatnich oraz Gram-ujemnych pałeczek
i ziarenkowców, obecność Gram-ujemnych wrzecionowców lub kwadratowo
zakończonych cienkich Gram-dodatnich laseczek, które moga˛ wskazywać na
Clostridium.
Badań w kierunku bakterii beztlenowych rutynowo nie należy wykonywać
w przypadku próbek moczu, wydzielin z narza˛dów płciowych, kału lub odkrztuszonej plwociny. Obecność bakterii beztlenowych w tych próbkach wskazuje na zanieczyszczenie komensalna˛ flora˛ fizjologiczna˛, właściwa˛ dla miejsca
pochodzenia próbki. Klinicyści powinni zostać poinformowani, że próbki
zawieraja˛ce flore˛ fizjologiczna˛ nie nadaja˛ sie˛ do hodowli beztlenowych, z wyja˛tkiem ważnych wskazań klinicznych.
Zwykły agar z krwia˛ jest dobrym podłożem stałym do izolacji najważniejszych
patogenów beztlenowych. Dla bardziej wymagaja˛cych gatunków zalecany jest
agar z krwia˛wzbogacony w czynniki wzrostu (hemina i menadion). Takie podłoża
sa˛ komercyjnie doste˛pne jako agar beztlenowy Wilkins-Chalgrena.
Bakterie beztlenowe cze˛sto sa˛ cze˛ścia˛ złożonej mikroflory zawieraja˛cej także
drobnoustroje tlenowe, sta˛d należy przygotować selektywny agar do hodowli
beztlenowców, dodaja˛c jeden lub wie˛cej specyficznych czynników hamuja˛cych
wzrost bakterii tlenowych. Na przykład dodanie aminoglikozydu (neomycyna,
kanamycyna) w końcowym ste˛żeniu 50 µg/ml hamuje wzrost wie˛kszości
tlenowych i wzgle˛dnie beztlenowych bakterii. Roztwór aminoglikozydu przygotowywany jest przez rozpuszczenie 500 mg w 100 ml wody destylowanej. Na
100 ml podłoża agarowego do hodowli beztlenowców, po ostudzeniu do 56°C,
należy dodać aseptycznie 5 ml odwłóknionej krwi i 1 ml roztworu antybiotyku.
Dobrze wymieszać i rozlać po 15 – 18 ml do sterylnych płytek Petriego. Płytki
powinny zostać jak najszybciej zużyte lub przechowywane w chłodziarce,
najlepiej w plastikowym woreczku lub re˛kawie.
Procedury posiewu i izolacji
Przy podejrzeniu zakażenia bakteriami beztlenowymi próbki należy niezwłocznie
posiać na jedno z poniższych podłoży:
– agar do hodowli beztlenowców do inkubacji w anaerostacie;
– agar do hodowli beztlenowców do inkubacji w eksykatorze;
– agar MacConkeya;
– podłoże płynne do hodowli beztlenowców (z tioglikolanem lub wycia˛giem
mie˛snym).
Hodowle w kierunku bakterii tlenowych należy zakładać zgodnie z obowia˛zuja˛ca˛
procedura˛, a równoległe posiewy tlenowe materiału przegla˛dać po 24 i 48 godzi-
115
nach inkubacji. Na niewielka˛ powierzchnie˛ płytki z podłożem dla bakterii
beztlenowych nałożyć badany materiał i rozsiać go za pomoca˛ ezy. Płytki należy
umieścić w anaerostacie i odczytać po 48 godzinach inkubacji. Jeśli wzrost nie jest
wystarczaja˛cy, konieczna jest dalsza inkubacja przez 24 – 48 godzin. Hodowle na
podłożach płynnych należy zakładać posiewaja˛c duża˛ obje˛tość materiału za
pomoca˛ pipety Pasteura, tak by rozprowadzić inoculum w całym podłożu.
Po 48 godzinach należy skontrolować wzrost na agarze z krwia˛ do hodowli
beztlenowców i porównać ze wzrostem obserwowanym na podłożach do hodowli
tlenowych. Z każdego typu kolonii należy wykonać preparat barwiony metoda˛
Grama. Obserwowane w preparacie bakterie o tej samej morfologii, które rosna˛
zarówno na agarze tlenowym, jak i beztlenowym, to prawdopodobnie wzgle˛dne
beztlenowce. Kolonie, które pojawiaja˛ sie˛ na agarze tylko w warunkach
beztlenowych, to przypuszczalnie beztlenowce, które należy przesiać na dwa
podłoża agarowe z krwia˛, jedno do inkubacji w anaerostacie, drugie w eksykatorze. Jeżeli wzrost pojawi sie˛ tylko na podłożu inkubowanym w anaerostacie, prowadzić identyfikacje˛ czystej kolonii w kierunku bakterii beztlenowych.
Jeśli obserwuje sie˛ wzrost w głe˛bokich warstwach podłoża płynnego do hodowli
beztlenowców, konieczny jest posiew na podłoża agarowe dla bakterii tlenowych
i beztlenowych, z którymi należy poste˛pować podobnie, jak w przypadku
pierwszego posiewu. Jeżeli do podłoża płynnego wsiano duża˛ obje˛tość ropy,
wynik hodowli może być dodatni, przy jednoczesnym ujemnym wyniku posiewu
na podłożach stałych.
Identyfikacja klinicznie ważnych beztlenowców
Grupa Bacteroides fragilis
Grupa obejmuje kilka spokrewnionych gatunków należa˛cych do fizjologicznej
flory jelit i pochwy. Cze˛sto sa˛ one odpowiedzialne za mieszane zakażenia
w obre˛bie jamy brzusznej i miednicy, moga˛ również wywoływać bakteriemie˛.
B. fragilis jest nieruchliwa˛ Gram-ujemna˛ pałeczka˛, cze˛sto wykazuja˛ca˛ polimorfizm, która rośnie szybko na agarze do hodowli beztlenowców. Po 48 godzinach
pojawiaja˛sie˛ średniej wielkości (do 3 mm średnicy), półprzezroczyste, szarobiałe,
niehemolizuja˛ce kolonie. Szybkiej identyfikacji można dokonać na podstawie
testu z żółcia˛. Czysta kolonia badanego drobnoustroju posiewana jest głe˛boko do
dwóch probówek z płynnym podłożem tioglikolanowym, z których jedna zawiera
20% (2 ml w 10 ml) sterylnej żółci wołowej. Po 24 godzinach należy porównać
wzrost w obu probówkach: wzrost B. fragilis jest wyraźnie stymulowany
w bulionie z dodatkiem żółci.
Rodzaj Clostridium obejmuje wiele gatunków Gram-dodatnich, wytwarzaja˛cych
spory laseczek; niektóre z nich należa˛ do normalnej flory przewodu pokarmowego, inne wyste˛puja˛ w kurzu i glebie. Gatunkiem o najwie˛kszym znaczeniu
klinicznym jest C. perfringens. Bakteria ta zwia˛zana jest ze zgorzela˛ gazowa˛,
może również wywoływać bakteriemie˛ lub inne poważne infekcje. W przeciwieństwie do pozostałych gatunków C. perfringens nie wykazuje zdolności ruchu i nie
wytwarza spor w zakażonych tkankach lub młodych hodowlach.
116
CZE˛ŚĆ I
C. perfringens rośnie szybko na płynnym podłożu do hodowli beztlenowców,
wytwarzaja˛c duże ilości gazu. Na agarze beztlenowym po 48 godzinach
obserwowane sa˛ średniej wielkości (2 – 3 mm) kolonie. Wie˛kszość szczepów
wytwarza podwójna˛ strefe˛ hemolizy: wewne˛trzna˛ strefe˛ całkowitej hemolizy
i zewne˛trzna˛ strefe˛ hemolizy cze˛ściowej.
Szybka identyfikacja jest możliwa na podstawie wyniku odwrotnego testu
CAMP1, który przeprowadza sie˛ w poniżej opisany sposób (patrz ryc. 11)2:
1. Przygotować płytke˛ z podłożem agarowym z dodatkiem 5% przepłukanej
trisem krwi baraniej.
2. Nałożyć czysta˛ hodowle˛ Streptococcus agalactiae wzdłuż średnicy płytki.
Posiać badana˛hodowle˛ Clostridium prostopadle do linii posiewu S. agalactiae,
nie dotykaja˛c jej.
3. Inkubować w anaerostacie przez 24 godziny.
C. perfringens tworzy w miejscu skrzyżowania posiewów strefe˛ widocznej
hemolizy, kształtem przypominaja˛ca˛ strzałe˛. Laseczki ujemne w odwrotnym
teście CAMP moga˛ zostać opisane jako ,,Clostridium spp. nie-C. perfringens’’.
Ryc. 11. Odwrotny test CAMP.
Peptostreptococcus
Niektóre gatunki bezwzgle˛dnie beztlenowych Gram-dodatnich ziarenkowców
należa˛ do komensalnej flory układu oddechowego, pokarmowego i moczowo-płciowego. Wywołuja˛, zwykle wraz z innymi tlenowymi i beztlenowymi
bakteriami, ropnie, zakażenia ran, a nawet bakteriemie˛. Wzrost beztlenowych
1
Odwrotny test CAMP: nazwa pochodzi od nazwisk Christy, Adkins i Munch-Peterson, którzy
pierwsi opisali te˛ reakcje˛ u paciorkowców grupy B.
2
Hansen M.V., Elliot L.P.: New presumptive identification test for Clostridium perfringens: reverse
CAMP test. Journal of Clinical Microbiology, 1980, 12: 617 – 619.
117
ziarenkowców na podłożach laboratoryjnych zwykle jest wolniejszy niż wzrost
Bacteroides i Clostridium, a kolonie na agarze z krwia˛pojawiaja˛ sie˛ nie wcześniej
niż po 48 godzinach inkubacji.
W rutynowej diagnostyce zakażeń beztlenowcami identyfikacja gatunków nie jest
konieczna. Gram-dodatnie ziarenkowce, które nie rosna˛ w warunkach tlenowych,
a na agarze z krwia˛ dla bakterii beztlenowych wytwarzaja˛ niewielkie, wypukłe,
białe kolonie, moga˛ być z dużym prawdopodobieństwem uznane za Peptostreptococcus spp.
Badanie wrażliwości na antybiotyki
Antybiogram dla bakterii beztlenowych nie powinien być wykonywany rutynowo, ze wzgle˛du na brak wiarygodności metody dyfuzyjno-kra˛żkowej.
Wie˛kszość zakażeń wywołana jest przez wrażliwe na penicyline˛ bakterie,
z wyja˛tkiem infekcji wywodza˛cych sie˛ z przewodu pokarmowego lub pochwy.
W zakażeniach takich zazwyczaj obecne sa˛ Bacteroides fragilis, które wytwarzaja˛c β-laktamazy sa˛ oporne na penicyliny i wie˛kszość cefalosporyn. Lekiem
z wyboru w tych infekcjach jest klindamycyna, metronidazol lub chloramfenikol.
Aminoglikozydy i chinolony nie wykazuja˛aktywności wobec beztlenowców, lecz
moga˛ być stosowane z powodu aktywności wobec bakterii tlenowych, które
cze˛sto wyste˛puja˛ w zakażeniach mieszanych.
118
Oznaczanie wrażliwości
na antybiotyki
Wprowadzenie
W Genewie podczas spotkania zorganizowanego w 1977 r. przez WHO1
wyrażono niepokój dotycza˛cy obserwowanego na świecie narastania oporności na
antybiotyki, zwia˛zanej z cze˛sto nieograniczonym wzrostem stosowania antybiotyków zarówno u ludzi, jak i zwierza˛t. W ostatnich latach lekooporne bakterie
były przyczyna˛ kilku poważnych epidemii zakażeń o dużej śmiertelności.
Doprowadziło to do potrzeby wprowadzenia krajowych i mie˛dzynarodowych
programów kontroli monitoruja˛cych antybiotykooporność bakterii na podstawie
oceny lekowrażliwości z zastosowaniem wiarygodnych metod, które pozwoliłyby
uzyskać porównywalne dane. Doste˛pność mikrobiologicznych i epidemiologicznych danych ułatwi klinicyście wybór możliwie najlepszego preparatu przeciwbakteryjnego w leczeniu zakażeń.
Aby założenia te były skuteczne, należy odpowiednia˛, powtarzalna˛ metoda˛
przeprowadzić oznaczenia lekowrażliwości, której wyniki powinny mieć bezpośrednie zastosowanie kliniczne. Najwyższym kryterium wiarygodności każdej
metody oznaczania wrażliwości jest korelacja wyniku z odpowiedzia˛ pacjenta na
leczenie przeciwbakteryjne.
Na spotkaniu WHO ustalono, że ze wzgle˛du na prostote˛ i powtarzalność, zarówno
dla celów klinicznych, jak i w monitorowaniu, zalecana jest zmodyfikowana
metoda dyfuzyjno-kra˛żkowa Kirby-Bauera2, dla której wymagania zostały ustalone przez WHO w 1976 r. Metoda jest szczególnie zalecana dla bakterii należa˛cych
do rodziny Enterobacteriaceae, lecz może być stosowana również w przypadku
wszystkich szybko rosna˛cych patogenów. Metoda ta została także przystosowana
dla najważniejszych klinicznie bakterii o wyższych wymaganiach odżywczych,
z wyja˛tkiem ścisłych beztlenowców i mykobakterii. Jest rekomendowana,
ponieważ poszczególne elementy testu sa˛ możliwe do wykonania przez pracowników laboratorium3.
Podstawowe zasady oznaczania
lekowrażliwości
Testy wrażliwości na antybiotyki określaja˛ zdolność czynnika przeciwbakteryjnego do zahamowania wzrostu bakterii in vitro. Zdolność te˛ można oznaczyć
zarówno metoda˛ rozcieńczeń, jak i metoda˛ dyfuzyjna˛.
1
Surveillance for the prevention and control of health hazards due to antibiotic-resistant
enterobacteria. Geneva, World Health Organization, 1978 (WHO Technical Report Series, No. 624).
2
WHO Expert Committee on Biological Standardization. Twenty-eighth report. Geneva, World
Health Organization, 1977 (WHO Technical Report Series, No. 610).
3
Metoda˛ porównywalna˛ do metody Kirby-Bauera, oparta˛ na tych samych zasadach i wymaganiach
kontroli jakości, jest metoda NEO-SENSITABS, produced ROSCO Diagnostica, Taastrup, Dania.
W metodzie zamiast bibułowych kra˛żków stosowane sa˛ 9-milimetrowe oznaczone kolorem tabletki
przeciwbakteryjne. Forma tabletek gwarantuje wyja˛tkowa˛ stabilność antybiotyku z okresem przechowywania do czterech lat, nawet w temperaturze pokojowej. Zwie˛kszona stabilność jest bardzo ważna
dla laboratoriów w krajach tropikalnych.
119
OZNACZANIE WRAŻLIWOŚCI NA ANTYBIOTYKI
Test rozcieńczeń
Rozcieńczenia antybiotyku do ilościowej oceny aktywności przeciwbakteryjnej
można przygotować w bulionie lub podłożu agarowym, które naste˛pnie inkubuje
sie˛ z badanym mikroorganizmem. Najniższe ste˛żenie preparatu, które po
całonocnej inkubacji hamuje wzrost szczepu, określa sie˛ jako minimalne ste˛żenie
hamuja˛ce (MIC — minimum inhibitory concentration). Wartość MIC porównuje
sie˛ naste˛pnie ze znanym ste˛żeniem leku, jakie osia˛gane jest w surowicy i innych
płynach ustrojowych, aby ocenić przypuszczalna˛ odpowiedź kliniczna˛.
Test dyfuzji
Bibułowe kra˛żki nasa˛czone określona˛ ilościa˛ antybiotyku umieszcza sie˛ na
podłożu agarowym z równomiernie posianym badanym drobnoustrojem. Gradient
ste˛żenia antybiotyku tworzy sie˛ przez dyfuzje˛ z kra˛żka, a powstała strefa
zahamowania wokół kra˛żka koreluje, wśród innych czynników, z wrażliwościa˛
szczepu.
Istnieje prawie liniowa zależność pomie˛dzy log MIC, mierzonym w teście
rozcieńczeń, i średnica˛ strefy zahamowania w teście dyfuzyjnym. Linie˛ regresji
wyrażaja˛ca˛ te˛ zależność można uzyskać badaja˛c duża˛ liczbe˛ szczepów równocześnie dwoma metodami (patrz ryc. 12 i 13).
Kliniczna definicja terminów ,,oporny’’
i ,,wrażliwy’’
Wynik badania wrażliwości w formie przedstawianej lekarzowi kwalifikuje
mikroorganizm do jednej z dwóch lub wie˛cej kategorii wrażliwości. Najprostszy
system składa sie˛ jedynie z dwóch kategorii: wrażliwy i oporny. Klasyfikacja,
35
30
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
25
20
•
15
•
•
•
•
•
10
•
•
6
0,03 0,06 0,12 0,25 0,5
1
2
4
8
16
32
••
64
MIC (µg/ml)
WHO 90961
Ryc. 12. Graficzna prezentacja korelacji mie˛dzy wartościa˛ log2MIC i strefa˛ zahamowania
wzrostu uzyskiwana˛ w metodzie dyfuzyjnej z użyciem kra˛żków zawieraja˛cych jedno,
określone ste˛żenie antybiotyku.
120
CZE˛ŚĆ I
mimo że ze wzgle˛dów statystycznych i epidemiologicznych posiada wiele zalet,
jest zbyt sztywna dla klinicysty. Dlatego cze˛sto przyjmuje sie˛ klasyfikacje˛ trzech
kategorii. Metoda Kirby-Bauera i jej modyfikacja uwzgle˛dniaja˛ trzy kategorie
wrażliwości i ważne jest, aby zarówno lekarz, jak i pracownik laboratorium
rozumieli ich dokładne definicje i znaczenie kliniczne.
35
S
Średnica strefy
(mm)
Średnice
graniczne
I
25
20
●
1 14
R
— — — — — — — — — — — — —
— — — — — — — — — — — — — — — — — —
●
1 27
15
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
10
6
0,03 0,06 0,12 0,25 0,5
S
▲
1
2
I
4
— — — — — — —
S – susceptible/wrażliwy
I – intermediate/średnio wrażliwy
R – resistant/oporny
30
8
▲
16
R
32
64
MIC (µg/ml)
WHO 90962
Ryc. 13. Interpretacja wielkości stref (wrażliwy, średnio wrażliwy, oporny) w odniesieniu
do wartości MIC.
• Wrażliwy. Mikroorganizm określany jest jako ,,wrażliwy’’ na antybiotyk, jeśli
odpowiedź kliniczna na leczenie danym antybiotykiem, stosowanym w zalecanych dawkach, jest prawdopodobna.
• Średnio wrażliwy dotyczy dwóch sytuacji. Określa szczepy o ,,umiarkowanej
wrażliwości’’ na antybiotyk, który może być zastosowany w leczeniu w wie˛kszej dawce (np. β-laktam) z powodu niskiej toksyczności lub koncentracji
w ognisku zakażenia (np. mocz). Klasyfikacja odnosi sie˛ również do szczepów
wykazuja˛cych ,,średnia˛ wrażliwość’’ na bardziej toksyczne antybiotyki (np.
aminoglikozydy), które nie moga˛być zastosowane w wyższych dawkach. W tej
sytuacji pośrednia kategoria stanowi strefe˛ buforowa˛ mie˛dzy wrażliwościa˛
i opornościa˛.
Podobnie jak wie˛kszość klinicystów nie jest świadoma, mimo klinicznego
znaczenia, subtelnej różnicy mie˛dzy średnia˛ i umiarkowana˛ wrażliwościa˛,
wiele laboratoriów w obydwu sytuacjach używa określenia ,,średnia’’.
• Oporny. Ten termin wskazuje, że niezależnie od zastosowanej dawki i lokalizacji infekcji, oczekiwany jest brak odpowiedzi klinicznej na dany antybiotyk.
W pewnych sytuacjach, na przykład w badaniu odpowiedzi gronkowców na
benzylopenicyline˛, istnieja˛tylko kategorie ,,wrażliwy’’ i ,,oporny’’ (odpowiadaja˛ce zdolności do wytwarzania β-laktamaz).
Najlepsza decyzja o użyciu określonego antybiotyku i stosowanego dawkowania
zależy nie tylko od wyników antybiogramu, ale również od jego interpretacji
przez lekarza. Należy wzia˛ć pod uwage˛ także inne czynniki, takie jak właściwości
chorobotwórcze mikroorganizmu, działania uboczne i farmakokinetyczne właściwości leku, jego przenikanie do różnych obszarów ciała oraz status immunologiczny pacjenta.
121
Wskazania do rutynowego oznaczania
lekowrażliwości
Antybiogram w laboratorium klinicznym może zostać wykonany w dwóch celach:
• aby ukierunkować lekarza w wyborze najlepszego leku przeciwbakteryjnego
indywidualnie dla pacjenta;
• aby gromadzić informacje epidemiologiczne o oporności mikroorganizmów
o istotnym znaczeniu dla zdrowia publicznego.
Antybiogram jako wskazówka
do leczenia
Antybiogramy nigdy nie powinny być wykonywane dla zanieczyszczaja˛cych
próbke˛ lub komensalnych mikroorganizmów, należa˛cych do flory fizjologicznej,
oraz innych, nie maja˛cych zwia˛zku z procesem zakażenia. Na przykład obecność
Escherichia coli w moczu w liczbie mniejszej od znacza˛cej nie jest uważana za
przyczyne˛ infekcji i wykonanie antybiogramu byłoby bezcelowe lub wre˛cz
myla˛ce.
Antybiogramy powinny być wykonywane tylko z czystych hodowli mikroorganizmów prawdopodobnie wywołuja˛cych zakażenie.
Rutynowe badanie wrażliwości nie jest wskazane w naste˛puja˛cych sytuacjach:
• Jeśli drobnoustrój należy do gatunku z przewidywalna˛ wrażliwościa˛ na
określony lek. Tak jest w przypadku Streptococcus pyogenes i Neisseria
meningitidis, które nadal wykazuja˛ wrażliwość na benzylopenicyline˛. (Jakkolwiek ostatnio przedstawiono w raportach sporadyczne pojawianie sie˛ benzylopenicylinoopornych meningokoków.) Podobnie jest w przypadku paciorkowców kałowych (enterokoków), które poza kilkoma wyja˛tkami (Enterococcus faecium — przyp. tłum.) sa˛wrażliwe na ampicyline˛. Jeśli na podstawie cech
klinicznych podejrzewa sie˛ oporność tych mikroorganizmów, szczepy należy
przesłać do referencyjnego laboratorium.
• Jeśli drobnoustrój wymaga wzbogaconego podłoża, np. Haemophilus influenzae i Neisseria gonorrhoeae. Przy braku ścisłego przestrzegania właściwej
techniki wykonania antybiogramu test dyfuzyjno-kra˛żkowy może dawać
niewiarygodne rezultaty. Pojawienie sie˛ wytwarzaja˛cych β-laktamazy wariantów wyżej wymienionych szczepów spowodowało konieczność wprowadzenia
specjalnych testów, takich jak wykrywaja˛cy β-laktamazy in vitro test opisany
na stronie 92. Za monitorowanie wrażliwości pneumokoków, gonokoków
i Haemophilus odpowiadaja˛ regionalne i centralne laboratoria. W razie
wysta˛pienia problemu oporności szczepów należy ostrzec lokalne laboratoria
i dostarczyć instrukcje dotycza˛ce właściwych w tej sytuacji metod badania
lekowrażliwości i alternatywnych schematów leczenia.
• Niepowikłane zakażenia wywołane przez Salmonella (inne niż S. typhi lub
S. paratyphi). Leczenie przeciwbakteryjne takich infekcji nie jest uzasadnione,
nawet z zastosowaniem antybiotyków wykazuja˛cych aktywność in vitro.
Istnieje wiele dowodów przemawiaja˛cych za brakiem klinicznych korzyści
leczenia niepowikłanego zapalenia żoła˛dkowo-jelitowego wywołanego przez
pałeczki Salmonella (a w praktyce wie˛kszości chorób biegunkowych o niejasnej etiologii). Paradoksalnie, stosowanie antybiotyków może wydłużyć wydalanie i rozprzestrzenianie sie˛ tych bakterii, a także prowadzić do selekcji
szczepów opornych.
122
CZE˛ŚĆ I
Antybiogram jako narze˛dzie badań
epidemiologicznych
Rutynowe określanie wrażliwości wie˛kszości patogenów (S. typhi, pałeczki
Shigella) jest istotnym elementem programu kontroli zakażeń układu pokarmowego. Badania te dostarczaja˛ lekarzowi informacji o pojawieniu sie˛ opornych
szczepów (S. typhi oporna na chloramfenikol, pałeczki Shigella oporne na
kotrimoksazol i ampicyline˛) oraz o ewentualnej potrzebie modyfikacji schematu
standardowego leczenia. Mimo że antybiogramy dla niedurowych serotypów
pałeczek Salmonella, odpowiedzialnych za zakażenia jelitowe, nie maja˛ znaczenia w leczeniu pacjenta, pojawienie sie˛ wielolekoopornych szczepów jest
ostrzeżeniem dla lekarzy przed nadmiernym lub niewłaściwym stosowaniem
leków przeciwbakteryjnych. Stała kontrola i analiza antybiogramów jest doskonałym źródłem informacji o wyste˛powaniu opornych gronkowców i Gram-ujemnych pałeczek, które moga˛ być odpowiedzialne za krzyżowe zakażenia
szpitalne. Okresowe raportowanie wzorów oporności izolowanych szczepów
stanowi nieoceniona˛ pomoc w prowadzeniu właściwej polityki antybiotykowej
w szpitalu, opartej na ograniczeniu i/lub rotacji ratuja˛cych życie leków, takich jak
aminoglikozydy i cefalosporyny.
Wybór leków do oznaczania lekowrażliwości
w laboratoriach klinicznych
Wybór leków używanych w rutynowym antybiogramie dokonywany jest na
podstawie spektrum przeciwbakteryjnego leku, jego właściwości farmakokinetycznych, toksyczności, skuteczności i doste˛pności, a także kosztów zarówno dla
pacjenta, jak i dla społeczeństwa. Spośród wielu preparatów przeciwbakteryjnych
stosowanych w leczeniu jedynie niewielka cze˛ść starannie dobranych leków
powinna być wykorzystywana w oznaczaniu wrażliwości.
W tabeli 23 wymienione zostały antybiotyki stosowane w różnych sytuacjach
klinicznych. Leki podzielono na dwie grupy. Grupa pierwsza to leki doste˛pne
w wie˛kszości szpitali, które powinny być uwzgle˛dnione w antybiogramie dla
Tabela 23. Podstawowe zestawy antybiotyków do rutynowego oznaczania wrażliwościa
Enterobacteriaceae
a
b
Pseudomonas
aeruginosa
Staphylococcus
Układ
pokarmowy
Grupa 1
Leki pierwszego rzutu
Benzylopenicylina
Oksacylina
Erytromycyna
Tetracyklina
Chloramfenikol
Ampicylina
Chloramfenikol
Kotrimoksazol
Kwas nalidyksowy
Tetracyklina
Sulfonamid
Trimetoprim
Kotrimoksazol
Ampicylina
Nitrofurantoina
Kwas nalidyksowy
Tetracyklina
Ampicylina
Piperacylina
Chloramfenikol
Gentamycyna
Kotrimoksazol
Tobramycyna
Tetracyklina
Cefalotyna
Gentamycyna
Amoksycylina/
/kwas klawulanowy b
Grupa 2
Leki uzupełniaja˛ce
Gentamycyna
Amikacyna
Kotrimoksazol
Klindamycyna
Nitrofurantoina
Norfloksacyna
Norfloksacyna
Chloramfenikol
Gentamycyna
Amoksycylina/
/kwas klawulanowy b
Cefuroksym
Ceftriakson
Ciprofloksacyna
Piperacylina
Amikacyna
Mocz
Informacje o poszczególnych antybiotykach sa˛ umieszczone w tekście.
Amoksycylina z kwasem klawulanowym (inhibitor β-laktamaz).
123
Krew i tkanki
Amikacyna
Ciprofloksacyna
Ceftazydym
każdego izolowanego szczepu1. Testy dla leków z drugiej grupy powinny być
wykonywane jedynie na specjalne zlecenie lekarza, gdy izolowany patogen jest
oporny na leki pierwszego rzutu lub gdy inne powody (alergia na lek lub jego
niedoste˛pność) uzasadniaja˛ takie badanie. Wiele antybiotyków o dobrej aktywności klinicznej zostało pominie˛tych w tabeli, lecz należy podkreślić, że ich
zastosowanie jest rzadko konieczne w leczeniu zakażonych pacjentów. Wyja˛tkowo, jeśli istnieja˛ szczególne wskazania znane lekarzowi lub jeśli doste˛pne sa˛
nowe i lepsze leki, do leczenia można wła˛czyć jeden lub wie˛cej leków
dodatkowych. Wskazana jest aktualizacja informacji zawartych w tabeli we
współpracy z personelem klinicznym. W antybiogramach wykorzystuje sie˛
niekiedy tylko jeden lek reprezentuja˛cy cała˛ grupe˛, co może być przyczyna˛
nieporozumień w sytuacji, gdy klinicyści nie sa˛ tego świadomi. Wynik antybiogramu dla reprezentatywnego antybiotyku można odnieść do wszystkich lub do
wie˛kszości przedstawicieli danej grupy. W niektórych krajach poważne utrudnienia wynikaja˛ z faktu, że lekarze znaja˛ tylko handlowe nazwy leków, bez nazw
mie˛dzynarodowych. Należy położyć nacisk na informowanie personelu medycznego o nazwach niehandlowych antybiotyków i zache˛cać do ich stosowania2.
1. Kra˛żek z benzylopenicylina˛ stosowany jest do określania wrażliwości na
wszystkie β-laktamazowrażliwe penicyliny (takie jak doustna fenoksymetylopenicylina i fenetycylina). W zakażeniach wywołanych przez gronkowce
wytwarzaja˛ce β-laktamazy powinno sie˛ stosować β-laktamazooporne penicyliny lub inny antybiotyk, np. erytromycyne˛.
2. Kra˛żek z oksacylina˛ jest reprezentatywny dla całej grupy β-laktamazoopornych penicylin (wliczaja˛c metycyline˛, nafcyline˛, kloksacyline˛, dikloksacyline˛ i flukloksacyline˛). Istnieja˛ dowody kliniczne na krzyżowa˛ oporność
mie˛dzy metycylina˛ i grupa˛ cefalosporyn. Dlatego niepotrzebne i myla˛ce jest
wła˛czenie cefalotyny do antybiogramu dla gronkowców. Oporność na
metycyline˛ i pozostałe leki tej grupy ma cze˛sto heterogenny charakter, np.
wie˛kszość komórek może być w pełni wrażliwa i tworzyć szeroka˛ strefe˛
zahamowania, podczas gdy cze˛ść populacji rośnie w strefie zahamowania
w postaci drobnych kolonii. Ten typ oporności jest lepiej wykrywany
w temperaturze 35°C3 lub przy przedłużonym czasie inkubacji. Poważna˛
wada˛ metycyliny, jako antybiotyku reprezentatywnego dla całej grupy, jest
jej duża niestabilność, nawet w prawidłowych warunkach przechowywania.
W standardowej metodzie dyfuzyjnej preferuje sie˛ stosowanie kra˛żka
z oksacylina˛, która jest bardziej trwała. Kra˛żki z kloksacylina˛i dikloksacylina˛
nie sa˛ stosowane, ponieważ moga˛ nie wykrywać heteroopornych szczepów.
3. Wynik badania wrażliwości na tetracykline˛ można odnieść do chlorotetracykliny, oksytetracykliny oraz innych przedstawicieli tej grupy. Jednak wie˛kszość opornych na tetracykline˛ gronkowców zachowuje wrażliwość na
minocykline˛. Kra˛żki z minocyklina˛ moga˛ wie˛c być przydatne w oznaczaniu
wrażliwości wieloopornych szczepów gronkowców.
4. Wynik badania wrażliwości na chloramfenikol można odnieść do tiamfenikolu, pochodnego leku o porównywalnym spektrum przeciwbakteryjnym, ale bez znanego ryzyka niedokrwistości aplastycznej.
1
W Polsce dobór kra˛żków do wykonania antybiogramu powinien być oparty na rekomendacjach
opracowanych przez Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów (przyp.
tłum.).
2
International Nonproprietary Names (INN) for Pharmaceutical Substances. Cumulative list No. 9.
Geneva, World Health Organization, 1996.
3
Sahm D.F. et al.: Current concepts and approaches to antimicrobial agent susceptibility testing. In:
Cumitech 25, Washington, DC, American Society for Microbiology, 1988.
124
CZE˛ŚĆ I
5. W antybiogramie stosowany jest tylko jeden przedstawiciel sulfonamidów
(sulfafurazol).
6. Kra˛żek z kotrimoksazolem zawiera kombinacje˛ trimetoprimu i sulfonamidu
(sulfametoksazol). Dwa składniki tego synergistycznego poła˛czenia maja˛
podobne właściwości farmakokinetyczne i generalnie działaja˛ jak jeden lek.
7. Ampicylina jest przedstawicielem grupy penicylin o szerokim spektrum
działania, wykazuja˛cych aktywność wobec wielu Gram-ujemnych bakterii.
Ponieważ jest wrażliwa na β-laktamazy, nie powinna być stosowana
w określaniu lekowrażliwości gronkowców. Ogólnie, wynik wrażliwości na
ampicyline˛ odnosi sie˛ również do innych przedstawicieli grupy: amoksycyliny, piwampicyliny, talampicyliny itp. (choć amoksycylina jest dwukrotnie bardziej aktywna wobec pałeczek Salmonella i o połowe˛ mniej
aktywna wobec pałeczek Shigella i H. influenzea).
8. Rutynowo należy określać wrażliwość jedynie na cefalotyne˛, ponieważ
wynik jest reprezentatywny dla innych cefalosporyn pierwszej generacji
(cefaleksyna, cefradyna, cefalorydyna, cefazolina, cefapiryna). Ze wzgle˛du
na doste˛pność cefalosporyn drugiej i trzeciej generacji oraz ich pochodnych
(cefamycyny) o rozszerzonym spektrum, w wybranych przypadkach może
być uzasadnione użycie kra˛żków z antybiotykami tej grupy (cefoksytyna,
cefamandol, cefuroksym, cefotaksym, ceftriakson). Wrażliwość na cefalosporyny stosowane w cie˛żkich zakażeniach gronkowcowych można określić
na podstawie wyników badania wrażliwości na oksacyline˛, o czym wspomniano już powyżej w punkcie 2.
9. Erytromycyna jest wykorzystywana do oceny wrażliwości także na inne
makrolidy (oleandomycyna, spiramycyna).
10. Aminoglikozydy tworza˛ grupe˛ chemicznie podobnych leków obejmuja˛cych
streptomycyne˛, gentamycyne˛, kanamycyne˛, netylmycyne˛ i tobramycyne˛. Ich
spektra przeciwbakteryjne nie zawsze sa˛ na tyle podobne, aby można było
założyć istnienie krzyżowej oporności, ale wobec wrażliwych patogenów leki
te wykazuja˛ identyczna˛ skuteczność. W licznych badaniach porównywano
nefrotoksyczność i ototoksyczność gentamycyny, netylmycyny i tobramycyny, ale nie uzyskano ostatecznych dowodów, świadcza˛cych o mniejszej
toksyczności którejkolwiek z nich. Zaleca sie˛, aby każde laboratorium
wybrało jeden lek do podstawowego antybiogramu. Pozostałe antybiotyki
należy zachować w rezerwie do leczenia pacjentów z zakażeniami wywołanymi przez oporne drobnoustroje.
11. Stosowanie nitrofurantoiny ograniczone jest do leczenia zakażeń układu
moczowego i wrażliwość na ten lek nie powinna być oznaczana dla szczepów
pochodza˛cych z innych materiałów niż mocz.
Tabela 24 zawiera wartości graniczne średnic stref zahamowania wzrostu dla
szczepów kontrolnych.
Zmodyfikowana metoda Kirby-Bauera
Metoda dyfuzyjno-kra˛żkowa, po raz pierwszy opisana w 1966 r.1, jest dobrze
wystandaryzowana˛ i wysoko ceniona˛ metoda˛. Oficjalne instytucje zaleciły ja˛,
z niewielkimi modyfikacjami, jako referencyjna˛ metode˛, która może być
rutynowo stosowana w laboratoriach klinicznych.
1
Bauer A.W. et al.: Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disc method. American
Journal of Clinical Pathology, 1966; 45: 493 – 496.
125
Tabela 24. Strefy zahamowania wzrostu dla szczepów kontrolnycha
Antybiotyk
Amikacyna
Amoksycylina/kwas
klawulanowyb
Ampicylina
Benzylopenicylina
Cefalotyna
Cefalozyna
Ceftazydym
Cefotaksym
Ceftriakson
Cefuroksym
Chloramfenikol
Ciprofloksacyna
Klindamycyna
Kotrimoksazol
Erytromycyna
Gentamycyna
Kwas nalidyksowy
Nitrofurantoina
Norfloksacyna
Oksacylina
Piperacylina
Sulfonamidc
Tetracyklina
Tobramycyna
Trimetoprim
Wankomycyna
a
b
c
Zawartość
w kra˛żku
Średnica strefy zahamowania (mm)
S. aureus
(ATCC 25923)
E. coli
(ATCC 25922)
P. aeruginosa
(ATCC 27853)
30 µg
20/10 µg
20 – 26
28 – 36
19 – 26
19 – 25
18 –26
—
10 µg
10 µg
30 µg
30 µg
30 µg
30 µg
30 µg
30 µg
30 µg
5 µg
2 µg
25 µg
15 µg
10 µg
30 µg
300 µg
10 µg
1 µg
100 µg
300 µg
30 µg
10 µg
5 µg
30 µg
27 – 35
26 – 37
29 – 37
29 – 35
16 – 20
25 – 31
22 – 28
27 – 35
19 – 26
22 – 30
24 – 30
24 – 32
22 – 30
19 – 27
—
18 – 22
17 – 28
18 – 24
—
24 – 34
24 – 30
19 – 29
19 – 26
17 – 21
16 – 22
—
15 – 21
23 – 29
25 – 32
29 – 35
29 – 35
20 – 26
21 – 27
30 – 40
—
24 – 32
—
19 – 26
22 – 28
20 – 25
28 – 35
—
24 – 30
15 – 23
18 – 25
18 – 26
21 – 28
—
—
—
—
—
22 –29
18 –22
17 –23
—
—
25 –33
—
—
—
16 –21
—
—
22 –29
—
25 –33
—
—
19 –25
—
—
National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial disc susceptibility tests. 6th ed. Vol. 21 No 1 (M2-A7 i M7-A5) i 11th informational
supplement 2001 (M100-S11).
Sulfizoksazol.
Odczynniki
1. Przygotować agar Mueller-Hintona z postaci sproszkowanej, zgodnie z zaleceniem producenta. Podłoża powinny być przygotowane w sposób, który
umożliwi uzyskanie odpowiednich stref zahamowania dla szczepów kontrolnych (patrz tabela 24). Ważne jest, aby nie przegrzać podłoża.
2. Schłodzić podłoże do 45 – 50°C i rozlać na płytki. Wypełnić do poziomu około
4 mm. Płytka o średnicy 9 cm zawiera około 25 ml podłoża.
3. Gdy agar ste˛żeje, płytki do natychmiastowego użycia suszyć przez 10 – 30 minut
w 35°C, umieszczaja˛c je w cieplarce do góry dnem, z uchylonymi wieczkami.
4. Nie wykorzystane płytki można przechowywać w chłodziarce, w szczelnie
zamknie˛tych plastikowych woreczkach. Płytki moga˛ być przechowywane
w ten sposób przez 2 tygodnie.
W celu uzyskania wiarygodnych stref zahamowania wzrostu, do badania lekowrażliwości na sulfonamidy i kotrimoksazol należy użyć agaru Mueller-Hintona,
zawieraja˛cego niskie ste˛żenia inhibitorów tymidyny i tyminy. Z tego wzgle˛du
każda nowa partia agaru Mueller-Hintona musi zostać przetestowana z użyciem
126
CZE˛ŚĆ I
szczepu kontrolnego Enterococcus faecalis (ATCC 29212 lub 33186) oraz kra˛żka
z kotrimoksazolem. O odpowiedniej jakości podłoży świadczy wyraźna, 20-milimetrowa lub wie˛ksza, strefa zahamowania, co ważne — bez mglistego
wzrostu i drobnych kolonii.
Kra˛żki z antybiotykami
Można używać wszystkich doste˛pnych komercyjnie kra˛żków o właściwej
średnicy i ste˛żeniu leku. Zapasy kra˛żków należy przechowywać w –20°C;
odpowiednia jest także zamrażarka chłodziarki. Mały podre˛czny zestaw kra˛żków
można przechowywać w chłodziarce do miesia˛ca. Po wyje˛ciu z chłodziarki
pojemniki należy pozostawić w temperaturze pokojowej na około 1 godziny (do
wyrównania temperatur). Taka procedura zmniejsza skraplanie pary, pojawiaja˛cej
sie˛ w wyniku kontaktu ciepłego powietrza z powierzchnia˛ zimnego pojemnika.
Jeśli używa sie˛ dyspensera kra˛żków, należy przechowywać go w chłodziarce ze
szczelnie domknie˛ta˛ pokrywa˛. Przed otwarciem dyspenser również powinien
zostać ogrzany do temperatury pokojowej.
Wzorzec zme˛tnienia
Przygotować wzorzec zme˛tnienia (ge˛stości zawiesiny — przyp. tłum.) wlewaja˛c
0,6 ml 1% (10 g/l) roztworu dwuwodzianu chlorku baru do 100-mililitrowego
kalibrowanego cylindra i wypełnić do 100 ml 1% (10 ml/l) kwasem siarkowym.
Roztwór wzorcowego zme˛tnienia należy umieścić w identycznej probówce, jak
probówki z bulionem. Wzorzec może być przechowywany w ciemności,
w temperaturze pokojowej przez 6 miesie˛cy, pod warunkiem, że jest zamknie˛ty
w sposób uniemożliwiaja˛cy parowanie.
Wymazówki
Przygotowuje sie˛ zapas bawełnianych wymazówek na drewnianych patyczkach.
Wymazówki sterylizuje sie˛ w autoklawie lub w sterylizatorach na suche gora˛ce
powietrze, umieszczaja˛c je w puszkach, probówkach lub opakowane w papier.
Procedura
Aby przygotować inoculum z hodowli na podłożu stałym, należy zebrać eza˛
3 – 5 kolonii badanego mikroorganizmu o tym samym wygla˛dzie.
127
Przenieść do probówki z fizjologicznym roztworem soli.
Jeśli inoculum przygotowywane jest z czystej hodowli, należy w ten sam sposób
w roztworze fizjologicznym soli zawiesić eza˛ materiał pobrany ze zlewnego
wzrostu.
Porównać probówke˛ ze wzorcem zme˛tnienia i dostosować ge˛stość badanej
zawiesiny do wzorca, dodaja˛c wie˛cej bakterii lub wie˛cej fizjologicznego roztworu
soli.
Właściwa ge˛stość inoculum jest konieczna do uzyskania zlewnej lub prawie
zlewnej murawy wzrostu.
Badany szczep posiać na płytki, zanurzaja˛c sterylna˛ wymazówke˛ w inoculum.
Usuna˛ć nadmiar zawiesiny, obracaja˛c i przyciskaja˛c wymazówke˛ mocno do
ścianki probówki powyżej poziomu płynu.
128
CZE˛ŚĆ I
Zawiesine˛ trzykrotnie rozprowadzić dokładnie na całej powierzchni podłoża,
przekre˛caja˛c płytke˛ za każdym razem o 60°. Na koniec przesuna˛ć wymazówke˛
wzdłuż brzegów powierzchni agaru. Pozostawić na kilka minut do wyschnie˛cia
w temperaturze pokojowej, z zamknie˛tym wieczkiem.
Kra˛żki z antybiotykami można umieścić na posianej płytce za pomoca˛ sterylnej
pe˛sety. Zastosowanie szablonu (ryc. 15) ułatwia równomierne rozmieszczenie
kra˛żków.
Do umieszczenia kra˛żków z antybiotykami na posianej płytce można również
użyć sterylnej igły z zatyczka˛.
129
Alternatywnie, do nałożenia na posiana˛ płytke˛ kra˛żków z antybiotykami można
użyć dyspensera.
Maksymalnie na płytce o średnicy 9 – 10 cm można umieścić siedem kra˛żków.
Sześć kra˛żków można rozmieścić równomiernie w jednakowej odległości, około
15 mm od brzegu płytki, a jeden kra˛żek nałożyć w centrum płytki. Każdy kra˛żek
należy delikatnie przycisna˛ć, zapewniaja˛c równomierny kontakt z podłożem.
Płytki powinny być w cia˛gu 30 minut umieszczone w cieplarce w 35°C. Temperatura powyżej 35°C zaburza wyniki wrażliwości na oksacyline˛/metycyline˛.
Nie inkubować w atmosferze dwutlenku we˛gla.
Po całonocnej inkubacji należy zmierzyć średnice˛ każdej strefy (wliczaja˛c
średnice˛ kra˛żka) i zanotować odczyt (w mm). Interpretować wyniki zgodnie
z wartościami przedstawionymi w tabeli 25.
Pomiar stref może być wykonany za pomoca˛linijki przyłożonej do dna płytki, bez
jej otwierania.
130
CZE˛ŚĆ I
Jeśli płytka nie jest przezroczysta, pomiaru można dokonać za pomoca˛suwmiarki.
Wyniki badania lekowrażliwości można odczytać posługuja˛c sie˛ szablonem
(ryc. 14).
131
Tabela 25. Interpretacja stref zahamowania wzrostu w zmodyfikowanej metodzie
Kirby-Baueraa dla bakterii szybko rosna˛cych
Średnica strefy zahamowania (mm)
Antybiotyk
Zawartość
w kra˛żku
Oporny
Średnio
wrażliwy
Wrażliwy
30 µg
< 14
15 – 16
> 17
20/10 µg
< 13
14 – 17
> 18
10 µg
10 µg
< 13
< 16
14 – 16
—
> 17
> 17
10 IU
10 IU
< 28
< 14
—
—
> 29
> 15
Cefalotyna
30 µg
< 14
15 – 17
> 18
Cefalozyna
30 µg
< 14
15 – 17
> 18
Cefotaksym
30 µg
< 14
15 – 22
> 23
Ceftazydym
30 µg
< 14
15 – 17
> 18
Ceftriakson
30 µg
< 13
14 – 20
> 21
Cefuroksym sodium, cefamandol
30 µg
< 14
15 – 17
> 18
Chloramfenikol
30 µg
< 12
13 – 17
> 18
Ciprofloksacyna
5 µg
< 15
16 – 20
> 21
Klindamycyna
2 µg
< 14
15 – 20
1 21
Amikacyna
Amoksycylina/kwas klawulanowyb
Ampicylina dla:
– Enterobacteriaceae
– enterokoki
Benzylopenicylina dla:
– gronkowce
– enterokoki
Kotrimoksazol
25 µg
< 10
11 – 15
1 16
Erytromycyna
15 µg
< 13
14 – 22
> 23
Gentamycyna
10 µg
< 12
13 – 14
> 15
Kwas nalidyksowyc
30 µg
< 13
14 – 18
1 19
Nitrofurantoinac
300 µg
< 14
15 – 16
> 17
Norfloksacynac
10 µg
< 12
13 – 16
> 17
1 µg
< 10
10 – 12
> 13
100 µg
100 µg
< 17
< 17
—
18 – 20
> 18
> 21
Oksacylina
Piperacylina dla:
– P. aeruginosa
– inne pałeczki Gram-ujemne
300 µg
< 12
13 – 16
> 17
Tetracyklina
30 µg
< 14
15 – 18
> 19
Tobramycyna
10 µg
< 12
13 – 14
> 15
Trimetoprimc
5 µg
< 10
11 – 15
1 16
30 µg
30 µg
—
< 14
—
15 – 16
> 15
> 17
Sulfonamidc, d
Wankomycyna dla:
– gronkowce
– enterokoki
a
National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial disc susceptibility tests. 6th ed., Vol. 21, No 1 (M2-A7 i M7-A5) Wayne, PA, NCCLS i 11th
informational supplement 2001 (M100-S11).
b
c
Używane tylko do badania patogenów wyizolowanych z dróg moczowych i niektórych
szczepów jelitowych.
d
Sulfizoksazol.
132
CZE˛ŚĆ I
Kra˛żek
z antybiotykiem
Strefa wewne˛trzna:
szczep oporny
▲
▲
▲
▼
Strefa czarna:
średnia wrażliwość
Strefa zewne˛trzna:
szczep wrażliwy
WHO 91127
Ryc. 14. Szablon do określania wrażliwości.
Granice˛ strefy zahamowania ustala sie˛ gołym okiem w miejscu, gdzie rozpoczyna
sie˛ widoczny wzrost; istnieja˛ jednak trzy wyja˛tki:
• W przypadku sulfonamidów i kotrimoksazolu w strefie zahamowania pojawia
sie˛ słaby wzrost; nie należy go brać pod uwage˛.
• W przypadku określania wrażliwości β-laktamazododatnich gronkowców na
benzylopenicyliny brzegi strefy zahamowania sa˛ wyraźnie widoczne i uniesione; łatwo uznać je za dodatni wynik testu, podczas gdy niezależnie od
rozmiaru strefy zahamowania szczep należy opisać jako oporny.
• Pewne gatunki Proteus moga˛ wokół niektórych kra˛żków z antybiotykami
wytwarzać, w wyraźnie ograniczonej strefie zahamowania, cienka˛ warstwe˛
wzrostu mgławicowego, którego nie należy brać pod uwage˛.
Interpretacja wielkości stref zahamowania
Stosowanie wzornika. Dla każdego antybiotyku należy przygotować oddzielny
wzornik (patrz ryc. 14). Wynik można odczytać z jednoczesna˛ interpretacja˛
— wrażliwy, oporny lub średnio wrażliwy: ,,wrażliwy’’, jeśli granica strefy
wykracza poza czarny pierścień; ,,oporny’’, jeśli nie obserwuje sie˛ strefy lub gdy
jej granica mieści sie˛ w polu białego pierścienia; ,,średnio wrażliwy’’, jeśli granica
strefy zahamowania leży w obre˛bie czarnego pierścienia.
Stosowanie linijki. Wyniki pomiarów stref zahamowania w mm należy interpretować zgodnie z granicznymi średnicami przedstawionymi w tabeli 25.
Bezpośrednie a pośrednie oznaczanie
lekowrażliwości
W opisanej powyżej metodzie inoculum przygotowywane jest z pierwotnej płytki
hodowlanej lub z czystych hodowli. Jest to tak zwany pośredni test lekowrażliwości. W przypadkach, gdy niezbe˛dny jest szybki wynik, zamiast standardowego
inoculum można wykorzystać badany materiał, np. mocz, dodatnie posiewy z krwi
lub wymazy ropy. W przypadku moczu należy najpierw zbadać pod mikroskopem
osad, oceniaja˛c obecność dowodów infekcji, np. obecność granulocytów i/lub
drobnoustrojów. Naste˛pnie można wykorzystać mocz jako inoculum w metodzie
standardowej. Jeśli barwienie Grama inkubowanych hodowli z krwi, wykazuja˛cych wzrost bakterii, lub wymazów z ropy potwierdzi obecność dużej liczby
mikroorganizmów jednego typu, materiały te moga˛ zostać użyte jako bezpośrednie inoculum. Jest to tzw. bezpośredni test lekowrażliwości; zaleta˛ testu bezpośredniego jest szybsze o 24 godziny uzyskanie wyniku. Główna˛ wade˛ stanowi brak
właściwego przygotowania inoculum. Jeśli na płytkach pojawi sie˛ zbyt słaby lub
zbyt intensywny wzrost lub gdy obecne sa˛ mieszane hodowle, należy bardzo
uważnie interpretować wyniki i powtórzyć test używaja˛c czystych hodowli.
133
Czynniki techniczne wpływaja˛ce na wielkość
strefy zahamowania w metodzie
dyfuzyjno-kra˛żkowej
Ge˛stość inoculum
W przypadku zbyt małej ge˛stości inoculum uzyskana strefa zahamowania,
niezależnie od wrażliwości mikroorganizmu, be˛dzie wie˛ksza. Z tego powodu
oporne szczepy moga˛ zostać opisane jako wrażliwe. W odwrotnej sytuacji, zbyt
dużej ge˛stości inoculum, wielkość uzyskanej strefy be˛dzie mniejsza i szczepy
wrażliwe moga˛zostać opisane jako oporne. Zwykle najlepsze wyniki uzyskuje sie˛
przygotowuja˛c inoculum warunkuja˛ce prawie zlewny wzrost.
Czas nałożenia kra˛żków
Na posianych płytkach, pozostawionych w temperaturze pokojowej dłużej niż
podano w procedurze, przed nałożeniem kra˛żków dochodzi do namnażania
szczepów. W rezultacie średnica strefy zahamowania jest mniejsza i szczepy
wrażliwe moga˛ zostać opisane jako oporne.
Temperatura inkubacji
W celu otrzymania optymalnego wzrostu podłoża z antybiogramem należy
inkubować w 35°C. Jeśli temperatura jest niższa, wydłuża sie˛ czas inkubacji,
a uzyskane strefy sa˛ wie˛ksze. W przypadku badania wrażliwości heterogennie
opornych szczepów Staphylococcus aureus na metycyline˛ (oksacyline˛) cze˛ść
oporna˛ populacji wykrywa sie˛ w 35°C. W wyższych temperaturach cała hodowla
wykazuje wrażliwość. W temperaturze 35°C i niższej w strefie zahamowania
rosna˛ oporne kolonie. Opisane kolonie sa˛ lepiej widoczne, jeśli przed odczytem
płytke˛ pozostawi sie˛ na kilka godzin w temperaturze pokojowej. Należy zawsze
zidentyfikować ten typ kolonii, wykluczaja˛c zanieczyszczenie.
Czas inkubacji
Wie˛kszość metod uwzgle˛dnia 16 – 18-godzinny okres inkubacji. Jakkolwiek
w wyja˛tkowych sytuacjach wste˛pny wynik może zostać przygotowany po
6 godzinach. Nie jest to metoda zalecana i w każdym przypadku wyniki należy
potwierdzić po odpowiednim czasie inkubacji.
Rozmiar płytek, grubość warstwy podłoża
agarowego i rozmieszczenie kra˛żków
z antybiotykami
Testy wrażliwości przeprowadza sie˛ zwykle na płytkach o średnicy 9 – 10 cm,
umieszczaja˛c nie wie˛cej niż 6 – 7 kra˛żków na każdej z nich. W przypadku badania
wrażliwości na wie˛ksza˛ liczbe˛ antybiotyków zaleca sie˛ użycie dwóch płytek lub
134
CZE˛ŚĆ I
jednej o średnicy 14 cm. Na bardzo cienkich podłożach może wytwarzać sie˛
wie˛ksza strefa zahamowania; odwrotnie dzieje sie˛ w przypadku zbyt grubych
podłoży. Właściwe rozmieszczenie kra˛żków zapobiega nakładaniu sie˛ stref
zahamowania lub powstawaniu zniekształceń przy brzegach płytki (patrz ryc. 15).
WHO 86961
Ryc. 15. Szablon do równomiernego nakładania kra˛żków na płytke˛ średnicy 90 mm.
Ste˛żenie antybiotyków w kra˛żkach
Średnica strefy zahamowania zależy od zawartości antybiotyku w kra˛żku.
Zmniejszeniu aktywności leku w źle przechowywanym kra˛żku towarzyszy
odpowiednie zmniejszenie wielkości strefy zahamowania.
Skład podłoża
Podłoże wpływa na wielkość strefy, decyduja˛c o stopniu wzrostu, współczynniku
dyfuzji i aktywności leku. Ważne jest stosowanie podłoży odpowiednich dla danej
metody.
Możliwość uzyskania różnych warunków badania lekowrażliwości, wpływaja˛cych na średnice˛ strefy, jasno przemawia za potrzeba˛ standaryzacji metody
dyfuzyjno-kra˛żkowej. Jedynie przestrzeganie ustalonych parametrów metody
umożliwia uzyskanie wartościowych wyników. Nieprawidłowości zaburzaja˛ce
przebieg badania moga˛ prowadzić do przedstawienia lekarzowi raża˛co błe˛dnych
wyników.
Precyzja i dokładność metody powinny być monitorowane za pomoca˛ustalonego,
opisanego poniżej programu kontroli jakości. W ten sposób możliwa jest szybka
identyfikacja i korekta błe˛dów.
135
Kontrola jakości
Potrzeba kontroli jakości testu
lekowrażliwości
Na końcowy wynik testu dyfuzyjno-kra˛żkowego wpływa duża liczba zmiennych.
Niektóre z nich, takie jak ge˛stość inoculum i temperatura inkubacji, łatwo
kontrolować, jednak laboratorium rzadko znany jest dokładny skład podłoża
komercyjnego lub różnice w jakości kolejnych serii. Laboratorium nie może
również odpowiadać za zawartość antybiotyków w kra˛żkach. Wyniki testów
musza˛ być cia˛gle monitorowane w programie kontroli jakości, który należy
traktować jako element procedury.
Precyzja i dokładność metody powinny być kontrolowane przez równoległe
wykonywanie testów dla szczepu kontrolnego o znanej lekowrażliwości. Szczepy
kontrolne i badane drobnoustroje podlegaja˛ tej samej procedurze. Uzyskane dla
mikroorganizmów kontrolnych wielkości stref powinny odpowiadać wartościom
przedstawionym w tabeli 24. Powtarzaja˛ce sie˛ uzyskiwanie wyników, które nie
mieszcza˛ sie˛ w określonym zakresie, jest przypuszczalnie efektem błe˛du
technicznego lub użycia niewłaściwych odczynników. Należy sprawdzić każdy
odczynnik i etap testu, odnaleźć i wyeliminować bła˛d.
Standardowa procedura kontroli jakości
Program kontroli jakości polega na równoległym prowadzeniu oznaczania
wrażliwości dla szczepów kontrolnych i badanych. Kontrole należy przeprowadzać co tydzień lub dla co pia˛tej serii badań i — dodatkowo — przy każdej
nowej partii agaru Mueller-Hintona lub kra˛żków.
Standardowe szczepy do kontroli jakości
Staphylococcus aureus (ATCC 25923)
Escherichia coli (ATCC 25922)
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853)
Powyższe szczepy można uzyskać z państwowych kolekcji szczepów. Sa˛ także
doste˛pne komercyjnie w formie liofilizowanej uzyskanej z czystych hodowli.
Hodowle szczepów wzorcowych do codziennego użytku powinny być prowadzone na skosach lub agarze odżywczym (zalecany jest agar tryptozowo-sojowy)
i przechowywane w chłodziarce. Co 2 tygodnie należy przesiewać hodowle na
świeże skosy.
Przygotowanie inoculum
Hodowle można zakładać na każdym podłożu płynnym i inkubować do chwili
zme˛tnienia bulionu. Z każdego podłoża płynnego należy przesiać szczep na płytke˛
agarowa˛ i inkubować przez noc. Naste˛pnie pobrać pojedyncze kolonie i przeprowadzić badanie wrażliwości w sposób opisany na stronach 127 – 130.
136
▲
średnica
25
24
23
22
21
20
19
X
18
X X
X X
17
X
16 X
15
14
X
13
12
11
10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
Data
Akceptowalna
CZE˛ŚĆ I
▼
WHO 91093
Ryc. 16. Karta kontroli jakości antybiogramów.
Nakładanie kra˛żków z antybiotykami
Po posianiu inoculum na płytki, w sposób opisany na str. 129, nałożyć
odpowiednie kra˛żki na płytke˛. Wybrane kra˛żki dla każdego szczepu kontrolnego
zostały wymienione w tabeli 24.
Odczytywanie wyników
Po 16 – 18 godzinach inkubacji należy zmierzyć linijka˛ średnice stref zahamowania i zapisać, ła˛cznie z data˛ badania, na specjalnej karcie kontroli jakości. Zapis
powinien być prowadzony dla każdej kombinacji szczep-kra˛żek. Karta zawiera
diagram wielkości stref w milimetrach, z zaznaczonym zakresem wartości
prawidłowych. Przykład takiej karty przedstawiono na ryc. 16. Jeśli wyniki
systematycznie wykraczaja˛ poza dopuszczalne granice, należy podja˛ć działania,
które poprawia˛ jakość badania.
Istotne odchylenia wyników, których nie można wyjaśnić technicznymi błe˛dami
w procedurze, moga˛ wskazywać na zanieczyszczenie, nagła˛ zmiane˛ wrażliwości
lub zmiane˛ właściwości szczepu kontrolnego. Należy wówczas uzyskać z wiarygodnego źródła świeży szczep wzorcowy.
137
Badania serologiczne
Wprowadzenie
Odczyny serologicznie, w przeciwieństwie do posiewów i badań mikrobiologicznych, wykrywaja˛c w próbkach klinicznych antygeny bakteryjne lub przeciwciała
powstałe w odpowiedzi na nie, dostarczaja˛ jedynie pośrednich dowodów
zakażenia. Testy te, ze wzgle˛du na wysoka˛swoistość i czułość, sa˛obecnie szeroko
stosowane w mikrobiologii.
W odpowiedzi na pierwotne zakażenie patogennym drobnoustrojem wie˛kszość
pacjentów wytwarza zarówno przeciwciała IgM, jak i IgG. Po kilku tygodniach
dominuja˛ca˛ klasa˛ przeciwciał staja˛ sie˛ IgG i w konsekwencji tylko IgG pozostaja˛
w surowicy pacjenta. Kolejna infekcja wywołana przez ten sam patogen wywołuje
odpowiedź z wytworzeniem przeciwciał IgG. Ponieważ komórki wytwarzaja˛ce
przeciwciała zachowuja˛ pamie˛ć immunologiczna˛, odpowiedź taka, w porównaniu
z odpowiedzia˛pierwotna˛, jest zwykle szybsza i bardziej nasilona; jest to tak zwana
odpowiedź wtórna.
Poziom przeciwciał najcze˛ściej oznaczany jest przez ,,miareczkowanie’’. Diagnostyczne miano jest najwie˛kszym rozcieńczeniem surowicy pacjenta, przy
którym wykrywalne sa˛ jeszcze przeciwciała. Na przykład, jeśli przeciwciała
wykrywane sa˛ w rozcieńczeniu 1:1024 i nie wyższym, miano surowicy wynosi
1024. Surowica pobrana w ostrym okresie infekcji, przy podejrzeniu pierwotnego
zakażenia, nosi nazwe˛ surowicy fazy ostrej; surowica pobrana w czasie rekonwalescencji, zwykle 2 tygodnie później, nosi nazwe˛ surowicy ozdrowieńca.
Reakcja na antygen pojawia sie˛ niezależnie od okresu zakażenia, choć jej typ
może być różny. Obecność przeciwciał IgG w pojedynczej próbce surowicy może
wskazywać na ekspozycje˛ w przeszłości, nie pozwala wie˛c na rozpoznanie
świeżej infekcji. Niekiedy antygen stymuluje również powstawanie przeciwciał
reaguja˛cych krzyżowo z innymi antygenami. Ze wzgle˛du na brak swoistości
takich przeciwciał, badanie jednej próbki surowicy może prowadzić do niewłaściwej interpretacji wyników. W wie˛kszości testów serologicznych należy wykonać, najlepiej jednocześnie, badanie surowicy pobranej w ostrym okresie choroby
i surowicy ozdrowieńca; zapobiega to ewentualnym różnicom wynikaja˛cym
z warunków przeprowadzania badania. Wzrost miana przeciwciał o dwa dwukrotne rozcieńczenia (np. z rozcieńczenia 1:8 do 1:32) świadczy zwykle o świeżym
zakażeniu. Jest to tak zwany czterokrotny wzrost miana. Badanie pojedynczej
próbki surowicy może być przydatne tylko w niektórych przypadkach, np.
w diagnostyce zakażenia Mycoplasma pneumoniae, gdy wysokie miana lub
obecność przeciwciał IgM wskazuja˛ na świeża˛ infekcje˛. Typ reakcji antygen-przeciwciało zależy od rodzaju antygenu.
Metody kontroli jakości
Wiarygodność i spójność wyników badań serologicznych całkowicie zależa˛ od
metod kontroli jakości, przeprowadzanej przed, podczas i po każdym teście.
Środki kontroli jakości sa˛ niezmiernie istotne ze wzgle˛du na fałszywie dodatnie
i fałszywie ujemne wyniki, które moga˛ istotnie wpływać na decyzje lekarza,
dotycza˛ce leczenia pacjenta. Na jakość badań serologicznych wpływa wiele
138
CZE˛ŚĆ I
czynników, do których zaliczane sa˛: doświadczenie personelu laboratoryjnego,
jakość zestawów i wyposażenie, jakość próbek, kontrole stosowane w testach oraz
interpretacja i wydawanie wyników. Po wykonaniu testu, należy wyrzucić zużyte
materiały do pojemnika wypełnionego środkiem dezynfekuja˛cym, umyć i zdezynfekować re˛ce oraz powierzchnie˛ blatu.
Wyposażenie
Do wyposażenia laboratorium serologicznego należa˛: łaźnie wodne, cieplarki,
chłodziarki, zamrażarki, pH-metry, wagi, wirówki, mikroskopy i wytrza˛sarki.
Monitoring i rutynowe przegla˛dy sprze˛tu sa˛ istotnym elementem programu
zapewnienia jakości. Należy przestrzegać stałego serwisowania sprze˛tu z okresowymi przegla˛dami i ewentualna˛ kalibracja˛ lub naprawa˛. Dla każdego urza˛dzenia
należy prowadzić zapis dat przegla˛du, serwisu i naprawy.
Łaźnia wodna poza czasem jej wykorzystania powinna być pozostawiana pusta,
co miesia˛c suszona i czyszczona. Temperature˛ łaźni wodnej należy starannie
kontrolować, nie dopuszczaja˛c do zmian wie˛kszych niż ± 1°C; konieczny jest
codzienny pomiar i zapis temperatury, również w trakcie działania. Wskazane jest
stosowanie pokrywy, która zapobiega chłodzeniu powierzchni wody. Mieszanine˛
antygenu i przeciwciał można inkubować dopiero po uzyskaniu wymaganej
temperatury i utrzymaniu jej co najmniej przez godzine˛. Poziom wody powinien
odpowiadać poziomowi płynu w umieszczonych w łaźni probówkach lub kolbach.
Mikroskopy maja˛ najwie˛ksze znaczenie przy wykonywaniu testu VDRL (Venereal Disease Research Laboratory, VDRL) oraz testu immunofluorescencji kre˛tków
w modyfikacji absorpcyjnej (FTA-Abs) i musza˛ być utrzymywane w możliwie
najlepszym stanie. Po użyciu okular, obiektyw i kondensator mikroskopu należy
przetrzeć mie˛kka˛szmatka˛, usuwaja˛c resztki olejku i zanieczyszczenia. Nieużywany mikroskop przechowuje sie˛ pod przykryciem, zabezpieczony przed wilgocia˛.
Intensywność lampy rte˛ciowej w mikroskopie fluorescencyjnym należy sprawdzać regularnie z użyciem światłomierza.
Należy kontrolować działanie wytrza˛sarek do testów VDRL oraz szybkiego testu
do wykrywania reagin w osoczu (RPR) i korygować wszelkie zmiany, które moga˛
mieć niekorzystny wpływ na reakcje˛ aglutynacji. Mechaniczna wytrza˛sarka
powinna być regularnie oliwiona.
Materiały
Szklane naczynia i igły używane w testach serologicznych musza˛ spełniać
określone parametry.
Nie należy korzystać z uszczerbionych lub porysowanych naczyń, płytek
i szkiełek. Użycie brudnych lub niewłaściwie oczyszczonych szklanych naczyń,
które moga˛ zawierać organiczne zanieczyszczenia, jest główna˛ przyczyna˛
fałszywych wyników. Przy stanowisku przeznaczonym do mycia należy umieścić
pisemne instrukcje. Główne etapy mycia powinny obejmować: wste˛pne płukanie,
mycie właściwym detergentem laboratoryjnym, płukanie woda˛ z kranu, a naste˛pnie woda˛destylowana˛, suszenie; należy upewnić sie˛, że detergent został usunie˛ty.
139
BADANIA SEROLOGICZNE
Wszystkie pipety należy zanurzyć w detergencie tak, aby roztwór wnikna˛ł do
wewna˛trz. Płukać pod bieża˛ca˛ woda˛ co najmniej 30 minut, a naste˛pnie w wodzie
destylowanej. Szklane płytki używane do odczynów VDRL musza˛ zostać
starannie oczyszczone z pozostałości detergentu i resztek olejku. Należy unikać
przedłużonego moczenia w detergencie ze wzgle˛du na możliwość uszkodzenia
pierścieni ceramicznych na płytkach. Szklane płytki z pierścieniami z parafiny
powinny być czyszczone z użyciem właściwych rozpuszczalników organicznych
(np. benzyny).
W odczynie RPR i VDRL do przygotowywania i rozcieńczania antygenu wykorzystuje sie˛ igły kalibrowane. W zestawie do odczynu RPR znajduje sie˛
igła, która˛ należy sprawdzić przed użyciem, określaja˛c liczbe˛ kropli/ml. Prawidłowo funkcjonuja˛ca 20-podziałkowa igła powinna dozować 90 kropli/ml. Nie
należy stosować igieł działaja˛cych niewłaściwie. Po użyciu umyć woda˛ destylowana˛. Do testu VDRL przygotować dwie igły, odłamuja˛c czubki za pomoca˛
szczypiec. Sprawdzić igłe˛ określaja˛c liczbe˛ kropli/ml: 18-podziałkowa igła
powinna dozować 60 kropli/ml, a 21 – 22-podziałkowa 100 kropli/ml. Każda˛
nieprawidłowo działaja˛ca˛ igłe˛ należy odrzucić lub wyregulować, dociskaja˛c lub
zwalniaja˛c koniec. Po użyciu umyć w wodzie destylowanej, 70% etanolu
i acetonie.
Odczynniki
Zwia˛zki chemiczne stosowane w serologii musza˛ mieć jakość odczynników
i spełniać kryteria określonej procedury. Musza˛ być przechowywane zgodnie
z zaleceniami producenta.
Do przygotowania odczynników powinna być używana wysokiej jakości woda
destylowana o pH 7,0. Należy przechowywać ja˛ w odpowiednio opisanym z data˛,
ciepłoodpornym szklanym naczyniu lub plastikowej butli ze szczelnie domknie˛ta˛
zakre˛tka˛.
Fizjologiczny roztwór soli jest używany sam lub jako roztwór buforowany, na
przykład buforem fosforanowym. W wilgotnym klimacie, w celu usunie˛cia wody,
chlorek sodu należy suszyć gora˛cym powietrzem w 160 – 180°C przez 30 minut.
Sól rozpuścić w wodzie destylowanej lub demineralizowanej i przechowywać
w ciepłoodpornym, odpowiednio opisanym z data˛ szklanym naczyniu lub
plastikowej butli, ze szczelnie zamknie˛ta˛ zakre˛tka˛. Przed użyciem buforu
oznaczyć jego pH.
Surowice zawieraja˛ce makroskopowo widoczne cza˛steczki należy odwirować
w 3000 g przez 10 minut i do testów użyć supernatantu. Osocze z hemoliza˛ lub
zanieczyszczone nie powinno być użyte. Inaktywowana˛ surowice˛ do testów
należy przygotować, ogrzewaja˛c w 56°C przez 30 minut. Jeśli nie zostanie zużyta
w cia˛gu 4 godzin od inaktywacji, należy ja˛ ponownie inaktywować, ogrzewaja˛c
w 56°C przez 10 minut. Wszystkie surowice przed użyciem pozostawić
w temperaturze pokojowej.
W rozdziale zostana˛ szczegółowo omówione niektóre testy serologiczne najcze˛ściej wykonywane w laboratoriach medycznych. Należa˛ do nich testy do
diagnostyki kiły, test Wrighta do diagnostyki brucelozy i test wykrywaja˛cy
antystreptolizyne˛ O do diagnostyki późnych powikłań po zakażeniach paciorkowcowych.
140
CZE˛ŚĆ I
Każdy opis procedury odnosi sie˛ do badań wykonywanych z użyciem komercyjnych zestawów do przeprowadzania testów. Gotowe zestawy sa˛wytwarzane przez
wielu producentów, zawieraja˛ w opakowaniu szczegółowe instrukcje, które przed
użyciem należy uważnie przeczytać.
Reakcje serologiczne
Odczyn kłaczkuja˛cy i precypitacji
W odczynie kłaczkuja˛cym, w wyniku reakcji rozpuszczonego antygenu z przeciwciałami, powstaje precypitat, który można ogla˛dać zarówno pod mikroskopem, jak i gołym okiem. Po zmieszaniu odczynników prawie natychmiast
pojawia sie˛ wste˛pne wia˛zanie antygenu przez przeciwciała. Dalsze formowanie
wie˛kszych, widocznych kłaczków wymaga godziny lub dłuższego czasu i jest
zależne od temperatury. Reakcja zachodzi szybciej w strefie ,,równoważnej’’,
optymalnego stosunku antygen-przeciwciało. Probówka z najszybciej tworza˛cym
sie˛ precypitatem jest dobrym wskaźnikiem równoważności. Najszerzej stosowanymi odczynami kłaczkuja˛cymi sa˛ testy VDRL i RPR. Obydwa wykorzystywane
w diagnostyce kiły (wywołanej przez Treponema pallidum) i innych zakażeń
kre˛tkowych.
Odczyn kłaczkuja˛cy dostarcza jakościowego dowodu reakcji antygen-przeciwciało, ale nie wskazuje, czy obecna jest jedna, czy kilka reakcji antygen-przeciwciało. Jeśli jednak test przeprowadzany jest na półpłynnym żelu, ze
wzgle˛du na różna˛ zdolność do dyfuzji i współczynniki migracji antygenów,
można reakcje te rozróżnić.
Odczyn aglutynacji
W odczynie aglutynacji reagent, którym może być antygen lub przeciwciało,
jest osadzony lub zaabsorbowany na mikrocza˛steczce. Nośnikami reagentów
moga˛ być różne cza˛steczki, np. lateks, żelatyna, mikrogranulki, bakterie lub
krwinki czerwone. Technika ta nosi również nazwe˛ biernej aglutynacji. Jeśli
nośnikiem sa˛ erytrocyty, technike˛ określa sie˛ mianem hemaglutynacji biernej,
jeżeli sa˛ to komórki gronkowca, technika nosi nazwe˛ koaglutynacji. Po dodaniu
swoistej surowicy odpornościowej komórki lub inne cza˛stki tworza˛ sieć poła˛czeń i w rezultacie aglutynat z wyraźnym supernatantem. Używaja˛c surowicy
o znanej swoistości można przeprowadzać identyfikacje˛ nieznanych mikroorganizmów lub ich antygenów. Test można wykonać na szkiełku i odczytać
wynik makroskopowo lub pod mikroskopem w małym powie˛kszeniu. Odczyn
aglutynacji wykorzystuje sie˛ także do oceny miana aglutynin przeciwbakteryjnych w surowicy pacjentów z nieznana˛ choroba˛. Wzrost miana podczas
trwania choroby przemawia jednoznacznie za zwia˛zkiem przyczynowo-skutkowym.
Aglutynacja szybciej zachodzi w wyższych temperaturach (35 – 56°C) i przy
ruchu (np. wstrza˛sanie, mieszanie lub wirowanie), które ułatwiaja˛ kontakt mie˛dzy
antygenem i przeciwciałem. Proces aglutynacji wymaga obecności soli. Potencjalnie poważny problem stanowi prozona: zahamowanie reakcji serologicznej
wskutek nadmiaru antygenu lub przeciwciał. Prozona daje fałszywie ujemny
wynik testu; tego błe˛du można jednak unikna˛ć badaja˛c seryjne rozcieńczenia
surowicy.
141
Powszechnie stosowany test aglutynacji wykorzystuje Staphylococcus aureus,
zawieraja˛cy na swojej powierzchni białko A. Jest to białko wia˛ża˛ce fragment Fc
przeciwciał IgG. Gronkowce opłaszczone przeciwciałami IgG w obecności
swoistego antygenu daja˛ wyraźnie widoczna˛ aglutynacje˛. Odczyn stosowany jest
głównie do identyfikacji drobnoustrojów hodowanych z próbek klinicznych lub
do wykrywania antygenów bakteryjnych w płynach ustrojowych zakażonych
pacjentów (płyn mózgowo-rdzeniowy w przypadku zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych).
Odczyny aglutynacji wykorzystywane sa˛ do wykrywania wirusa Epsteina-Barr
(mononukleoza zakaźna), rotawirusów, różyczki oraz antygenów bakteryjnych
(m.in. Haemophilus i Streptococcus A i B).
Odczyn immunofluorescencji
W odczynach immunofluorescencji immunoreagent (antygen lub przeciwciało)
znakowany jest barwnikiem fluorescencyjnym, na przykład fluoresceina˛ lub
rodamina˛, a reakcja antygenu z przeciwciałem wykrywana jest w mikroskopie
fluorescencyjnym. W odczynie immunofluorescencji bezpośredniej do wykrycia
obecności specyficznego antygenu wykorzystuje sie˛ znaczone fluoresceina˛
przeciwciała. Odczyny sa˛ przydatne w szybkiej identyfikacji Chlamydia trachomatis, C. psittaci, Rickettsia spp., Streptococcus pyogenes, Bordetella pertussis,
Corynebacterium diphtheriae, Legionella pneumophila i innych drobnoustrojów
izolowanych z próbek klinicznych.
W odczynie immunofluorescencji pośredniej (indirect fluorescent antibody
— IFA) wykonuje sie˛ badania seryjnych rozcieńczeń surowicy pacjenta ze
specyficznym antygenem, a dla uwidocznienia reakcji dodaje sie˛ znakowane
fluoresceina˛ przeciwciała przeciw ludzkim immunoglobulinom IgG lub IgM. Na
przykład, w serodiagnostyce kiły, szkiełko z adsorbowanym antygenem Treponema pallidum zanurza sie˛ w surowicy pacjenta i spłukuje. Naste˛pnie na szkiełku
umieszcza sie˛ znakowane fluoresceina˛ przeciwciała przeciw ludzkim immunoglobulinom, spłukuje i preparat ogla˛da sie˛ w mikroskopie fluorescencyjnym. Jeśli
surowica pacjenta zawiera specyficzne przeciwciała przeciw Treponema pallidum, widoczne sa˛ jasno fluoryzuja˛ce kre˛tki. Przy braku specyficznych przeciwciał przeciwkre˛tkowych w surowicy pacjenta kre˛tki nie świeca˛. Test IFA może
być również wykorzystywany do identyfikacji innych bakterii, na przykład
pra˛tków gruźlicy, a z powodu wie˛kszej liczby znakowanych fluoresceina˛
przeciwciał ła˛cza˛cych sie˛ z antygenem stanowi cze˛sto czulsza˛ metode˛ niż test
immunofluorescencji bezpośredniej.
Odczyny serologiczne w diagnostyce kiły
Odczyny serologiczne wykonywane w diagnostyce kiły to testy kre˛tkowe
i niekre˛tkowe. Do odczynów niekre˛tkowych należa˛: VDRL i RPR. Użyty w nich
antygen przygotowywany jest z antygenów niekre˛tkowych, takich jak kardiolipina-lecytyna i wykrywa podobne do przeciwciał reaginy, które sa˛ obecne
w surowicy wielu pacjentów z kiła˛, ale moga˛ także wyste˛pować w surowicy
pacjentów z innymi ostrymi i przewlekłymi schorzeniami. Testy sa˛ praktyczne,
niedrogie i powtarzalne, mimo że nie całkiem swoiste. Moga˛ potwierdzać
rozpoznanie wczesno- lub późnoobjawowej kiły lub być podstawa˛ rozpoznania
142
CZE˛ŚĆ I
kiły późnej. Sa˛ lepsze niż odczyny kre˛tkowe w monitorowaniu pacjentów po
leczeniu. VDRL jest skutecznym narze˛dziem w badaniach epidemiologicznych
kiły i innych chorób kre˛tkowych.
Odczyny z antygenami Treponema pallidum wykrywaja˛ swoiste przeciwciała,
powstaja˛ce w odpowiedzi na zakażenie kiła˛. Sa˛ wykorzystywane do potwierdzenia dodatnich wyników testów niekre˛tkowych. Odczyn immunofluorescencji
kre˛tków w modyfikacji absorpcyjnej (FTA-Abs) i odczyn hemaglutynacji
Treponema pallidum (TPHA) sa˛ wysoce swoiste i czułe, ale nie różnicuja˛
przebytych i aktywnych zakażeń kiły; nie można ich stosować w ocenie wyników
leczenia.
Odczyn VDRL
W odczynie wykorzystuje sie˛ cza˛steczki cholesterolu opłaszczone kompleksem
kardiolipina-lecytyna. Inaktywowana˛ surowice˛ lub płyn mózgowo-rdzeniowy
wytrza˛sa sie˛ na wytrza˛sarce z zawiesina˛antygenu VDRL przez podany okres. Jeśli
reaginy sa˛ obecne w badanym płynie, obserwuje sie˛ mikroflokulacje˛.
Odczyn VDRL jest wysoko dodatni we wczesnej kile. Po skutecznym leczeniu
miano stopniowa spada i zwykle w cia˛gu 1 – 2 lat odczyn staje sie˛ ujemny.
W późnej fazie choroby przez wiele lat, nawet po skutecznym leczeniu, surowica
może wykazywać dodatnie reakcje o niskim mianie (np. 1:8 lub mniejszym).
Reaktywność może spontanicznie zanikać u 20 – 30% nieleczonych pacjentów
w fazie latentnej choroby, a nawet cze˛ściej w późnej fazie kiły.
Fałszywie dodatnie wyniki obserwuje sie˛ z powodu podobieństwa antygenu
VDRL do tkanek gospodarza. Fałszywe wyniki moga˛ wyste˛pować u osób
zdrowych, jakkolwiek cze˛sto zwia˛zane sa˛ z określonymi chorobami lub przebytym szczepieniem. Fałszywie dodatnie reakcje, najcze˛ściej o niskim mianie (1:8
lub mniej), obserwowane sa˛ u osób z wirusowymi i bakteryjnymi zakażeniami
(atypowe zapalenie płuc, choroba papuzia, mononukleoza zakaźna i zapalenie
wa˛troby), podczas cia˛ży lub po niedawnym szczepieniu. Utrzymuja˛ce sie˛
fałszywie dodatnie wyniki, zwykle o dużym mianie, zwia˛zane sa˛ z obecnościa˛
autoprzeciwciał (czynnik reumatoidalny), wyste˛puja˛ u pacjentów z tra˛dem,
gruźlica˛, zaburzeniami odporności (np. toczeń rumieniowaty, kolagenozy, choroby reumatyczne, zespół Sjögrena, dysgammaglobulinemia), rzadziej u osób
z malaria˛ lub uzależnionych od heroiny. Dodatni i słabo dodatni wynik odczynu
VDRL nie powinien być traktowany jako ostateczny dowód kiły, podobnie jak
pojedynczy ujemny wynik nie wyklucza rozpoznania. Dla każdej słabo dodatniej
i dodatniej próbki, przy braku klinicznych objawów kiły, należy wykonać badania
z użyciem odczynów kre˛tkowych FTA-Abs lub TPHA.
Materiały i odczynniki zawarte w zestawie
do odczynu VDRL
Buforowany fizjologiczny roztwór soli
Zestaw kontrolnych surowic (ujemna, słabo dodatnia, dodatnia)
Antygen VDRL
143
Dodatkowe materiały i odczynniki
potrzebne do odczynu VDRL
Alkohol absolutny i aceton
Szkiełko do aglutynacji o wymiarach około 5 × 7,5 cm z zagłe˛bieniami o średnicy
16 mm i głe˛bokości 1,75 mm do badania płynu mózgowo-rdzeniowego
Odpowiednia liczba fiolek
Woda destylowana lub dejonizowana
Szklane płytki z 12 parafinowymi lub ceramicznymi pierścieniami o średnicy
około 14 mm do badania surowicy
Komora wilgotna
Igły podskórne bez skosu: 18-podziałkowe do badań surowicy i 21- lub
22-podziałkowe do badań płynu mózgowo-rdzeniowego
Stoper
Mikroskop świetlny o powie˛kszeniu × 10 okular i × 10 obiektyw
Wytrza˛sarka o ruchu kolistym o średnicy 2 cm, szybkości 180 obr./min,
w ustawieniu poziomym, z automatycznym pomiarem czasu
pH-metr
Pipety serologiczne: 5,0 ml, 1,0 ml i 0,2 ml
Sterylne roztwory soli (0,85% i 10%)
Strzykawka typu Luer, 1 lub 2 ml
Butelka z zawiesina˛ antygenu VDRL, 30-ml, okra˛gła, zamykana szklanym
korkiem, z wa˛skim wlotem, o średnicy około 35 mm, z płaskim dnem
Łaźnia wodna (56°C)
Przygotowanie antygenu VDRL
i surowicy kontrolnej
Antygen VDRL jest alkoholowym roztworem lipidów (kardiolipiny i lecytyny)
i cholesterolu. Sa˛ to substancje nierozpuszczalne w wodzie. Przygotować świeża˛
zawiesine˛ w dniu użycia, ponieważ antygen VDRL jest niestabilny. Zawartość
ampułki z antygenem rozlać do fiolek do przechowywania. Upewnić sie˛, że fiolki
sa˛ szczelnie zamknie˛te i przechowywać w ciemności w 15 – 30°C. Wyjmować
antygen według potrzeb.
Po otwarciu butelke˛ z buforowanym roztworem soli przechowywać w chłodziarce. Nie używać, jeśli pojawi sie˛ zme˛tnienie.
Do kontrolnej surowicy dolać 3 ml destylowanej lub dejonizowanej wody.
Nadwyżke˛ przygotowanych na dany dzień rozpuszczonych surowic podzielić na
odpowiednia˛ liczbe˛ porcji (dzienne zapotrzebowanie) i przechowywać w temperaturze –20°C do miesia˛ca. Nie zamrażać ponownie po rozmrożeniu. Surowice,
przeznaczone do wykorzystania w cia˛gu dnia, przechowywać w chłodziarce
w 2 – 8°C.
Przygotowanie zawiesiny antygenu VDRL
1. Ogrzać antygen i buforowany roztwór soli do temperatury pokojowej.
Sprawdzić pH buforowanego roztworu soli, wartość nie powinna przekraczać
pH 6,0 ± 0,1.
2. Do butelki z zawiesina˛ antygenu dodać pipeta˛ 0,4 ml buforowanego roztworu
soli i delikatnie przechylić naczynie, rozprowadzaja˛c warstwe˛ płynu na dnie.
144
CZE˛ŚĆ I
3. Za pomoca˛ 1-mililitrowej kalibrowanej pipety odmierzyć 0,5 ml roztworu
antygenu i dodać w opisany poniżej sposób:
• Trzymać pipete˛ w 1/3 wysokości butelki. Nie dotykać roztworu soli.
• Mieszaja˛c re˛cznie ruchem kolistym o średnicy około 5 cm, dodawać po
kropli antygenu.
• Wkraplać antygen w ten sposób przez około 6 sekund, a naste˛pnie dodać
pozostały antygen z pipety.
• Mieszać jeszcze przez 10 sekund.
4. Dodać 4,1 ml buforowanego roztworu soli, wlewaja˛c go po ściankach butelki.
5. Zamkna˛ć butelke˛ szklanym korkiem i wstrza˛sać w góre˛ i w dół około 30 razy
przez 10 sekund.
6. Pozostawić zawiesine˛ antygenu na co najmniej 10 minut. Wstrza˛sna˛ć
delikatnie przed użyciem. Zawiesine˛ należy wykorzystać w cia˛gu 8 godzin.
7. W przypadku badania płynu mózgowo-rdzeniowego rozcieńczyć antygen 10%
roztworem soli w stosunku 1:2. Wstrza˛sać butelke˛ delikatnie przez 10 sekund,
pozostawić na co najmniej 5 minut i użyć najpóźniej w cia˛gu 2 godzin.
Jakościowy odczyn VDRL
1. Za pomoca˛ 1,0-mililitrowej pipety kilkakrotnie wymieszać, a naste˛pnie
umieścić 0,05 ml inaktywowanej surowicy we wgłe˛bieniu szklanej płytki
VDRL.
2. Rozprowadzić surowice˛ okre˛żnymi ruchami końcówki pipety, tak by pokryła
cała˛ wewne˛trzna˛ powierzchnie˛ parafinowego lub ceramicznego wgłe˛bienia.
Jedynie użycie czystych płytek umożliwia równomierne rozprowadzenie
surowicy.
3. Trzymaja˛c poziomo strzykawke˛ z 18-podziałkowa˛ igła˛, do surowicy dodać
uważnie 1 krople˛ antygenu (1/60 ml). Nie dotykać surowicy igła˛.
4. Płytki w komorze wilgotnej wstawić na 4 minuty do wytrza˛sarki. Jeśli
wytrza˛sarka nie jest doste˛pna, płytki kołysać re˛cznie, cia˛głym ruchem kolistym
przez 4 minuty.
5. Natychmiast po wymieszaniu ocenić preparat pod mikroskopem w powie˛kszeniu × 10 okular i × 10 obiektyw.
6. Odczytać reakcje w poniższy sposób:
Średnie i duże grudki
R — Reactive/Dodatnia
Drobne grudki
W — Weakly reactive/Słabo dodatnia
Brak grudek lub bardzo słaby ślad N — Non-reactive/Ujemna
Surowica słabo dodatnia lub wykazuja˛ca śladowy odczyn, ze wzgle˛du na
obserwowane niekiedy reakcje prozony, powinna zostać powtórnie zbadana
w teście półilościowym.
Półilościowy odczyn VDRL
1. Przygotować serie podwójnych rozcieńczeń inaktywowanej surowicy w 0,85%
NaCl (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32).
2. Dla każdego rozcieńczenia surowicy przeprowadzić badanie jakościowe.
3. Zapisać wyniki i zgodnie z poniższymi przykładami określić najwyższe
dodatnie rozcieńczenie surowicy (nie słabo dodatnie):
4. W przypadku dodatnich wyników obserwowanych w rozcieńczeniu 1:32
przygotować kolejne podwójne rozcieńczenia w 0,85% NaCl (1:64, 1:128
i 1:256) i przeprowadzić ponownie badanie jakościowe.
145
Rozcieńczenie
Surowica
nierozcieńczona
1:2
1:4
1:8
W
R
R
R
W
N (szorstki)
N
W
R
R
W
W
N
N
W
R
R
R
N
N
N
W
R
R
Wynik
1:16 1:32
N
N
N
N
W
R
N
N
N
N
N
N
Słabo dodatni, bez rozcieńczenia
Dodatni, bez rozcieńczenia
Dodatni, rozcieńczenie 1:2
W — Weakly reactive/reakcja słabo dodatnia
R — Reactive/reakcja dodatnia
N — Non-reactive/reakcja ujemna
Odczyn RPR
Zawiesina antygenu w teście RPR zawiera cza˛steczki we˛gla pozwalaja˛ce na
makroskopowe uwidocznienie odczynu kłaczkuja˛cego. Główne różnice w stosunku do odczynu VDRL dotycza˛ użycia utrwalonego antygenu, kartoników zamiast
płytek, możliwości wykonania badania zarówno z surowica˛, jak i z osoczem, bez
konieczności inaktywacji surowicy. Potrzebna jest niewielka ilość próbki, można
użyć również osocza z krwi włośniczkowej. Testu RPR nie stosuje sie˛ do badania
płynu mózgowo-rdzeniowego.
W odczynie RPR antygen jest gotowy do użycia. Nie wymaga wcześniejszego
przygotowania czy rozcieńczenia. Termin ważności nieotwartego, przechowywanego w chłodziarce antygenu, wynosi jeden rok. Otwarty, przechowywany
w chłodziarce w plastikowym dozowniku, utrzymuje swoja˛ aktywność przez
3 miesia˛ce. Test RPR jest nieco bardziej czuły, prostszy i szybszy niż test VDRL.
Fałszywie dodatnie wyniki uzyskuje sie˛ nieznacznie cze˛ściej niż w odczynie
VDRL. Niektóre zestawy do testów wymagaja˛ użycia wytrza˛sarki do wymieszania reagentów, podczas gdy w innych można wymieszać je re˛cznie.
do odczynu RPR
Igła dozuja˛ca 60 kropli/ml zawiesiny antygenu
Surowice kontrolne, dodatnia i ujemna
Jednorazowe zakraplacze do odmierzenia 50 µl surowicy lub osocza
Kartoniki RPR pokryte warstwa˛ plastiku, każdy z dwoma rze˛dami po pie˛ć
dołeczków
Gotowa zawiesina antygenu RPR
Mieszadełka
potrzebne do odczynu RPR
Jednorazowy zakraplacz
Dermatograf
Komora wilgotna
Wytrza˛sarka o ruchach kolistych o średnicy 2 cm, szybkości 180 obr./min,
w ustawieniu poziomym, z automatycznym pomiarem czasu
Sterylny roztwór NaCl (0,85%)
146
CZE˛ŚĆ I
Jakościowy odczyn RPR
1. Wyja˛ć zestaw odczynników z lodówki i pozostawić do ogrzania do temperatury pokojowej.
2. Przygotować surowice˛ kontrolna˛, dodaja˛c wskazana˛ obje˛tość wody destylowanej.
3. Opisać każdy dołeczek na kartoniku RPR laboratoryjnym numerem badania,
pozostawiaja˛c miejsce dla dodatniej, słabo dodatniej i ujemnej surowicy
kontrolnej.
4. Za pomoca˛ jednorazowego zakraplacza umieścić 50 µl surowicy lub osocza
w odpowiednim dołeczku. Dla każdej próbki użyć nowego zakraplacza.
5. Delikatnie wstrza˛sna˛ć zawiesina˛ antygenu i do każdego dołeczka, dozuja˛ca˛
igła˛ z zestawu, dodać bezkontaktowo krople˛ antygenu. Ostrożnie wymieszać
zawiesine˛ antygenu z surowica˛. Dla każdej próbki użyć nowego mieszadełka.
Dokładnie rozprowadzić.
6. Kartoniki w komorze wilgotnej wstawić na 8 minut na wytrza˛sarke˛. Jeśli
wytrza˛sarka nie jest doste˛pna, kartoniki kołysać re˛cznie, cia˛głym ruchem
kolistym przez 2 minuty, naste˛pnie umieścić na 6 minut w wilgotnej komorze
zawieraja˛cej zwilżona˛bibułe˛ lub inny materiał. Wyja˛ć kartonik i obracać przez
chwile˛, do uzyskania końcowego wyniku. Uważać, aby nie zmieszać próbek ze
soba˛.
7. Po zdje˛ciu z wytrza˛sarki obejrzeć kartoniki w dobrym świetle. Dodatnia
surowica kontrolna powinna wykazywać wyraźnie widoczna˛ reakcje˛. Ujemna
surowica kontrolna nie wykazuje reakcji. Krótkie obracanie i przechylanie
kartonika w re˛kach może pomóc w zróżnicowaniu słabo dodatnich i ujemnych
próbek.
8. Zapisać wynik badania:
• Małe lub duże kłaczkowate skupiska: dodatni.
• Jednolite zme˛tnienie zawiesiny cza˛steczek: ujemny.
9. Przygotować seryjne rozcieńczenia każdej dodatniej surowicy w celu oznaczenia miana.
Półilościowy odczyn RPR
1. Wyja˛ć zestaw odczynników z lodówki i pozostawić do ogrzania do
temperatury pokojowej.
2. Opisać rza˛d 5 dołeczków na kartoniku RPR laboratoryjnym numerem
badania.
3. Za pomoca˛ jednorazowego zakraplacza dodać do każdego dołeczka po
1 kropli roztworu NaCl (0,85%). Nie rozprowadzać.
4. Za pomoca˛ nowego zakraplacza nanieść 1 krople˛ próbki surowicy do
pierwszego dołeczka. Wymieszać zakraplaczem (zacia˛gaja˛c i wypuszczaja˛c
zawartość 5 – 6-krotnie; unikać tworzenia sie˛ pe˛cherzyków).
5. Przenieść 50 µl mieszaniny (rozcieńczenie 1:2) do naste˛pnego dołeczka.
Wymieszać. Powtórzyć cała˛czynność do pia˛tego dołeczka wła˛cznie (rozcieńczenie 1:32). Usuna˛ć 50 µl mieszaniny z ostatniego rozcieńczenia.
6. Rozprowadzić przygotowane próbki w dołeczkach, rozpoczynaja˛c
od najwyższego rozcieńczenia. Dla każdej próbki użyć nowego mieszadełka.
7. Za pomoca˛ dozuja˛cej igły dodać bezkontaktowo do każdego dołeczka
1 krople˛ delikatnie wstrza˛śnie˛tego antygenu. Ostrożnie wymieszać zawiesine˛
antygenu z surowica˛. Dokładnie rozprowadzić. Do każdej próbki użyć
nowego mieszadełka.
147
8. Kartoniki w komorze wilgotnej wstawić na 8 minut na wytrza˛sarke˛. Jeśli
wytrza˛sarka nie jest doste˛pna, kartoniki kołysać re˛cznie, cia˛głym ruchem
kolistym przez 2 minuty, naste˛pnie umieścić na 6 minut w wilgotnej komorze
zawieraja˛cej mokra˛bibułke˛ lub inny materiał. Wyja˛ć kartonik i obracać przez
chwile˛, do uzyskania końcowego wyniku. Uważać, aby nie zmieszać próbek
ze soba˛.
9. Po zdje˛ciu z wytrza˛sarki obejrzeć kartoniki w dobrym świetle. Najwyższe
rozcieńczenie z widoczna˛ makroskopowo reakcja˛ jest mianem próbki.
10. Jeśli próbka jest dodatnia przy 1:32, należy wykonać dodatkowe serie
rozcieńczeń. Przygotować roztwór 1:16 z NaCl (0,85%), a naste˛pnie
w opisany wyżej sposób rozcieńczyć surowice˛.
Odczyn immunofluorescencji kre˛tków
w modyfikacji absorpcyjnej
(FTA-Abs)
W teście FTA-Abs wykorzystuje sie˛ utrwalony acetonem na szkiełku antygen
Treponema pallidum (szczep Nicholsa). Można również użyć zawieszonych
w roztworze soli liofilizowanych komórek T. pallidum. Inaktywowana˛ surowice˛
pacjenta inkubuje sie˛ z kre˛tkami Reitera, wia˛ża˛cymi niespecyficzne przeciwciała
kre˛tkowe. Po absorpcji surowice˛ umieszcza sie˛ na szkiełku. Specyficzne
przeciwciała z surowicy wia˛ża˛sie˛ na powierzchni komórek kre˛tków. Po spłukaniu
dodaje sie˛ koniugatu znakowanych fluorescencyjnie (izotiocyjanian fluoresceiny)
przeciwciał przeciw ludzkim immunoglobulinom. Koniugat zostanie zwia˛zany
przez przeciwciała obecne na powierzchni kre˛tków i uwidoczniony w mikroskopie fluorescencyjnym.
Dodatni odczyn pojawia sie˛ trzy tygodnie po zakażeniu i utrzymuje sie˛
u nieleczonych pacjentów Może być także obserwowany kilka lat po skutecznym
leczeniu we wczesnej fazie i przetrwać u chorych, u których terapie˛ wprowadzono
dopiero w późnej fazie choroby. Dodatni wynik testu z dużym prawdopodobieństwem wskazuje na zakażenie kiła˛. Fałszywie ujemne wyniki uzyskuje sie˛
wyja˛tkowo rzadko i zwia˛zane sa˛ prawdopodobnie ze zła˛ jakościa˛ antygenu.
Fałszywie dodatnie wyniki moga˛ być efektem obniżonej jakości odczynników,
a w rezultacie niedostatecznej eliminacji nieswoistych przeciwciał w procesie
absorpcji. Fałszywie dodatnie wyniki obserwowano również u pacjentów z marskościa˛ wa˛troby, zapaleniem żołe˛dzi, kolagenoza˛, opryszczka˛ narza˛dów płciowych, toczniem rumieniowatym i bardzo rzadko u kobiet w cia˛ży oraz u zdrowych
osób z nieznanych przyczyn.
Wykazano krzyżowa˛ reakcje˛ mie˛dzy T. pallidum i Borrelia burgdorferi (choroba
z Lyme). Próbki z nieproporcjonalnie wysokim mianem w teście FTA-Abs,
w porównaniu z innymi serologicznymi testami kiłowymi, powinny zostać
przebadane w kierunku obecności przeciwciał przeciw Borrelia.
Główna˛ zaleta˛ odczynu FTA-Abs jest jego wysoka swoistość i czułość oraz
wczesna reaktywność. Wyniki sa˛ wiarygodne i moga˛ być decyduja˛ce w wa˛tpliwych przypadkach. Test FTA-Abs jest jednak czasochłonny i drogi; wymaga
dobrego wyszkolenia personelu przeprowadzaja˛cego badanie i odczytuja˛cego
wyniki. Powinien wie˛c być traktowany jako test potwierdzenia w przypadkach
niepewnej diagnozy.
148
CZE˛ŚĆ I
do odczynu FTA-Abs
Roztwór buforu
Surowice kontrolne, dodatnia i ujemna
Przeciwciała przeciw ludzkim immunoglobulinom znakowane fluoresceina˛ (koniugat)
Liofilizowany ekstrakt kre˛tków Reitera (sorbent)
T. pallidum utrwalone na szkiełkach
potrzebne do odczynu FTA-Abs
Szkiełka nakrywkowe
Mikroskop fluorescencyjny z UV iluminacja˛ (× 40 obiektyw)
Podłoże utrwalaja˛ce
Buforowana sól, pH 7,2 (PBS)
Tween 80 (2%)-PBS
Odczyn FTA-Abs
1. Wyja˛ć zestaw odczynników z lodówki i pozostawić do ogrzania do
2. Pozostawić wymagana˛ liczbe˛ szkiełek przez 15 minut do ogrzania do
3. Zmieszać 50 µl surowicy badanej z 0,2 ml sorbentu. Równolegle rozcieńczyć
dodatnia˛ i ujemna˛ surowice˛ kontrolna˛: 1:5 z roztworem buforu i 1:5
z sorbentem.
4. Na jedno szkiełko z kre˛tkami nałożyć 10 µl roztworu buforu (kontrola
koniugatu), na drugie 10 µl sorbentu (kontrola sorbentu).
5. Na każde kolejne szkiełko nałożyć 10 µl odpowiedniego rozcieńczenia
surowicy badanej lub kontrolnej.
6. Umieścić szkiełka w wilgotnej komorze na 30 minut w 37°C. Zanurzyć
preparaty na 5 minut w roztworze Tween-PBS. Czynność powtórzyć. Spłukać
woda˛ destylowana˛, odsa˛czyć i zostawić do wyschnie˛cia w pojemniku na
preparaty.
7. Nałożyć na wszystkie szkiełka po 10 µl przeciwciał przeciw immunoglobulinom ludzkim rozcieńczonych zgodnie z zaleceniami producenta
w buforze.
8. Umieścić szkiełka w wilgotnej komorze na 30 minut w 37°C. Zanurzyć
preparaty na 5 minut w roztworze Tween-PBS. Czynność powtórzyć. Spłukać
woda˛ destylowana˛, odsa˛czyć i zostawić do wyschnie˛cia w pojemniku na
preparaty.
9. Na każde szkiełko nałożyć 2 krople podłoża utrwalaja˛cego i szkiełko
nakrywkowe.
10. Sprawdzić, czy koniugat, absorbent i ujemna surowica kontrolna nie
wykazuja˛ fluorescencji:
• Brak fluorescencji lub lekko zielonkawe kre˛tki: reakcja ujemna.
• Różny stopień zielonej fluorescencji: reakcja dodatnia.
149
Fluorescencje˛ można stopniować:
Ujemna
Graniczna
Dodatnia
0
1+, 2+, 3+
4+
Reakcja 2+ i wie˛ksza wskazuje na zakażenie T. pallidum.
Wykrywanie aglutynin w gora˛czce
Lekarz, który leczy pacjenta z gora˛czka˛ o nieustalonej przyczynie, cze˛sto
zleca wykonanie serii badań serologicznych, wspólnie określanych nazwa˛
odczynów aglutynacyjnych w gora˛czce, w celu potwierdzenia zakażeń wywołanych przez Brucella (odczyn Wrighta), Salmonella typhi (odczyn Widala)
i niektóre riketsje (odczyn Weila-Felixa). Odczyny wykrywaja˛ przeciwciała
aglutynuja˛ce skierowane przeciw somatycznemu antygenowi O i/lub rze˛skowemu
antygenowi H poszukiwanych drobnoustrojów lub, w przypadku odczynu
Weila-Felixa, krzyżowo reaguja˛ce z antygenem somatycznym dwóch szczepów
Proteus vulgaris.
Odczyny Widala i Weila-Felixa, ze wzgle˛du na znaczna˛ liczbe˛ technicznych
i interpretacyjnych problemów, nie sa˛obecnie zalecane do badań przesiewowych.
Ujemna reakcja nie wyklucza aktywnego zakażenia, ponieważ zakażenie może
być w fazie inkubacji, w której pacjent nie wytwarza jeszcze wykrywalnej liczby
przeciwciał. Zjawisko prozony także daje ujemne reakcje; zapobieganiu efektowi
prozony służy stosowanie seryjnych rozcieńczeń surowicy. Dodatnia reakcja
z danym antygenem może okazać sie˛ niediagnostyczna ze wzgle˛du na wykazywany podczas choroby wzrost wytwarzania heterologicznych aglutynin. Takie
reakcje nosza˛ nazwe˛ nieswoistej odpowiedzi wtórnej, w której w odpowiedzi na
stymulacje˛ antygenowa˛ pacjent wytwarza nieswoiste aglutyniny. Diagnostyka
serologiczna oparta jedynie na stwierdzeniu wysokiego miana przeciwciał nie jest
pewna i tylko serokonwersja z czterokrotnym wzrostem miana przeciwciał
w seryjnych rozcieńczeniach powinna być traktowana jako dowód świeżego
zakażenia.
Wie˛kszość pacjentów z ostra˛ bruceloza˛ pod koniec drugiego tygodnia zakażenia
wykazuje miano aglutynin 1:320 i wyższe. Nawet rok po leczeniu u 20%
pacjentów nadal wyste˛puja˛ znacza˛ce miana aglutynin Brucella. Wysokie miana
obserwowano sa˛ również u pacjentów zakażonych Francisella tularensis i Yersinia enterocolitica, u niedawno szczepionych na bruceloze˛ i cholere˛ lub
badanych testem skórnym z brucelergina˛. Obserwowano je również u pracowników rzeźni.
Ponieważ hodowle krwi przez wiele tygodni moga˛ nie wykazywać obecności drobnoustrojów, określenie miana aglutynin Brucella może stanowić
wste˛pna˛ diagnoze˛ ostrej brucelozy. Izolacja bakterii, zazwyczaj z krwi, dostarcza ostatecznych dowodów zakażenia. Przy podejrzeniu choroby i ujemnym wyniku posiewu krwi, w celu potwierdzenia zakażenia, można
przeprowadzić hodowle˛ szpiku kostnego pobranego z mostka. Pacjent ze
zlokalizowana˛ bruceloza˛ może nie gora˛czkować i nie wykazywać znacza˛cego
miana aglutynin Brucella. W tych przypadkach chorobe˛ podejrzewa sie˛ na
podstawie danych epidemiologicznych i obecności zwapniałych we˛złów chłonnych w badaniach radiologicznych. Diagnoze˛ należy jednak potwierdzić w hodowli krwi.
150
CZE˛ŚĆ I
Szybki test szkiełkowy jest testem przesiewowym, przeznaczonym do wykrywania aglutynin, podczas gdy test probówkowy jest testem potwierdzaja˛cym,
który służy do ilościowej oceny aglutynin. Każdy dodatni wynik otrzymany
w teście szkiełkowym należy potwierdzić w teście probówkowym.
do wykrywania aglutynin w brucelozie
Zawiesina antygenu (B. abortus, B. melitensis) w butelce z zakraplaczem
Ujemna surowica kontrolna
Dodatnia surowica kontrolna
Dodatkowe materiały i odczynniki potrzebne do wykrywania
aglutynin w brucelozie
Aplikator patyczków
Szklana płytka
Dermatograf
Pipety, 50 – 1000 µl
Linijka
Sterylny roztwór NaCl (0,85%)
Probówki i stojak na probówki
Stoper
Łaźnia wodna z kontrolowana˛ temperatura˛
Test szkiełkowy do wykrywania aglutynin w brucelozie
Preferowany w porównaniu z testem probówkowym jako mniej skomplikowany.
1. Próbka surowicy musi być czysta, bez widocznych resztek tłuszczowych. Nie
powinna wykazywać hemolizy ani być zanieczyszczona przez bakterie. Nie
może być inaktywowana przez podgrzewanie, ponieważ w ten sposób
zniszczone zostałyby niektóre termolabilne aglutyniny.
2. Przygotować szklana˛ płytke˛, rysuja˛c za pomoca˛ dermatografu i linijki dwa
rze˛dy 2,5-centymetrowych kratek. Każdy rza˛d zawieraja˛cy 5 kratek wystarcza
na przeprowadzenie badania antygenu z rozcieńczeniami surowicy do 1:320.
3. Za pomoca˛ 0,2-mililitrowej pipety nanieść 0,08, 0,04, 0,02, 0,01 i 0,005 ml
surowicy w rze˛dzie kratek.
4. Do każdej surowicy dodać 1 krople˛ właściwej dla testu szkiełkowego
zawiesiny dobrze wymieszanego antygenu.
5. Zaczynaja˛c od najwyższego rozcieńczenia wymieszać patyczkiem mieszanine˛
surowica-antygen. Końcowe rozcieńczenia sa˛ zależne od rozcieńczeń w makroskopowym odczynie probówkowym i wynosza˛ odpowiednio 1:20, 1:40,
1:80, 1:160 i 1:320.
6. Trzymaja˛c płytke˛ w obu dłoniach delikatnie wymieszać, wykonuja˛c 15 – 20 kolistych ruchów. Ogla˛dać mieszanine˛ w dobrym świetle przez 1 minute˛,
poszukuja˛c śladów aglutynacji. Reakcje pojawiaja˛ce sie˛ później moga˛ być
zwia˛zane z wysychaniem reagentów na szkiełku i powinny być potwierdzone
w teście probówkowym.
151
7. Odczytać wyniki w poniższy sposób:
Całkowita aglutynacja
Około 75% zaglutynowanych komórek
Śladowa lub brak aglutynacji
4+
3+
2+
1+
–
Probówkowy test wykrywaja˛cy aglutyniny w brucelozie
Przygotować seryjne rozcieńczenia surowicy i surowice˛ kontrolna˛ w poniżej
przedstawiony sposób:
1. Dla każdej badanej surowicy umieścić po 8 probówek w stojaku.
2. Do pierwszej probówki w każdym rze˛dzie dodać pipeta˛ 1,9 ml NaCl (0,85%),
do kolejnych po 0,5 ml.
3. Do probówki z 1,9 ml NaCl dodać 0,1 ml surowicy.
4. Dobrze wymieszać pipeta˛ i przenieść 0,5 ml roztworu do probówki drugiej.
Dokładnie wymieszać.
5. Do kolejnych probówek w rze˛dzie, ła˛cznie z siódma˛, dodać 1 krople˛
rozcieńczonej surowicy. Wymieszać dokładnie. Z probówki 7. po wymieszaniu usuna˛ć 0,5 ml roztworu. Probówka 8. jest kontrola˛ antygenu.
6. Do każdej z 8 probówek dodać 0,5 ml odpowiedniego antygenu. Wstrza˛sna˛ć
statywem, mieszaja˛c antygen z surowica˛. Kolejne rozcieńczenia wynosza˛
odpowiednio od 1:20 do 1:1280.
7. Inkubować w łaźni wodnej w 37°C przez 48 godz., zgodnie z zaleceniami
producenta.
8. Oceniać makroskopowo obecność aglutynacji w probówkach przez 1 minute˛
w dobrym świetle na ciemnym tle. Przy odczycie nie wstrza˛sać probówek.
Dodatnia reakcja wykazuje widoczna˛aglutynacje˛ (granulacje˛); ujemna reakcja
wykazuje zme˛tnienie zawiesiny bez aglutynacji. Najwyższe rozcieńczenie
wykazuja˛ce aglutynacje˛ jest mianem surowicy.
Odrzucić antygen, który nie aglutynuje z dodatnia˛ surowica˛ kontrolna˛ lub
aglutynuje z ujemna˛ surowica˛ kontrolna˛.
Aglutynacje˛ można obserwować w surowicy zdrowych osób, sta˛d pojedyncze
surowice o mianie niższym niż 1:80 maja˛ nieznaczna˛ wartość. Fałszywie dodatnie
wyniki otrzymuje sie˛ także u pacjentów zakażonych Francisella tularensis lub
u szczepionych przeciw Vibrio cholerae. Za pomoca˛ tego testu nie można
zróżnicować infekcji wywołanych B. abortus i B. melitensis.
Odczyn ASO
Zakażenia paciorkowcowe sa˛ cze˛ste i przeciwciała przeciw paciorkowcom
wyste˛puja˛ w dużym odsetku populacji. β-hemolizuja˛ce paciorkowce grupy A
wytwarzaja˛ dwie hemolizyny: wrażliwa˛ na tlen streptolizyne˛ O i tlenowo-stabilna˛
streptolizyne˛ S. Jedynie zredukowana (nieutleniona) streptolizyna O jest immunogenna i wykorzystywana w odczynie. Reakcja oparta jest na wytwarzaniu przez
pacjenta zakażonego Streptococcus pyogenes (grupa paciorkowców A) przeciwciał hamuja˛cych aktywność hemolityczna˛ streptolizyny O. Przeciwciała zwykle
utrzymuja˛ sie˛ długo, sta˛d pojedyncze stwierdzenie podwyższonego miana nie
świadczy o aktywnej infekcji. Jedynie w przypadku czterokrotnego wzrostu miana
przeciwciał w kolejnych próbkach, pobranych w 10 – 14-dniowym odste˛pie,
152
CZE˛ŚĆ I
należy rozważyć obecność świeżego zakażenia. Test najcze˛ściej wykorzystywany
jest w diagnostyce gora˛czki reumatycznej, ostrego kłe˛buszkowego zapalenia
nerek i innych chorób popaciorkowcowych.
Doste˛pne sa˛ dwa typy komercyjnych zestawów do odczynu antystreptolizyny O:
• Test lateksowej aglutynacji szkiełkowej ASO używany w badaniach przesiewowych do identyfikacji podwyższonych mian ASO (200 IU i wyższych)
w surowicy.
• Test probówkowy ASO jest odczynem zahamowania hemolizy, wykorzystywanym do określenia miana surowic dodatnich w teście lateksowo-szkiełkowym. Miano poniżej 50 IU nie potwierdza rozpoznania ostrej gora˛czki
reumatycznej.
do lateksowego testu szkiełkowego ASO
Jednorazowe kartoniki, każdy z 6 dołeczkami
Jednorazowy zakraplacz
Uczulony odczynnik lateksowy (ze streptolizyna˛ O)
Dodatkowe materiały i odczynniki potrzebne do lateksowego
testu szkiełkowego ASO
Aplikator patyczków
Lateksowy test aglutynacji szkiełkowej ASO
1.
2.
3.
4.
5.
Rozcieńczyć surowice˛ 1:20.
Umieścić 1 krople˛ roztworu surowicy w dołeczku na jednorazowym kartoniku.
Nowym zakraplaczem dodać 1 krople˛ uczulonego odczynnika lateksowego.
Patyczkiem wymieszać 2 krople i rozprowadzić je w dołeczku.
Przez 2 minuty obserwować obecność aglutynacji.
Dodatnia reakcja manifestuje sie˛ drobnym kłaczkowaniem (aglutynacja˛) w cia˛gu
2 minut.
Ujemna reakcja nie wykazuje aglutynacji.
Jeśli aglutynacja pojawi sie˛ w cia˛gu 2 minut, miano surowicy należy określić
w teście probówkowym antystreptolizyny O.
Materiały i odczynniki zawarte w zestawie do testu
probówkowego ASO
Zredukowany antygen streptolizyny O (suchy preparat)
Erytrocyty baranie
Standardowe przeciwciała przeciw streptolizynie O (suchy preparat, 20 IU/butelka)
Bufor do streptolizyny O (25 × koncentrat roztworu)
153
Dodatkowe materiały i odczynniki potrzebne do testu
probówkowego ASO
Woda destylowana
Pipety (1 ml, 2 ml)
Probówki
Łaźnia wodna
Test probówkowy ASO
1. Rozpuścić zredukowany antygen streptolizyny O (suchy preparat) w odpowiedniej obje˛tości wody destylowanej (w opisanej butelce), przygotowuja˛c
roztwór o ste˛żeniu 2 IU w 1 ml. Roztwór nie zawiera konserwantów i musi
zostać wykorzystany w cia˛gu 6 godzin.
2. Rozpuścić standardowa˛ antystreptolizyne˛ O (suchy preparat, 20 IU/butelka)
w 10 ml buforu streptolizyny O. Roztwór można przechowywać przez
6 miesie˛cy w 4°C, pod warunkiem, że nie uległ kontaminacji.
3. Przed użyciem rozcieńczyć bufor streptolizyny O (25 × koncentrat) w 480 ml
wody destylowanej. Rozcieńczony bufor nie wykorzystany w cia˛gu tygodnia
należy wyrzucić.
4. 1 ml erytrocytów baranich wypłukać trzykrotnie w buforze streptolizyny
O i odwirować, zebrać pipeta˛ supernatant. Dodaja˛c buforu streptolizyny O
uzyskać 8% zawiesine˛ komórek.
5. Odczynniki i surowice˛ pozostawić do ogrzania do temperatury pokojowej.
6. Przygotować w probówce rozcieńczenie surowicy pacjenta 1:10 (0,1 ml
surowicy + 0,9 ml buforu streptolizyny O). Przygotować dwa wyjściowe
roztwory z rozcieńczenia 1:10 w poniżej przedstawiony sposób:
Surowica
0,2 ml (1:10)
1,0 ml (1:100)
Bufor
Rozcieńczenie
1,8 ml
0,5 ml
1:100
1:150
7. Przygotować naste˛puja˛ce serie rozcieńczeń buforu streptolizyny O dla
każdego z wyjściowych roztworów:
Probówka
1
2
3
4
5
6
7
8
Surowica
0,2 ml
0,5 ml
0,5 ml
0,5 ml
0,5 ml
0,5 ml
(1:10)
(1:100)
(1:200)
(1:400)
(1:150)
(1:300)
0
0
Bufor
0,8
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
1,5
1,0
ml
ml
ml
ml
ml
ml
ml
ml
Rozcieńczenie
Zredukowana
streptolizyna O
1:50
1:200
1:400
1:800
1:300
1:600
—
—
0,5 ml
0,5 ml
0,5 ml
0,5 ml
0,5 ml
0,5 ml
0
0,5 ml
8. Uporza˛dkować probówki według wzrastaja˛cych rozcieńczeń: 1:50, 1:200,
1:300, 1:400, 1:600, 1:800.
9. Do probówki kontrolnej 7. dodać 1,5 ml buforu, do probówki kontrolnej 8.
dodać 1 ml buforu.
10. Do wszystkich probówek, z wyja˛tkiem kontrolnej 7., dodać 0,5 ml roztworu
zredukowanej streptolizyny O.
154
CZE˛ŚĆ I
11. Wymieszać i chłodzić w 4°C przez dwie godziny, umożliwiaja˛c przebieg
reakcji antygen-przeciwciało.
12. Do wszystkich probówek, wła˛czaja˛c kontrolne probówki 7. i 8., dodać 0,5 ml
8% zawiesiny erytrocytów, wymieszać i inkubować w łaźni wodnej w 37°C
przez 30 minut.
13. Odwirować probówki w 1000 g przez 2 minuty i obserwować hemolize˛.
W kontrolnej probówce 7. nie powinna zachodzić hemoliza, w kontrolnej
probówce 8. powinna zajść całkowita hemoliza.
14. Miano ASO to najwyższe rozcieńczenie nie wykazuja˛ce hemolizy:
• Jeśli we wszystkich probówkach zachodzi hemoliza, wynik opisać ,,miano
ASO poniżej 200 IU’’.
• Jeśli w probówkach o wyższym rozcieńczeniu nie zachodzi hemoliza,
zanotować wynik ,,ASO dodatnie z mianem’’.
Wykrywanie antygenów bakteryjnych
Lateksowy test aglutynacji i test koaglutynacji, wykrywaja˛ce antygeny bakteryjne, stosowane sa˛ do identyfikacji mikroorganizmów i ich antygenów w hodowlach lub w próbkach klinicznych. W teście aglutynacji lateksowej
cza˛steczki polimerów wykorzystuje sie˛ jako nośnik fazy stałej; w teście
koaglutynacji nośnikiem fazy stałej sa˛ erytrocyty. Za pomoca˛ testu lateksowego
można wykryć antygeny polisacharydowe bakterii wywołuja˛cych zapalenie opon
mózgowo-rdzeniowych, w tym Haemophilus influenzae (tyb b), S. pneumoniae
(omniwalentny), N. meningitidis (grupa A, B, C, Y i W135), E. coli (typ K1)
i S. agalactiae (grupa B). Testy aglutynacji lateksowej sa˛ przydatne do
identyfikacji paciorkowców z grup Lancefield A, B, C, D, F i G. Odczyny
lateksowe można wykorzystać w jakościowym teście aglutynacji szkiełkowej
i w ilościowym teście aglutynacji probówkowej oraz w typowaniu grup
Streptococcus A-D, N. meningitidis, H. influenzae, Salmonella, Shigella, Vibrio
cholerae itp.
Do wykrycia antygenów polisacharydowych w próbkach klinicznych niezbe˛dny
jest progowy poziom antygenu. Jeśli w preparacie barwionym metoda˛ Grama
widoczne sa˛ drobnoustroje, zwykle, choć nie w każdym przypadku, przekroczony
jest poziom progowy. W płynie mózgowo-rdzeniowym pacjentów z zakażeniem
N. meningitidis wykrywana jest znacznie mniejsza liczba bakterii niż w zakażeniach wywołanych innymi typami Neisseria spp., dlatego rzadziej osia˛gany jest
progowy poziom antygenów polisacharydowych.
Kilka serogrup N. meningitidis może wywoływać zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych. Serogrupy A, C, Y i W135 maja˛ stabilny antygen, który można
wykazać za pomoca˛ pojedynczego poliwalentnego odczynnika, podczas gdy
antygen grupy B jest stosunkowo niestabilny i w zwia˛zku z tym trudniej
wykrywalny. Nie można go zróżnicować z polisacharydowym antygenem K1
E. coli, która wśród E. coli jest głównym czynnikiem wywołuja˛cym zapalenie
opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków. Wykazanie w preparatach barwionych metoda˛ Grama obecności Gram-ujemnych dwoinek sugeruje N. meningitidis grupy B, obecność Gram-ujemnych pałeczek wskazuje na E. coli.
W niektórych testach, polisacharydowe antygeny z drobnoustrojów uzyskiwane
sa˛ przed badaniem. Pozyskiwanie antygenów przeprowadza sie˛ chemicznie lub
enzymatycznie.
155
Do wykrywania antygenów służa˛ cztery różne testy:
• W teście aglutynacji szkiełkowej antygen opłaszczony jest na cza˛steczkach
lateksu lub swoiste przeciwciała zwia˛zane sa˛ na komórkach gronkowców.
Reagenty miesza sie˛ re˛cznie cia˛głym ruchem kolistym przez 1 – 2 minuty
i makroskopowo obserwuje reakcje˛ aglutynacji.
• W testach ELISA roztwór próbki i antygenu najpierw przepuszczany jest przez
błone˛ opłaszczona˛ przeciwciałami (zwykle monoklonalnymi). Naste˛pnie błone˛
umieszcza sie˛ w roztworze zawieraja˛cym kolejne (monoklonalne) przeciwciała
zwia˛zane z enzymem. Obecność kompleksu antygen-przeciwciało z enzymem
wykrywa sie˛ w reakcji z barwnym substratem dodanym do roztworu.
• W ,,złotym’’ teście immunologicznym roztwór próbki i antygenu dyfunduje na
błonie, która˛ naste˛pnie sie˛ ogla˛da.
• W optycznym teście immunologicznym, przeciwciała zwia˛zane sa˛z silikonowa˛
płytka˛ o odblaskowych właściwościach. Reakcja antygenu ze specyficznym
przeciwciałem powoduje zmiane˛ w warstwie powierzchownej płytki i widoczna˛ różnice˛ refleksu światła.
Procedury odczynów aglutynacji lateksowej
i koaglutynacji
1. Dla zwia˛zanych antygenów komórkowych: używaja˛c standardowej ezy przenieść czyste kolonie do kropli soli na szkiełku, uważnie wymieszać do
uzyskania lekko opalizuja˛cej zawiesiny. Obecność aglutynacji zwykle wskazuje na szczepy szorstkie (R — ang. rough); szczepy gładkie (S — ang.
smooth) nie wykazuja˛ aglutynacji w soli. W takim przypadku należy dodać
odczynniki i przejść do punktu 4.
Dla ekstrahowanych antygenów: używaja˛c standardowej ezy przenieść dobrze
izolowane kolonie do probówki zawieraja˛cej roztwór ekstraktu, uzyskać
zawiesine˛. Inkubować zawiesine˛ w 35°C lub zgodnie z zaleceniami producenta.
Dla próbek klinicznych (płyn mózgowo-rdzeniowy, mocz): podgrzać próbke˛ do
temperatury wrzenia lub według zaleceń producenta. Schłodzić i odwirować
w 2000 g przez 5 – 10 minut.
2. Umieścić na płytce 1 krople˛ nośników opłaszczonych przeciwciałami.
3. Umieścić obok 1 krople˛ zawiesiny antygenu.
4. Wymieszać 2 krople i rozprowadzić w kratce.
5. Przechylać szkiełko re˛cznie, wykonuja˛c cia˛głe okre˛żne ruchy przez 1 minute˛.
Uważać, aby mieszanina nie rozlała sie˛ poza granice˛ kratki.
6. Po określonym przez producenta czasie obejrzeć szkiełko i sprawdzić, czy
obecna jest aglutynacja. Dla uzyskania lepszej widoczności trzymać szkiełko
blisko źródła światła i ogla˛dać na ciemnym tle.
7. Jako wynik dodatni uznaje sie˛ obecność aglutynacji w mieszaninie antygenu
i przeciwciał, np. zawiesina wykazuje aglutynacje˛ lub grudki. Aglutynacja jest
najlepiej widoczna przy delikatnym przechylaniu szkiełka, tak aby płyn
spływał wzdłuż dolnej granicy kratki.
156
Cze˛ść II
Najważniejsze podłoża
i odczynniki
157
Wprowadzenie
Laboratorium, wykorzystuja˛c zaledwie niewielka˛ ilość materiału diagnostycznego, może zidentyfikować czynnik etiologiczny zakażenia, co ma istotny wpływ
na leczenie pacjenta. W wie˛kszości rozwijaja˛cych sie˛ krajów działalność
laboratorium bakteriologicznego jest ograniczona niedoborem podłoży hodowlanych i podstawowych odczynników, których import jest bardzo kosztowny.
Podobnie jak w przypadku leków, przeprowadzaja˛c racjonalna˛ selekcje˛, można
zredukować liczbe˛ koniecznych do zakupienia podłoży i odczynników. Dodatkowo, niektóre proste podłoża i odczynniki można wytwarzać lub przygotowywać
na miejscu. Zastosowanie sie˛ do tych dwóch wskazówek pozwoli znacznie
ograniczyć koszty, a także poprawi doste˛pność materiałów laboratoryjnych
niezbe˛dnych do diagnostyk i badań epidemiologicznych.
Rozdział został przygotowany w taki sposób, aby umożliwić kierownikom
laboratoriów podje˛cie właściwych decyzji o przeznaczeniu środków finansowych
na zakup najważniejszych podłoży i odczynników. Składa sie˛ z dwóch cze˛ści,
z których każda zawiera wiele zestawień.
158
Patogeny, podłoża i odczynniki
diagnostyczne
Spodziewane patogeny
Patogeny wymieniono uwzgle˛dniaja˛c:
– cze˛stość izolacji,
– znaczenie kliniczne,
– cie˛żkość choroby,
– prawdopodobieństwo wywołania epidemii,
– współczynnik koszt–korzyść dla izolacji i/lub identyfikacji.
Wykaz nie jest przeznaczony do bezwarunkowego przestrzegania i może różnić
sie˛ w różnych krajach czy laboratoriach, zależnie od charakteru lokalnie
wyste˛puja˛cych chorób, kompetencji laboratorium oraz doste˛pnych środków.
Podłoża i odczynniki diagnostyczne
o nadrze˛dnym znaczeniu
Uwzgle˛dniaja˛c pewien stopień elastyczności przyje˛to poniższa˛ gradacje˛ podłoży
i odczynników diagnostycznych:
Stopień 1: Wysoko priorytetowe
Stopień 2: Średnio priorytetowe
Stopień 3: Nisko priorytetowe
Priorytet podłoży i odczynników zależy od znaczenia patogenów, do izolacji
i identyfikacji których służa˛. Istnieja˛ jednak wyja˛tki. Jeśli podłoże jest szeroko
stosowane do hodowli wielu patogenów, może zostać ocenione wyżej niż podłoże
przeznaczone do izolacji tylko jednego z nich.
Stopień 1: Podłoża i odczynniki o wysokim priorytecie, które powinny być
doste˛pne we wszystkich laboratoriach przeprowadzaja˛cych ogólna˛ diagnostyke˛
bakteriologiczna˛. Najcze˛ściej sa˛ przeznaczone do ogólnego użytku, proste do
przygotowania i stanowia˛ nieliczna˛ grupe˛.
Stopień 2: Podłoża i odczynniki o średnim priorytecie sa˛ stosowane dodatkowo,
w uzupełniaja˛cej diagnostyce laboratoryjnej i przydatne w badaniach epidemiologicznych; moga˛ nie mieć istotnego bezpośredniego wpływu na leczenie pacjenta,
np. surowice odpornościowe do identyfikacji serogrup meningokoków.
Stopień 3: Podłoża i odczynniki o niskim priorytecie bardzo rzadko maja˛
znaczenie w leczeniu pacjenta, natomiast sa˛ przydatne w edukacji, pracach
naukowych i dodatkowych badaniach prowadzonych przez laboratoria referencyjne. Ta kategoria odnosi sie˛ do podłoży i odczynników diagnostycznych
o niekorzystnym współczynniku koszt:efekt, które sa˛ zbyt drogie do stosowania
ogólnego lub wykorzystywane do izolacji i identyfikacji rzadko pojawiaja˛cych
sie˛, trudnych do izolacji drobnoustrojów.
Poniżej wymieniono patogeny, podłoża i odczynniki diagnostyczne stosowane
w diagnostyce laboratoryjnej z uwzgle˛dnieniem sugerowanego priorytetu. Sto-
159
PATOGENY, PODŁOŻA I ODCZYNNIKI DIAGNOSTYCZNE
pień ważności należy przystosować dla każdego laboratorium, uwzgle˛dniaja˛c
warunki lokalne.
Krew
Brucella
Burkholderia pseudomallei
Candida albicans i Cryptococcus neoformans
Pałeczki niefermentuja˛ce, inne niż Pseudomonas aeruginosa
Inne Enterobacteriaceae
Salmonella typhi i nie-typhi
Paciorkowce (S. pyogenes, S. pneumoniae, paciorkowce zielenieja˛ce)
Podłoża płynne do hodowli krwi
Priorytet
Bulion tryptozowo-sojowy (TSB) może zostać zasta˛piony innym
wzbogaconym bulionem, np. bulionem z wycia˛giem mózgowo-sercowym, każdy z dodatkiem polianetolosulfonianu sodu (SPS),
0,25 g/l
Bulion do hodowli beztlenowców z krwi: podłoże płynne tioglikolanowe, bulion Schaedlera lub bulion beztlenowy Wilkins-Chalgrena
1
2
Podłoża do izolacji
Przesiew na agar z krwia˛, agar czekoladowy i agar MacConkeya
1
Odczynniki diagnostyczne
Plazma do koagulazy
Odczynnik do wykrywania β-laktamazy
Odczynnik do wykrywania oksydazy
Aglutynuja˛ce surowice odpornościowe Salmonella
Czynniki V i XV
Surowica odpornościowa Haemophilus influenzae typ b
Surowica odpornościowa Neisseria meningitidis (poliwalentna i swoista dla grup A, B, C)
160
1
1
1
1
1
1
2
3
3
CZE˛ŚĆ II
Płyn mózgowo-rdzeniowy
Cryptococcus neoformans
Enterobacteriaceae
Agar z krwia˛ (z posianym Staphylococcus)
Agar czekoladowy
Agar MacConkeya
Podłoże Löwensteina-Jensena
Agar Sabouraud
Priorytet
1
1
1
2
2
Tusz chiński
Odczynnik do wykrywania β-laktamazy
Czynniki V i XV
Surowica odpornościowa Haemophilus influenzae typ b
Surowica odpornościowa Neisseria meningitidis (poliwalentna i swoista dla grup A, B, C)
1
1
1
1
2
3
3
Szybkie testy diagnostyczne
Zestaw testów do szybkiego wykrywania bakterii wywołuja˛cych
zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych
Mocz
Candida albicans
Enterokoki
Escherichia coli
161
3
Inne Enterobacteriaceae
Inne gronkowce
Pseudomonas i inne niefermentuja˛ce pałeczki
Staphylococcus saprophyticus
Podłoża do izolacji i podłoża ilościowe
Agar z krwia˛
Agar brolacynowy (może być zasta˛piony agarem z fioletem krystalicznym i laktoza˛, agarem MacConkeya, agarem bez fioletu krystalicznego lub agarem eozynowym z błe˛kitem metylenowym)
Agar CLED
Priorytet
1
1
1
Podłoża do identyfikacji
i odczynniki diagnostyczne
β-glukuronidaza (PGUA) do identyfikacji E. coli
Dla Gram-ujemnych pałeczek:
agar Kliglera (KIA)
odczynnik Kovacsa do wykrywania indolu
podłoże ruch-indol-ureaza (MIU)
odczynnik do wykrywania oksydazy
podłoże płynne z lizyna˛ (Möller)
test ONPG
podłoże Simmonsa z cytrynianem
Dla gronkowców i enterokoków:
test na obecność katalazy (H2O2)
plazma do wykrywania koagulazy
agar z żółcia˛ i eskulina˛ (dla enterokoków)
kra˛żek z nowobiocyna˛ (5 µg) różnicuja˛cy koagulazo-ujemne gronkowce
1
1
1
1
1
2
2
2
1
1
2
3
Kał
Aeromonas i Plesiomonas
Campylobacter spp.
Escherichia coli (enteropatogenne, enterotoksyczne, enteroinwazyjne i enterokrwotoczne)
Salmonellae spp. nie-typhi i Edwardsiella
Salmonella typhi i S. paratyphi
Shigella
Vibrio cholerae serogrupa O1, przecinkowce nie wywołuja˛ce cholery
162
CZE˛ŚĆ II
Podłoża transportowe
Podłoże Cary’ego-Blaira (dla wszystkich patogenów)
Buforowany roztwór soli i glicerolu (nie dla Vibrio lub Campylobacter)
Priorytet
1
2
Podłoża selektywne
Bulion seleninowy F
Zasadowa woda peptonowa
1
2
Agar cytrynianowo-deoksycholowy (może być zasta˛piony agarem
Salmonella-Shigella, agarem ksylozo-lizyno-deoksycholanowym
(XLD))
Agar MacConkeya (z fioletem krystalicznym)
Agar TCBS
Podłoże Campylobacter: podstawowy agar Columbia lub inny agar
z krwia˛ zawieraja˛cy lizat krwi i dodatek antybiotyku lub podłoże
podstawowe na bazie aktywnego we˛gla
1
1
1
2
Podłoża do wste˛pnej hodowli
i odczynniki diagnostyczne
Agar Kliglera (KIA) (dla patogenów jelitowych może być zasta˛piony
trójcukrowym agarem żelazowym, TSI)
Odczynnik Kovacsa do wykrywania indolu
Podłoże ruch-indol-ureaza (MIU) (można zasta˛pić podłożem do wykrywania ruchu + bulion peptonowy z mocznikiem)
1
1
1
1
Podłoża selektywne i odczynniki diagnostyczne
Woda peptonowa (lub podstawowy bulion z czerwienia˛ fenolowa˛)
Podłoże płynne z lizyna˛ (Möller)
Test ONPG
Podłoże Simmonsa z cytrynianem
Kra˛żek z czynnikiem wibriostatycznym O:129
2
2
2
2
2
Surowice do aglutynacji
Salmonella:
163
Priorytet
poliwalentna surowica anty-O (A-I i Vi)
1
surowice anty-O: O:2 (A), O:4 (B), O:9 (D), Vi
2
surowice anty-H: H:a, H:b, H:d, H:i, H:m, H:2
3
surowice anty-H fazy inwersji: H:b, H:i, H:1,2
3
Shigella:
poliwalentne surowice: anty-dysenteriae, anty-flexneri, anty-boydii, anty-sonnei
surowica anty-dysenteriae typ 1 (Shiga)
Vibrio cholerae:
poliwalentna surowica anty-O1
surowica anty-B (Ogawa), anty-C (Inaba),
anty-O:139
Haemophilus influenzae surowica typowa anty-b
poliwalentna
surowice grupowe anty-A, anty-B, anty-C
1
1
1
3
3
3
3
Górne drogi oddechowe
Candida albicans (jama ustna)
Corynebacterium diphtheriae (gardło i nos)
Haemophilus influenzae (ucho i zatoki)
Moraxella catarrhalis (ucho i zatoki)
Pseudomonas
Staphyloccoccus aureus (ucho i zatoki)
Streptococcus pneumoniae (ucho i zatoki)
Streptococcus pyogenes (grupa A, gardło)
Agar z krwia˛ (przygotowany na bazie bez glukozy)
Agar czekoladowy
Podłoże Löfflera z surowica˛ lub podłoże jajeczne Dorseta
Agar z krwia˛ i tellurynem
Zmodyfikowane podłoże Thayer-Martina dla gonokoków i meningokoków
Priorytet
1
2
2
2
3
Odczynniki do katalazy i koagulazy
Podłoża do rozkładu cukrów dla Neisseria spp.
Czynniki X i XV (kra˛żek lub pasek)
Trójmaślan glicerylu (trójbutyryna)
1
1
1
2
2
2
3
Szybkie testy diagnostyczne
Zestawy do identyfikacji serogrup paciorkowców β-hemolizuja˛cych
164
3
CZE˛ŚĆ II
Dolne drogi oddechowe
Candida albicans
Enterobacteriaceae
Moraxella catarrhalis
Agar z krwia˛
Agar czekoladowy
Agar MacConkeya
Agar Sabouraud
Selektywny agar z krwia˛ dla Haemophilus (bacytracyna lub wankomycyna)
Priorytet
1
1
1
2
3
3
Czynniki X i XV (kra˛żek lub pasek)
1
2
2
3
Próbki z układu moczowo-płciowego
do diagnostyki chorób przenoszonych droga˛
kontaktów seksualnych
Candida albicans (badanie mikroskopowe)
Chlamydia trachomatis
Gardnerella vaginalis (badanie mikroskopowe)1
Haemophilus ducreyi
Treponema pallidum (mikroskopia w ciemnym polu)
1
Gardnerella vaginalis nie jest patogenem, lecz drobnoustrojem wskaźnikowym bakteryjnej
waginozy.
165
Podłoża transportowe
Podłoża transportowe Amiesa lub Stuarta
Priorytet
1
Zmodyfikowane podłoże Thayer-Martina (MTM) lub podłoże New
York City (NYC)
czekoladowy agar Mueller-Hintona z krwia˛ końska˛ + wankomycyna
+ IsoVitaleX dla H. ducreyi
1
3
Odczynniki do identyfikacji
Test nitrocefinowy lub inne testy do wykrywania β-laktamaz
1
1
Ropa i wysie˛ki
Bacillus anthracis
Bacteroides i inne bezwzgle˛dne beztlenowce
Enterobacteriaceae
Mycobacterium tuberculosis, M. ulcerans
Inne Mycobacterium spp.
Pasteurella multocida
Pseudomonas i inne pałeczki niefermentuja˛ce
Streptococcus (inne gatunki)
Agar z krwia˛
Agar MacConkeya
Agar z mannitolem
Płynne podłoże tioglikolanowe (z indykatorem) (może być zasta˛pione
podłożem z wycia˛giem mie˛snym, bulionem Schaedlera lub bulionem
Wilkins-Chalgrena)
Bulion tryptozowo-sojowy (TSB)
166
Priorytet
1
1
2
2
2
CZE˛ŚĆ II
Test na katalaze˛ (H2O2)
Osocze do wykrywania koagulazy
Generator wodoru do anaerostatu
1
1
1
2
Lista rekomendowanych podłoży
i odczynników diagnostycznych
dla laboratoriów mikrobiologicznych
o średnim poziomie referencyjności
Podłoża hodowlane
Podłoże rekomendowane
Alternatywne
Stopień
referencyjności
Agar z żółcia˛ i eskulina˛
1
Agar z krwia˛(patrz agar tryptozowo-sojowy)
1
Agar z brolacyna˛
Agar z laktoza˛i fioletem krystalicznym, agar CLED
1
Podłoże jajeczne Dorseta
1
Żelazowy agar Kliglera (KIA)
Podłoże Löfflera z surowica˛
1
Agar MacConkeya (z fioletem krystalicznym)
1
Eozynowy agar z błe˛kitem metylenowym
Agar MacConkeya (bez fioletu krystalicznego)
Podłoże ruch-indol-ureaza (MIU)
1
1
Podłoże do wykrywania ruchu
+ bulion ureazowy + woda peptonowa (tryptonowa)
1
1
Dekstrozowy agar Sabouraud
1
Deoksycholanowy agar cytrynianowy Agar Salmonella-Shigella (SS)
1
Agar tryptozowo-sojowy (TSA)
Agar Columbia
1
Bulion tryptozowo-sojowy (TSB)
Bulion mózgowo-sercowy
TCBS
Podłoże transportowe (Amies)
Woda peptonowa Andrade
1
1
Podłoże transportowe (Stuarta lub
Cary’ego-Blaira)
1
Czerwony bulion fenolowy
2
Bulion z dekarboksylaza˛ (Möller)
2
Agar z mannitolem (MSA)
2
Bulion z selenitem F
2
Agar cytrynianowy Simmonsa
2
Podłoże tioglikolanowe
Agar z DNaza˛
167
Bulion Schaedlera, bulion do hodowli beztlenowców Wilkensa-Chalgrena, podłoże z wycia˛giem mie˛snym
2
3
Inhibitory i antybiotyki
stosowane jako dodatek do podłoży
lub odczynnik
Chloramfenikol (do izolacji grzybów)
Antybiotyki dodawane do podłoża dla gonokoków: wankomycyna,
kolistyna, nystatyna (trimetoprim): VCN (VCNT)
Dodatek antybiotyków do podłoża dla Campylobacter
Roztwór tellurynu (do izolacji Corynebacterium diphtheriae)
Bacytracyna (do izolacji Haemophilus spp.)
Wankomycyna (do izolacji Haemophilus ducreyi lub H. influenzae)
1
1
2
2
3
3
Dodatki wzbogacaja˛ce podłoża
IsoVitaleX (Polyvitex, Vitox, suplement B, suplement VX, suplement
CVA)
Polianetosulfonian sodu (SPS)
2
3
Kra˛żki, tabletki lub paski
Kra˛żek z nitrocefina˛ (Cefinaza) lub odczynnik
Test ONPG
PGUA (β-glukuronidaza)
Czynniki V i XV
Kra˛żek z nowobiocyna˛ (5 µg)
Test PYR
Kra˛żek z czynnikiem wibriostatycznym O:129
1
1
1
1
1
1
2
3
3
3
3
Zestawy diagnostyczne
Zastaw do szybkiej serodiagnostyki bakterii wywołuja˛cych zapalenie
opon mózgowo-rdzeniowych
Zestaw do identyfikacji serogrup paciorkowców hemolizuja˛cych
3
3
Inne odczynniki diagnostyczne
Skala z siarczanem baru (dla metody Kirby-Bauera) (skala MacFarlanda — przyp. tłum.)
Zestaw do barwienia metoda˛ Grama
Nadtlenek wodoru (H2O2) (katalaza)
Odczynnik Kovacsa (do indolu)
Odczynnik do wykrywania oksydazy (dimetyl-p-fenylenodiamina)
Osocze (do testu na koagulaze˛ i testu filamentacji)
Zestaw do barwienia metoda˛ Ziehl-Neelsena
168
1
1
1
1
1
1
1
CZE˛ŚĆ II
Buforowany fizjologiczny roztwór soli z glicerolem (do transportu
kału)
We˛glowodany: glukoza, laktoza, maltoza, mannitol, sacharoza
Generator wodoru do anaerostatu
Tusz chiński (do wykrywania otoczek)
Lizyna (do wykrywania dekarboksylazy)
2
2
2
2
2
Kra˛żki do oznaczania lekowrażliwości
Lista ważnych antybiotyków wg WHO (2002)
amoksycylina
ampicylina
benzylopenicylina
chloramfenikol
ciprofloksacyna
kotrimoksazol (sulfametoksazol-trimetoprim)
kloksacylina
erytromycyna
gentamycyna
kanamycyna
kwas nalidyksowy
nitrofurantoina
sulfonamid
tetracyklina (lub doksycyklina)
trimetoprim
Lista antybiotyków rezerwowych
amoksycylina/kwas klawulanowy
amikacyna
cefalotyna
cefazolina
cefotaksym
ceftazydym
ceftriakson
cefuroksym
ciprofloksacyna i inne fluorochinolony
klindamycyna
piperacylina
wankomycyna
Surowice do aglutynacji
Salmonella:
169
poliwalentna surowica anty-O (A-I i Vi)
surowice anty-O: O:2 (A), O:4 (B), O:9 (D), Vi
surowice anty-H: H:a, H:b, H:d, H:i, H:m, H:2
surowice anty-H fazy inwersji: H:b, H:i, H:1,2
Priorytet
1
2
3
3
Shigella:
poliwalentne surowice anty-dysenteriae, anty-flexneri, anty-boydii, anty-sonnei
surowica anty-dysenteriae typ 1 (Shiga)
Vibrio cholerae:
poliwalentna surowica anty-Ol
surowica anty-B (Ogawa), anty-C (Inaba),
anty-O:139
Haemophilus influenzae: surowica typowa anty-b
Neisseria meningitidis: poliwalentna
surowice grupowe anty-A, anty-B, anty-C
170
1
1
1
3
3
3
3
Wybrana literatura uzupełniaja˛ca
August M.J. et al.: Quality control and quality assurance practices in clinical microbiology.
Cumitech, 1990, 3A: 1 – 14.
Basics of quality assurance for intermediate and peripheral laboratories, 2nd ed.
Alexandria, WHO Regional Office for the Eastern Mediterranean, 2000.
Baron E.J., Finegold S.M.: Diagnostic microbiology, 8th ed. St Louis, MO, The C.V.
Mosby Company, 1990.
Blazevic D.J. et al.: Practical quality control procedures for the clinical microbiology
laboratory. Cumitech, 1976, 3: 1 – 12.
Cheesbrough M.: Medical laboratory manual for tropical countries. Vol. II: Microbiology.
London, Tropical Health Technology/Butterworths, 1989.
Collins C.H., Lyne P.M.: Microbiological methods, 5th ed. London, Butterworths, 1985.
Gillies R.P., Paul J.: Bacteriology illustrated. Edinburgh, Churchill Livingstone, 1983.
Howard B.J. et al.: Clinical and pathogenic microbiology. St Louis, MO, The C.V. Mosby
Company, 1987.
Koneman E.W.: Color atlas and textbook of diagnostic microbiology, 5th ed. Philadelphia,
Lippincott, 1997.
Miller J.M.: Quality control in microbiology. Atlanta, GA, Centers for Disease Control and
Prevention, 1987.
Miller J.M., Wentworth B.B.: Methods for quality control in diagnostic microbiology.
Washington, DC, American Public Health Association, 1985.
Montefiore D.G. et al.: Tropical microbiology. Edinburgh, Churchill Livingstone, 1984.
Murray P. et al.: Manual of clinical microbiology, 8th ed. Washington, DC, American
Society for Microbiology, 2003.
Stokes E.J. et al.: Quality control. In: Clinical bacteriology, 7th ed. London, Edward
Arnold, 1993.
Turk D.C. et al.: A short textbook of medical microbiology. London, Hodder & Stoughton,
1983.
Summanen P. et al.: Wadsworth anaerobic bacteriology manual. Belmont, CA, Star
Publishing Company, 1993.
171
Skorowidz
Acinetobacter lwofii 20 – 22
– spp., obraz hodowli 83
– w wydzielinie z cewki moczowej u me˛żczyzn 90
Actinomyces israelii 105
Aerobacter butzleri, identyfikacja biochemiczna 67
Aeromonas 162
– caviae, biochemiczne reakcje 65
– – wywoływane zakażenia 49
– hydrophila, biochemiczne reakcje 65
– sobria, wywoływane zakażenia 49
– veroni, biochemiczne reakcje 65
– wste˛pna identyfikacja 61
Agar cefoksytyno-cykloseryno-fruktozowy
(CCFA), podłoże do hodowli patogenów
jelitowych 54
– cysteinowo-tryptozowy (CTA), przechowywanie szczepów długoterminowe 26
– cytrynianowy Simmonsa 21
– czekoladowy 21
– – podłoże dla płynu mózgowo-rdzeniowego 38
– deoksycholanowo-cytrynianowy (DCA),
podłoże do hodowli patogenów jelitowych 53
– Hektoen (HEA), podłoże do hodowli
patogenów jelitowych 53
– Kliglera (KIA) 22
– – procedura posiewu i odczytu 56 – 58
– – reakcje typowe Enterobacteriaceae 61
– ksylozo-lizyno-deoksycholanowy
(XLD), podłoże do hodowli patogenów
jelitowych 53
– MacConkeya, podłoże do hodowli patogenów jelitowych 53
– – z fioletem krystalicznym 21
– Mueller-Hintona 21, 126
– Salmonella-Shigella (SS agar) 21
– – podłoże do hodowli patogenów jelitowych 53
– siarczanowo-bizmutowy, podłoże do hodowli patogenów jelitowych 53
– Tayer-Martina 21, 90, 91
– tellurynowy z krwia˛ selektywny 77
– z cytrynianem deoksycholanu 21
– – tiosiarczanowym, solami żółci i sacharoza˛ (TCBS), podłoże do hodowli patogenów jelitowych 53
– z krwia˛ 21
172
Agar, z mannitolem 21
– z solami żółci (BSA), podłoże do hodowli patogenów jelitowych 54
– – i cytrynianem tiosiarczanowym 21
– z zasadowym ekstraktem mie˛snym
(MEA), podłoże do hodowli patogenów
jelitowych 54
– z żółcia˛ i eskulina˛ 21
– żelazowy trójcukrowy – patrz Agar Kliglera Aglutynacja lateksowa, procedury
156
– surowice 169
Aglutyniny, wykrywanie w gora˛czce 150
AIDS – patrz Zespół nabytego niedoboru
odporności
Ameby, poszukiwanie w płynie mózgowo-rdzeniowym 37
Amikacyna 123, 126, 169
– strefy zahamowania wzrostu 132
Aminoglikozydy 125
Amoksycylina 92, 123, 125, 126, 169
Ampicylina 92, 123, 125, 126, 169
Anaerostat, kontrola jakości 18
Angina Vincenta 74
Antybiogram – patrz też Lekowrażliwość
– jako narze˛dzie badań epidemiologicznych 123
– jako wskazówka do leczenia 122
– karta kontroli jakości 137
– w hodowli z krwi 34
Antybiotyki do rutynowego oznaczania
wrażliwości 123
– jako dodatek do podłoży 168
– kra˛żki 127
– lista rezerwowych 169
– określanie wrażliwości, szablon 133
– oznaczanie lekowrażliwości 24, 118,
119, 127, 133
– ste˛żenie w kra˛żkach 135
– strefy zahamowania wzrostu 126, 132,
133
– ważne wg WHO 169
Antygen(y) bakteryjne, wykrywanie 155
– do diagnostyki 23
– H, procedura identyfikacji 70
– somatyczny O, procedura identyfikacji
68
– VDRL, przygotowanie 144, 145
Antykoagulant 32
Arcobacter butzleri, wywoływane zakażenia 50
Autoklaw, kontrola jakości 18
SKOROWIDZ
Bacillus anthracis 102, 111, 166
Bacteroides 166
– fragilis 20, 21, 101, 113, 160
– – a bakteriemia i fungemia 31
– – a zakażenia szpitalne 103
– – identyfikacja 116, 118
– melaninogenicus – patrz Prevotella melaninogenica
Bacytracyna 168
Badanie(a) bakteriologiczne 29
– – rodzaje gwarancji jakości 13
– – zapewnienie jakości 12
– mikrobiologiczne 14, 15
– serologiczne 138
– – metody kontroli jakości 138
– – wyposażenie laboratorium 139
Bakterie beztlenowe 20
– – diagnostyka zakażeń 114
– – identyfikacja 116
– – podłoża do hodowli 115
– – posiew i izolacja 115
– – przechowywanie długoterminowe 26
– – wrażliwość na antybiotyki 118
– – zakażenia 113
– Gram-ujemne kwasooporne 20
– jelitowe, morfologia kolonii 60
– – wste˛pna identyfikacja izolowanych
szczepów 56
– kwasooporne, barwienie metoda˛ Ziehl-Neelsena 38
– mikroaerofilne 113
– podział ze wzgle˛du na wymagania tlenowe 113
Bakteriemia 30, 113
– przyczyny 31
Barwienie kwasooporne (Ziehl-Neelsena)
106
– – test jakości 23
– metoda˛ Grama 105
– – – test jakości 23
Barwniki 22
Benzylopenicylina 84, 123, 124, 126, 169
– działanie na Neisseria gonorrhoeae 92
– stefy zahamowania wzrostu 132, 133
Białko, ste˛żenie w poszczególnych typach zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych 38
Biegunki, czynniki etiologiczne 48
– w zakażeniach HIV/AIDS 48
Błonica 74
Bordetella pertussis 142
Borrelia burgdorferi 148
Botulizm przyranny 102, 113
Brucella 160
– spp. a bakteriemia i fungemia 31
– wykrywanie aglutynin 150
Bruceloza, miano aglutynin 150
– wykrywanie aglutynin, test probówkowy 152
173
Bruceloza, miano aglutynin, test szkiełkowy 151
– zestaw do wykrywania aglutynin 151
BSA – patrz Agar z solami żółci
Bulion azotanowy 21
– do posiewu z krwi 32
– malonianowy 21
– Schaedlera 160
– seleninowy 21
– tioglikolanowy 21
– tryptozowo-sojowy (TSB), 32, 160
– – wybór podłoża dla płynu mózgowo-rdzeniowego 38
– Wilkins-Chalgrena 160
– z mocznikiem, lekko buforowany
(UREA), procedura posiewu i odczytu 56
– z wycia˛giem mózgowo-sercowym 160
Burkholderia pseudomallei 160
– – jako przyczyna bakteriemii i fungemii 31
Butelki z podłożem do posiewu krwi 32
Calymmatobacterium granulomatis 96
– – objawy zakażenia 89
Campylobacter coli, identyfikacja biochemiczna 67
– – identyfikacja końcowa 66
– – – wste˛pna 61
– fetus, identyfikacja biochemiczna 67
– hyointestinalis, identyfikacja biochemiczna 67
– jejuni 113
– – identyfikacja biochemiczna 67
– – – końcowa 66
– lari, identyfikacja biochemiczna 67
– spp. 162
– – badanie wizualne próbek kału 52
– – wybór podłoża 18
– upsaliensis, identyfikacja biochemiczna 67
– warunki inkubacji 54
Candida albicans 20, 21, 95, 160, 161, 165
– – a zapalenie pochwy 93
– – lekowrażliwość 85
– – obraz hodowli 83
– a zapalenie gardła 75
CCFA – patrz Agar cefoksytyno-cykloseryno-fruktozowy
Cefaleksyna 125
Cefalorydyna 125
Cefalotyna 123 – 126, 169
Cefalozyna 126
SKOROWIDZ
Cefamandol 125
Cefamycyna 125
Cefapiryna 125
Cefazolina 125, 169
Cefoksytyna 125
Cefotaksym 125, 126, 169
Cefradyna 125
Ceftazydym 123, 126, 169
Ceftriakson 123, 125, 126, 169
Cefuroksym 123, 125, 126, 169
– sodium, strefy zahamowania wzrostu 132
Cewka moczowa u me˛żczyzn, zapalenie 90
Chlamydia psittaci 142
– trachomatis 89, 96, 165
– – a odczyn immunofluorescencji 142
– – a zapalenie cewki moczowej u me˛żczyzn 90
– – – pochwy u dziewczynek 93
– – – szyjki macicy 93, 95
– – zakażenie w cia˛ży 93
– – – objawy 89
– wykrywanie 90
Chloramfenikol 84, 118, 123, 124, 126,
168, 169
Chlorek sodu 140
– żelaza/deaminaza fenyloalaniny 21
Chłodziarka, kontrola jakości 18
Cholera 49
– badanie wizualne próbek kału 52
Choroba(y) legionistów 79
– z Lyme 148
– przenoszone droga˛ kontaktów seksualnych, 89
– – próbki do diagnostyki 165
– – spodziewane patogeny 165
Cieplarka, kontrola jakości 18
Ciprofloksacyna 123, 126, 169
Citrobacter freundi 22
– – biochemiczne reakcje 63
– spp. a zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych 36
Clostridium botulinum 113
– difficile, wste˛pna identyfikacja 61
– perfringens 20, 102, 113, 166
– – identyfikacja 116
– spp. 93
– tetani 113
Corynebacterium diphtheriae 74, 142
– – hodowla 77
– – nosicielstwo 75
174
Cryptococcus neoformans 160, 161
– – a zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych 36
– – posiew 39
– – poszukiwanie w płynie mózgowo-rdzeniowym 37
CTA – patrz Agar cysteinowo-tryptozowy
Czas inkubacji a wielkość strefy zahamowania 134
Czerwień metylowa/Voges-Proskauer 21
Czerwonka pełzakowa, badanie wizualne
próbek kału 52
Czynnik V, test jakości 23
– XV, test jakości 23
DCA – patrz Agar deoksycholanowo-cytrynianowy
Deaminaza fenyloalaniny/chlorek żelaza 21
Dekarboksylaza lizyny 21
– ornityny 21
Dezynfekcja skóry w miejscu wkłucia 31
Diagnostyka mikrobiologiczna, etapy 14
Dihydrolaza argininy 21
Dikloksacylina 124
Doksycyklina 169
Drogi oddechowe dolne, spodziewane patogeny 165
– – górne, spodziewane patogeny 164
– – – zakażenia 73
Edwardsiella tarda, biochemiczne reakcje
63
Enterobacter cloacae 20
– morfologia kolonii 60
Enterobacteriaceae 20, 160, 161, 162, 166
– lekowrażliwość 84, 123
– na agarze żelazowym Kliglera (KIA) 60,
61
– obraz hodowli 84
– przechowywanie długoterminowe 25
– wste˛pna identyfikacja 39, 57, 59
– wybór podłoża 17
– zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych
36
Enterococcus faecalis 20, 21
– – szczep kontrolny 127
– faecium 122
– spp., morfologia kolonii 60
Enterokoki 161
Erytromycyna 84, 123, 124 – 126, 169
Escherichia coli 20 – 22, 113, 161, 162
SKOROWIDZ
Escherichia coli, a zakażenia szpitalne 102
– – a zapalenie oskrzeli 80
– – – opon mózgowo-rdzeniowych 36
– – badanie wizualne próbek kału 52
– – morfologia kolonii 60
– – strefy zahamowania wzrostu 126
– – szczepy standardowe do kontroli jakości 136
– – test β-glukuronidazowy do szybkiej
identyfikacji 47
– – w moczu 122
– – wste˛pna identyfikacja 56
– – wykrywanie antygenów 155
Fenetycylina 124
Fenoksymetylopenicylina 124
Fermentacja dekstrozy bez oleju 21
Flukloksacylina 124
Francisella tularensis 152
– – miano aglutynin 150
Fungemia 30
– przyczyny 31
Gardło, flora fizjologiczna 73
– pobieranie materiału do badań 75
– przesyłanie materiału do badań 75
– zapalenie, czynniki bakteryjne 74
Gardnerella vaginalis 95, 165
– – zapalenie pochwy 93
Gentamycyna 123, 125, 126, 169
Glicerol, przechowywanie szczepów długoterminowe 25
Glukoza, ste˛żenie w poszczególnych typach zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych 38
β-Glukuronidaza (PGUA), test jakości 23
Gonokoki, przechowywanie szczepów krótkoterminowe 26
– zapalenie gardła 74
Gora˛czka, wykrywanie aglutynin 150
Gronkowce 101
– identyfikacja 108
– przechowywanie długoterminowe 25
– wrażliwość na benzylopenicyliny 133
Gruźlica płuc 79, 80
Grzyby 20
Haemophilus 142
– ducreyi 96, 165
– – hodowla 98, 99
– – pobieranie próbki 97
175
Haemophilus influenzae 21, 108, 122, 160,
161
– – – oskrzeli 79, 80
– – – płuc 80
– – surowice do aglutynacji 164, 170
– – typ b 20
– – w aspiratach z jamy opłucnej 101
– parainfluenzae 20
– przechowywanie szczepów krótkoterminowe 26
Hafnia alvei, biochemiczne reakcje 63
HBV – patrz Wirus zapalenia wa˛troby
typu B
HEA – patrz Agar Hektoen
Herpesvirus 96
– a zapalenie cewki moczowej u me˛żczyzn
90
HIV/AIDS – patrz Zespół nabytego niedoboru odporności
Hodowla(e) 28
– Corynebacterium diphtheriae 77
– Mycobacterium tuberculosis 85, 87
– Neisseria gonorrhoeae 91, 92, 95
– patogenów jelitowych, podłoża 53
– płynu mózgowo-rdzeniowego, wybór
podłoża 38
– podłoża 17, 159
– Streptococcus pyogenes 76
– warunki beztlenowe 114
– z krwi 31, 33
Identyfikacja antygenu H 70
– – somatycznego O 68
– Neisseria gonorrhoeae 92
– serologiczna Yersinia enterocolitica 72
– – Salmonella 67, 69
– – – paratyphi A 70
– – – typhi 70
– – Shigella 71
Indol (woda peptonowa) 21
Inhibitory jako dodatek do podłoży 168
Inoculum, ge˛stość a wielkość strefy zahamowania 134
– przygotowanie 137
Interpretacja wyników badań, jakość 13
Jama otrzewnej, drobnoustroje 101
– zapalenie 113
Kał 48
– badanie wizualne próbek 52
– – wste˛pna izolacja 54
SKOROWIDZ
Kał, identyfikacja biochemiczna gatunków
Campylobacter 67
– – końcowa mikrobiologiczna izolowanych szczepów 62
– – – serologiczna izolowanych szczepów 67
– – wste˛pna izolowanych szczepów 56
– izolacja bakterii wste˛pna 54
– pobieranie próbek do badania 51
– podłoża transportowo-wzbogacaja˛ce 53
– posiew próbek 53
– przesyłanie próbek do badania 51
– spodziewane patogeny 162
Kanamycyna 125, 169
Kandydiaza pochwy 95
Katalaza, test jakości 23
KIA – patrz Agar Kliglera
Kiła 96
– diagnostyka, odczyny serologiczne 142
– odczyn VDRL 143
Klebsiella pneumoniae 20, 21
– – a zapalenie płuc 80
Klindamycyna 118, 123, 126, 169
Kloksacylina 124, 169
Koaglutynacja, procedury 156
Kolistyna 168
Kontakty seksualne, przenoszone choroby
89
Kontrola jakości sprze˛tu 18
– – standardowa procedura 136
– – standardowe szczepy 136
– – wewne˛trzna 16
– – zestaw szczepów 20
– – zewne˛trzna 27
Kotrimoksazol 84, 123, 125, 126, 169
Kra˛żek z bacytracyna˛, test jakości 23
– z optochina˛, test jakości 23
– z tellurydem, test jakości 23
Kra˛żki 168
– czas nałożenia a wielkość strefy zahamowania 134
– do oznaczania lekowrażliwości 169
– z antybiotykami 127, 135
– – nakładanie na płytke˛ 137
Krew 30
– antybiogram 34
– butelki z podłożem do posiewu 32
– obje˛tość próbki 31
– pobieranie próbek 31
– podłoża do posiewu 32
– – płynne do hodowli 160
– prowadzenie hodowli 33
176
Krew, zakażenie a wrażliwość antybiotyków 123
Kre˛tki Reitera 148
– odczyn immunofluorescencji w modyfikacji absorpcyjnej (FTA-Abs) 148
Kryteria jakości w mikrobiologii 14
Kwas klawulanowy 123, 126, 169
– nalidyksowy 123, 126, 169
Laboratoria referencyjne 27
Laboratorium mikrobiologiczne, zapewnienie jakości badań 13
– wyposażenie do badań serologicznych
139
Legionella pneumophila 142
– – metody badań 79
Lekowrażliwość bakterii wyhodowanych
z plwociny 84
– kra˛żki do oznaczania 169
– oznaczanie na antybiotyki 133
– – w moczu 47
– – w płynie mózgowo-rdzeniowym 40
– szczepów izolowanych z gardła 78
Leukocytoza w poszczególnych typach
zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych
38
Listeria monocytogenes 93, 161
Łaźnia wodna 139
– – kontrola jakości 18
MEA – patrz Agar z zasadowym ekstraktem mie˛snym
Meningokoki, przechowywanie szczepów
krótkoterminowe 26
Metoda dyfuzyjno-kra˛żkowa – patrz Metoda Kirby-Bauera
Metoda Grama, test jakości barwienia 23
Metoda Kirby-Bauera 119, 120
– – czynniki techniczne 134
– – zmodyfikowana 125
– – – interpretacja stref zahamowania
wzrostu 132
– NEO-SENSITABS 119
Metronidazol 118
Metycylina 124
– badanie wrażliwości Staphylococcus aureus 134
Micrococcus spp. 113
Mikrobiologia, kryteria jakości 14
Mikroorganizmy Gram-dodatnie jako przyczyna bakteriemii 31
– – – – fungemii 31
SKOROWIDZ
Mikroorganizmy Gram-ujemne jako przyczyna bakteriemii 31
– – – – fungemii 31
Mikroskop, kontrola jakości 18
Mikroskopy 139
MIL – patrz Podłoże ruch-indol-lizyna
Minocyklina 124
Mobiluncus spp. a zapalenie pochwy 93
Mocz, badanie przesiewowe 43
– – z użyciem kalibrowanej ezy 44
– – – pasków bibułowych 44
– hodowla i interpretacja 43
– identyfikacja drobnoustrojów 47
– metody badań przesiewowych 43
– oznaczanie lekowrażliwości 47
– pobieranie materiału do badania, 41, 42
– – u niemowla˛t i dzieci 43
– posiew ilościowy i wste˛pna identyfikacja
44
– – – interpretacja wyników 46
– zakażenie a wrażliwość antybiotyków
123
Mononukleoza zakaźna 142
Moraxella catarrhalis 20
– – zapalenie oskrzeli 79
Morganella, biochemiczne reakcje 63
Mycobacterium fortuitum 107
– fortuitum-chelonei 106
– marinum 107
– spp. 166
– tuberculosis 101, 161, 166
– – jako przyczyna zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych 36
– – hodowla 85, 87
– – – interpretacja 88
– – – zasady bezpieczeństwa 88
– ulcerans 107, 166
Mycoplasma pneumoniae 138
– – metody badań 79
Naegleria fowleri, poszukiwanie w płynie
mózgowo-rdzeniowym 37
Nafcylina 124
Narza˛dy płciowe żeńskie, pobieranie próbek 93
– – – transport próbek 93
– – owrzodzenia 96
– – – pobieranie próbek 96
Neisseria gonorrhoeae 20, 21, 122, 165
– – – pochwy u dziewczynek 93, 95
– – – szyjki macicy 93
– – badanie wrażliwości na antybiotyki 92
– – hodowla 91, 92, 95
177
Neisseria gonorrhoeae, identyfikacja 92
– – zakażenia, objawy 89
– – – w cia˛ży 93
– meningitidis 20, 21, 122, 160, 161
– – przyczyna˛ bakteriemii i fungemii 31
– – – zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych 36
– przechowywanie szczepów długoterminowe 26
Netylmycyna 125
Niemowle˛ta, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, przyczyny 36
o-Nitrofenylo-β-D-galaktopiranozyd 23
Nitrofurantoina 123, 125, 126, 169
Nocardia asteroides 108, 113
Norfloksacyna 123
NYC – patrz Podłoże New York City
Nystatyna 168
Odczyn aglutynacji 141
– ASO 152
– FTA-Abs 149
– immunofluorescencji 142
– – kre˛tków w modyfikacji absorpcyjnej
(FTA-Abs) 148
– kłaczkuja˛cy 141
– precypitacji 141
– RPR 142, 146 – 148
– – jakościowy 147
– – półilościowy 147
Odczyn VDRL 142 – 146
– – półilościowy 145
– Weila-Felixa 150
– Widala 150
– Wrighta 150
Odczynnik Nitrocefin 92
Odczynniki 22, 126
– diagnostyczne 159, 168
– – do hodowli płynu mózgowo-rdzeniowego 161, 162
– – – próbek z układu moczowo-płciowego 166
– – – z dolnych dróg oddechowych 165
– – – z górnych dróg oddechowych 164
– – do kału 163
– – w hodowli krwi 160
– – – ropy 167
– do badań serologicznych 140
– testy jakości 23
Odczyny aglutynacji lateksowej, procedury
156
– serologiczne 138
– – w diagnostyce kiły 142
SKOROWIDZ
Odleżyny, owrzodzenia, pobieranie próbek
104
Oksacylina 84, 123, 124, 126
– badanie wrażliwości Staphylococcus aureus 134
Oksydaza, test jakości 23
Oleandomycyna 125
Olej mineralny, przechowywanie szczepów
długoterminowe 25
ONPG – patrz o-Nitrofenylo-β-D-galaktopiranozyd
Oparzenia, drobnoustroje 101
Opony mózgowo-rdzeniowe, przyczyny
zapalenia 36
Oskrzela, zapalenie 80
Osocze do koagulazy, test jakości 23
Owrzodzenia narza˛dów płciowych, badanie
bezpośrednie próbki 97
– – – hodowla 98
– – – pobieranie próbek 96
– odleżynowe, pobieranie próbek 104
– Buruli 107
Paciorkowce 160
– α-hemolizuja˛ce jako przyczyna bakteriemii i fungemii 31
– β-hemolizuja˛ce, różnicowanie 77
– przechowywanie szczepów 26
– w aspiratach z jamy opłucnej 101
– zielenieja˛ce 160
Pałeczki beztlenowe Gram-dodatnie, wste˛pna identyfikacja 58
– – Gram-ujemne, wste˛pna identyfikacja
59
– Gram-ujemne 20
Papilomavirus, objawy zakażenia 89
Paski 168
– bibułowe do badania moczu 44
Pasteurella multocida 102, 110, 166
Patogeny 159
– jelitowe, podłoża do hodowli 53
Peptostreptococcus, identyfikacja 117
– magnus 113
– spp. a ropień płuca 80
– – jako przyczyna bakteriemii i fungemii
31
PGUA – patrz β-Glukuronidaza
Piperacylina 123, 126, 169
Piwampicylina 125
Plesiomonas 162
– shigelloides, biochemiczne reakcje 63,
65
Plwocina, badanie mikroskopowe 82
– hodowla i interpretacja 82
– ocena makroskopowa 81
178
Plwocina, pobieranie próbek 81
– podłoża do hodowli 83
– ropna, badania 79
Płuca, gruźlica 80
– zapalenie 80
Płyn mózgowo-rdzeniowy, badanie mikroskopowe 37
– – barwienie preparatów metoda˛ Grama
37
– – cechy w zapaleniu opon 38
– – ocena makroskopowa 37
– – oznaczanie lekowrażliwości 40
– – pobieranie 36
– – spodziewane patogeny 161
– – transport próbek 36
Płytka hodowlana, sposób posiewu bakterii
45
Pneumokoki w aspiratach z jamy opłucnej
101
Podłoża do hodowli 17, 159
– – bakterii beztlenowych 115
– – kału 163
– – płynu mózgowo-rdzeniowego 161
– – z plwociny 83
– do identyfikacji w hodowli płynu mózgowo-rdzeniowego 162
– do izolacji w hodowli krwi 160
– – – płynu mózgowo-rdzeniowego 162
– – – próbek z układu moczowo-płciowego 166
– – – ropy 166
– – – z dolnych dróg oddechowych 165
– do posiewu krwi 32
– gotowe, przechowywanie 20
– hodowlane, dodatki wzbogacaja˛ce 168
– – rekomendowane 167
– płynne do hodowli krwi 160
– przygotowywane, kontrola jakości 20
– testy kontrolne 21
– z wycia˛giem mie˛snym, przechowywanie długoterminowe bakterii beztlenowych 26
Podłoże agarowe Thayer-Martina modyfikowane 21, 90, 91
– jajeczne Dorseta 77
– New York City 91
– ruch-indol-lizyna, procedura posiewu
i odczytu 56, 57
– suche, zamawianie i przechowywanie 18
– tioglikolonowe płynne 160
– z mocznikiem 22
– z tellurynem, taurocholanem i żelatyna˛
(TTG) dla patogenów jelitowych 54
– przygotowanie 20
– skład a wielkość strefy zahamowania
134, 135
Porphromonas w aspiratach z jamy opłucnej 101
SKOROWIDZ
Prevotella melaninogenica a ropień płuca
80
– w aspiratach z jamy opłucnej 101
Proteus mirabilis 20 – 22
Proteus, morfologia kolonii 60
– vulgaris 150
Providencia, biochemiczne reakcje 63
– spp. 60
Przecinkowce w kale, reakcje biochemiczne 65
Przeciwciała, oznaczanie 138
Przetoki, pobiernie próbek 104
Pseudobakteriemia, przyczyny 32
Pseudomonas 162, 166
– aeruginosa 20, 21, 101, 160
– – – płuc 80
– – stefy zahamowania wzrostu 126
– – wrażliwość na antybiotyki 123
– jako przyczyna bakteriemii i fungemii 31
– obraz hodowli 83
– spp. w wydzielinie z cewki moczowej
u me˛żczyzn 90
Rany 100
– cie˛te 102
– dra˛ża˛ce, pobieranie próbek 104
– drenuja˛ce we˛złów chłonnych, pobieranie
próbek 104
– penetruja˛ce 101, 102
– pooperacyjne, pobieranie próbek 104
– próbki chirurgiczne 100
– zakażenia szpitalne 102
Reakcje serologiczne 141
Rickettsia spp. 142
Riketsje, wykrywanie aglutynin 150
Ropa, odczynniki diagnostyczne 167
– podłoża do izolacji 166
Ropień(nie) 100, 113
– otorbiony, drobnoustroje 101
– płuca 80
– próbki chirurgiczne 100
– pobieranie i transport próbek 103
Ropniak opłucnej 113
Rotawirusy 142
– wywoływane zakażenia 50
Salmonella 122, 160, 162
– arizonae, biochemiczne reakcje 63
– biochemiczne reakcje 63
– choleraesuis, biochemiczne reakcje 63
179
Salmonella, identyfikacja końcowa 62
– – serologiczna 67, 68
– paratyphi A, biochemiczne reakcje 63
– – identyfikacja serologiczna 71
– spp., identyfikacja 56
– surowice do aglutynacji 163, 169
– typhi, biochemiczne reakcje 63
– – identyfikacja serologiczna 70
– – wykrywanie aglutynin 150
– typhimurium 20
– wykrywanie antygenów 155
Salmonelozy, badanie wizualne próbek kału 52
Schemat Kauffmanna-White’a 68
Sepsa 30
Serratia marcescens 20, 21
Shigella 162
– badanie wizualne próbek kału 52
– boydii 72
– – biochemiczne reakcje 63, 64
– dysenteriae 71
– flexneri 20 – 22, 72
– identyfikacja końcowa 65
– – serologiczna 71
– – wste˛pna 58
– paratyphi 162
– reakcje biochemiczne 63
– sonnei 72
– spp., morfologia kolonii 60
– surowice do aglutynacji 164, 170
– typhi 162
– typhimurium 21, 22
– wykrywanie antygenów 155
Skaleczenia zakażone, pobieranie próbek
104
Skóra, drobnoustroje 101
Spiramycyna 125
Sprze˛t laboratoryjny, dbałość 17
SS agar – patrz Agar Salmonella-Shigella
Staphylococcus agalactiae 20, 93
– aureus 20, 21, 93, 107 – 110, 113, 142,
160, 166
SKOROWIDZ
Staphylococcus aureus, a zapalenie oskrzeli
80
– – – płuc 80
– – badanie wrażliwości na metycyline˛
134
– – – – na oksacyline˛ 134
– – lekooporność 112
– – stefy zahamowania wzrostu 126
– epidermidis 20, 21, 108 – 110
– – lekooporność 112
– mitis 20
– pneumoniae 20
– pyogenes 20
– różnicowanie szczepów 110
– saprophyticus 108 – 110, 162
– – spp. przyczyna˛ zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych 36
– wrażliwość na antybiotyki 123
Sterylizator szkła, kontrola jakości 18
Strefy zahamowania wzrostu, odczytywanie wyników 137
Streptococcus 142, 166
– agalactiae 161
– α-hemolizuja˛cy 21
– pneumoniae 21, 160, 161
– – – opon mózgowo-rdzeniowych 36
– – – płuc 80
– – lekowrażliwość 84, 85
– pyogenes 21, 122, 142, 160, 166
– – hodowla 76
– – odczyn ASO 152
– – – zapalenia gardła 74
Streptomycyna 125
Sulfafurazol 125
Sulfametoksazol 125, 169
Sulfizoksazol 126
Sulfonamidy 123, 125, 126, 169
– strefy zahamowania wzrostu 132, 133
Surowica(e) 28, 140
– do aglutynacji 169
180
Surowica(e), do aglutynacji w kale 163
– Loefflera 77
– odpornościowe do diagnostyki 23
Szczepy izolowane z gardła, badanie lekowrażliwości 78
– kontrolne, pozyskiwanie 24
– – przechowywanie długoterminowe 25
– – – krótkoterminowe 26
– standardowe do kontroli jakości 136
Szyjka macicy, zapalenie 93
Tabletki 168
Talampicylina 125
TCBS – patrz Agar z cytrynianem tiosiarczanowym, solami żółci i sacharoza˛
Temperatura inkubacji a wielkość strefy
zahamowania 134
Termin ,,oporny’’, definicja 120
– ,,wrażliwy’’, definicja 120
Test(y) aglutyncji lateksowy ASO, probówkowy 153, 154
– – – – szkiełkowy 153, 156
– – szkiełkowej 155
– – – bezpośredni 68
– CAMP odwrotny 117
– czułość diagnostyczna 16
– dyfuzji 120
– ELISA 155, 156
– FTA-Abs – patrz Odczyn immunofluorescencji kre˛tków w modyfikacji absorpcyjnej
– β-glukuronidazowy do identyfikacji
E. coli 47
– hemaglutynacji pośredniej 66
– IFA (indirect fluorescent antibody)
– patrz Odczyn immunofluorescencji
– kontrolne dla podłoży 21
– laboratoryjne, gwarancja jakości 13
– – ocena jakości 14
– – wiarygodność 12
– lekowrażliwości, kontrola jakości 136
– na oksydaze˛, procedura 60
– optyczny immunologiczny 156
– probówkowy do wykrywania aglutynin
w brucelozie 152
– rozcieńczeń 120
– RPR 141
– szkiełkowy do wykrywania aglutynin
w brucelozie 151
– szybkie do hodowli płynu mózgowo-rdzeniowego 161
– śluzowy, procedura 61
– VDRL 141
– wrażliwości na polimiksyne˛ B 66
– z nitrocefina˛ 92
– z surowicami odpornościowymi Shigella 71
SKOROWIDZ
Test(y), swoistość diagnostyczna 16
– ,,złoty’’ immunologiczny 156
Tetracyklina 84, 123, 124, 126, 169
Te˛żec 113
– a rana penetruja˛ca 102
Tiamfenikol 124
Tkanka(i) podskórna, drobnoustroje 101
– – zapalenie 113
– zakażenie a wrażliwość antybiotyków
123
Tobramycyna 123, 125, 126
Treponema pallidum 96, 141, 142, 148, 165
– – badanie bezpośrednie 97, 98
Trichomonas vaginalis a zapalenie cewki
moczowej u me˛żczyzn 90
Trimetoprim 123, 125, 126, 168, 169
Trypanosoma, poszukiwanie w płynie mózgowo-rdzeniowym 37
TSB – patrz Bulion tryptozowo-sojowy
TTG – patrz Podłoże z tellurynem, taurocholanem i żelatyna˛
Ugryzienia przez zwierze˛ta 102
Układ moczowo-płciowy, próbki do diagnostyki chorób przenoszonych droga˛
kontaktów seksualnych 165
– pokarmowy, zakażenie a wrażliwość antybiotyków 123
UREA – patrz Bulion z mocznikiem, lekko
buforowany
Ureaplasma urealyticum a zapalenie cewki
moczowej u me˛żczyzn 90
Utlenianie dekstrozy bez oleju 21
Vibrio cholerae 20, 162
– – biotypy, różnice 65
– – – wste˛pna 59, 61
– – posiew kału 53
– fluvialis, biochemiczne reakcje 65
– furnissii, biochemiczne reakcje 65
– hollisae, biochemiczne reakcje 65
– mimicus, biochemiczne reakcje 65
– parahaemolyticus, wste˛pna identyfikacja 59
– spp. 21
181
Vibrioparahaemolyticus, biochemiczne reakcje 65
Voges-Proskauer – patrz Czerwień metylowa/Voges-Proskauer
Waginoza bakteryjna 93
Wankomycyna 126, 168, 169
We˛zły chłonne, drobnoustroje 101
Wirówka, kontrola jakości 18
Wirus cytomegalii, objawy zakażenia
89
– Epsteina-Barr 142
– HIV – patrz Wirus nabytego niedoboru
odporności
– nabytego niedoboru odporności, objawy
zakażenia 89
– opryszczki 96
– różyczki 142
– zapalenia wa˛troby typu B, objawy zakażenia 89
Woda peptonowa (indol) 21
Wrzód mie˛kki 96
Wstrza˛sarki 139
Wścieklizna 102
Wydzielina(y) ropne 100
– – badanie lekowrażliwości 112
– – – mikroskopowe105
– – hodowla 107
– – identyfikacja drobnoustrojów 108
– – ocena makroskopowa 104, 105
– z cewki moczowej u me˛żczyzn, transport
próbek 90
– – badanie bezpośrednie i interpretacja
91
– – pobieranie 90
– z pochwy, badanie bezpośrednie i interpretacja 94
– – hodowla 95
– – nieprawidłowa, przyczyny 93
Wykrywanie antygenów bakteryjnych
155
Wymaz z odbytu, pobieranie 52
Wymazówki 127
Wyrostek robaczkowy, zapalenie 113
Wysie˛k(i), drobnoustroje 101
– komórkowy biegunkowego kału, badanie 52
– ropny 100
– – próbki chirurgiczne 100
Wzorzec zme˛tnienia 127
XLD – patrz Agar ksylozo-lizyno-deoksycholanowy
SKOROWIDZ
Yersinia enterocolitica 20, 21, 162
– – – serologiczna 72
– – – wste˛pna 56, 58
– – miano aglutynin 150
– wywoływane zakażenia 50, 51
– frederiksenii, biochemiczne reakcje 64
– intermedia, biochemiczne reakcje 64
– kristensenii, biochemiczne reakcje 64
– pseudotuberculosis, biochemiczne reakcje 64
Zadrapania przez zwierze˛ta 102
Zakażenia bakteriami beztlenowymi 113,
114
– dróg oddechowych dolnych 79
– – – górnych 73
– – – – hodowla i identyfikacja 76
– – – – mikroskopia bezpośrednia 76
– ran szpitalne 102
Zapalenie cewki moczowej u kobiet 93
– – – u me˛żczyzn 90
– gardła, czynniki bakteryjne 74
– – gonokokowe 74
– – martwicze, wrzodzieja˛ce 74
182
Zapalenie, jamy otrzewnej 113
– narza˛dów miednicy u kobiet 93, 94
– opon mózgowo-rdzeniowych, cechy płynu 38
– – – gruźlicze, posiew 38
– – przyczyny 36
– – typy 38
– oskrzeli i płuc 80
– – ostre 79
– – przewlekłe 79
– płuc 80
– – pierwotne atypowe 79
– – wywołane przez chlamydie 79
– pochwy 93
– – niespecyficzne – patrz Waginoza
– szyjki macicy 93
– tkanki podskórnej 113
– wyrostka robaczkowego 113
Zespół nabytego niedoboru odporności,
biegunki 48
Zestawy diagnostyczne 168
Zgorzel gazowa 113
Ziarenkowce Gram-dodatnie 20
Ziarniniak pachwiny 96
Żelatynaza 21

Podstawowe procedury laboratoryjne w bakteriologii klinicznej

Transkrypt

Podobne dokumenty

grudzień 2010 - Loycon Systems