segmentacja i analiza obrazów mikroskopowych barwionych
Transkrypt
segmentacja i analiza obrazów mikroskopowych barwionych
SEGMENTACJA I ANALIZA OBRAZÓW MIKROSKOPOWYCH BARWIONYCH IMMUNOHISTOCHEMICZNIE WOJCIECH BIENIECKI Katedra Informatyki Stosowanej, Wydz.EiE, Politechnika Łódzka Al.Politechniki 11, 90-924 Łódź, [email protected] Streszczenie. Artykuł jest kontynuacją poprzednich prac [1]. Opisano własny algorytm segmentacji obrazów barwnych. Pod uwagę wzięto mikroskopowe obrazy komórek raka sutka pozyskane metodami biopsji aspiracyjnej cienkoigłowej (BAC), jako wycinki histologiczne i jako odcisk na zamrożonym szkiełku podstawkowym. Celem badania jest określenie liczby jąder komórkowych widocznych na obrazie i wyróżnienie jąder, które wykazują reakcję barwną. Ze względu na niską jakość obrazów wejściowych i różnorodność kształtów komórek, segmentację przeprowadza się etapami jako złożenie metod klasyfikacji barwnej i morfologicznej. 1 SEGMENTACJA OBRAZU Segmentacja jest jednym z najważniejszych etapów analizy obrazu. Proces ten polega na rozdzieleniu obrazu na pewne jego podzbiory będące w ścisłym związku z obiektami lub obszarami rzeczywistymi znajdującymi się na tym obrazie. Możemy mówić o segmentacji kompletnej, gdy obraz dzielimy na rozłączne obszary odpowiadające poszczególnym rzeczywistym obiektom, podczas gdy segmentacja częściowa dzieli nam obraz na pewne obszary na przykład związane z klasami obiektów. Aby dokonać segmentacji należy zdefiniować klasyfikator, który będzie wydzielał obszary obrazu na podstawie pewnych ich parametrów: jasności, gradientu jasności, tonu koloru, kształtu, powierzchni czy tekstury. Poniżej przedstawiono krótki przegląd metod segmentacji. barwa reakcja ton barwy (º) brunatna pozytywna [280; 360] ∪ [0; 10] błękitna negatywna [180; 280] Tab. 1. Przedziały wartości tonu barwy (ang. hue) dla jąder kom. w barwieniu immunohistochemicznym, [21, str. 278] Najprostszym podejściem jest całościowe potraktowanie obrazu. Każdy punkt obrazu przyporządkowujemy do jednej spośród zdefiniowanych wcześniej klas, np. tła, obiektów klasy A, obiektów klasy B nie sprawdzając spójności powstałych zbiorów. Najczęściej stosowaną techniką jest progowanie jasności każdego punktu obrazu. Zwykle na podstawie histogramu rozkładu jasności można znaleźć odpowiedni próg (lub progi), aby rozdzielić punkty związane z obiektami od punktów tła. W odniesieniu do obrazów kolorowych, gdzie z każdym punktem związany jest pewien wektor a nie wartość skalarna, stosujemy algorytmy oparte na regule najbliższego sąsiedztwa dla przestrzeni cech skonstruowanej dla składowych koloru lub rozwijanej ostatnio metodzie mean shift [4, 5, 6]. Ciekawsze i bardziej zaawansowane algorytmy segmentacji to grupa bazująca na wykrywaniu krawędzi [10]. Stosowane tu mogą być filtry, np. Prewitta [14] Sobela [16], Canny’ego [3], Wallisa, Kirsha [9] itd. Należy zwrócić uwagę na fakt, że brzegi te nie zawsze tworzą zamknięty kontur, szczególnie dla obrazów o słabo widocznych, rozmytych krawędziach. Inna grupa technik segmentacji to segmentacja oparta na obszarach (ang. region based). W założeniu algorytmy te dzielą obraz na klastry zwane regionami, przy czym każdy region zawiera jeden obiekt. Wyróżniamy tu techniki podziału obszarów, łączenia obszarów, techniki mieszane oraz metodę powodziową. Ostatnio zaproponowano nowe metody segmentacji relaksacyjnej zapewniające ciągłość konturu często nazywane metodami aktywnego konturu. Pomysł polega na otoczeniu domniemanego obiektu pewnym konturem o zgrubnym kształcie a następnie iteracyjnym dopasowaniu tegoż konturu zacieśniając go lub rozciągając na podstawie obliczeń tzw. funkcji energii. Istnieją różne odmiany tych metod (snakes i ray propagation) [17]. Grupa metod opartych na wykrywaniu krawędzi, algorytmów opartych na obszarach i metod aktywnego konturu określana będzie dalej wspólną nazwą segmentacji morfologicznej. 2 CHARAKTERYSTYKA BADANEGO OBRAZU Obraz źródłowy, który poddawany jest analizie (Rys. 1) zawiera pewne charakterystyczne obiekty rzeczywiste: jądra komórkowe raka zabarwione na kolor brunatny (z reakcją pozytywną), jądra komórkowe zabarwione na kolor błękitny (z reakcją negatywną), jądra z reakcją częściową, jądra komórkowe źle nasycone barwnikiem, cytoplazma, komórki tłuszczowe, struktury niekomórkowe oraz inne obiekty – zanieczyszczenia, pęcherze powietrza, artefakty powstałe podczas akwizycji obrazu. 7 sklejonych jąder cytoplazma struktury niekomórkowe Jądra o częściowej reakcji jądro z reakcją pozytywną Błędy akwizycji obrazu jądro żle wysycone barwnikiem Jądro z reakcją negatywną pęcherz powietrza Rys. 1. Mikroskopowy obraz preparatu z biopsji (BAC). Na obrazie można wyróżnić kilka rodzajów obiektów. Obraz, który poddawany jest przetwarzaniu pochodzi z mikroskopu optycznego, skąd jest zbierany poprzez kamerę wideo, ściągany poprzez kartę TV do komputera PC i tam zapisywany jako 24 bitowa bitmapa o rozdzielczości 700 na 525 punktów. Obraz wejściowy „surowy” nie nadaje się bezpośrednio do segmentacji. Częściowo wynika to za sposobu, w jaki obraz powstaje. Obraz powstały z prześwietlenia preparatu mikroskopowego jest dwuwymiarowym rzutem pewnego fragmentu przestrzeni, co może powodować pewne deformacje kształtów i wielkości znajdujących się tam obiektów. Jeżeli na przykład dwie kule o jednakowej średnicy zostaną przecięte różnymi płaszczyznami, to wielkości tych przekrojów będą różne. To zjawisko zostało opisane jako efekt Holmesa [http1, 21] (Rys.2). Ponadto jądra komórkowe na preparacie mogą stykać się lub nakładać na siebie, a niektóre mogą zostać zniekształcone lub zniszczone w procesie przygotowania preparatu. Rys 2. Efekt Holmesa: a), b) różne grubości wycinka oraz c), d) – odpowiadające im obrazy mikroskopowe Następnym problemem związanym z powstawaniem obrazu w mikroskopie optycznym jest trudność w ustawieniu ostrości na wszystkie obiekty na preparacie na raz, a związane jest to z ograniczoną głębią ostrości układu soczewek. Nieostre krawędzie na obrazie mikroskopowym utrudniają zastosowanie metod segmentacji wykorzystującej wykrywanie krawędzi. Istnieją pewne algorytmy poprawy ostrości obrazu [13], a polegają one na złożeniu kilku obrazów tej samej sceny wykonanych przy różnych nastawach ostrości i wybraniu z każdego z nich tych punktów, dla których ostrość jest najlepsza. Niestety zastosowanie tych metod jest ograniczone w przypadku mikroskopii optycznej, gdyż obserwowane obiekty są częściowo przezroczyste. W przeciwieństwie do zwykłych zdjęć fotograficznych, gdzie obraz powstaje na skutek odbicia promieni światła od przedmiotów znajdujących się w polu widzenia, obraz mikroskopowy powstaje dzięki przenikaniu światła przez wycinek i jego częściowe pochłanianie, załamanie i ugięcie przez znajdujące się tam obiekty. Przezroczystość jąder komórkowych jest nierównomierna, dla przykładu wnętrze jądra może być jaśniejsze niż fragmenty jego brzegu. To zjawisko z kolei utrudnia zastosowanie algorytmów segmentacji bazujących na progowaniu. Obraz powstający w mikroskopie optycznym podlega też pewnym zakłóceniom związanym z jego akwizycją do postaci cyfrowej. Występują pewne zniekształcenia barw, pogorszenie kontrastu, pogorszenie ostrości. Jasność, % PUNKTY TŁA PUNKTY Z REAKCJĄ NEGATYWNĄ PUNKTY Z REAKCJA POZYTYWNĄ PUNKTY Z REAKCJĄ POZYTYWNĄ Ton koloru, º Rys. 3. Wykres składowych koloru dla punktów obrazu i odpowiadające im klasy uzyskane metodą k-NN 3 ALGORYTM Przetestowano kilka metod segmentacji polegającej na progowaniu jasności i kolorów, segmentacji morfologicznej z modyfikacjami uwzględniającymi specyfikę badanych obrazów. Dla obrazów kolorowych ciekawe wydaje się zastosowanie statystycznych metod rozpoznawania obrazów. Zaimplementowano metodę opartą na regule najbliższego sąsiada [7], wraz z modyfikacjami redukcji wielkości zbioru uczącego [15]. Wśród technik segmentacji morfologicznej ciekawym rozwiązaniem jest zastosowanie metody powodziowej [2, 18, 12]. Zaimplementowano własny algorytm oparty na metodzie powodziowej z redukcją efektu nadmiernej segmentacji. Ważnym etapem przetwarzania obrazu jest weryfikacja procesu segmentacji poprzez indeksację zaklasyfikowanych punktów obrazu i dokonanie analizy wielkości i kształtu otrzymanych w ten sposób spójnych obiektów. Działanie algorytmu przedstawiono na Rys. 4. We wstępnej fazie obróbki obraz jest filtrowany w celu usunięcia defektów jego digitalizacji i wyrównania jasności histogramu w celu ustalenia jednolitych warunków dla pracy segmentera. Oprócz wyrównania histogramu jasności zastosowano operację morfologiczną “zamykania” dla obrazów kolorowych [11]. Zamykanie obrazu ma działanie podobne do filtru medianowego [8], lecz skuteczniej usuwa niejednorodności jasności i zabarwienia wnętrza obiektów (jąder komórkowych), co poprawia skuteczność segmentacji. ρ(x1,x2) = Hx1 −Hx2 + Sx1 −Sx2 + Ix1 −Ix2 + ∇x1 −∇x2 Równ. 1. Funkcja odległości w przestrzeni cech dla metody k-NN. W następnym etapie każdemu punktowi obrazu przyporządkowujemy wektor cech o składowych H: ton koloru, S: nasycenie, I: jasność, grad(I): moduł gradientu jasności dla otoczenia punktu oraz ustalamy funkcję odległości (Równ. 1). Powstały w ten sposób zbiór poddajemy klasyfikacji metodą najbliższego sąsiada. Przetwarzanie wstępne obrazu Konwersja przestrzeni barw RGB→HSI, ∇I Załadowanie zbioru uczącego. Redukcja Skalaka Analiza punktów metodą k-NN Segmentacja morfologiczna Rys. 4. Schemat blokowy systemu analizy obrazu mikroskopowego. Zastosowanie tej metody wymaga precyzyjnego ustalenia zbioru uczącego. Otrzymujemy go ręcznie poprzez wskazanie przez człowieka na obrazie wzorcowym punktów należących do klasy tła, klasy punktów jąder o reakcji pozytywnej, klasy punktów jąder o reakcji negatywnej. Zbiór uczący jest redukowany metodą Skalaka [15], co znacznie przyspiesza klasyfikację punktów obrazu. Po przeprowadzeniu analizy metodą 1-NN powstaje obraz skwantowany do trzech wartości: punkty należące do tła, punkty należące do jąder „czerwonych”, czyli o reakcji pozytywnej i punktów należących do jąder „niebieskich”, czyli o reakcji negatywnej. Poglądowy wykres punktów w przestrzeni cech dla poklasyfikowanego zbioru przedstawia Rys. 3. Następnie realizowana jest druga faza segmentacji. (Rys. 5). Na początku następuje indeksacja, tzn. punkty o tej samej klasie tworzące zbiór spójny są przydzielane do obiektu o wspólnym numerze. Wysegmentowane w ten sposób obiekty odpowiadają miejscom, w których znajduje się barwnik – w większości przypadków trafiają one w jądra komórkowe. Można wyróżnić również obiekty (z reguły bardzo niewielkie), które są błędnie zaklasyfikowanymi punktami tła, obiekty, które prawidłowo zaklasyfikowano jako jądra komórkowe, lecz z reguły są to grupy nakładających się jąder komórkowych, wreszcie istnieją sąsiadujące ze sobą pary obiektów różnych klas, które w rzeczywistości razem pokrywają obszar jednego jądra komórkowego. Takie obszary należy połączyć w jeden obiekt i odpowiednio ustalić jego klasę. Analizę wielkości rozpoczynamy od zmierzenia pola powierzchni (w punktach) znalezionych obiektów i ustalenia wartości pola S0 odpowiadającego jednemu jądru komórkowemu (Rys. 6.) 1. Indeksacja punktów tworzących zbiory spójne metodą zalewania. Powstają rozłączne, spójne obiekty A1...Am z połączonych punktów klasy A i obiekty B1...Bn powstałe z punktów klasy B. 2. Dla wszystkich obiektów A1...Am, B1...Bn, obliczenie pola powierzchni S(Ai), S(Bj).Ręczenie lub poprzez analizę rokładu wielkości obliczenie wzorcowego pola powierzchni obiektów: S0A i S0B. 3. Dla każdego obiektu Ai znajdź listę L(Ai) obiektów klasy B stykających się z Ai . Dla każdego obiektu Bj znajdź listę L(Bj) obiektów klasy A stykających się z Bj. Oznacz obiekty klasy A mniejsze niż ½ S0A i klasy B mniejsze niż ½ S0B jako MAŁE. Oznacz obiekty większe niż 3/2 S0A i 3/2 S0B jako GRUPY. Pozostałe obiekty oznacz jako WYSEGMENTOWANE. Usuń MAŁE obiekty, które mają puste listy L. 4. Dla każdego MAŁEGO obiektu następuje próba połączenia go z obiektem z listy L. Jeśli Obiektów jest kilka, wybieramy taki, aby sumaryczne pole powierzchni było zbliżone do wartości wzorcowej. Dany obiekt MAŁY zmieni swoją klasę. 5. Określenie przypuszczalnej liczby obiektów w GRUPACH. 6. Wykonać segmentację metodą powodziową dla obszarów określonych jako GRUPY. W przypadku nadmiernej segmentacji zastosować usuwanie linii podziału o najmniejszej wysokości tak, by uzyskać sugerowaną liczbę obiektów. Rys. 5. Algorytm dzielenia i łączenia obszarów Wykorzystujemy tu fakt, że dla określonego preparatu mikroskopowego i przy określonym powiększeniu pole powierzchni jądra komórkowego jako składnika jednorodnej tkanki ma w przybliżeniu rozkład normalny o parametrach, które można obliczyć lub przyjąć z góry. W ten sposób możemy znaleźć obiekty, które nie mieszczą się w określonym przedziale pola powierzchni i oznaczyć je jako GRUPY. Są to z reguły grupy jąder komórkowych tworzące jednolitą plamę. W przybliżeniu na podstawie pola powierzchni tej plamy da się określić ilość znajdujących się tam jąder. Dla prostokąta zawierającego taki kształt uruchamiamy algorytm transformacji powodziowej dla wartości jasności punktów. Ta transformacja bardzo precyzyjnie rysuje linie podziału pomiędzy obiektami, co więcej są to linie zamknięte. Często jednak powoduje nadmierną segmentację i charakteryzuje się dużym kosztem obliczeniowym. Liczba obiektów Liczba obiektów 25 40 35 Obiekty dobrze wysegmentowane 30 Obiekty dobrze wysegmentowane 20 25 15 20 10 15 10 5 5 0 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 Powierzchnia w punktach Reakcja pozytywna 0 0 500 1000 1500 2000 2500 Powierzchnia w punktach Reakcja negatywna Rys. 6. Rozkład pola powierzchni dla obiektów dwóch klasy wysegmentowanych z obrazu Rys. 7. Segmentacja metodą powodziową: zjawisko nadmiernej segmentacji i jego redukcja Z tegoż powodu metodę tą stosujemy tylko do wycinka obrazu. Nasza implementacja watershed pozwala usuwać pewne granice podziału generowane przez oryginalną implementację poprzez wykrywanie tzw. słabych linii podziału (Rys 7.), czyli o zbyt niskiej wysokości względnej. Wartość ta jest parametrem i może być tak ustawiona, aby uzyskać ilość obiektów zbliżoną do wartości szacowanej. 4 WYNIKI TESTÓW W celu przetestowania algorytmu wzięto pod uwagę trzy aspekty: jakość segmentacji, jakość identyfikacji i zgodność pomiaru z pomiarem dokonywanym ręcznie. Zakładamy, że osoba wykonująca pomiar ręcznie, tzn. licząca obiekty zaobserwowane na monitorze i klasyfikująca je jako pozytywne lub negatywne jądra komórkowe jest nieomylna. Zakładamy również, że jeśli liczba obiektów wysegmentowanych z jednego obrazka jest zgodna z liczbą uzyskaną przez laboranta, segmentacja działa właściwie. Program przetestowano na serii 70 obrazów pochodzących z 18 preparatów mikroskopowych pobranych dla trzech pacjentów. W każdym preparacie znaleziono zwykle trzy lub cztery skupiska komórek i wykonano zdjęcie. Tab. 2 przedstawia wyniki zebrane dla jednego z pacjentów. Główne kolumny tabeli to ER (receptory estrogenowe) i PR (receproty progesteronowe). Każdy wiersz tabeli dla ER i PR zawiera dane otrzymane z jednego obrazu. Oznaczenia kolumn są następujące: mP – liczba jąder komórkowych z reakcją pozytywną znalezionych przez laboranta na jednym obrazie, mT – liczba wszystkich jąder obliczona manualnie, mP procent liczby jąder mP% = ⋅ 100% mT komórkowych z reakcją pozytywną. Nr pacjenta / badanie H Średnio 18512 B Średnio I Średnio mP 195 156 118 156 45 67 28 47 48 42 73 131 74 mT mP% 273 71 267 58 187 63 242 64 86 52 140 48 60 47 95 49 51 94 42 100 73 100 139 94 76 97 ER pP 124 150 101 125 24 54 20 33 34 45 76 112 67 pT pP% pA% 285 44 48 289 52 60 186 54 69 253 50 59 81 30 46 155 35 40 67 30 54 101 31 47 55 62 74 49 92 95 76 100 100 133 84 89 78 85 90 mP 175 99 229 168 70 89 27 44 58 37 30 10 58 34 mT MP% 228 77 238 42 264 87 243 68 132 53 117 76 46 59 91 48 97 59 43 86 59 51 29 35 68 85 50 64 PR pP 149 107 158 138 80 64 38 45 57 22 18 13 31 21 pT pP% pA% 235 63 82 248 43 45 263 60 74 249 56 67 140 57 61 110 58 82 51 75 85 97 46 66 100 59 73 33 67 73 44 41 52 30 43 53 72 43 41 45 49 55 Tab. 2. Wyniki badań dla jednego pacjenta – porównanie metody tradycyjnej i automatycznej Kolumny pP, pT, pP% i pA% to wyniki działania programu dla tego samego obrazu, kolejno: liczba jąder komórkowych z reakcją pozytywną, liczba wszystkich jąder, procent jąder z reakcją pozytywną i procent pola powierzchni zabarwionego barwnikiem wskazującym na reakcję pozytywną. Etykiety H, B, I grupują wiersze ze względu na badany materiał: wycinek histologiczny, rozmaz z biopsji i odcisk na zamrożonym szkiełku. Surowe wyniki wskazują, że różnice pomiędzy ilością wysegmentowanych jąder komórkowych ręcznie i automatycznie różnią się w każdym przypadku. W celu dokładniejszej analizy zbadano korelację pomiędzy ciągami pomiarów i wykonano test zgodności serii Wilcoxona [19, 20, http2]. mP% - pP% mP% - pA% pP% - pA% Korelacja (program Statistica) r=0,82 p<0,05 n=35 r=0,58 p<0,05 n=35 r=0,82 p<0,05 n=35 r=0,60 p<0,05 n=35 r=0,94 p<0,05 n=35 r=0,96 p<0,05 n=35 Tab. 3. Korelacja dwóch serii pomiarów dla: frakcji jąder pozytywnych obliczonej ręcznie i automatycznie, frakcji jąder pozytywnych obliczonej ręcznie i pola powierzchni zabarwionej pozytywnie uzyskanej automatycznie oraz dla frakcji ilości i frakcji pola powierzchni uzyskanych automatycznie Wyniki przeprowadzonego testu wykazują, że istnieje istotna różnica pomiędzy ilością jąder komórkowych wysegmentowanych przez algorytm i znalezionych przez laboranta. Natomiast frakcja pola powierzchni zabarwionej pozytywnie, obliczona przez program wskazuje zgodność z frakcją ilości jąder komórkowych znalezionych manualnie. Potwierdza to skuteczność działania metody segmentacji barwnej metodą najbliższego sąsiada. Różnice w ilości wysegmentowanych jąder komórkowych wskazują, że segmentacja morfologiczna czasami zawodzi i co ciekawsze różni się także w kolejnych przebiegach programu przy zmianie jej parametrów. Wniosek z tego jest taki, że póki co proces analizy musi być nadzorowany przez laboranta. Dla 70 zdjęć Serie T Z p-level N ER mC% - pC% 109,0 3,22 0,0013 ER mC% - pA% 224,0 1,01 0,313 35 TAK ER mT - PT 234,0 1,33 0,185 35 TAK PR mC% - pC% 94,0 3,62 0,0003 PR mC% - pA% 213,0 1,67 0,094 35 TAK PR mT – PT 145,0 2,60 0,009 35 35 35 Zgod ność NIE NIE NIE Tab. 4. Test zgodności serii Wilcoxona wykonany programem Statistica dla różnych kombinacji 5 WNIOSKI Z przeprowadzonej analizy wynika, że rezultaty otrzymane metodą automatyczną mogą być przydatne w badaniach obrazów mikroskopowych barwionych immunohistochemicznie. Należy zwrócić uwagę na fakt, że w badaniach rutynowych reakcję repceptorów estrogenowych i progesteronowych określa się w sposób dużo mniej dokładny, niż jest to w stanie wykonać algorytm. Istnieje również uzasadnione podejrzenie, że człowiek może popełniać pomyłki w liczeniu i klasyfikowaniu jąder komórkowych. W przypadku jąder komórkowych ciemnych, słabo wysyconych barwnikiem, lub wykazujących częściową reakcję wskazanie właściwej klasy dla takiego jądra jest wykonywane przez program precyzyjniej. Co więcej w przypadkach obrazów histologicznych, gdzie w polu widzenia znajduje się około 300 obiektów zmęczenie wzroku może powodować powstawanie błędów. Testy pokazały, że największe różnice w wynikach analizy ręcznej i automatycznej wystąpiły dla obrazów o najniższej jakości, zawierających zanieczyszczenia lub uszkodzone fragmenty tkanki. Doświadczony laborant jest w stanie rozpoznać takie obrazy i zaklasyfikować widoczne obiekty do odpowiednich klas. W tym przypadku algorytm segmentacji wymaga dopasowania parametrów ręcznie przez osobę obsługującą program. LITERATURA [1] W. Bieniecki, Sz. Grabowski, J. Sekulska, M. Turant, A. Kałużyński, “Automatic segmentation and recognition of patomorphological microscopic images,” CADSM’2003 Feb. 2003, Lviv Slavsko Conference, pp.461–464. [2] S. Beucher, C. Lantuejoul, ”Use of watersheds in contour detection”, in Proceedings of International Workshop on Image Processing, Real-Time Edge and Motion Detection/Estimation, Rennes, Sept. 1979. [3] J. Canny, “A Computational Approach to Edge Detection,” IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence, 1986. vol. PAMI–8, No. 6, pp. 679–698. [4] D. Comaniciu, V. Ramesh, P. Meer, “The Variable Bandwidth Mean Shift and Data-Driven Scale Selection,” IEEE Int. Conf. Computer Vision (ICCV'01), Vancouver, Canada, vol. 1, 438-445, 2001. [5] D. Comaniciu, P. Meer, “Mean Shift Analysis: A Robust Approach Toward Feature Space Analysis,” IEEE Transactions On Pattern Analysis and Computer Intelligence, vol. 24, no. 5, May 2002 [6] D. Comaniciu, “An Algorithm for Data-Driven Bandwidth Selection”, IEEE Trans. Pattern Analysis Machine Intell., vol. 25, No. 2, 2003. [7] E. Fix and J. L. Hodges, “Discriminatory Analysis: Nonparametric Discrimination Small Sample Performance,” from project 21-49-004, Report Number 11, USAF School of Aviation Medicine, Randolph Field, Texas, pp. 280–322, 1952. [8] Sz. Grabowski, W. Bieniecki, “A two-pass median filter for impulse noise attenuation in color images”, CADSM’2003 Feb. 2003, Lviv Slavsko Conference, pp.101–104. [9] R. Kirsch, “Computer determination of the constituent structure of biological images,” Computers and Biomedical Research, vol. 4, pp.315–328, June 1971. [10] M. Lineberry, „Image segmentation by edge tracing,” Applications of Digital Image Processing IV, vol. 359 1982. [11] Gerasimos Louverdis, Ioannis Andreadis, Philippos Tsalides, “Morphological Granulometries for Color Images,” 2nd Hellenic Conference on Artificial Intelligence, SETN 2002. Thes Saloniki, Greece, 2002. [12] A. Moga, B. Cramariuc, M. Gabbouj, “A parallel watershed algorithm based on rainfalling simulation,” in European Conference on Circuit Theory and Design, vol 1. pp. 339-342, Istanbul, Turkey, 1995. [13] J.M. Ogden, E.H. Adelson, J.R. Bergen, P.J. Burt, “Pyramid-based Computer Graphics”, RCA Engineer, Sept/Oct, 1985. [14] J. Prewitt, “Object enhancement and extraction,” in Picture Processing and Psychopictronics, New York: Academic Press, 1970. [15] D. Skalak, “Prototype and Feature Selection by Sampling and Random Mutation Hill-Climbing Algorithms,” in Proc. Eleventh International Conference on Machine Learning, pp. 293-301, New Brunswick, New Jersey, 1994. [16] I. Sobel, “Camera Models and Machine Perception,” Ph.D. thesis, Stanford University, Stanford, CA, 1970. [17] H. Tek, D. Comaniciu, J.P. Williams, “Vessel Detection by Mean Shift Based Ray Propagation,” IEEE Workshop on Mathematical Methods in Biomedical Image Analysis, Hawaii, 2001. [18] L. Vincent, P. Soille, “Watersheds in digital spaces: An efficient algorithm based on immersion simulations,” IEEE PAMI, 1991, 13(6): 583-598, 1991. [19] B. L. van der Waerden, „Mathematical Statistics“. New York: Springer-Verlag, 1969. [20] F. Wilcoxon, "Individual Comparisons Ranking Methods." Biometrics 1, 80-83, 1945. by [21] K. Zieliński, M. Strzelecki, „Komputerowa analiza obrazu biomedycznego”. PWN, W-wa, Lodz, 2002. [http1] Holmes Effect, University of Dellware http://www.udel.edu/Biology/Wags/b667/lect6/lect6 _11.gif [http2] STATISTICA - Data Mining, Data Analysis, Quality Control, and Web Analytics Software http://www.statsoftinc.com/