pobierz

Transkrypt

pobierz

PRACA POGLĄDOWA
Review Article
Acta Haematologica Polonica
2006, 37, Nr 4 str. 443–474
JOANNA RUPA, KRZYSZTOF LEWANDOWSKI
Praktyczne aspekty oznaczania chimeryzmu
hematopoetycznego
Practical aspects of hematopoietic chimerism monitoring
Z Katedry i Kliniki Hematologii i Chorób Rozrostowych Układu Krwiotwórczego
Akademii Medycznej w Poznaniu
Kierownik Katedry i Kliniki: Prof. dr hab. med. M. Komarnicki
SŁOWA KLUCZOWE: Chimeryzm hematopoetyczny – Chimeryzm liniowy – Metody oznaczania
KEY WORDS:
Hematopoietic chimerism – Lineage chimerism – Methods
STRESZCZENIE: Ocena stanu chimeryzmu hematopoetycznego po allo-SCT ułatwia monitorowanie restauracji krwiotworzenia z komórek dawcy w organizmie biorcy i pozwala na odpowiednie modyfikowanie leczenia potransplantacyjnego. Monitorowanie zmian stanu chimeryzmu
w czasie, szczególnie w przypadku chimeryzmu liniowego, jest także przydatne w ocenie przyjęcia lub odrzucenia przeszczepu, śledzenia choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD),
czy też w monitorowaniu choroby resztkowej (MRD) i w wykryciu wznowy choroby podstawowej. W zależności od stopnia odtworzenia hematopoezy z komórek macierzystych dawcy wyróżnia się chimeryzm całkowity, mieszany i odnowę autologiczną. Zaleca się aby ocena chimeryzmu hematopoetycznego u pacjentów po alloprzeszczepie była wykonywana co 2–4 tygodnie do
czasu stwierdzenia chimeryzmu całkowitego lub stabilnego bądź malejącego chimeryzmu mieszanego. W przypadku stwierdzenia wzrastającego chimeryzmu mieszanego zaleca się wykonywanie oznaczeń co tydzień, szczególnie po podaniu infuzji limfocytów dawcy (DLI) czy też po
modyfikacji leczenia immunosupresyjnego.
Jedną z pierwszych metod oceny chimeryzmu była analiza chromosomów metafazalnych za pomocą konwencjonalnej cytogenetyki. Dwie techniki biologii molekularnej zrewolucjonizowały
ocenę chimeryzmu po SCT: fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) z użyciem specyficznych sond dla chromosomów płciowych (XY-FISH) lub określonych anomalii chromosomalnych oraz analiza genomowego DNA za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Dzięki
metodzie PCR możliwa jest ocena m.in. markerów genetycznych o dużej zmienności indywidualnej: zmiennej liczby powtórzeń tandemowych (VNTR) i krótkich tandemowych powtórzeń
(STR). Uzupełnieniem oceny STR lub VNTR może być ilościowy PCR w czasie rzeczywistym
(RQ-PCR) pozwalający na ocenę krótkich polimorficznych nukleotydowych insercji/delecji
(SNP) charakterystycznych dla osoby badanej. Ostatnio, dużo uwagi poświęca się ocenie chimeryzmu w wybranych frakcjach komórkowych po uprzedniej ich izolacji z krwi obwodowej lub
szpiku za pomocą techniki immunomagnetycznej lub cytometrycznej. Dzięki wymienionym metodom możliwa jest ocena chimeryzmu w limfocytach B (CD19+, CD20+), T (CD3+), komórkach NK (CD56+), granulocytach (CD15+, CD16+), monocytach (CD14+), komórkach dendry-
188
J. RUPA, K. LEWANDOWSKI
tycznych, komórkach CD34+, makrofagach, erytrocytach, płytkach krwi i megakariocytach
(CD61+). Tak przeprowadzona ocena ułatwia interpretację zjawisk klinicznych i laboratoryjnych
u chorych po przeszczepieniu allogenicznych komórek hematopoetycznych szpiku i krwi obwodowej.
SUMMARY: The evaluation of chimerism after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-SCT ) can be a useful tool for monitoring engraftment and can indicate an appropriate
treatment modification. The sequential monitoring of chimerism, especially in cells subsets (lineage chimerism), is important for assessment of engraftment, graft failure/rejection and detection
of minimal residual disease (MRD), development of impending graft versus host disease or recurrent malignancy. Depending on the degree of donor cell engraftment, complete chimerism
(CC), mixed chimerism (MC) and autologous recovery (AR) can be distinguished. The assessment of chimerism following a non-myeloablative allogeneic stem cell transplantation is recommended in a 2 to 4–weeks interval until donor chimerism or stable/decreasing mixed chimerism
is achieved. In the case of increasing MC, the evaluation should be performed weekly, particularly after the administration of donor lymphocyte infusion (DLI) or immunosupression modification. Initially conventional cytogenetics was used to evaluate the chimerism status after alloSCT. There are two molecular biology techniques that have revolutionised chimerism detection:
fluorescence in situ hybridization analysis of sex chromosome-specific probes (XY-FISH) and
probes for disease specific cytogenetics abnormalities, and the analysis of genome DNA using
polymerase chain reaction. Due to PCR, the donor and the recipient specific DNA sequences
may be characterised including variable number of tandem repeats (VNTR) and short tandem repeats (STR). Quantitative evaluation of chimerism is possible using a real-time PCR and the analysis of short polymorphic insertion/deletion (single nucleotide polymorphism – SNP) characteristic of the person analysed. Recently, more attention has been drawn to chimerism analysis in
selected cell subsets (lineage chimerism) after cells fraction isolation from blood or bone marrow
by means of immunomagnetic or flow cytometry cell sorting. Due to the methods mentioned
above, the chimerism analysis can be performed in B ( CD19+, CD20+) and T (CD3+) lymphocytes, NK cells (CD56+), granulocytes (CD15+,CD16+), monocytes (CD14+), dendritic cells,
CD34+ cells, macrophages, erythrocytes, platelets and megakaryocytes (CD61+). The above
mentioned evaluation facilitates the analysis of clinical and laboratory symptoms in patients who
have undergone allogeneic bone marrow and peripheral blood hematopoietic stem cell transplantation.
WPROWADZENIE
W 1956 roku C.E. Ford i wsp. przeprowadzili pierwsze allogeniczne transplantacje
komórek hematopoetycznych (allo-SCT – ang. allogenic stem cell transplantation)
u myszy (1). W wyniku eksperymentu udokumentowano stopniowy wzrost komórek
hematopoetycznych dawcy w organizmie biorcy po uprzednim naświetlaniu dawkami
letalnymi ocenianych myszy. Z tego powodu zwierzęta te określono mianem chimer
radiacyjnych. Pierwszą zakończoną powodzeniem transplantację mieloablacyjną
u człowieka wykonano w 1959 roku. W przygotowaniu przedtransplantacyjnym stosowano napromieniowanie całego ciała. W 1997 roku przeprowadzono pierwszą allo-SCT bez uprzedniego przygotowania mieloablacyjnego u człowieka (2–7). Według
aktualnie obowiązujących klasyfikacji, w zależności od rodzaju stosowanej chemioi/lub radioterapii, wyróżnia się prawdziwie niemieloablacyjne allotransplantacje (NMC
– ang. truly nonmyeloablative conditioning regiments) oraz allotransplantacje o zredu-
Praktyczne aspekty oznaczania chimeryzmu hematopoetycznego
189
kowanym kondycjonowaniu (RIC – ang. reduced-intensity conditioning) (8). Intensywność RIC allo-SCT jest większa od NMC, ale mniejsza od allotransplantacji mieloablacyjnych (9, 10). Przykłady schematów używanych do kondycjonowania w każdym rodzaju transplantacji w zależności od intensywności mielo- i immunosupresji
przedstawiono na rycinie 1 (3, 9, 11–17).
Ryc. 1. Najczęściej stosowane schematy leczenia kondycjonującego w zależności od ich intensywności
mielo- i immunosupresji
Fig. 1. Commonly used conditioning regimens according to the degree of immunoablation/myeloablation
of commonly used conditioning regiments (11, 17)
Objaśnienie użytych skrótów: TBI – napromienianie całego ciała (ang. total body radiation); FlagIda –
fludarabina, arbinozyd cytozyny, idarubicyna; FC – fludarabina, cyclofosfamid; MF – melfalan, fludarabina; TT-C – tiotepa, cyklofosfamid; Bu16/Cy – busulfan 16mg/m2, cyklofosfamid; Bu8/F/ATG – busulfan 8 mg/m2, fludarabina, globulina antytymocytarna; F-TBI – fludarabina-TBI; BEAM – BCNU, etopozyd, arbinozyd cytozyny, melfalan; TT, M-ATG – tiotepa, melfalan, globulina antytymocytarna;
TBI/Cy F TT – TBI, cyklofosfamid, fludarabina, tiotepa.
W porównaniu do postępowania mieloablacyjnego zaletą kondycjonowania niemieloablacyjnego jest jego mniejsza toksyczność narządowa. Ten typ kondycjonowa-
190
nia umożliwia wykonanie transplantacji także u osób starszych i w gorszym stanie biologicznym.
Tolerancja komórek przeszczepionych w organizmie biorcy jest możliwa dzięki
odpowiedniemu przeprowadzeniu leczenia immunosupresyjnego. W tym celu najczęściej stosuje się: cyklosporynę A, glikokortykosteroidy, globulinę antytymocytarną
(ATG), metotrexat, mykofenolan mofetylu, alemtuzumab (MabCampath) (8, 17–19).
W zdecydowanej większości przypadków ocena charakteru hematopoezy po NMC
wskazuje na współistnienie zarówno komórek własnych, jak i komórek dawcy w organizmie biorcy.
Ryc. 2. Model zmian stanu chimeryzmu hematopoetycznego po allogenicznym przeszczepieniu komórek
krwiotwórczych bez kondycjonowania mieloablacyjnego
Objaśnienie użytych skrótów: DLI – infuzja limfocytów dawcy. Analiza produktu PCR na żelu agarozowym (A) lub metodą elektroforezy kapilarnej (B)
Fig. 2. The schematic diagram of chimerism changes following a non-myeloablative allogeneic stem cell
transplantation
Podanie komórek hematopoetycznych od dawcy zgodnego w układzie HLA może
prowadzić do wystąpienia reakcji przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD – ang.
graft versus host disease), czy też przeszczep przeciwko białaczce/nowotworowi
(GVL/GVT – ang. graft versus leukemia/tumor) (20–24). W przypadku GVL/GVT
limfocyty cytotoksyczne dawcy, reagując z komórkami nowotworowymi prowadzą do
eliminacji resztkowej choroby nowotworowej. W przypadku GvHD, w wyniku interak-
191
cji pomiędzy komórkami prezentującymi antygen (APC) biorcy z dojrzałymi limfocytami T dawcy dochodzi do niszczenia komórek hematopoetycznych biorcy. Reakcja ta
ma charakter ostry (aGvHD – ang. acute) lub też przewlekły (cGvHD – ang. chronic).
Do głównych objawów ostrej GvHD należą zmiany skórne, objawy uszkodzenia błony
śluzowej przewodu pokarmowego i uszkodzenie wątroby (14, 15, 23, 24). Umownie,
reakcję występującą do 100 dni od podania komórek hematopoetycznych określa się
jako ostrą GvHD, natomiast powyżej 100 doby przewlekłą GvHD
Udowodniono, że odpowiednie prowadzenie leczenia immunosupresyjnego umożliwia zastąpienie hematopoezy biorcy przez komórki krwiotwórcze dawcy przy zachowanym efekcie GVL/GVT. Dzięki temu możliwa jest eliminacja resztkowych komórek
nowotworowych w organizmie biorcy (9, 11). Rycina 2 przedstawia model zmian stanu chimeryzmu hematopoetycznego po allogenicznym przeszczepieniu komórek
krwiotwórczych bez kondycjonowania mieloablacyjnego.
Przydatność kliniczna badań chimeryzmu hematopoetycznego
Ocena chimeryzmu hematopoetycznego u chorych po allo-SCT ma wiele zastosowań klinicznych. Niektóre z nich przedstawiono w Tabeli 1 (25).
Tabela 1. Przydatność kliniczna oceny stanu chimeryzmu hematopoetycznego
Table 1. The clinical applications of hematopoietic chimerism analysis
Przydatność kliniczna oceny stanu chimeryzmu hematopoetycznego
1. Udokumentowanie odtworzenia hematopoezy z komórek dawcy (przyjęcie przeszczepu)
2. Ocena przetrwałych komórek dawcy w organizmie biorcy w przypadkach:
– nieadekwatnej funkcji szpiku kostnego
– kwalifikacji do podania infuzji limfocytów dawcy
– kwalifikacji do drugiej allogenicznej transplantacji
– określenia ryzyka przewlekłego odrzucania
3. Ocena ryzyka choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD), odrzucania przeszczepu
i wznowy choroby podstawowej
4. Określenie, czy nawrót choroby nowotworowej jest z komórek dawcy czy biorcy
5. Ocena związku rekonstytucji immunologicznej z przyjęciem przeszczepu po transplantacji komórek
hematopoetycznych w przebiegu leczenia ciężkiego niedoboru odporności
Głównym celem oznaczeń chimeryzmu hematopoetycznego jest udokumentowanie
przyjęcia przeszczepionych komórek krwiotwórczych dawcy w organizmie biorcy.
Monitorowanie zmian stanu chimeryzmu w czasie jest przydatne w ocenie przyjęcia
lub odrzucenia przeszczepu, śledzeniu choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi
czy w wykryciu wznowy choroby podstawowej (26). Ocena chimeryzmu może także
służyć monitorowaniu choroby resztkowej (MRD – ang. minimal residual disease)
w przypadkach, gdy nie ma markera molekularnego specyficznego dla komórek klonu
nowotworowego (9, 11, 27).
192
Doszczepienie komórek krwiotwórczych dawcy, podanie infuzji limfocytów dawcy
(DLI – ang. donor lymphocyte infusion) czy też modyfikacja leczenia immunosupresyjnego może zapobiec odrzuceniu przeszczepu lub/i wznowie choroby podstawowej
(25, 28–31). Zastosowanie wymienionych metod może także zmienić typ chimeryzmu
hematopoetycznego.
Typy chimeryzmu hematopoetycznego
W zależności od stopnia odtworzenia hematopoezy z komórek macierzystych dawcy wyodrębnia się: chimeryzm całkowity (CC – ang. complete chimerism), mieszany
(MC – ang. mixed chimerism) i odnowę autologiczną (AR – ang. autologous
recovery). U pacjentów po allo-SCT, u których nie wykryto własnych komórek hematopoetycznych (autologicznych), należy rozpoznać chimeryzm całkowity (chimeryzm
dawcy). Autologiczną odnowę hematopoezy należy rozpoznać w przypadkach, w których w próbkach krwi obwodowej/szpiku nie stwierdza się obecności DNA komórek
dawcy. U osób, u których stwierdza się obecność zarówno DNA komórek dawcy jak
i biorcy mamy do czynienia z chimeryzmem mieszanym.
Zgodnie z zaleceniami Europejskiej Grupy ds. Przeszczepiania Krwi i Szpiku
(EMBT – ang. European Group for Blood and Marrow Transplantation, 2004), wyróżnia się chimeryzm dawcy oraz trzy rodzaje chimeryzmu mieszanego: przelotny, stabilny i postępujący (Rycina 3). Klasyfikacja ta jest oparta na analizie zmian stanu chimeryzmu w czasie za pomocą metod ilościowych.
CHIMERYZM
MIESZANY
(MC)
MALEJĄCY MC
CHIMERYZM
CAŁKOWITY
STABILNY MC
ROSNĄCY MC
ODNOWA
AUTOLOGICZNA
Ryc. 3. Możliwe zmiany stanu chimeryzmu hematopoetycznego u chorych po NMC allo-SCT
Fig. 3. Different states of chimerism in patients post NMC allo-SCT
193
W tabeli 2 przedstawiono definicje poszczególnych rodzajów chimeryzmu hematopoetycznego (15).
Tabela 2. Typy chimeryzmu hematopoetycznego po allo-SCT (wg EBMT 2004 r.)
Table 2. Types of hematopoietic chimerism following allo-SCT according to EBMT
Chimeryzm dawcy
(ang. donor chimerism – DC)
Wszystkie komórki pochodzą od dawcy po allo-SCT
Przelotny chimeryzm mieszany
(ang. Trasient mixed chimerism – TMC)
Stan przejściowy obserwowany w 6-9 miesięcy po allo-SCT, w których odsetek komórek biorcy zwykle nie
przekracza 1-5%, a w kolejnych miesiącach dochodzi do
DC; może być związany z niskim ryzykiem GvHD
Stabilny chimeryzm mieszany
(ang. stable mixed chimerism – SMC)
Postępujący chimeryzm mieszany
(ang. progressive mixed chimerism – PMC)
Mieszany profil markerów genetycznych dawcy/biorcy, w
którym odsetek komórek biorcy (zwykle nieprzekraczający 1- 20%) po allo-SCT pozostaje na stałym poziomie;
powiązany z dobrym rokowaniem
Mieszany profil markerów genetycznych dawcy/biorcy, w
którym odsetek komórek biorcy wzrasta w czasie (>10%
komórek biorcy) i może być prognostycznym wskaźnikiem wznowy choroby
Zasady oznaczania chimeryzmu hematopoetycznego u pacjentów po kondycjonowaniu mieloablacyjnym i bez mieloablacji
Monitorowanie stanu chimeryzmu hematopoetycznego umożliwia wczesne wykrywanie wznowy choroby podstawowej, odrzucenia przeszczepu oraz rozwoju ciężkiej
choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. Jak dotąd nie ma jednoznacznych ustaleń dotyczących częstości wykonywania oznaczeń chimeryzmu hematopoetycznego.
Większość autorów podkreśla, że u pacjentów po alloprzeszczepie bez mieloablacji
ocena powinna być wykonywana w interwałach od dwóch do czterech tygodni.
W przypadku wykrycia wzrastającego chimeryzmu mieszanego zaleca się wykonywanie oznaczeń co tydzień, szczególnie po podaniu DLI czy też po modyfikacji leczenia
immunosupresyjnego. Ocenę taką należy prowadzić do czasu uzyskania stabilnego
bądź malejącego chimeryzmu mieszanego. U osób nieleczonych DLI proponuje się
wykonywanie oznaczeń co 3 do 6 miesięcy. U pacjentów po mieloablacyjnym przeszczepieniu komórek hematopoetycznych bez deplecji limfocytów T oznaczenia należy wykonać w 1, 3, 6 i 12 miesiącu od przeszczepienia, a następnie przynajmniej raz
w roku (zwykle w 18, 24 i 36 miesiącu od przeszczepu). W przypadku stwierdzenia
CC dalsza ocena chimeryzmu hematopoetycznego jest nieobowiązkowa. Co 2–4 tygodnie zaleca się ocenę chimeryzmu u pacjentów po mieloablacyjnym przeszczepie z deplecją limfocytów T. W każdym przypadku stabilnego MC lub CC zaleca się ocenę
chimeryzmu z częstością jak w przeszczepieniach bez deplecji limfocytów T, tj. w 3, 6
i 12 miesiącu od zabiegu (14, 27, 32–37).
194
Metody oceny chimeryzmu
Markery biologiczne różnicujące komórki dawcy i biorcy oraz techniki laboratoryjne stosowane do oceny chimeryzmu ulegają stałym zmianom. Podstawą oceny chimeryzmu hematopoetycznego jest wykorzystanie różnic pomiędzy dawcą i biorcą w zakresie polimorficznych markerów genetycznych bądź ich produktów.
Jednym z pierwszych testów stosowanych w ocenie przyjęcia przeszczepu była
analiza antygenów erytrocytarnych. Metoda ta znalazła szczególne zastosowanie
w przypadkach oceny poprzeszczepowej chorych z przewlekłą białaczką szpikową
(ang. chronic myeloid leukemia – CML). U chorych z CML podczas wznowy choroby
stwierdza się bowiem stopniowe zastępowanie granulocytów, monocytów i erytrocytów dawcy przez odpowiednie komórki biorcy. Zwiększony odsetek autologicznych
krwinek czerwonych i/lub zmniejszona liczba erytrocytów dawcy prawie zawsze korelują z wystąpieniem wznowy choroby. W praktyce analiza antygenów erytrocytarnych
okazuje się być prostą, dokładną i relatywnie czułą techniką badawczą, której rezultaty
uzyskuje się w ciągu 24 godzin. Rozwój cytometrii przepływowej zwiększył szybkość
i skuteczność tej metody (38). Ocena antygenów erytrocytarnych jest jednak obarczona
szeregiem ograniczeń. Najważniejszymi z nich są przetoczenia masy erytrocytarnej
oraz fakt, że w ponad 80% przypadków przeszczepień od dawcy rodzinnego markery
dawcy i biorcy są identyczne, co uniemożliwia ocenę chimeryzmu hematopoetycznego. Także długi czas życia krwinek czerwonych oraz hemoliza wywołana niezgodnością w układzie ABO dawcy i biorcy utrudniają analizę chimeryzmu poprzeszczepowego. Według najnowszych danych czułość tej metody ocenia się na 0,04% do 3% (14,
39, 40).
Ocena chimeryzmu jest także możliwa dzięki analizie chromosomów metafazalnych za pomocą konwencjonalnej cytogenetyki (41). Metoda ta jest szczególnie przydatna w przypadku różnicy płci między dawcą a biorcą przeszczepu komórek hematopoetycznych. Ograniczeniem wspomnianej metody są: 1) ta sama płeć dawcy i biorcy
(za wyjątkiem występowania specyficznych, związanych z chorobą anomalii genetycznych u biorcy), 2) pracochłonność, 3) konieczność analizy minimum 30 metafaz celem
wykluczenia obecności 10% komórek biorcy z pewnością 95%) oraz 4) mała liczba
metafaz, które można ocenić jednorazowo (25, 42, 43, 44).
Pod koniec lat 80-tych dwie techniki biologii molekularnej zrewolucjonizowały
ocenę chimeryzmu po SCT: fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (ang. fluorecence in
situ hybridization – FISH) z użyciem specyficznych sond dla chromosomów X i Y lub
niektórych innych anomalii chromosomalnych oraz analiza genomowego DNA za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (ang. polimerase chain reaction – PCR). Obie
wymienione metody charakteryzują się wysoką czułością i specyficznością.
Technika FISH poprzez zastosowanie specyficznych sond dla chromosomów X lub
Y umożliwia ilościową ocenę chimeryzmu hematopoetycznego zarówno w komórkach
metafazalnych, jak i interfazalnych (43, 45, 46) Metoda FISH pozwala na szybką ocenę dużej liczby komórek z wysoką precyzją i czułością. Jej zastosowanie jest jednak
możliwe jedynie w około 50% przypadków pacjentów po allo-SCT, u których dawca
195
różni się płcią z biorcą (47). Odsetek wyników fałszywie negatywnych u mężczyzn nie
przekracza 5,6% i 2,7% u kobiet (25). Potencjalnym ograniczeniem tej techniki badawczej jest związana z wiekiem lub uzależniona od choroby podstawowej utrata chromosomu Y oraz występowanie konstytutywnych wariantów DNA w chromosomie Y.
W celu wykluczenia ww. anomalii niezbędna jest ocena struktury chromosomu Y za
pomocą konwencjonalnej cytogenetyki przed wykonaniem transplantacji komórek hematopoetycznych.
W praktyce zastosowanie znalazły sondy DXZ1 i DXZ3 specyficzne dla chromosomu X oraz DYZ1 i DYZ3 dla chromosomu Y. Czułość i specyficzność techniki
FISH w tych przypadkach można zwiększyć poprzez równoczesne użycie sond specyficznych dla chromosomu X i Y wyznakowanych różnymi fluorochromami (z 1–2,5%
do 0,3–0,6%) (48, 49).
Jednym ze sposobów zwiększenia czułości oznaczeń stanu chimeryzmu hematopoetycznego i monitorowania MRD jest połączenie fluorescencyjnego immuno-fenotypowania z techniką XY-FISH (FICTION – ang. fluorescence immunophenotyping and interphase cytogenetics as a tool for the investigation of neoplasms). Czułość tej metody
jest bardzo wysoka i wynosi od 0,1% do 0,001%. Metoda ta jest jednak czasochłonna i
bardzo trudna technicznie, co uniemożliwia jej szersze zastosowanie w badaniach stanu chimeryzmu hematopoetycznego u chorych po allo-SCT (50–55).
Wykrycie przez K.B. Mullisa w 1983 roku mikrosatelit i minisatelit genomowego
DNA (56) oraz opracowanie metody reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) zapoczątkowało rozwój wielu metod oceny stanu chimeryzmu hematopoetycznego u osób po
allo-SCT opartych na analizie polimorfizmu genetycznego. Dzięki metodzie PCR możliwa jest ocena m.in. specyficznych, tandemowo powtarzających się sekwencji DNA,
tzw. zmiennej liczby powtórzeń tandemowych (VNTR – ang. variable number of tandem repeats) i krótkich tandemowych powtórzeń (STR – ang. short tandem repeats).
Podstawą wymienionej analizy jest stwierdzenie, że sekwencja STR czy VNTR jest
stała, a liczba jej powtórzeń jest cechą indywidualną. Wysoka polimorficzność wymienionych sekwencji DNA u człowieka umożliwia identyfikację komórek dawcy u biorcy przeszczepu. Sekwencje VNTR składają się z 9 do 50 par zasad, natomiast STR od
2 do 8 par zasad. Polimorfizm liczby tandemowych powtórzeń w danym locus dziedziczy się zgodnie z prawem Mendla. Ocena STR/VNTR jest niezależna od wyniku typowania w układzie HLA i różnicy płci pomiędzy dawcą i biorcą. Może być ona przeprowadzona bezpośrednio po transplantacji, nawet w przypadku dostępności jedynie niewielkiej ilości DNA do analizy (25, 57).
Polimorfizm VNTR/STR może być ustalony poprzez amplifikację metodą PCR
określonej sekwencji DNA. Fragment oligonukleotydowy komplementarny do niepolimorficznej sekwencji 5’ i 3’ (tzw. primer lub starter) przyłącza się w kierunku przeciwnym do nici pomiędzy fragmentem polimorficznym VNTR/STR. Primery inicjują
amplifikację DNA poprzez powtarzające się cykle denaturacji, wydłużania i syntezy.
Po amplifikacji 106–109 kopii DNA możliwa jest identyfikacja badanego markera genetycznego na żelu agarozowym lub poliakrylamidowym, po wybarwieniu np. brom-
196
kiem etydyny. Produkt reakcji może być hybrydyzowany z sondami radioaktywnymi,
co umożliwia jego wizualizację przez autoradiografię.
W ostatnich latach rozpoczęto ocenę stanu chimeryzmu hematopoetycznego po allo-SCT za pomocą techniki PCR, umożliwiającej identyfikację sekwencji specyficznych dla genów płciowych. W przypadkach, gdy dawcą komórek hematopoetycznych
jest mężczyzna, a biorcą kobieta, STR i dwualleliczne markery zlokalizowane na chromosomie Y są najbardziej przydatne do oceny stanu chimeryzmu. W ocenie chimeryzmu Y-STR przydatne są następujące markery: DYS-19, DYS-390, DYS-389I, DYS389II, DYS-391, DYS-392 i DYS-393. Chimeryzm hematopoetyczny można także
ocenić poprzez analizę innego genu specyficznego dla chromosomu Y – SRY. SRY
zlokalizowany jest na krótkim ramieniu chromosomu Y, a produkt jego transkrypcji
determinuje proces różnicowania jąder. Gdy dawcą szpiku dla mężczyzny jest kobieta,
markerem różnicującym chromosomy X i Y jest wielkość produktu genu amelogeniny
(212 par zasad w przypadku chromosomu Y i 218 par zasad chromosomu X) (48, 49).
Metoda STR-PCR uważana jest za standardową w ocenie chimeryzmu poprzeszczepowego. Jej czułość jest stosunkowo wysoka, jednak błąd detekcji rzadszych genotypów wynosi aż 0,4% do 5%. W porównaniu do STR-PCR, technika VNTR jest bardziej skomplikowana i mniej czuła. Różnica czułości pomiędzy STR i VNRT spowodowana jest przede wszystkim zwiększoną ilością fragmentów bogatych w guaninę i
cytozynę (GC) w mini- i mikrosatelitach DNA, a także wielkością produktu PCR.
Wprowadzenie automatycznych analizatorów DNA (m.in. ABI Prism 377 i ABI
Prism 310) umożliwiło szybszą i dokładniejszą ilościową ocenę chimeryzmu. Stało się
to możliwe dzięki jednoczesnej ocenie większej liczby STR/VNTR i użyciu starterów
PCR wyznakowanych różnymi barwnikami fluorescencyjnymi (58–70).
Thiede i współpracownicy oceniając 27 różnych STR u 203 pacjentów poddanych
allo-SCT od zgodnych w układzie HLA dawców rodzinnych stwierdzili, że informatywność markerów genetycznych uzależniona była od stopnia heterozygotyczności
dawcy/biorcy i wahała się od 4,4% do 49% (71). Według innych autorów czułość tej
metody mieści się w przedziale od 0,1% do 1% w przypadku autoradiografii i 5–10%
przy identyfikacji produktu na żelu agarozowym lub poliakrylamidowym (72). W metodzie tej preferencyjnie amplifikowane są allele krótsze. Z tego powodu dłuższe fragmenty mogą nie zostać zamplifikowane w ilości dostatecznej do ich wykrycia na żelu
agarozowym bądź poliakrylamidowym, czy też nawet metodą elektroforezy kapilarnej.
Podczas amplifikacji niektórych STR obecność pomyłkowo powstałych produktów
(ang. slippage products), szczególnie dinukleotydowych, może prowadzić do znacznego utrudnienia właściwej detekcji powstałych produktów PCR (dynamic range of detection) (63, 73–75).
Wśród technik, które z uwagi na czasochłonność i umiarkowaną czułość nie znalazły szerszego zastosowania, należy wymienić: IPA-REISD, RFLP i system ARMS.
IPA-REISD (ang. image processing and restriction endonuclease in situ digestion) jest
metodą ilościową, pozwalającą na rozróżnienie komórek dawcy oraz biorcy niezależnie od płci. Umożliwia ona wykrycie ukrytych polimorfizmów (ang. cryptic polimorphisms) wśród wysoce powtarzalnych sekwencji DNA w chromosomach metafazal-
197
nych lub jądrach interfazalnych komórek krwi obwodowej lub szpiku. Metoda ta może
znaleźć zastosowanie w przypadkach, gdy produkty powstałe po trawieniu genomowego DNA dawcy i biorcy enzymem restrykcyjnym wykazują różny wzorzec trawienia
(14, 76–79).
Ocena polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (ang. restriction fragment length polimorphism – RFLP) pozwala na analizę stanu chimeryzmu hematopoetycznego. Wzór RFLP może być zidentyfikowany za pomocą metody Southerna.
Z uwagi na złożoność metody, stosunkowo małą czułość (1–10%) i niemożność oceny
ilościowej, metoda ta nie jest rutynowo stosowana (14, 41, 80–86).
Allelo-specyficzny PCR (tzw. system ARMS, ang. amplification refractory mutation system) jest kolejną techniką pozwalającą na selektywną amplifikację małych ilości DNA biorcy allo-SCT. Primer w systemie ARMS jest zaprojektowany w ten sposób, aby jego koniec 3’ łączył się z allelem polimorficznym locus biorcy nie wykazując powinowactwa do allelu dawcy (14, 87, 88).
W ostatnim czasie coraz mniej uwagi poświęca się metodom jakościowym oceny
stanu chimeryzmu. Ich wadą według większości autorów jest brak możliwości dostatecznej oceny dynamiki zmian chimeryzmu mieszanego w całkowity lub odwrotnie
w kierunku odnowy autologicznej. W części przypadków przy niewielkiej liczbie markerów różnicujących nie jest możliwe jednoznaczne określenie stanu chimeryzmu hematopoetycznego.
Ocena półilościowa chimeryzmu hematopoetycznego w czasie możliwa jest za pomocą zmodyfikowanych metod VNTR-PCR i STR-PCR (rozcieńczenia materiału genetycznego dawcy i biorcy). Zasada pomiaru oparta jest na ocenie densytometrycznej
ilości produktu PCR i jej porównaniu z krzywą standardową wykreśloną w oparciu o
procentową zawartość DNA dawcy i biorcy (89–92). W przypadkach tych współczynnik biorca/dawca określa się w oparciu o następujący wzór:
Procent komórek dawcy
=
suma powierzchni pól pod pikami alleli dawcy
suma powierzchni pół pod pikami alleli dawcy i biorcy
Metoda półilościowa nie znajduje aktualnie szerszego zastosowania z uwagi na
czasochłonność, małą powtarzalność oznaczeń oraz niską efektywność.
Alternatywą dla oceny STR lub VNRT jest ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (RQ-PCR – ang. quantitative real-time PCR). Metoda ta
oparta jest na wykrywaniu specyficznych krótkich polimorficznych dinukleotydowych
inercji/delecji. Polimorfizm pojedynczego nukleotydu (SNPs – ang. single nucleotide
polimorphisms) występuje bowiem w genomie ludzkim ze średnią częstością 1,3 kpz
i jest uznawany za najczęstszą zmianę genetyczną (93). W fazie wydłużania PCR dochodzi do emisji sygnału fluorescencyjnego, generowanego podczas związania niespecyficznych barwników fluorescencyjnych (np. SYBR Green czy YO-PRO-1) lub specyficznych dla amplifikowanego fragmentu DNA fluorescencyjnych sond do dwuniciowego DNA (dsDNA). Wielkość fluorescencji jest proporcjonalna do ilości kopii
analizowanego materiału w probówce. W trakcie każdego cyklu reakcji produkt amplifikacji PCR ulega podwojeniu. W metodzie tej obserwuje się liniową zależność pomię-
198
dzy liczbą kopii DNA lub RNA w probówce w pierwszym cyklu a narastaniem liczby
sygnałów fluorescencyjnych w końcowym produkcie reakcji (ang. thermed cycle threshold – Ct). Czułość RQ-PCR waha się od 10-4 do 10-5 (94, 95, 96). W zależności od
rozcieńczenia transkryptu rozpiętość wyników fałszywie ujemnych mieści się w przedziale od 1% do 6% wszystkich oznaczeń. Wyniki fałszywie dodatnie (około 6%) spowodowane są zwykle zanieczyszczeniami laboratoryjnymi (np. komórkami niehematopoetycznymi, w tym endotelium czy fibroblastami). Powtarzalność wyników RQ-PCR
w poszczególnych laboratoriach jest duża, a rozbieżności mogą być wynikiem złego
przechowywania, niewłaściwych warunków transportu próbek oraz odmiennych procedur wewnątrzlaboratoryjnych.
Alizadeh i współpracownicy, oceniając 11 SNP za pomocą RQ-PCR i sond TaqMan, w 90% przypadków rozróżnili z najniższą czułością 0,1% dawcę i biorcę allo-SCT (97). Ocena genu SRY u 43 mężczyzn, dla których dawcami były kobiety wykazała, że możliwe jest wykrycie 1 komórki „męskiej” wśród 100 000 komórek „żeńskich” (47, 98). Wymagania aparaturowe, koszt oznaczeń oraz niska dostępność tej
metody ogranicza jej stosowanie w rutynowej praktyce klinicznej (75, 95, 96, 97, 99,
100–103).
Jedną z nowych metod różnicujących dawcę i biorcę w oparciu o SNP i technikę
real-time PCR jest pirosekwencjonowanie. Pozwala ona na ilościową ocenę chimeryzmu hematopoetycznego. W metodzie tej oprócz polimerazy DNA wykorzystuje się
też inne enzymy, w tym ATP sulfurylazę i lucyferazę oraz substraty dla tych enzymów,
odpowiednio adenozyno-5’-fosforosiarczan i lucyferynę. W pierwszym etapie pirosekwencjonowania denaturuje się zamplifikowany fragment DNA. Następnie, po hybrydyzacji startera dla wybranego SNP, polimeraza DNA katalizuje wbudowywanie kolejnych, komplementarnych dNTP. Każdemu przyłączeniu dNTP towarzyszy uwolnienie
pirofosforanu (PPi), który z kolei w obecności APS pod wpływem sulfurylazy zostaje
przekształcony w ATP. Podczas utlenienia lucyferyny do oksylucyferyny w obecności
ATP i lucyferazy dochodzi do uwolnienia kwantu światła, który jest uwidoczniony w
piktogramie jako pik. Wysokość piku jest proporcjonalna do liczby wbudowanych nukleotydów. Pozostałe ATP i niezużyte dNTP są degradowane apyrazą. Jako pierwsi pirosekwencjonowanie zastosowali Hochberg i współpracownicy u 55 pacjentów po niemieloablacyjnym przeszczepieniu komórek hematopoetycznych od dawców zgodnych
w układzie HLA. Oznaczenia chimeryzmu przeprowadzono w oparciu o analizę 14
SNP. Zaletą tej metody jest jej szybkość i czułość. Umożliwia ona bowiem analizę 96
próbek w mniej niż 2 godziny i identyfikację zaledwie 5% komórek dawcy w organizmie biorcy. Autorzy podkreślają, że zastosowanie SNP, szczególnie związanych z antygenami mniejszego układu zgodności tkankowej mogącymi mieć wpływ na wystąpienie GvHD i wyniki transplantacji, może dostarczyć również nowych, istotnych danych klinicznych (100). W tabeli 3 przedstawiono porównanie najczęściej stosowanych metod oceny chimeryzmu potransplantacyjnego (7, 14, 16, 32, 47, 67, 93, 98).
Chimeryzm liniowy
199
Jedną z możliwości zwiększenia czułości i informatywności oznaczeń chimeryzmu
hematopoetycznego w oparciu o metody PCR lub FISH jest jego ocena w wybranych
frakcjach komórkowych krwi obwodowej lub szpiku (chimeryzm liniowy – ang. Lineage chimerism) (104). Dzięki ocenie chimeryzmu liniowego możliwe jest stwierdzenie
Tabela 3. Metody oceny chimeryzmu hematopoetycznego
Table 3. Methods for hematopoietic chimerism analysis
Średnia
Metoda
Cel
Komentarz
czułość
transfuzje krwi mogą prowadzić do
antygeny eryFenotyp erytrocytów
0,04–3% błędnych wniosków, detekcja jednego
trocytarne
typu komórek
zastosowanie wyłącznie u dawcy i
chromosom X/
Cytogenetyka klasyczbiorcy niezgodnego płcią lub w przyY, anomalie ka5–10%
na
padku wykrycia anomalii cytogeneriotypu
tycznych; chromosomy metafazalne
chromosom X/
wyższa czułość w porównaniu do cyFISH (fluorescencyjna
Y, anomalie ka- 0,5–2,5% togenetyki klasycznej, chromosomy
hybrydyzacja in situ)
riotypu
interfazalne
Informatywność
niska
niska
wysoka
FICTION: XY-FISH + chromosom X ,
immunohistochemia
chromosom Y
0,1–
0,001%
czasochłonna i trudna technicznie metoda
średnia
miejsca trawienia enzymów
restrykcyjnych
5–10%
wątpliwe wyniki w przypadkach występowania wielu miejsc działania enzymów restrykcyjnych
wysoka
STR-PCR/ VNTR-PCR STR/VNTR
1–5%
umiarkowana wydajność
wysoka
STR-PCR + sortowanie
STR/VNTR
komórek
0,1–
0,001%
czasochłonna i trudna metoda, wysokie wymagania aparaturowe
wysoka
0,001– szybka, wysoka wydajność i czułość,
0,0001% wysokie wymagania aparaturowe
wysoka
RFLP-PCR
Real-time quantitative
PCR
SNP/ markery
dla chromosomu Y
„rozdwojenia chimeryzmu” (ang. split chimerism). Dotyczy to przypadków, gdy obecność markerów genetycznych dla komórek dawcy stwierdza się jedynie w wybranych
liniach komórkowych, np. mieloidalnej czy limfoidalnej, podczas gdy w innych nie są
one wykrywane (105).
Dobór markerów genetycznych do oznaczeń stanu chimeryzmu hematopoetycznego
W przypadku oceny chimeryzmu liniowego istotną rolę może odgrywać dobór
markerów genetycznych. Thiede i współpracownicy analizując sygnał komórkowy
w populacji komórek CD34+ dla jednego markera genetycznego zlokalizowanego na
chromosomie 7 w jednym przypadku wykazali, że w porównaniu do oznaczeń innych
markerów genetycznych wielkość sygnału odbiega znacznie od wartości przewidywanych w oparciu o ocenę heterozygotyczności alleli. Mogło to wskazywać na utratę heterozygotyczności w danym locus. Ocena cytogenetyczna przed przeszczepieniem wykazała jednak obecność delecji chromosomu 7. Wzrost liczby komórek CD34+ pocho-
200
dzących od biorcy przeszczepu mógł wskazywać na ponowne pojawienie się klonu nowotworowego. Przykład ten potwierdza przypuszczenie, że w niektórych przypadkach
wykonanie badania tylko dla tego jednego markera genetycznego może prowadzić do
błędnych wniosków. Podobne obserwacje dotyczą innych delecji chromosomalnych typowych dla schorzeń mielo- i limfoproliferacyjnych (m.in. zlokalizowanych na chromosomie 5, 7, 13 i 17) (106). Z tego powodu zaleca się użycie kilku markerów genetycznych do oznaczeń chimeryzmu hematopoetycznego.
Metody oceny chimeryzmu liniowego
Jedną z pierwszych metod stosowanych do izolacji wybranych komórek krwi obwodowej/szpiku jest separacja wirowaniem w gradiencie gęstości (Ficoll, Percoll, Gradisol L, Gradisol G). W metodzie tej komórki osadzają się w miejscu, w którym gęstość otaczającego medium jest identyczna z gęstością pozyskiwanych komórek.
W 1980 roku Olofsson i współpracownicy podczas wirowania krwi we wzrastającym
gradiencie na Ficollu (np. preparat Lymphoprep) zaobserwowali, że limfocyty i monocyty krwi obwodowej charakteryzuje gęstość poniżej 1,077 g/ml, a granulocyty powyżej 1,077 g/ml. Z uwagi na łatwość penetracji Ficollu do wnętrza izolowanych komórek częściej używanym medium jest Percoll. Percoll jako substancja izoosmotyczna
i pH-obojętna nie zmienia właściwości fizycznych pozyskiwanych komórek (107,
108). Wadą metod sedymentacyjnych jest stosunkowo mała czystość izolacji.
Aktualnie w preparatyce komórek krwi i szpiku stosuje się przeciwciała monoklonalne specyficzne dla molekuł powierzchniowych CD (ang. cluster of differentiaton –
kompleks różnicowania). Do izolacji komórek krwi obwodowej/szpiku używa się m.in.
przeciwciał anty-CD3 identyfikujących limfocyty T, anty-CD4 limfocyty pomocnicze,
anty-CD8 limfocyty cytotoksyczne, anty-CD19 i anty-CD22 limfocyty B. W przypadku separacji komórek NK przydatne są przeciwciała anty-CD56, do izolacji monocytów przeciwciała anty-CD14 i/lub anty-CD11b, granulocytów anty-CD15, eozynofili
anty-CD16, megakariocytów i płytek krwi anty-CD61, komórek erytroidalnych anty-CD71, a komórek hematopoetycznych progenitorowych anty-CD34 (109). Izolacja
całej frakcji leukocytów jest możliwa dzięki użyciu przeciwciał anty-CD45.
Separacja wybranej frakcji komórek z krwi obwodowej lub szpiku, po wyznakowaniu odpowiednimi przeciwciałami monoklonalnymi, jest możliwa za pomocą techniki
immunomagnetycznej i cytometrycznej. W pierwszej przeciwciała monoklonalne
sprzężone są z kuleczkami paramagnetycznymi (MACS, Dynabeads). Podczas przechodzenia przez kolumienkę separacyjną umieszczoną w polu magnetycznym komórki
wyznakowane specyficznymi przeciwciałami związanymi z paramagnetycznymi kuleczkami są na niej zatrzymywane. Po usunięciu z pola magnetycznego zatrzymane komórki można odzyskać poprzez elucję z kolumienki. Zarówno frakcja magnetyczna
(selekcja pozytywna), jak i niemagnetyczna (selekcja negatywna) mogą być całkowicie
odzyskane. W podobny sposób odbywa się automatyczna izolacja komórek na sorterze
komórkowym np. auto-MACS firmy Miltenyi Biotec (47, 61, 110, 111). Czystość wyizolowanych w ten sposób frakcji komórkowych waha się od 95% do 99,9%.
201
W metodzie cytometrycznej pożądana frakcja komórkowa po wyznakowaniu przeciwciałem monoklonalnym z fluorochromem (m.in. FITC – izotiocyjanian fluoresceiny, APC – allofikocyjanina, PE – fikoerytyna, biotyna, streptawidyna) jest oddzielana
od pozostałych komórek jądrzastych za pomocą cytometru przepływowego z sorterem
komórkowym (112–116).
Dla zwiększenia efektywności izolacji komórek proponuje się wstępną separację
mononuklearów z krwi obwodowej (np. poprzez sedymentację), a następnie wyznakowanie poszukiwanej frakcji komórek odpowiednim przeciwciałem monoklonalnym
i jej separację za pomocą metody immunomagnetycznej czy cytometrycznej.
W celu zwiększenia efektywności procesu izolacji można zastosować kombinację
kilku metod. Hancock i współpracownicy zalecają wykonanie izolacji dwuetapowo
(60). Po oddzieleniu z krwi obwodowej mononuklearów metodą sedymentacji (Ficoll),
przeprowadza się separację komórek metodą immunomagnetyczną. W procedurze tej
najbardziej efektywna jest podwójna selekcja pozytywna, najpierw komórek CD15+,
a później komórek CD45+. Umożliwia to wychwyt większości leukocytów.
W 2003 roku Koehl i współpracownicy przedstawili metodę pozyskiwania poszczególnych frakcji komórkowych z krwi żylnej pełnej metodą immunomagnetyczną.
Po wyizolowaniu komórek CD34+ przeprowadza się izolację komórek CD3+, CD56+
i CD14+, a frakcje negatywne komórek wykorzystuje do dalszych izolacji. I tak,
z frakcji komórek CD3– po wyznakowaniu przeciwciałami monoklonalnymi anty-CD56 izoluje się komórki NK (CD56+ CD3–), z frakcji CD14– limfocyty pomocnicze
(CD4+ CD3+ CD56–), a z komórek CD56– limfocyty cytotoksyczne (CD8+CD3+
CD56–). Średnia czystość wyizolowanych w taki sposób frakcji komórkowych przekracza 90,5% w każdym przypadku (61).
W tabeli 4 przedstawiono przegląd niektórych prac, w których oceniano chimeryzm liniowy w różnych frakcjach komórkowych (26, 55, 61, 72, 81, 86, 104, 105,
113, 116–142).
Tabela 4. Przegląd publikacji oceniających chimeryzm liniowy
Table 4. Examples of publications on lineage specific chimerism
Rodzaj izolowanych komórek
Wybrane badania
komórki mieloidalne (CD13, CD33) Childs [120], Baron [136], Chou [130], Maris (119), Keil (137)
granulocyty (CD15, CD16)
Childs [120], Porta [127], Matthes-Maris [139], Urbini [135]
Childs [120], Baron [72], Haddad [118], Yamazaki (86),
limfocyty T (CD3)
Fernandez-Aviles [141]
Bornhaűser [117], Matthes-Martin [139], Baron [72], Koenecke
komórki NK (CD56)
[138], Guimond [140], Maury [123], van Leeuwen [113]
monocyty (CD14)
limfocyty Th (CD4)
limfocyty Tc (CD8)
limfocyty B (CD19, CD20)
erytrocyty
makrofagi (CD68)
Childs [120], Baron [72], Haddad [118], Yamazaki [86]
Jaksch [26], Urbini [135], Petersen [142]
Jaksch [26], Urbini [135], Petersen [142]
Childs [120], Zetterquist [126], Winiarski [116], Bader [105],
Maury [123], Mattson [121,122], Uzunel [119], Valcarcel
[125], Koehl [61], Dubovsky [104]
Childs [120], Wu [132]
Wickenhauser [55]
202
płytki krwi/megakarioctyty (CD61)
komórki dendrytyczne
komórki CD34+
Chou [130], Eklund [131], French [81]
Nachbaur [129], Affermann-Gretzinger [128], Porta [127]
Thiede [133], Scheffold [134]
Chimeryzm w limfocytach T
Limfocyty T odgrywają kluczową rolę w rekonstytucji krwiotworzenia z komórek
dawcy, w odrzucaniu przeszczepu oraz rozwoju ostrej i przewlekłej GvHD. Ocena chimeryzmu w limfocytach T jest możliwa po izolacji metodą immunomagnetyczną lub
cytometryczną z użyciem przeciwciał anty-CD3, anty-CD4 (izolacja limfocytów pomocniczych) i anty-CD8 (izolacja limfocytów cytotoksycznych).
W 2001 roku Antin ze współpracownikami w czasie spotkania grupy roboczej
Amerykańskiego Towarzystwa Transfuzjologii i Transplantacji Szpiku (ang. ABMRT
– American Society of Blood and Marrow Transplantation) oraz Narodowego Programu Dawców Szpiku i Międzynarodowego Rejestru Dawców Szpiku (ang. IBMTR –
International Bone Marrow Transplant Registry) wysunęła hipotezę, że niski poziom
chimeryzmu w komórkach CD3+CD8+ dawcy związany jest z odrzucaniem przeszczepu (27). Przeprowadzona przez Barona i współpracowników ocena kinetyki rekonstytucji hematopoezy z komórek dawcy w różnych liniach komórkowych u 120 osób wykazała, że niski procent limfocytów T dawcy w 14 dobie po allo-SCT związany jest ze
zwiększonym prawdopodobieństwem odrzucenia przeszczepu. Okazało się także, że
wysoki odsetek limfocytów T dawcy w 28 dobie korelował ze zwiększonym ryzykiem
rozwoju ostrej GvHD (72). Szybkie osiągnięcie chimeryzmu całkowitego w linii limfoidalnej, ale nie w linii mieloidalnej, prawdopodobnie jest czynnikiem prognostycznym
rozwoju stabilnego chimeryzmu mieszanego (137). Seryjne badania chimeryzmu poprzeszczepowego w granulocytach i w subpopulacjach limfocytów T (komórki CD4+ i
CD8+) wykazały, że odsetek komórek CD4+ oraz CD8+ dawcy przewyższa chimeryzm granulocytarny w 7 i 14 dobie po allo-SCT. Ocena chimeryzmu liniowego wykazała jednak, że szybciej dochodzi do wytworzenia całkowitego chimeryzmu dawcy w
granulocytach (przedział od 14–104 dni, średnio w 42 dobie) niż w komórkach CD4
(14–378 dni, średnio w 154 dobie) czy też w limfocytach CD8 (14–378, średnio w 120
dobie) (142).
Inne badania poświęcone były ocenie związku pomiędzy stanem stanu chimeryzmu
w limfocytach T i ich subpopulacjach we krwi obwodowej a wystąpieniem ostrej
i przewlekłej choroby GvHD. Childs i współpracownicy potwierdzili, że szybkie osiągnięcie DC w limfocytach T prawie zawsze poprzedzało wystąpienie pierwszych objawów aGvHD (120). Zależność pomiędzy całkowitym chimeryzmem w limfocytach T a
rozwojem GvHD potwierdził także Hardy ze współpracownikami w grupie chorych
z zaawansowanym rakiem piersi leczonym allo-BMT o zredukowanym kondycjonowaniu (9 przypadków aGvHD i 4 przypadki cGvHD w grupie 16-osobowej) (143).
Również Keil stwierdził częstsze występowanie zarówno ostrej, jak i przewlekłej
GvHD (6 przypadków aGvHD i 17 cGvHD) u pacjentów, u których chimeryzm w limfocytach T przewyższał 90% (137). Mattson zaobserwował znacząco częstsze prawdo-
203
podobieństwo wystąpienia aGvHD w grupie pacjentów z DC w porównaniu do osób z
MC w limfocytach T (52% vs. 5%, n=102, p<0,001). W wieloczynnikowej analizie
obecność chimeryzmu dawcy w limfocytach T okazała się najbardziej znaczącym
czynnikiem rozwoju aGvHD II–IVo (121). Wyżej wymienione zależności nie potwierdzono w odniesieniu do limfocytów B. Wykazano natomiast tendencję do rzadszego
rozwoju aGvHD II-IVo u pacjentów z MC mieloidalnym w porównaniu do pacjentów z
DC w limfocytach T (13% vs. 33%) (137). Zależność ta nie została potwierdzona przez
Mattsona. W badaniu tym aż 90% analizowanych pacjentów (18 z 22 chorych) z
pierwszymi objawami aGvHD miało chimeryzm mieszany w limfocytach T. Przeczy
to hipotezie, że chimeryzm mieszany chroni przed aGvHD. Należy jednak podkreślić,
że u wszystkich chorych z aGvHD doszło do konwersji chimeryzmu w limfocytach T
(MC do DC), a w momencie rozpoznania aGvHD tylko u 15 z 22 analizowanych chorych stwierdzono MC w komórkach mieloidalnych (144).
Jaksch i współpracownicy oceniając chimeryzm w komórkach CD4 i CD8 w grupie 34 pacjentów w 7 i w 10 dobie po allo-SCT zaobserwowali, że wczesne monitorowanie chimeryzmu może być pomocne w przewidywaniu wystąpienia aGvHD. Wykazali oni istnienie znacząco wyższego ryzyka rozwoju aGvHD u pacjentów z CC w limfocytach CD4+ w 7 dobie (p=0,005), a także w grupie osób, u których liczba limfocytów CD4+ dawcy wzrosła o 50% lub więcej między 7 a 10 dniem od transplantacji
(26).
Należy jednak wspomnieć, że Valcárel i współpracownicy na podstawie analizy 68
pacjentów nie wykazali związku pomiędzy kinetyką osiągnięcia chimeryzmu dawcy
w limfocytach T a wystąpieniem aGvHD (53% w przypadku CC i 42% z MC) (125).
Śledzenie zmian chimeryzmu hematopoetycznego w wybranych populacjach komórkowych w kontekście monitorowania wznowy choroby podstawowej było przedmiotem wielu badań (31, 45, 104, 105, 116, 126, 145). Roux i współpracownicy badając chimeryzm liniowy u 7 chorych, u których doszło do wznowy choroby w przeciągu
4 lat od allo-SCT, 5 pacjentów z rozpoznaniem przewlekłej białaczki szpikowej
(CML) i 2 z ostrą białaczką szpikową (AML), potwierdziła pojawianie się komórek
autologicznych w populacji limfocytów T (chimeryzm mieszany). Badania stanu chimeryzmu w limfocytach B, komórkach NK i monocytach w tych przypadkach wykazywały utrzymywanie się chimeryzmu całkowitego. W momencie stwierdzenia wznowy cytogenetycznej u pacjentów z CML początkowo stwierdzano chimeryzm mieszany w monocytach i w limfocytach T. W przypadkach tych do roku od wykrycia wznowy cytogenetycznej potwierdzano obecność DC w limfocytach B i komórkach NK
(145). Dubovsky przeprowadziła analizę chimeryzmu liniowego u chorych z wcześniejszym całkowitym chimeryzmem, u których pojawiły się ponownie komórki autologiczne. W 4 przypadkach zmiany te poprzedzały nawrót choroby podstawowej, a w 2
pomimo obecności zmian nie zaobserwowano wznowy choroby. U jednego pacjenta z
ostrą białaczką B-komórkową (B-ALL) pomimo DC w leukocytach krwi obwodowej
wykryto wzrost liczby autologicznych komórek CD19+ (104).
Bader ze współpracownikami ocenił rekonstytucję krwiotworzenia w limfocytach
T, komórkach NK, B, a także w monocytach i granulocytach u pacjentów ze wzrastają-
204
cym chimeryzmem mieszanym. Celem analizy była próba odpowiedzi na pytanie czy
za stan chimeryzmu mieszanego odpowiedzialne są prawidłowe komórki autologiczne
czy komórki nowotworowe. Wyniki badania potwierdziły podwyższoną liczbę komórek autologicznych w populacji monocytów i limfocytów, a następnie granulocytów
krwi obwodowej przed wznową choroby. Autorzy wysunęli hipotezę, że pojawiające
się de nowo komórki autologiczne osłabiają reakcję przeszczep przeciwko gospodarzowi, co może indukować proces tolerancji dla własnych komórek, w tym klonu nowotworowego. W analizowanej pracy u pacjentów ze wzrastającym chimeryzmem mieszanym zastosowanie immunoterapii nasilało efekt przeszczep przeciwko białaczce i
prowadziło do eliminacji komórek autologicznych. W jednym przypadku ALL pomimo utrzymywania się chimeryzmu całkowitego doszło jednak do wznowy choroby, co
utrudnia interpretację uzyskanych wyników (105).
Spostrzeżenia Badera potwierdził Massenkeil ze współpracownikami w oparciu
ocenę chimeryzmu mieszanego w wyselekcjonowanych liniach komórkowych u 23 pacjentów leczonych allo-SCT z powodu ostrych białaczek. W 5 przypadkach (38%) malejący chimeryzm mieszany lub konwersja chimeryzmu całkowitego w mieszany poprzedzały wznowę choroby. Autorzy wysunęli hipotezę, że profilaktyczne podanie DLI
u pacjentów z dużym ryzykiem wznowy ALL lub AML może prowadzić do konwersji
MC w CC, a tym samym zmniejszać ryzyko wznowy choroby (31).
Ocena chimeryzmu limfocytów B
Izolację limfocytów B do oznaczeń chimeryzmu liniowego przeprowadza się zwykle za pomocą przeciwciał monoklonalnych anty-CD20 i/lub anty-CD19 metodą immunomagnetyczną lub cytometryczną (61, 72, 104, 105, 116, 120, 121, 122, 125, 126).
W większości badań z powodu małej liczebności grupy badanych nie udało się wykazać istotnych statystycznie różnic pomiędzy zmianą stanu chimeryzmu w limfocytach
B a wystąpieniem odrzucania przeszczepu czy też rozwoju GvHD. Jedynie Zetterquist
i współpracownicy potwierdzili związek pomiędzy wzrastającą liczbą komórek autologicznych we frakcji CD19+ krwi obwodowej a zwiększonym ryzykiem wznowy choroby u dzieci z ostrą białaczką limfoblastyczną leczonych allo-SCT (126). Autorzy
podkreślają jednak, że zależności te powinny być potwierdzone na większej grupie badawczej.
Ocena chimeryzmu w komórkach NK
Większość retrospektywnych badań klinicznych dowodzi, że komórki NK odgrywają obok limfocytów T kluczową rolę w rekonstytucji hematopoezy z komórek dawcy. Znalazło to potwierdzenie m.in. u pacjentów poddanych przeszczepieniu komórek
krwiotwórczych od dawców niespokrewnionych po kondycjonowaniu niemieloablacyjnym. W przypadkach tych nie dochodzi bowiem do dostatecznej eliminacji komórek NK biorcy (146).
205
Izolacja komórek NK jest możliwa za pomocą metody cytometrycznej i sorterem
komórkowym (14, 20, 34, 135, 137, 138, 139, 140), a także metodą immunomagnetyczną (61, 86, 105, 123, 10). Do selekcji komórek NK metodą immunomagnetyczną
używa się przeciwciał monoklonalnych anty-CD56 sprzężonych z paramagnetykami
(61, 86, 105, 123).
W 2001 roku Bornhaűser i współpracownicy stwierdzili, że w 4 z 10 analizowanych przypadków, u których wykazano malejący chimeryzm mieszany w komórkach
NK, u 3 doszło do odrzucenia przeszczepu. U pozostałych 6 pacjentów, u których odsetek komórek dawcy we frakcji NK przekraczał 75%, potwierdzono stabilny chimeryzm mieszany (117). Matthes-Martin oceniając chimeryzm w limfocytach T, komórkach NK, monocytach i granulocytach u 39 dzieci wykazali znamienny związek pomiędzy stanem chimeryzmu komórek NK w +28 dobie a późnym odrzucaniem przeszczepu (139).
Znaczenie chimeryzmu w komórkach NK potwierdził także Baron i współ-pracownicy analizując wyniki badań w grupie 120 osób poddanych allo-SCT. Okazało się, że
niski procent komórek NK dawcy w 14 dobie po allo-SCT związany był ze zwiększonym prawdopodobieństwem odrzucenia przeszczepu, a wcześniejsza konwersja chimeryzmu mieszanego w chimeryzm całkowity poprawiała przeżycie wolne od progresji
choroby (PFS – ang. progression-free survival) (72).
Ocena chimeryzmu w komórkach dendrytycznych
Jak dotąd niewiele prac poświęcono zmianom chimeryzmu komórek dendrytycznych. We krwi obwodowej u ludzi zidentyfikowano dwa typy komórek dendrytycznych: pochodzenia mieloidalnego (DC1), wykazujące ekspresję antygenów CD33,
CD13 i CD11c (po stymulacji TNFα czy CD40L produkujące IL-12) i pochodzenia
limfoidalnego lub plazmatycznego (DC2), bez ekspresji markerów mieloidalnych,
z wysoką ekspresją receptora α dla interleukiny 3 (IL3-Rα) (127). Obecność wspomnianych markerów powierzchniowych umożliwia separację i ocenę chimeryzmu komórek dendrytycznych u osób po allo-SCT (127, 128). Zawartość komórek dendrytycznych we krwi, a także w szpiku jest niska. Z tego powodu wyizolowanie dostatecznej liczby komórek dendrytycznych dla potrzeb oceny chimeryzmu liniowego jest
trudne.
Nachbaurn i współpracownicy stosując eksperymentalną metodę hodowli komórek
jednojądrzastych krwi obwodowej po stymulacji granulocytarno-makrofagowym czynnikiem wzrostu (GM-CSF) w obecności interleukiny 4 i czynnika martwicy nowotworu α (TNFα – ang. tumor necrosis factor α) uzyskali dojrzałe komórki dendrytyczne
pochodzenia monocytarnego (moDCs) o ekspresji: CD40+, CD80+, CD83+, CD86+,
CD1a–, CD14–. Izolacja tych komórek metodą cytometryczną pozwoliła na ocenę chimeryzmu metodą VNTR-PCR, a także na analizę związku pomiędzy stanem chimeryzmu w komórkach moDCs a wznową choroby podstawowej i ryzykiem rozwoju
GvHD. Nachbaurn stwierdził, że w przypadku pacjentów leczonych RIC allo-SCT
mieszany chimeryzm komórek dendrytycznych zwiazany był ze zwiększonym ryzy-
206
kiem wznowy choroby podstawowej, ale także mniejszym ryzykiem rozwoju aGvHD.
W przypadku pacjentów poddanych mieloablacyjnemu allo-SCT chimeryzm całkowity
komórek dendrytycznych wykrywano przez cały okres obserwacji (129).
Chimeryzm w komórkach CD68+
W odtworzeniu hematopoezy po allo-SCT ważną rolę odgrywają także makrofagi,
których identyfikacja jest możliwa za pomocą przeciwciał monoklonalnych antyCD68. Wickenhauser i współpracownicy ocenili związek pomiędzy zmianami chimeryzmu hematopoetycznego w makrofagach a wznową przewlekłej białaczki szpikowej.
Zawartość makrofagów biorcy oceniano techniką XY-FISH w 13 trepanobiopsjach (8
mężczyzn i 5 kobiet). Okazało się, że podczas wznowy przewlekłej białaczki szpikowej ma miejsce wzrost liczby makrofagów biorcy w materiale trepanobiopsyjnym. Fenomen ten korelował ze zmianami chimeryzmu hematopoetycznego w komórkach
mieloidalnych (55).
Chimeryzm płytkowy i megakariocytarny
Jak dotąd pojedyncze badania poświęcone są ocenie chimeryzmu płytkowego
(130) czy megakariocytarnego (128). Chou i współpracownicy opracowali półilościową metodę oceny chimeryzmu w komórkach CD61+ izolowanych metodą cytometryczną z krwi obwodowej. W metodzie tej warunkiem wykonania oznaczeń chimeryzmu płytkowego było nie wykonywanie przetoczeń masy płytkowej przez okres co
najmniej 10–14 dni (130).
W badaniach Eklund i współpracowników megakariocyty (komórki CD61+) ze
szpiku izolowano metodą immunomagnetyczą. Efektywność separacji weryfikowano
poprzez określenie liczby komórek CD41+/GPIIb i oceniono ją na 80–90%. Analizę
chimeryzmu hematopoetycznego przeprowadzono za pomocą PCR. Mała liczebność
grupy badanej (n=13) uniemożliwiła powiązanie wyników chimeryzmu megakariocytarnego ze stanem klinicznym osób badanych. Zaobserwowano jednak istotny związek
przedłużonej trombocytopenii z MC (131).
Inną metodę oceny chimeryzmu megakariocytarnego/płytkowego u chorych
z trombastenią Glanzmanna przedstawiła French ze współpracownikami. Po wyizolowaniu RNA z osocza bogatopłytkowego (PRP – ang. platelet-rich plasma) dokonywano oceny specyficznych dla płytek krwi i megakariocytów polimorficznych sekwencji
dla integryny αIIb za pomocą RFLP (HPA-3). Dwukrotnie wykonane badania metodą
RFLP u chorego z trombastenią Glanzmanna po allo-SCT o zredukowanej intensywności kondycjonowania wykazały heterozygotyczność pacjenta względem HPA-3a/b (chimeryzm mieszany). Autorzy podkreślają, iż udokumentowanie przyjęcia przeszczepionych komórek hematopoetycznych w linii megakariocytarnej może być dowodem na
to, że przeszczepy o zredukowanym kondycjonowaniu mogą być alternatywną metodą
leczenia pacjentów z dysfunkcjami płytkowymi, takimi jak trombastenia Glanzmanna
(81).
Chimeryzm erytroidalny
207
Ocena chimeryzmu erytroidalnego u chorych po allo-SCT jest utrudniona stosowaniem przetoczeń masy erytrocytarnej i stosunkowo długim czasem życia krwinek czerwonych (około 120 dni). W niektórych przypadkach chorób wrodzonych dotyczących
struktury hemoglobiny jest to jednak możliwe w zasadzie bez ograniczeń. I tak, mutacja występująca u osób z anemią sierpowatą spowodowana jest substytucją pojedynczej pary zasad w kodonie 6 genu β-globiny. Pirosekwencjonowanie produktu amplifikacji PCR w tych przypadkach pozwala rozróżnić DNA homozygotycznego biorcy od
heterozygotycznego lub homozygotycznego zdrowego dawcy przeszczepu. Metoda ta
umożliwia także ilościową oceną każdego allelu w próbce badanej. Pirosekwencjonowanie genomowego DNA pozwala na molekularną ocenę chimeryzmu we wszystkich
komórkach jądrzastych krwi obwodowej, natomiast RNA-pirosekwencjonowanie dla
tej samej mutacji umożliwia ocenę chimeryzmu erytroidalnego. Wu i współpracownicy
przedstawili wyniki chimeryzmu RNA dla β-globiny z analizą polimorfizmu STR w
genomowym DNA uzyskanym z mononuklearów krwi obwodowej, wynikami cytogenetyki i elektroforezy hemoglobiny. Analiza ta wykazała, że pomimo niskiego poziomu chimeryzmu mieszanego w leukocytach procent materiału genetycznego dawcy w
erytrocytach był stosunkowo wysoki. Stanowi temu towarzyszyła znamienna poprawa
kliniczna u dwóch osób, u których przeprowadzono niemieloablacyjne przeszczepienie
allogenicznych komórek krwiotwórczych (134).
Chimeryzm w komórkach CD34+
Izolacja komórek CD34+ jest możliwa za pomocą przeciwciał monoklonalnych anty-CD34 i metody cytometrycznej lub immunomagnetycznej.
Pierwsze doniesienia analizujące zmiany stanu chimeryzmu hematopoetycznego
we krwi obwodowej i/lub szpiku w komórkach CD34+ u pacjentów z AML, ALL lub
zespołami mielodysplastycznymi (MDS) wskazały, że ocena chimeryzmu hematopoetycznego w tych komórkach może być przydatna w prognozowaniu wznowy choroby
(106, 133, 134, 147, 148, 149). Opierając się na obserwacji, że antygen CD34 jest
obecny przede wszystkim na powierzchni komórek blastycznych, rozpoczęto ocenę
chimeryzmu hematopoetycznego w populacji CD34+ komórek szpiku i krwi obwodowej. Częstość występowania we krwi obwodowej prawidłowych komórek hematopoetycznych o ekspresji CD34+ mieści się w przedziale od 1/1000 do 1/10000.
Ekspresję antygenu CD34+ potwierdzono w 70% przypadkach komórek białaczkowych. Wykazano także, że ekspresja CD34 zmienia się w czasie trwania choroby oraz
w przypadkach wznowy choroby po allo-SCT. Również selekcja klonu komórek nowotworowych utrudnia monitorowanie choroby resztkowej za pomocą oceny chimeryzmu w komórkach CD34+ (98).
Ocena chimeryzmu liniowego a rodzaj choroby podstawowej
Szybkość podjęcia czynności krwiotwórczych przez przeszczepione komórki hematopoetyczne zależy od choroby, będącej wskazaniem do SCT. W przypadku chorób
208
limfoproliferacyjnych bądź ostrych białaczek szpikowych wykazano tendencję do
szybszej rekonstytucji hematopoezy w limfocytach T, w porównaniu do pacjentów
z MDS czy też CML (72). Obserwacja ta może ułatwić wybór frakcji komórkowej
krwi lub szpiku, w której wykonywane są oznaczenia chimeryzmu liniowego. Należy
zaznaczyć, że badanie chimeryzmu (również liniowego) ma znaczenie nie tylko
w schorzeniach hematopoetycznych. Jest ono także przydatne u chorych z nowotworami litymi (np. rak nerki, płuca, wątroby, jelita) poddanych niemieloablacyjnemu przeszczepieniu allogenicznych komórek krwiotwórczych (148, 150).
PODSUMOWANIE
Rekonstytucja krwiotworzenia w poszczególnych populacjach komórkowych u pacjentów po allo-SCT bez kondycjonowania mieloablacyjnego jest procesem złożonym,
zależnym od wielu czynników, w tym: od rodzaju terapii niemieloablacyjnej, od źródła
komórek krwiotwórczych, metody ich kolekcji (komórki macierzyste szpiku lub z krwi
obwodowej, krew pępowinowa, przeszczepienia o redukowanej liczbie limfocytów T),
ich ilości, wcześniejszej chemioterapii, a także choroby podstawowej będącej wskazaniem do transplantacji (135, 140, 147, 151, 152). Na proces przyjęcia przeszczepu i
stan chimeryzmu wpływa również immunoterapia adoptywna czy rodzaj leczenia immunosupresyjnego (18, 19, 30, 119). Z tych powodów dobór metody oceny chimeryzmu hematopoetycznego, wybór markerów różnicujących dawcę i biorcę, a także częstość wykonywania oznaczeń powinny być indywidualnie dobrane w oparciu o przebieg przeszczepu i stan kliniczny pacjenta.
PIŚMIENNICTWO
1. Ford CE, Hamerton JL, Barnes DW, Loutit. “Cytological identification of radiation-chimeras”.
Nature, 1956; 10(177): 425–424.
2. Giralt S, Estey E, Albitar M, van Besien K, Rondon G, Anderlini P, O'Brien S, Khouri I, Gajewski
J, Mehra R, Claxton D, Andersson B, Beran M, Przepiorka D, Koller C, Kornblau S, Korbling M, Keating
M, Kantarjian H, Champlin R. “Engraftment of allogeneic hematopoietic progenitor cells with purine analog-containing chemotherapy: harnessing graft-versus-leukemia without myeloablative therapy”. Blood.
1997; 89(12): 4531–4536.
3. Spitzer TR. “Nonmyeloablative allogeneic stem cell transplant strategies and the role of mixed chimerism”. Oncologist. 2000; 5(3): 215–223.
4. Sykes M, Preffer F, McAfee S, Saidman SL, Weymouth D, Andrews DM, Colby C, Sackstein R,
Sachs DH, Spitzer TR. “Mixed lymphohaemopoietic chimerism and graft-versus-lymphoma effects after
non-myeloablative therapy and HLA-mismatched bone-marrow transplantation”. Lancet. 1999;
353(9166): 1755–1759.
5. Khouri IF, Keating M, Korbling M, Przepiorka D, Anderlini P, O'Brien S, Giralt S, Ippoliti C, von
Wolff B, Gajewski J, Donato M, Claxton D, Ueno N, Andersson B, Gee A, Champlin R. „Transplant-lite:
induction of graft-versus-malignancy using fludarabine-based nonablative chemotherapy and allogeneic
blood progenitor-cell transplantation as treatment for lymphoid malignancies’. J Clin Oncol. 1998; 16(8):
2817–24.
6. Hellman A, Zaucha JM. “Niemieloablacyjne przeszczepianie komórek krwiotwórczych – współczesny stan wiedzy”. Acta Haematol Pol. 2004; 35 (suplement 1): 153–167.
209
7. Machaczka M, Rucińska M, Skotnicki AB. „Przeszczepianie allogenicznych komórek hematopoetycznych z zastosowaniem niemieloablacyjnego leczenia kondycjonujacego: minitransplantacja”. Przegl
Lek. 1999; 56(10): 633–637.
8. Champlin R, Khouri I, Shimoni A, Gajewski J, Kornblau S, Molldrem J, Ueno N, Giralt S, Ander lini P. “Harnessing graft-versus-malignancy: non-myeloablative preparative regimens for allogeneic haematopoietic transplantation, an evolving strategy for adoptive immunotherapy”. Br J Haematol. 2000;
111(1): 18–29.
9. Banna GL, Aversa S, Sileni VC, Favaretto A, Ghiotto C, Monfardini S. “Nonmyeloablative allogeneic stem cell transplantation (NST) after truly nonmyeloablative and reduced intensity conditioning regimens”. Crit Rev Oncol Hematol. 2004; 51(3): 171–89.
10. Anagnostopoulos A, Giralt S. “Critical review on non-myeloablative stem cell transplantation
(NST)”. Crit Rev Oncol Hematol. 2002; 44(2): 175–90.
11. Anagnostopoulos A, Giralt S. “Critical review on non-myeloablative stem cell transplantation
(NST)”. Crit Rev Oncol Hematol. 2002; 44(2): 175–90.
12. Delis S, Ciancio G, Burke GW 3rd, Garcia-Morales R, Miller J. “Donor bone marrow transplantation: chimerism and tolerance”. Transpl Immunol. 2004; 13(2): 105–1.
13. Haddad N, Rowe JM. „Current indications for reduced-intensity allogeneic stem cell transplantation”. Best Pract Res Clin Haematol. 2004; 17(3): 377–386.
14. Khan F, Agarwal A, Agrawal S. “Significance of chimerism in hematopoietic stem cell transplantation: new variations on an old theme”. Bone Marrow Transplant. 2004; 34(1): 1–12.
15. McCann SR, Lawler M. “Monitoring outcome: MRD, chimaerism and relapse”. The EBMT
Handbook, 2004; 13: 197–200.
16. McCann SR, Crampe M, Molloy K, Lawler M. “Hemopoietic chimerism following stem cell
transplantation”. Transfus Apher Sci. 2005; 32(1): 55–61.
17. Storb RF, Champlin R, Riddell SR, Murata M, Bryant S, Warren EH. ‘Non-myeloablative transplants for malignant disease”. Hematology (Am Soc Hematol Educ Program). 2001: 375–91.
18. Maloney DG, Sandmaier BM, Mackinnon S, Shizuru JA. “Non-myeloablative transplantation”.
Hematology (Am Soc Hematol Educ Program). 2002; 392–421.
19. Sykes M, Sachs DH. “Mixed chimerism”. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2001;
356(1409): 707–726.
20. Battiwalla M, Barrett J. Allogeneic transplantation using non-myeloablative transplant regimens.
Best Pract Res Clin Haematol. 2001;14(4):701–722.
21. Kolb HJ, Schmid C, Barrett AJ, Schendel DJ. “Graft-versus-leukemia reactions in allogeneic
chimeras“. Blood. 2004; 103(3): 767–76.
22. Peggs KS, Mackinnon S. “Exploiting graft-versus-tumour responses using donor leukocyte infusions”. Best Pract Res Clin Haematol. 2001; 14(4): 723–739.
23. Couriel DR, Saliba RM, Giralt S, Khouri I, Andersson B, de Lima M, Hosing C, Anderlini P,
Donato M, Cleary K, Gajewski J, Neumann J, Ippoliti C, Rondon G, Cohen A, Champlin R. „ Acute and
chronic graft-versus-host disease after ablative and nonmyeloablative conditioning for allogeneic hematopoietic transplantation”. Biol Blood Marrow Transplant. 2004; 10(3): 178–185.
24. Lee SJ, Vogelsang G, Flowers ME. “Chronic graft-versus-host disease”. Biol Blood Marrow
Transplant. 2003; 9(4): 215–233.
25. Bryant E, Martin PJ. “Documentation of Engraftment and Characterization of Chimerism Following Hematopoietic Cell Transplantation”. Thomas’Hematopoietic Cell Transplantation, Oxford, UK:
Blackwell Publishin; 2004: 234–239.
26. Jaksch M, Uzunel M, Remberger M, Sundberg B, Mattsson J. “Molecular monitoring of T-cell
chimerism early after allogeneic stem cell transplantation may predict the occurrence of acute GVHD
grades II-IV”. Clin Transplant. 2005; 19(3): 346–349.
27. Antin JH, Childs R, Filipovich AH, Giralt S, Mackinnon S, Spitzer T, Weisdorf D. “Establishment of complete and mixed donor chimerism after allogeneic lymphohematopoietic transplantation: recommendations from a workshop at the 2001 Tandem Meetings of the International Bone Marrow Trans-
210
plant Registry and the American Society of Blood and Marrow Transplantation”. Biol Blood Marrow
Transplant. 200; 7(9): 473–485.
28. Bader P, Kreyenberg H, Hoelle W, Dueckers G, Kremens B, Dilloo D, Sykora KW, Niemeyer
C, Reinhardt D, Vormoor J, Gruhn B, Lang P, Greil J, Handgretinger R, Niethammer D, Klingebiel T,
Beck JF. “Increasing mixed chimerism defines a high-risk group of childhood acute myelogenous leukemia patients after allogeneic stem cell transplantation where pre-emptive immunotherapy may be effective”. Bone Marrow Transplant. 2004; 33(8): 815–21.
29. Bader P, Kreyenberg H, Hoelle W, Dueckers G, Handgretinger R, Lang P, Kremens B, Dilloo D,
Sykora KW, Schrappe M, Niemeyer C, Von Stackelberg A, Gruhn B, Henze G, Greil J, Niethammer D,
Dietz K, Beck JF, Klingebiel T. “Increasing mixed chimerism is an important prognostic factor for unfavorable outcome in children with acute lymphoblastic leukemia after allogeneic stem-cell transplantation:
possible role for pre-emptive immunotherapy?” J Clin Oncol. 2004 May 1; 22(9): 1696–705.
30. Dey BR, McAfee S, Colby C, Sackstein R, Saidman S, Tarbell N, Sachs DH, Sykes M, Spitzer
TR. „Impact of prophylactic donor leukocyte infusions on mixed chimerism, graft-versus-host disease, and
antitumor response in patients with advanced hematologic malignancies treated with nonmyeloablative
conditioning and allogeneic bone marrow transplantation”. Biol Blood Marrow Transplant. 2003; 9(5):
320–329.
31. Massenkeil G, Nagy M, Lawang M, Rosen O, Genvresse I, Geserick G, Dorken B, Arnold R.
„Reduced intensity conditioning and prophylactic DLI can cure patients with high-risk acute leukaemias if
complete donor chimerism can be achieved”. Bone Marrow Transplant. 2003; 31(5): 339–345.
32. Bader P, Niethammer D, Willasch A, Kreyenberg H, Klingebiel T. „How and when should we
monitor chimerism after allogeneic stem cell transplantation?” Bone Marrow Transplant. 2005; 35(2):
107–119.
33. Bader P, Holle W, Klingebiel T, Handgretinger R, Benda N, Schlegel PG, Niethammer D, Beck
J. „Mixed hematopoietic chimerism after allogeneic bone marrow transplantation: the impact of quantitative PCR analysis for prediction of relapse and graft rejection in children”. Bone Marrow Transplant. 1997;
19(7): 697–702.
34. Bader P, Beck J, Frey A, Schlegel PG, Hebarth H, Handgretinger R, Einsele H, Nieme yer C,
Benda N, Faul C, Kanz L, Niethammer D, Klingebiel T. „Serial and quantitative analysis of mixed hematopoietic chimerism by PCR in patients with acute leukemias allows the prediction of relapse after allogeneic BMT”. Bone Marrow Transplant. 1998; 21(5): 487–495.
35. Formankova R, Honzatkova L, Moravcova J, Sieglova Z, Dvorakova R, Nadvornikova S, Vitek
A, Lukasova M, Stary J, Brdicka R. “Prediction and reversion of post-transplant relapse in patients with
chronic myeloid leukemia using mixed chimerism and residual disease detection and adoptive immunotherapy”. Leuk Res. 2000; 24(4): 339–347.
36. Jółkowska J, Witt M. „Chimeryzm komórkowy po transplantacji szpiku kostnego”. Acta Haematol Pol. 2004; 35(3): 321–328.
37. Zeiser R, Spyridonidis A, Wasch R, Ihorst G, Grullich C, Bertz H, Finke J. „Evaluation of immunomodulatory treatment based on conventional and lineage-specific chimerism analysis in patients with
myeloid malignancies after myeloablative allogeneic hematopoietic cell transplantation”. Leukemia. 2005;
19(5): 814–21.
38. Hendriks EC, de Man AJ, van Berkel YC, Stienstra S, de Witte T. “Flow cytometric method for
the routine follow-up of red cell populations after bone marrow transplantation”. Br J Haematol. 1997;
97(1): 141–145.
39. Schaap N, Schattenberg A, Bar B, Mensink E, de Man A, Geurts van Kessel A, de Witte T. „Red
blood cell phenotyping is a sensitive technique for monitoring chronic myeloid leukaemia patients after Tcell-depleted bone marrow transplantation and after donor leucocyte infusion”. Br J Haematol. 2000;
108(1): 116–125.
40. Schaap N, Schattenberg A, Mensink E, Preijers F, Hillegers M, Knops R, Pennings A, Boezeman J, Geurts van Kessel A, de Pauw B, de Witte T. „Long-term follow-up of persisting mixed chimerism
after partially T cell-depleted allogeneic stem cell transplantation”. Leukemia. 2002; 16(1): 13–21.
211
41. Offit K, Burns JP, Cunningham I, Jhanwar SC, Black P, Kernan NA, O'Reilly RJ, Chaganti RS.
“Cytogenetic analysis of chimerism and leukemia relapse in chronic myelogenous leukemia patients after
T cell-depleted bone marrow transplantation”. Blood. 1990; 75(6): 1346–1355.
42. Shimoni A, Nagler A. Non-myeloablative stem cell transplantation (NST): chimerism testing as
guidance for immune-therapeutic manipulations. Leukemia. 2001; 15(12): 1967–1975.
43. Seong D, Giralt S, Fischer H, Hayes K, Glassman A, Arlinghaus R, Xu J, Kantarjian H, Siciliano
M, Champlin R. Usefulness of detection of minimal residual disease by 'hypermetaphase' fluorescent in
situ hybridization after allogeneic BMT for chronic myelogenous leukemia. Bone Marrow Transplant.
1997; 19(6): 565–570.
44. Seong CM, Giralt S, Kantarjian H, Xu J, Swantkowski J, Hayes K, Glassman AB, Khouri I,
Korbling M, Thall P, Siciliano MJ, Champlin RE. “Early detection of relapse by hypermetaphase fluorescence in situ hybridization after allogeneic bone marrow transplantation for chronic myeloid leukemia”. J
Clin Oncol. 2000; 18(9): 1831–1836.
45. Lamba R, Abella E, Kukuruga D, Klein J, Savasan S, Abidi MH, Mohamed A, Peres E. “Mixed
hematopoietic chimerism at day 90 following allogenic myeloablative stem cell transplantation is a predictor of relapse and survival”. Leukemia. 2004; 18(10): 1681–1686.
46. van Tol MJ, Langlois van den Bergh R, Mesker W, Ouwerkerk-van Velzen MC, Vossen JM,
Tanke HJ. ‚Simultaneous detection of X and Y chromosomes by two-colour fluorescence in situ hybridization in combination with immunophenotyping of single cells to document chimaerism after sex-mismatched bone marrow transplantation”. Bone Marrow Transplant. 1998; 21(5): 497–503.
47. Thiede C, Bornhauser M, Ehninger G. „Strategies and clinical implications of chimerism diagnostics after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation”. Acta Haematol. 2004; 112(1-2): 16–23
48. Choi SJ, Lee KH, Lee JH, Kim S, Chung HJ, Lee JS, Kim SH, Park CJ, Chi HS, Kim WK. “Prognostic value of hematopoietic chimerism in patients with acute leukemia after allogeneic bone marrow
transplantation: a prospective study”. Bone Marrow Transplant. 2000; 26(3): 327–332.
49. Elmaagacli AH, Becks HW, Beelen DW, Stockova J, Butzler R, Opalka B, Schaefer UW. „Detection of minimal residual disease and persistence of host-type hematopoiesis: a study in 28 patients after
sex-mismatched, non-T cell-depleted allogeneic bone marrow transplantation for Philadelphia-chromosome positive chronic myelogenous leukemia”. Bone Marrow Transplant. 1995; 16(6): 823–829.
50. Gerritsen WR, Jagiello CA, Bourhis JH. “Detection of chimerism in subpopulations of cells by
fluorescence in situ hybridization and immunofluorescent staining of cell surface antigens”. Bone Marrow
Transplant. 1994; 13(4): 441–447.
51. Kogler G, Wolf HH, Heyll A, Arkesteijn G, Wernet P. “Detection of mixed chimerism and leukemic relapse after allogeneic bone marrow transplantation in subpopulations of leucocytes by fluorescent
in situ hybridization in combination with the simultaneous immunophenotypic analysis of interphase
cells”. Bone Marrow Transplant. 1995; 15(1): 41–48.
52. Weber-Matthiesen K, Winkemann M, Muller-Hermelink A, Schlegelberger B, Grote W. „Simultaneous fluorescence immunophenotyping and interphase cytogenetics: a contribution to the characterization of tumor cells”. J Histochem Cytochem. 1992; 40(2): 171–175.
53. Martin-Subero JI, Chudoba I, Harder L, Gesk S, Grote W, Novo FJ, Calasanz MJ, Siebert R.
“Multicolor-FICTION: expanding the possibilities of combined morphologic, immunophenotypic, and genetic single cell analyses”. Am J Pathol. 2002; 161(2): 413–420.
54. Teerenhovi L, Knuutila S, Ekblom M, Rossi L, Borgstrom GH, Tallman JK, Andersson L, de la
Chapelle A. “A method for simultaneous study of the karyotype, morphology, and immunologic phenotype of mitotic cells in hematologic malignancies”. Blood. 1984; 64(5): 1116–1122.
55. Wickenhauser C, Thiele J, Perez F, Varus E, Stoffel MS, Kvasnicka HM, Beelen DW, Schaefer
UW. „Mixed chimerism of the resident macrophage population after allogeneic bone marrow transplantation for chronic myeloid leukemia“. Transplantation. 2002; 73(1): 104–111.
56. Rinehart FP, Deininger PL, Schmid CW. “A critical examination of possible fractionations of
hcuman DNA according to base composition”. Biochim Biophys Acta. 1978; 520(1): 21–37.
212
57. Tilanus MG. “Short tandem repeat markers in diagnostics: what's in a repeat?” Leukemia. 2006;
20(8): 1353–1355
58. Acquaviva C, Duval M, Mirebeau D, Bertin R, Cave H. “Quantitative analysis of chimerism
after allogeneic stem cell transplantation by PCR amplification of microsatellite markers and capillary
electrophoresis with fluorescence detection: the Paris-Robert Debre experience”. Leukemia. 2003; 17(1):
241–246.
59. Chalandon Y, Vischer S, Helg C, Chapuis B, Roosnek E. “Quantitative analysis of chimerism
after allogeneic stem cell transplantation by PCR amplification of microsatellite markers and capillary
electrophoresis with fluorescence detection: the Geneva experience”. Leukemia. 2003; 17(1): 228–231.
60. Hancock JP, Goulden NJ, Oakhill A, Steward CG. „Quantitative analysis of chimerism after allogeneic bone marrow transplantation using immunomagnetic selection and fluorescent microsatellite
PCR”. Leukemia. 2003; 17(1): 247–251.
61. Koehl U, Beck O, Esser R, Seifried E, Klingebiel T, Schwabe D, Seidl C. „Quantitative analysis
of chimerism after allogeneic stem cell transplantation by PCR amplification of microsatellite markers and
capillary electrophoresis with fluorescence detection: the Frankfurt experience”. Leukemia. 2003; 17(1):
232–236.
62. Pindolia K, Janakiraman N, Kasten-Sportes C, Demanet C, Van Waeyenberge C, Pals G, Worsham MJ. „Enhanced assessment of allogeneic bone marrow transplant engraftment using automated
fluorescent-based typing”. Bone Marrow Transplant. 1999; 24(11): 1235–1241.
63. Schraml E, Lion T. “Interference of dye-associated fluorescence signals with quantitative analysis of chimerism by capillary electrophoresis”. Leukemia. 2003; 17(1): 221–223.
64. Kristt D, Israeli M, Narinski R, Or H, Yaniv I, Stein J, Klein T. „Hematopoietic chimerism monitoring based on STRs: quantitative platform performance on sequential samples”. J Biomol Tech. 2005;
16(4): 380–391.
65. Bieniaszewska M, Balon J, Hałaburda K, Reichert M, Piekarska A, Pawłowski R, Hellmann A.
„Kliniczne znaczenie wczesnego, całkowitego chimeryzmu po allogenicznej transplantacji komórek macierzystych hematopoezy”. Acta Haematol Pol. 2004; 35(2): 217–225.
66. Jólkowska J, Pieczonka A, Strabel T, Boruczkowski D, Wachowiak J, Bader P, Witt M. „Hematopoietic chimerism after allogeneic stem cell transplantation: a comparison of quantitative analysis by
automated DNA sizing and fluorescent in situ hybridization”. BMC Blood Disord. 2005; 5(1): 1.
67. Trzyna E, Ratajczak MZ. „Przegląd metod stosowanych w monitorowaniu chimeryzmu po alloprzeszczepach ze szczególnym uwzględnieniem technik molekularnych”. Acta Haematol Pol. 2004; 35(1):
27–41.
68. Sellathamby S, Balasubramanian P, Sivalingam S, Shaji RV, Mathews V, George B,
Viswabandya A, Srivastava A, Chandy M. “Developing an algorithm of informative markers for evaluation of chimerism after allogeneic bone marrow transplantation”. Bone Marrow Transplant. 2006; 37(8):
751–755.
69. Miura Y, Tanaka J, Toubai T, Tsutsumi Y, Kato N, Hirate D, Kaji M, Sugita J, Shig ematsu A,
Iwao N, Ota S, Masauzi N, Fukuhara T, Kasai M, Asaka M, Imamura M. “Analysis of donor-type chimerism in lineage-specific cell populations after allogeneic myeloablative and non-myeloablative stem cell
transplantation”. Bone Marrow Transplant. 2006; 37(9): 837–843
70. Lion T, Watzinger F. “Chimerism analysis following nonmyeloablative stem cell transplantation”. Methods Mol Med. 2006; 125: 275–229.
71. Thiede C, Bornhauser M, Ehninger G. „Evaluation of STR informativity for chimerism testing-comparative analysis of 27 STR systems in 203 matched related donor recipient pairs”. Leukemia. 2004;
18(2): 248–254.
72. Baron F, Baker JE, Storb R, Gooley TA, Sandmaier BM, Maris MB, Maloney DG, Heimfeld S,
Oparin D, Zellmer E, Radich JP, Grumet FC, Blume KG, Chauncey TR, Little MT. “Kinetics of engraftment in patients with hematologic malignancies given allogeneic hematopoietic cell transplantation after
nonmyeloablative conditioning”. Blood. 2004; 104(8): 2254–2262.
213
73. Lion T. “Summary: reports on quantitative analysis of chimerism after allogeneic stem cell
transplantation by PCR amplification of microsatellite markers and capillary electrophoresis with fluorescence detection”. Leukemia. 2003;17(1):252-4
74. . Nollet F, Billiet J, Selleslag D, Criel A. “Standardisation of multiplex fluorescent short tandem
repeat analysis for chimerism testing”. Bone Marrow Transplant. 2001; 28(5): 511–518.
75. Wilhelm J, Reuter H, Tews B, Pingoud A, Hahn M. “Detection and quantification of
insertion/deletion variations by allele-specific real-time PCR: application for genotyping and chimerism
analysis”. Biol Chem. 2002; 383(9): 1423–1433.
76. Buno I, Lopez-Fernandez C, Fernandez JL, Llamas P, Diez-Martin JL, Gosalvez J. „ Improving
chimaerism quantification in bone marrow transplant recipients by image processing and analysis after restriction endonuclease in situ digestion (IPA-REISD)”. Leukemia. 1996; 10(7): 1232–1236.
77. Buno I, Diez-Martin JL, Lopez-Fernandez C, Fernandez JL, Gosavez J. “Polymorphisms for the
size of heterochromatic regions allow sex-independent quantification of post-BMT chimerism targeting
metaphase and interphase cells”. Haematologica 1999; 84: 138–141.
78. Diez-Martin JL, Buno I, Lopez-Fernandez C, Fernandez MN, Polo N, Gosalvez J. „ Restriction
endonuclease in situ digestion (REISD): a novel quantitative sex-independent method to analyze chimerism after bone marrow transplantation”. Exp Hematol. 1996; 24(11): 1333–1339.
79. Gosalvez J, Lopez-Fernandez C, Buno I, Polo N, Llamas P, Fernandez MN, Fernandez JL, DiezMartin JL. „Restriction endonuclease in situ digestion (REISD) and fluorescence in situ hybridization
(FISH) as complementary methods to analyze chimerism and residual disease after bone marrow transplantation”. Cancer Genet Cytogenet. 1996; 89(2): 141-145.
80. Blazar BR, Orr HT, Arthur DC, Kersey JH, Filipovich AH. “Restriction fragment length polymorphisms as markers of engraftment in allogeneic marrow transplantation”. Blood. 1985; 66(6): 1436–
1444
81. French DL, Fruchtman S, Mitchell WB, Coller BS, Peretz H. “Evidence for megakaryocyte engraftment following reduced-intensity conditioning”. Exp Hematol. 2004; 32(9): 877–880.
82. Leclair B, Fregeau CJ, Aye MT, Fourney RM. “DNA typing for bone marrow engraftment follow-up after allogeneic transplant: a comparative study of current technologies”. Bone Marrow Transplant.
1995; 16(1): 43–55.
83. Schwartz DW, Glock B, Jungl EM, Mayr WR. „Strategy to detect chimerism in allogeneic bone
marrow transplant recipients by PCR-amplification fragment length polymorphism analysis of microsatellite polymorphisms”. Vox Sang. 1995; 68(2): 139–143.
84. Suttorp M, Schmitz N, Dreger P, Schaub J, Loffler H. „Monitoring of chimerism after allogeneic
bone marrow transplantation with unmanipulated marrow by use of DNA polymorphisms”. Leukemia.
1993; 7(5): 679–87.
85. Ugozzoli L, Yam P, Petz LD, Ferrara GB, Champlin RE, Forman SJ, Koyal D, Wallace RB.
“Amplification by the polymerase chain reaction of hypervariable regions of the human genome for evaluation of chimerism after bone marrow transplantation”. Blood. 1991; 77(7): 1607–1615.
86. Yamazaki S, Takahashi H, Fujii H, Miyamae T, Mori M, Fujioka K, Funabiki T, Yokota S, Arai
N, Ikuta K. “Split chimerism after allogeneic bone marrow transplantation in Chediak-Higashi syndrome”.
Bone Marrow Transplant. 2003;31(2):137-40.
87. Lo YM, Patel P, Newton CR, Markham AF, Fleming KA, Wainscoat JS. “Direct haplotype determination by double ARMS: specificity, sensitivity and genetic applications”. Nucleic Acids Res. 1991;
19(13): 3561–3567.
88. Lo YM, Roux E, Jeannet M, Chapuis B, Fleming KA, Wainscoat JS. “Detection of chimaerism
after bone marrow transplantation using the double amplification refractory mutation system”. Br J Haematol. 1993; 85(1): 223–226.
89. Au WY, Chan EC, Lie AK, Liang R, Leung AY, Ma SK, Kwong YL. „Poor engraftment after
allogeneic bone marrow transplantation: role of chimerism analysis in treatment and outcome”. Ann Hematol. 2003; 82(7): 410-5.
214
90. Bader P, Klingebiel T, Schaudt A, Theurer-Mainka U, Handgretinger R, Lang P, Niethammer
D, Beck JF. „Prevention of relapse in pediatric patients with acute leukemias and MDS after allogeneic
SCT by early immunotherapy initiated on the basis of increasing mixed chimerism: a single center experience of 12 children”. Leukemia. 1999; 13(12): 2079–2086.
91. Bader P, Kreyenberg H. “Analysis of chimerism after stem cell transplantation”. Methods Mol
Med. 2004; 91: 247–264.
92. Barrios M, Jimenez-Velasco A, Roman-Gomez J, Madrigal ME, Castillejo JA, Torres A, Heini ger A. “Chimerism status is a useful predictor of relapse after allogeneic stem cell transplantation for acute
leukemia”. Haematologica. 2003; 88(7): 801–810.
93. Baron F, Little MT, Storb R. “Kinetics of engraftment following allogeneic hematopoietic cell
transplantation with reduced-intensity or nonmyeloablative conditioning”. Blood Rev. 2005; 19(3): 153–
164.
94. Elmaagacli AH. „Real-time PCR for monitoring minimal residual disease and chimerism in patients after allogeneic transplantation”. Int J Hematol. 2002; 76 Suppl 2: 204–205.
95. Jimenez-Velasco A, Barrios M, Roman-Gomez J, Navarro G, Buno I, Castillejo JA, Rodr iguez
AI, Garcia-Gemar G, Torres A, Heiniger AI. “Reliable quantification of hematopoietic chimerism after allogeneic transplantation for acute leukemia using amplification by real-time PCR of null alleles and insertion/deletion polymorphisms”. Leukemia. 2005; 19(3): 336–343.
96. Maas F, Schaap N, Kolen S, Zoetbrood A, Buno I, Dolstra H, de Witte T, Schatte nberg A, van
de Wiel-van Kemenade E. „Quantification of donor and recipient hemopoietic cells by real-time PCR of
single nucleotide polymorphisms”. Leukemia. 2003; 17(3): 621–629.
97. Alizadeh M, Bernard M, Danic B, Dauriac C, Birebent B, Lapart C, Lamy T, Le Prise PY, Beauplet A, Bories D, Semana G, Quelvennec E. “Quantitative assessment of hematopoietic chimerism after
bone marrow transplantation by real-time quantitative polymerase chain reaction”. Blood. 2002; 99(12):
4618–4625.
98. Thiede C. “Diagnostic chimerism analysis after allogeneic stem cell transplantation: new methods and markers”. Am J Pharmacogenomics. 2004; 4(3): 177–187.
99. Fredriksson M, Barbany G, Liljedahl U, Hermanson M, Kataja M, Syvanen AC. „Assessing
hematopoietic chimerism after allogeneic stem cell transplantation by multiplexed SNP genotyping using
microarrays and quantitative analysis of SNP alleles”. Leukemia. 2004; 18(2): 255–266.
100.
Hochberg EP, Miklos DB, Neuberg D, Eichner DA, McLaughlin SF, Mattes-Ritz A,
Alyea EP, Antin JH, Soiffer RJ, Ritz J. „A novel rapid single nucleotide polymorphism (SNP)-based
method for assessment of hematopoietic chimerism after allogeneic stem cell transplantation”. Blood.
2003; 101(1): 363–369.
101.
Thiede C, Kellermann T, Schwerdtfeger R, Baurmann H, Steudel C, Ehninger G,
Bornhauser M. “Real-time PCR the SRY-gene allows sensitive and quantitative chimerism analysis after
allogeneic blood stem cell transplantation: Clinical results in 43 patients”. (abstract) Bone Marrow Transplant, 2003; 31: S23–A181.
102.
Wilhelm J, Pingoud A. “Real-time polymerase chain reaction”. Chembiochem. 2003;
4(11): 1120-8.
103.
Eshel R, Vainas O, Shpringer M, Naparstek E. “Highly sensitive patient-specific realtime PCR SNP assay for chimerism monitoring after allogeneic stem cell transplantation”. Lab Hematol.
2006; 12(1): 39–46.
104.
Dubovsky J, Daxberger H, Fritsch G, Printz D, Peters C, Matthes S, Gadner H, Lion T,
Muller-Berat N. „Kinetics of chimerism during the early post-transplant period in pediatric patients with
malignant and non-malignant hematologic disorders: implications for timely detection of engraftment,
graft failure and rejection”. Leukemia. 1999; 13(12): 2059, 2060–9.
105.
Bader P, Stoll K, Huber S, Geiselhart A, Handgretinger R, Niemeyer C, Einsele H,
Schlegel PG, Niethammer D, Beck J, Klingebiel T. „Characterization of lineage-specific chimaerism in
patients with acute leukaemia and myelodysplastic syndrome after allogeneic stem cell transplantation before and after relapse”. Br J Haematol. 2000; 108(4): 761–768
215
106.
Thiede C, Bornhauser M, Oelschlagel U, Brendel C, Leo R, Daxberger H, Mohr B,
Florek M, Kroschinsky F, Geissler G, Naumann R, Ritter M, Prange-Krex G, Lion T, Neubauer A,
Ehninger G. “Sequential monitoring of chimerism and detection of minimal residual disease after allogeneic blood stem cell transplantation (BSCT) using multiplex PCR amplification of short tandem repeatmarkers”. Leukemia. 2001; 15(2): 293–302.
107.
Cowland JB, Borregaard N. „Isolation of neutrophil precursors from bone marrow for
biochemical and transcriptional analysis”. J Immunol Methods. 1999; 232(1-2): 191–200.
108.
Pertoft H. “Fractionation of cells and subcellular particles with Percoll”. J Biochem
Biophys Methods. 2000; 44(1-2): 1–30.
109.
Wognum AW, Eaves AC, Thomas TE. “Identification and isolation of hematopoietic
stem cells”. Arch Med Res. 2003; 34(6): 461–475.
110.
Perez-Simon JA, Caballero D, Diez-Campelo M, Lopez-Perez R, Mateos G, Canizo C,
Vazquez L, Vidriales B, Mateos MV, Gonzalez M, San Miguel JF. „Chimerism and minimal residual disease monitoring after reduced intensity conditioning (RIC) allogeneic transplantation”. Leukemia. 2002;
16(8): 1423–1431.
111.
Thiede C, Bornhauser M, Oelschlagel U, Brendel C, Leo R, Daxberger H, Mohr B,
Florek M, Kroschinsky F, Geissler G, Naumann R, Ritter M, Prange-Krex G, Lion T, Neubauer A,
Ehninger G. “Sequential monitoring of chimerism and detection of minimal residual disease after allogeneic blood stem cell transplantation (BSCT) using multiplex PCR amplification of short tandem repeatmarkers”. Leukemia. 2001; 15(2): 293–302.
112.
Lamb LS Jr, Robbins NF, Abhyankar S, Joyce M, Stetler-Stevenson M, HensleeDowney PJ, Gee AP. “Flow cytometric cell sorting combined with molecular chimerism analysis to detect
minimal recurrent leukemia: good news and bad news”. Bone Marrow Transplant. 1997; 19(11): 1157–
1161.
113.
van Leeuwen JE, van Tol MJ, Joosten AM, Schellekens PT, van den Bergh RL,
Waaijer JL, Oudeman-Gruber NJ, van der Weijden-Ragas CP, Roos MT, Gerritsen EJ, van der Berg H,
Haraldsson A, Khan P, Vossen J. “Relationship between patterns of engraftment in peripheral blood and
immune reconstitution after allogeneic bone marrow transplantation for (severe) combined immunodeficiency”. Blood. 1994; 84(11): 3936–3947.
114.
Metes D, Logar A, Rudert WA, Zeevi A, Woodward J, Demetris AJ, Abu-Elmagd K,
Eghtesad B, Shapiro R, Fung JJ, Trucco M, Starzl TE, Murase N. “Four-color flow cytometric analysis of
peripheral blood donor cell chimerism”. Hum Immunol. 2003; 64(8): 787–795.
115.
Sykes M, Preffer F, McAfee S, Saidman SL, Weymouth D, Andrews DM, Colby C,
Sackstein R, Sachs DH, Spitzer TR. “Mixed lymphohaemopoietic chimerism and graft-versus-lymphoma
effects after non-myeloablative therapy and HLA-mismatched bone-marrow transplantation”. Lancet.
1999; 353(9166): 1755–1759.
116.
Winiarski J, Gustafsson A, Wester D, Dalianis T. “Follow-up of chimerism, including
T- and B-lymphocytes and granulocytes in children more than one year after allogeneic bone marrow
transplantation”. Pediatr Transplant. 2000; 4(2): 132–139.
117.
Bornhauser M, Thiede C, Platzbecker U, Jenke A, Helwig A, Plettig R, Freiberg-Richter J, Rollig C, Geissler G, Lutterbeck K, Oelschlagel U, Ehninger G. „Dose-reduced conditioning and allogeneic hematopoietic stem cell transplantation from unrelated donors in 42 patients”. Clin Cancer Res.
2001; 7(8): 2254–2262.
118.
Haddad E, Le Deist F, Aucouturier P, Cavazzana-Calvo M, Blanche S, De Saint Basile
G, Fischer A. “Long-term chimerism and B-cell function after bone marrow transplantation in patients
with severe combined immunodeficiency with B cells: A single-center study of 22 patients”. Blood. 1999;
94(8): 2923–2930.
119. Maris M, Boeckh M, Storer B, Dawson M, White K, Keng M, Sandmaier B, Maloney D, Storb
R, Storek J. “Immunologic recovery after hematopoietic cell transplantation with nonmyeloablative conditioning”. Exp Hematol. 2003; 31(10): 941–952.
216
120. Childs R, Clave E, Contentin N, Jayasekera D, Hensel N, Leitman S, Read EJ, Carter C, Bahceci
E, Young NS, Barrett AJ. „Engraftment kinetics after nonmyeloablative allogeneic peripheral blood stem
cell transplantation: full donor T-cell chimerism precedes alloimmune responses”. Blood. 1999; 94(9):
3234–3241.
121.
Mattsson J, Uzunel M, Remberger M, Ringden O. “T cell mixed chimerism is significantly correlated to a decreased risk of acute graft-versus-host disease after allogeneic stem cell transplantation”. Transplantation. 2001; 71(3): 433–439.
122. Mattsson J, Uzunel M, Tammik L, Aschan J, Ringden O. ‘Leukemia lineage-specific chimerism
analysis is a sensitive predictor of relapse in patients with acute myeloid leukemia and myelodysplastic
syndrome after allogeneic stem cell transplantation”. Leukemia. 2001; 15(12): 1976–1985.
123. Maury S, Jouault H, Kuentz M, Vernant JP, Tulliez M, Cordonnier C, Bories D. “Chimerism
analysis by lineage-specific fluorescent polymerase chain reaction in secondary graft failure after allogeneic stem cell transplantation”. Transplantation. 2001; 71(3): 374–380.
124.
Uzunel M, Mattsson J, Brune M, Johansson JE, Aschan J, Ringden O. “Kinetics of
minimal residual disease and chimerism in patients with chronic myeloid leukemia after nonmyeloablative
conditioning and allogeneic stem cell transplantation”. Blood. 2003; 101(2): 469–472.
125. Valcarcel D, Martino R, Caballero D, Mateos MV, Perez-Simon JA, Canals C, Fernandez F,
Bargay J, Muniz-Diaz E, Gonzalez M, San Miguel JF, Sierra J. „Chimerism analysis following allogeneic
peripheral blood stem cell transplantation with reduced-intensity conditioning”. Bone Marrow Transplant.
2003; 31(5): 387–392.
126. Zetterquist H, Mattsson J, Uzunel M, Nasman-Bjork I, Svenberg P, Tammik L, Bayat G, Winiarski J, Ringden O. “Mixed chimerism in the B cell lineage is a rapid and sensitive indicator of minimal residual disease in bone marrow transplant recipients with pre-B cell acute lymphoblastic leukemia”. Bone
Marrow Transplant. 2000;25(8):843-51
127. Porta MD, Rigolin GM, Alessandrino EP, Maiocchi M, Malcovati L, Vanelli L, Barate C, Rumi
E, Ciccone M, Cuneo A, Lazzarino M, Castoldi G. „Dendritic cell recovery after allogeneic stem-cell
transplantation in acute leukemia: correlations with clinical and transplant characteristics”. Eur J Haematol. 2004; 72(1): 18–25.
128. Auffermann-Gretzinger S, Lossos IS, Vayntrub TA, Leong W, Grumet FC, Blume KG, StockerlGoldstein KE, Levy R, Shizuru JA. “Rapid establishment of dendritic cell chimerism in allogeneic hematopoietic cell transplant recipients”. Blood. 2002; 99(4): 1442–1448.
129. Nachbaur D, Kircher B, Eisendle K, Latzer K, Haun M, Gastl G. „Phenotype, function and chimaerism of monocyte-derived blood dendritic cells after allogeneic haematopoietic stem cell transplantation”. Br J Haematol. 2003; 123(1): 119–126.
130. Chou PM, Olszewski M, Huang W, Silva M, Kletzel M. “Platelet chimerism by polymerase
chain reaction (PCR) utilizing variable number of tandem repeats (VNTR) in allogeneic stem cell transplant in children: a new novel approach to full chimerism analysis” Bone Marrow Transplant. 2003; 32(8):
825–828.
131. Eklund O, Dalianis T, Wester D, Winiarski J. “Megakaryocyte chimerism after allogeneic stem
cell transplantation in children”. Pediatr Transplant. 2003; 7(1): 31–37.
132. Wu CJ, Hochberg EP, Rogers SA, Kutok JL, Biernacki M, Nascimento AF, Marks P, Bridges K,
Ritz J. “Molecular assessment of erythroid lineage chimerism following nonmyeloablative allogeneic stem
cell transplantation”. Exp Hematol. 2003; 31(10): 924-33.
133. Thiede Ch, Lutterbeck K, Oelschlagel U, Kiehl M, Steudel Ch, Platzbecker U, Bre ndel C, Fauser
AA, Neubauer A, Ehninger G, Bornhauser M. „Detection of relapse by sequential monitoring of chimerism in circulating CD34+ cells’. Ann Hematol. 2002; 81 Suppl 2: S27–8.
134. Scheffold C, Kroeger M, Zuehlsdorf M, Tchinda J, Silling G, Bisping G, Stelljes M, Buechner
T, Berdel WE, Kienast J. „Prediction of relapse of acute myeloid leukemia in allogeneic transplant recipients by marrow CD34+ donor cell chimerism analysis”. Leukemia. 2004; 18(12): 2048–2050.
135. Urbini B, Arpinati M, Bonifazi F, Chirumbolo G, Falcioni S, Stanzani M, Bandini G, Motta MR,
Perrone G, Giannini B, Tura S, Baccarani M, Rondelli D. “Allogeneic graft CD34(+) cell dose correlates
217
with dendritic cell dose and clinical outcome, but not with dendritic cell reconstitution after transplant”.
Exp Hematol. 2003; 31(10): 959–965.
136.
Baron F, Baudoux E, Frere P, Tourqui S, Schaaf-Lafontaine N, Greimers R, Herens C,
Fillet G, Beguin Y. “Nonmyeloablative stem cell transplantation with CD8-depleted or CD34-selected
peripheral blood stem cells”. J Hematother Stem Cell Res. 2002; 11(2): 301–314.
137. Keil F, Prinz E, Moser K, Mannhalter C, Kalhs P, Worel N, Rabitsch W, Schulenburg A, Mitterbauer M, Greinix H. „Rapid establishment of long-term culture-initiating cells of donor origin after nonmyeloablative allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation, and significant prognostic impact of
donor T-cell chimerism on stable engraftment and progression-free survival” .Transplantation. 2003;
76(1): 230–236.
138. Koenecke C, Shaffer J, Alexander SI, Preffer F, Dombkowski D, Saidman SL, Dey B, McAfee
S, Spitzer TR, Sykes M. “NK cell recovery, chimerism, function, and recognition in recipients of haploidentical hematopoietic cell transplantation following nonmyeloablative conditioning using a humanized
anti-CD2 mAb, Medi-507”. Exp Hematol. 2003; 31(10): 911–923.
139. Matthes-Martin S, Lion T, Haas OA, Frommlet F, Daxberger H, Konig M, Printz D, Scharner D,
Eichstill C, Peters C, Lawitschka A, Gadner H, Fritsch G. “Lineage-specific chimaerism after stem cell
transplantation in children following reduced intensity conditioning: potential predictive value of NK cell
chimaerism for late graft rejection”. Leukemia. 2003; 17(10): 1934–1942.
140. Guimond M, Busque L, Baron C, Bonny Y, Belanger R, Mattioli J, Perreault C, Roy DC. “Relapse after bone marrow transplantation: evidence for distinct immunological mechanisms between adult
and paediatric populations”. Br J Haematol. 2000; 109(1): 130–137.
141. Fernandez-Aviles F, Urbano-Ispizua A, Aymerich M, Colomer D, Rovira M, Martinez C, Nadal
E, Talarn C, Carreras E, Montserrat E. “Serial quantification of lymphoid and myeloid mixed chimerism
using multiplex PCR amplification of short tandem repeat-markers predicts graft rejection and relapse, respectively, after allogeneic transplantation of CD34+ selected cells from peripheral blood”. Leukemia.
2003; 17(3): 613–620.
142. Petersen SL, Madsen HO, Ryder LP, Svejgaard A, Masmas TN, Dickmeiss E, Heilmann C, Vindelov LL. “Chimerism studies in HLA-identical nonmyeloablative hematopoietic stem cell transplantation
point to the donor CD8(+) T-cell count on day + 14 as a predictor of acute graft-versus-host disease”. Biol
Blood Marrow Transplant. 2004; 10(5): 337–346.
143. Hardy N, Steinberg S, Krumlauf M, Cvitkovic R, Castro K, Hakim F, Carter C, Read E, Leitman
E, Gress R, Bishop MR. “Development of graft-versus-host disease depends upon establishment of complete donor T cell chimerism after T cell depleted, reduced intensity hematopoietic stem cell transplantation”. Biol Blood Transplant, 2005; 11 (2), Supp 1: 39.
144.
Mattsson J, Uzunel M, Brune M, Hentschke P, Barkholt L, Stierner U, Aschan J, Ringden O. „Mixed chimaerism is common at the time of acute graft-versus-host disease and disease response
in patients receiving non-myeloablative conditioning and allogeneic stem cell transplantation”. Br J
Haematol. 2001; 115(4): 935–944.
145.
Roux E, Abdi K, Speiser D, Helg C, Chapuis B, Jeannet M, Roosnek E. „Characterization of mixed chimerism in patients with chronic myeloid leukemia transplanted with T-cell-depleted bone
marrow: involvement of different hematologic lineages before and after relapse”. Blood. 1993; 81(1):
243–248.
146. Parham P, McQueen KL. “Alloreactive killer cells: hindrance and help for haematopoietic transplants”. Nat Rev Immunol. 2003; 3(2): 108–122.
147. Thiele J, Wickenhauser C, Kvasnicka HM, Varus E, Beelen DW, Schaefer UW. ‚Dynamics of
lineage-restricted mixed chimerism following sex-mismatched allogeneic bone marrow transplantation”.
Histol Histopathol. 2003; 18(2): 557–574.
148.
Carvallo C, Geller N, Kurlander R, Srinivasan R, Mena O, Igarashi T, Griffith LM, Linehan WM, Childs RW. “Prior chemotherapy and allograft CD34+ dose impact donor engraftment following nonmyeloablative allogeneic stem cell transplantation in patients with solid tumors”. Blood.
2004;103(4):1560-3
218
149. Thiel A, Scheffold A, Radbruch A. “Immunomagnetic cell sorting-pushing the limits”. Immunotechnology. 1998; 4(2): 89–96.
150. Ueno NT, Cheng YC, Rondon G, Tannir NM, Gajewski JL, Couriel DR, Hosing C, de Lima MJ,
Anderlini P, Khouri IF, Booser DJ, Hortobagyi GN, Pagliaro LC, Jonasch E, Giralt SA, Champlin RE.
„Rapid induction of complete donor chimerism by the use of a reduced-intensity conditioning regimen
composed of fludarabine and melphalan in allogeneic stem cell transplantation for metastatic solid
tumors”. Blood. 2003; 102(10): 3829–3836.
151.
Baron F, Baudoux E, Frere P, Tourqui S, Schaaf-Lafontaine N, Greimers R, Herens C,
Fillet G, Beguin Y. “Nonmyeloablative stem cell transplantation with CD8-depleted or CD34-selected
peripheral blood stem cells”. J Hematother Stem Cell Res. 2002; 11(2): 301–314.
152. Mohr B, Koch R, Thiede C, Kroschinsky F, Ehninger G, Bornhauser M. „CD34+ cell dose, conditioning regimen and prior chemotherapy: factors with significant impact on the early kinetics of donor
chimerism after allogeneic hematopoietic cell transplantation”. Bone Marrow Transplant. 2004; 34(11):
949–954.
Praca wpłynęła do Redakcji 10.10.2005 r. i została zakwalifikowana do druku 7.10.2006 r.
Adres Autorow:
Katedra i Klinika Hematologii
i Chorób Rozrostowych Układu Krwiotwórczego
Poznań

pobierz

Transkrypt

Podobne dokumenty

pobierz

Pobieranie i deponowanie komórek macierzystych krwi pępowinowej