Mikrorozmnażanie roślin prowadzonych w

Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej
Katedra Technologii Leków i Biochemii
Kultury tkankowe i komórkowe roślin i zwierząt
MikrorozmnaŜanie roślin prowadzonych w kulturach in vitro
Wstęp.
MikrorozmnaŜanie jest metodą rozmnaŜania wegetatywnego w kulturze
in vitro, uŜywaną do masowego mnoŜenia roślin na skalę produkcyjną. Dynamicznie
rosnące komercyjne znaczenie tej gałęzi produkcji roślinnej znajduje
odzwierciedlenie w jej współczesnej nazwie: przemysł in vitro (ang. in vitro industry,
the micropropagation industry).
Metoda kultury in vitro była doskonalona od początku XX wieku,
lecz rozmnaŜanie roślin na skalę produkcyjną z jej zastosowaniem stało się moŜliwe
dopiero od 1965 roku, kiedy to Murashige w USA opracował sposób klonalnego
rozmnaŜania storczyków. Metodę tę zaadoptowano do rozmnaŜania innych waŜnych
gospodarczo roślin, głównie ozdobnych i sadowniczych. Obecnie jest ona najszerzej
wykorzystywaną techniką w biotechnologii. Znalazła zastosowanie przede wszystkim
w produkcji takich roślin, które trudno rozmnaŜają się wegetatywnie za pomocą
metod tradycyjnych (rośliny ozdobne, drzewa leśne, odmiany heterozygotyczne),
oraz roślin elitarnych, o duŜej wartości jednostkowej. Tylko w niewielkim stopniu
słuŜy ona dotychczas w rozmnaŜaniu roślin rolniczych (ziemniaków, zbóŜ, roślin
tropikalnych. MikrorozmnaŜanie moŜna teŜ wykorzystać do rozmnaŜania form
poliploidalnych czy aneuploidalnych, których rozmnaŜanie generatywne daje
niejednolite potomstwo).
Liczba gatunków rozmnaŜanych za pomocą kultury in vitro wynosi obecnie
około 300, natomiast na świecie produkuje się za pomocą kultury in vitro około
800 mln sztuk roślin, z czego 90% stanowią rośliny ozdobne. Ocenia się,
Ŝe produkcja europejska wynosi około 200 mln sztuk rocznie, a najwaŜniejszym
producentem europejskim jest Holandia (62 mln sztuk rocznie), następnie Francja,
Polska, Włochy i Niemcy. Oprócz krajów europejskich, czołowymi producentami
roślin w laboratoriach in vitro są USA (110 mln szt.) i Indie (130 mln szt.). W krajach
tych głównym produktem mikrorozmnaŜania są ozdobne rośliny doniczkowe
o dekoracyjnym ulistnieniu, a takŜe rośliny waŜne gospodarczo np. ziemniaki, byliny,
rośliny przyprawowe.
W Polsce działa obecnie około 20 laboratoriów zajmujących się
mikrorozmnaŜaniem, głównie roślin ozdobnych (gerbera, róŜanecznik, azalia,
storczyk, fikus, lilia, chryzantema, gloksynia, goździk, paproć, primula), a takŜe
borówki wysokiej, truskawki, Ŝurawiny i jeŜyny.
Krajowa produkcja sadzonek in vitro jest jedną z największych w Europie i
szacunkowo wynosi około 70 – 100 mln sztuk na rok. Zaspokaja ona potrzeby
rynkowe naszego kraju, ale w większości jest eksportowana do Holandii, Anglii,
Izraela, Węgier, Czech, Białorusi, Bułgarii, Turcji, USA oraz na Ukrainę, Litwę i
Łotwę.
Laboratoria włoskie dostarczają na rynek około 20 mln sztuk roślin
sadowniczych, szczególnie winorośli i brzoskwiń. Laboratoria belgijskie specjalizują
się w produkcji ozdobnych roślin drzewiastych (Rhododendron).
RozmnaŜanie wegetatywne roślin w kulturach in vitro moŜna prowadzić w
oparciu o:
a) pobudzanie rozwoju pąków bocznych (metoda najlepiej poznana)
b) formowanie pąków przybyszowych bezpośrednio lub pośrednio przez kalus
c) embriogenezę somatyczną
Embriogeneza somatyczna to proces biologiczny, podczas którego w
warunkach in vitro formują się zarodki z komórek wegetatywnych. Otrzymane w ten
sposób zarodki mogą posłuŜyć do produkcji sztucznych nasion.
Sztuczne nasiona to specjalnie spreparowane zarodki somatyczne (komórki
somatyczne, zaczątki rośliny) zdolne do regeneracji na skalę komercyjną,
umieszczone w osłonce ochronno – odŜywczej.
Sposób prowadzenia kultury.
Bardzo istotne znaczenie w procesie mikrorozmnaŜania roślin ma skład
poŜywki (głównie zawartość hormonów) oraz jej rodzaj (stała czy płynna). Najczęściej
stosuje się poŜywkę według Murashige’a i Skooga (1962) lub jej modyfikację,
rzadziej poŜywkę B5 według Gamborga i in. (1968).
W procesie mikrorozmnaŜania moŜna wyróŜnić następujące etapy:
1. załoŜenie kultury – obejmuje wyłoŜenie sterylnych eksplantatów pierwotnych
na poŜywkę stymulującą wytwarzanie pąków lub cebulek przybyszowych.
2. namnaŜanie – najczęściej prowadzi się na poŜywkach z wysoką zawartością
cytokinin indukujących tworzenie nowych pędów (mikrocebulek). Wytworzone
pędy mogą być ponownie wykładane na taką samą poŜywkę, gdzie proces ten
się powtarza. Subkulturę najczęściej zakłada się co 4 tygodnie i przeprowadza
od 10 do 15 razy.
3. ukorzenianie pędów – przeprowadza się w zaleŜności od gatunku rośliny
zarówno in vitro, jak i in vivo. Stosuje się często poŜywki z wysokim stęŜeniem
auksyn, obniŜoną zawartością soli mineralnych oraz dodatkiem węgla
aktywnego.
Celem mikrorozmnaŜania jest uzyskanie duŜej liczby genetycznie
jednolitych roślin. W trakcie trwania kultury in vitro moŜe być zachowana stabilność
genetyczna materiału roślinnego lub moŜe wystąpić spontaniczna zmienność (tzw.
zmienność somaklonalna), w wyniku której regenerowane rośliny mogą wykazywać,
na pewien czas lub na trwałe, inne cechy niŜ wyjściowy materiał rodzicielski.
W mikrorozmnaŜaniu zmienność jest wadą, ale stwierdzono, Ŝe moŜe ona być
nowym źródłem zmienności genetycznej moŜliwym do wykorzystania w hodowli
twórczej. Zmienność somaklonalna pozwala znacznie poszerzyć zakres zmienności
genetycznej roślin uprawnych, co jest szczególnie waŜne przy ograniczonej puli
genowej lub w przypadku gatunków uŜytkowych, które utraciły zdolność do
rozmnaŜania generatywnego. Zmiany w kulturach in vitro mogą dotyczyć takŜe
takich właściwości roślin, których nie moŜna osiągnąć na drodze konwencjonalnej.
Zaletą zmienności somaklonalnej jest takŜe moŜliwość uzyskania roślin róŜniących
się tylko jedną cechą przy zachowaniu innych cech odmianowych. Jej wykorzystanie
jest równieŜ tańszą od innych metodą manipulacji genetycznej.
Zalety i wady mikrorozmnaŜania.
Podstawową zaletą stosowania tej techniki jest moŜliwość uzyskania w krótkim
czasie bardzo duŜej ilości roślinek z materiału wyjściowego. Liczba namnoŜonych
roślinek zaleŜy od odmiany, rodzaju eksplantatu, warunków fizycznych kultury,
składu poŜywki oraz liczby przeprowadzonych subkultur. Np. teoretyczna wydajność
namnaŜania ze średniej wielkości cebuli w kulturze wytrząsanej wynosi 2000
mikrocebulek w ciągu 45 dni.
Stosowanie do mikrorozmnaŜania kultur merysystemów wierzchołkowych
stwarza moŜliwość uwalniania materiału hodowlanego od wirusów i innych
patogenów. Im mniejszy jest izolowany merystem (0,5 do 1 mm), tym większa
skuteczność eliminacji wirusa. W celu zwiększenia prawdopodobieństwa otrzymania
zdrowych roślin stosuje się często kulturę merysytemów łącznie z termoterapią
lub chemoterapią.
Inną korzyścią stosowania tej techniki jest moŜliwość przechowywania
zregenerowanych roślinek przez kilka miesięcy w obniŜonej temperaturze. Pozwala
to na spokojną, rozłoŜoną w czasie produkcję in vitro i wysadzanie roślin
w optymalnym terminie. Stosuje się równieŜ długoterminowe przechowywanie in vitro
merysystemów lub pędów przez okres 2-5 lat w banku genów.
Kolejną zaletą mikrorozmnaŜania jest łatwy transport rozmnoŜonego
materiału. Szacunkowo około 40 000 roślinek moŜna umieścić w paczce waŜącej
15 kg. Ułatwia to transport i międzynarodową wymianę materiału roślinnego.
Trudności, z jakimi spotyka się w trakcie mikrorozmnaŜania:
a) bakteryjne i grzybowe skaŜenie eksplantatów pierwotnych;
b) witryfikacja (zeszklenie) zregenerowanych roślin;
c) trudności ukorzeniania i adaptacji do warunków normalnej uprawy;
d) występowanie niekorzystnych fizjologicznych modyfikacji wśród namnoŜonych
roślin (np. słaby wigor tych roślin, słaby rozwój systemu korzeniowego,
opóźnienie kwitnienia).
Część praktyczna.
Celem ćwiczenia jest mikrorozmnaŜanie roślin, pochodzących z hodowli
in vitro załoŜonych przez studentów na wcześniejszym laboratorium.
Do mikrorozmnaŜania wykorzystane zostaną merystemy wierzchołka pędu
i fragmenty łodygi.
Materiał roślinny:
3 mm eksplantaty wierzchołkowe dowolnej rośliny
1 – 3 mm fragmenty łodygi
Materiały sterylne:
Płytki Petriego
Penseta, skalpel
PoŜywka MS bez hormonów
PoŜywka MS zawierająca auksynę (NAA – kwas naftalenooctowy, 0.1 mg/l)
oraz cytokininę (BAP – 6 –benzyloaminopurynę, 0.5 mg/l), pH 5.8
Wykonanie ćwiczenia:
Ćwiczenie wykonuje się pod wyciągiem laminarnym z nawiewem sterylnego
powietrza.
1. Za pomocą sterylnej pensety, dobrze opalonej w płomieniu palnika, wyjąć
roślinę ze słoika i umieścić ją na płytce Petriego.
2. Odciąć przy pomocy skalpela około 3 mm merystem wierzchołkowy
oraz 1- 3 mm fragment łodygi, a resztę rośliny umieścić z powrotem w słoiku.
3. UŜywając dobrze opalonej pensety wyłoŜyć pobrane eksplantaty pierwotne
na poŜywkę MS: merystem wierzchołkowy na poŜywkę MS bez hormonów,
a fragment łodygi na poŜywkę MS z hormonami.
4. Słoiki zabezpieczyć dodatkowo parafilmem, dobrze opisać i umieścić
w fitotronie na około 8 tygodni.
5. Obserwować wygląd roślin, liczbę roślin uzyskanych z eksplantatu, szybkość
powiększania się hodowli.
Przygotowanie sprawozdania.
1. Opisać sposób wykonania ćwiczenia.
2. Rola jednego dowolnie wybranego fitohormonu we wzroście i rozwoju roślin.
3. Wymienić znane (poza mikrorozmnaŜaniem) rodzaje kultur in vitro. Opisać
którąś z nich.
4. Opisać sposoby uwalniania roślin od patogenów.
Literatura uzupełniająca:
1. Biotechnologia roślin. S. Malepszy, PWN 2004.
2. Wprowadzenie do biotechnologii w genetyce i hodowli roślin. Praca zbiorowa
pod kierownictwem S. Malepszego, Wydawnictwo SGGW-AR, Warszawa
1990.
3. www.horticentre.pl - Skierniewicki Portal Ogrodniczy