docWyjedź na płatny staż do Japonii,Pajęczyna jak kamizelka
download 
Reklamacja Transkrypt
Wyjedź na płatny staż do Japonii,Pajęczyna jak kamizelka
Wyjedź na płatny staż do Japonii Rozpoczęła się rekrutacja do programu Fundacji Canon „Canon Fundation in Europe”. Program jest adresowany do wysoko wykwalifikowanych naukowców różnych specjalizacji z Europy, którzy zainteresowani są prowadzeniem swoich badań w Japonii. Projekty w Japoni mogą być prowadzone od 3-12 miesięcy. Wnioski mozna składać do 15 września 2015 r. W trakcie pobytu w Japonii stypendyści otrzymają wsparcie finansowe w wysokości od 22 500 euro do 27 500 euro rocznie (w przypadku krótszego czasu stypendium, będzie to kwota proporcjonalnie mniejsza. Wnioski mogą być składane przez osoby ze stopnie zawodowym magistra lub stopniem naukowym doktora, ze stopniem naukowym uzyskanym nie dawniej niż 10 lat przed złożeniem wniosku. Strona internetowa konkursu Fundacji Canona znajduje się tutaj. Fundacja Canon - stypendia w Japonii źródło - opracowanie własne Pajęczyna kuloodporna jak kamizelka Ludzka skóra wzmocniona pajęczym jedwabiem może zatrzymać kulę wystrzeloną z broni palnej. Niezwykłe zjawisko prezentuje na filmie portal „New Scientist”. Film jest efektem współpracy międzynarodowego zespołu składającego się z naukowców i artystów. Zespół planujący przedsięwzięcie artystyczno-naukowe – mający na celu stworzenie skóry zbrojonej pajęczą siecią, inspirowany głównie przez cykl filmów pt. „Spiderman”, wykorzystał fakt, że pajęczyna jest czterokrotnie mocniejsza niż kevlar, z którego wytwarza się kamizelki kuloodporne. Artystyczny performance artystki Jalily Essaidi wymagał współpracy międzynarodowego zespołu. Na pierwszym etapie w laboratorium biologii syntetycznej Uniwersytetu Stanowego w Utah zmodyfikowane genetycznie kozy i jedwabniki wytworzyły pajęczą nić, następnie kokony zostały wysłane do Korei Południowej, gdzie pajęczy jedwab został uprzędzony. Następnie pajęczy jedwab przyjechał do Europy, gdzie w Niemczech upleciono z niego niezwykle cienką tkaninę. Tkanina ta została powleczona przez biochemików z Uniwersytetu w Lejdzie (Holandia) hodowaną in-vitro skórą, co zajęło pięć tygodni. Efekt możecie zobaczyć na filmie: http://www.newscientist.com/blogs/nstv/2012/01/stronger-than-steel-spider-silk-sk in-takes-a-bullet.html Niestety, kula o prędkości 329 metrów na sekundę przebija wzmocnioną pajęczą nicią skórę i tylko przy prędkości dwukrotnie mniejszej pocisk jest zatrzymywany. Oczywiście w „normalnych” warunkach nawet kula lecąca z prędkością 150 m/s z łatwością przebija ludzką skórę – nawet skórę wzmocnioną „ zwykłym jedwabiem”. Fundacja Canon - stypendia w Japonii źródło - opracowanie własne Westgard: czy diagnostyka molekularna nauczy się na błędach analityki ogólnej? Jakość w diagnostyce molekularnej to temat bardzo gorący, wzbudza emocje nie tylko w Polsce, ale na całym świecie. Zwrócili nań uwagę także Westgardowie. Co syn prof. Westgarda, największego autorytetu w dziedzinie kontroli jakości w diagnostyce, ma do powiedzenia na temat QC w biologii molekularnej? Sten Westgard, syn słynnego autora „reguł Westgarda” stosowanych w większości dobrych laboratoriów, jest autorem niezwykle cennego serwisu internetowego „Westgard QC”, w którym ostatnio poruszył temat kontroli jakości w diagnostyce molekularnej. Jest to temat trudny, gdyż wiele metod molekularnych w ogóle nie pasuje do schematów kontroli jakości ogólnie przyjętych jako złoty standard. O ile powoli oswajane są pomiary ilościowe i jakościowe w wirusologii molekularnej, o tyle cała sfera rzadkich chorób dziedzicznych i genetycznych defektów nabytych pozostaje swoistą terra incognita. Przede wszystkim nie istnieją produkowane i dystrybuowane odgórnie kontrole jakości-o czym boleśnie przekonujemy się także w Polsce. Wg kryteriów QC opracowanych w Stanach, każdy mierzony analit powinien być odnoszony do przygotowanego na zewnątrz laboratorium, wystandaryzowanego materiału referencyjnego. Co więcej, jeżeli analitów mierzone jest naraz więcej, każdy z nich musi mieć swoją kontrolę odniesienia. Westgard jr. powołuje się na artykuł państwa C. Rundella i J. Gordon, w którym autorzy zwracają uwagę na najnowocześniejsze zdobycze biologii molekularnej: na techniki mikromacierzy i sekwencjonowania genomowego, w których ilość różnych mierzonych analitów jest tak ogromna, że sam pomysł zastosowania kontroli dla każdego z nich wydaje się śmieszny i niedorzeczny. Westgard zauważa także, że sprawdzone i stosowane od lat sposoby kontroli jakości w laboratorium molekularnym są bardzo racjonalne, a nawet wystarczające w diagnostyce. Twierdzi on również, że przestawianie się na siłę z tych sprawdzonych sposobów kontroli jakości na odgórnie nakazane metody stosowane w analityce ogólnej (nie przystające do realiów diagnostyki molekularnej) to ślepa uliczka, która zaowocuje „powielaniem błędów chemii klinicznej” Autor wskazuje także na inny aspekt kontroli jakości, który nie przystaje do realiów diagnostyki molekularnej: kryterium 2SD (2x odchylenie standardowe) jako kryterium jakości wyniku badania materiału kontrolnego. Np. Real-Time PCR częstokroć operuje na wartościach istotnych klinicznie w skali log10, co sprawia że dwukrotna zmiana poziomu transkryptu nie jest traktowana jako znacząca, co więcej oznaczać może brak zmian istotnych diagnostycznie. Dlatego w podobnych przypadkach należałoby przemyśleć rozluźnienie kryterium 2SD. Jak wiemy z wypowiedzi Pani Prezes Krajowej Izby Diagnostów, dla ustawodawcy chemia kliniczna jest szablonem i modelem, wobec którego są tworzone standardy jakości także w genetyce molekularnej. Artykuł p. Westgarda i cytowanych przez niego profesjonalistów w dziedzinie QC dowodzi, że jest to karygodny błąd, który nie tylko nie poprawi sytuacji, ale może powielić błędy, które zostały już kiedyś popełnione, opóźniając tym samym zarówno rozwój jak i nadzór nad jakością oznaczeń molekularnych! Fundacja Canon - stypendia w Japonii źródło - opracowanie własne Źródło: Westgard QC Medical Laboratory Observer Marzena Wojtaszewska Konferencja – terapia fagowa i szczepionki nieswoiste W Krakowie, 22 maja 2015 r. (piątek) w godz. 10:00-14:00 odbędzie się konferencja naukowo – szkoleniowa: „Postępy w profilaktyce i leczeniu zakażeń bakteryjnych: terapia fagowa i szczepionki nieswoiste jako alternatywa dla antybiotyków”. Wydarzenie odbędzie się w Katedrze Chorób Wewnętrznych UJ CM w Krakowie. Głównym celem konferencji jest nakreślenie narastającego problemu lekooporności bakterii, która jawi się jednym z największych wyzwań współczesnej medycyny. Eksperci, organizacje międzynarodowe, periodyki naukowe i medyczne alarmują o tym zagrożeniu wzywając do podjęcia niezbędnych działań i badań naukowych aby mu przeciwdziałać. Podczas spotkania dowiecie się jakie są aktualne możliwości wykorzystania wirusów bakteryjnych – bakteriofagów oraz szczepionek nieswoistych w leczeniu antybiotykoopornych zakażeń bakteryjnych. Wydarzenie organizowane jest przez Ośrodek Terapii Fagowej Centrum Medycznego Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu we współpracy z Instytutem Biotechnologii Surowic i Szczepionek BIOMED S.A. w Krakowie. Konferencja jest okazją do wysłuchania wykładów zaproszonych gości oraz lekarzy pracujących w Ośrodku Terapii Fagowej i jego krakowskiej filii. Lekarze otrzymają 4 punkty edukacyjne. Fundacja Canon - stypendia w Japonii źródło - opracowanie własne Termin: 22 maja 2015 r. (piątek) godz. 10:00-14:00 Miejsce: sala wykładowa II Katedra Chorób Wewnętrznych UJ CM im. prof. Andrzeja Szczeklika Szpital Uniwersytecki przy ul. Skawińskiej 8 w Krakowie. Rejestracja elektroniczna dla lekarzy: http://mp.pl/biomed/terapiafagowa Informacja o konferencji i zapisach dla uczestników niebędących lekarzami: tel. 71 370 99 01, e-mail [email protected]. PROGRAM: http://www.biomed.pl/resources/plakat_konferencja_22.05.2015.pdf Co wiemy o fluorescencyjnych białkach Najlepiej znanym białkiem fluorescencyjnym jest białko zielonej fluorescencji (ang. Green Fluorescent Protein, GFP), które w 1962 roku zostało wyizolowane z meduzy Aequorea victoria przez Osamu Shimomurę. Przez pierwsze 30 lat od momentu odkrycia tego białka budziło ono zainteresowanie jedynie niewielkiej garstki naukowców, którzy zajmowali się badaniami luminescencji organizmów morskich. Jednak największą uwagę uzyskało w 1992 roku, kiedy poznano jego podstawową strukturę oraz w 1994 roku kiedy użyto go po raz pierwszy jako znacznik fluorescencyjny do znakowania in vivo [1]. GFP jest niewielkim białkiem o masie 25,9 kDa. Tworzy ono strukturę beta-baryłki głównie z dwurzędowych struktur beta-harmonijek. Chromofor znajdujący się w środku struktury baryłki zbudowany jest z trzech aminokwasów: Ser65-Tyr66Gly67, poddanych posttranslacyjnej cyklizacji i oksydacji [3]. Źródło: Wikimedia Commons, autor: Richard Wheeler, licencja: CC BYSA 3.0 Ryc. 1. Struktura przestrzenna GFP Coraz częstsze stosowanie GFP spowodowało, że zaczęto poszukiwać jego ulepszonych wariantów. Wprowadzane modyfikacje polegały głównie na: zmniejszeniu tendencji do oligomeryzacji i wrażliwości na pH, rozszerzeniu zakresu spektralnego, zwiększeniu intensywności fluorescencji i fotostabilności białka, a także przyspieszeniu dojrzewania chromoforu [3]. Białka fluorescencyjne oraz chromoproteiny z rodziny GFP składają się z 220-240 aminokwasów (25kDa). Ich struktura jest podobna do GFP i różni się jedynie w obrębie chromoforu w pozycji 65. Struktura baryłki jest stabilizowana poprzez wiele interakcji niekowalencyjnych, które zapewniają bardzo wysoką stabilność termiczną oraz odporność na proteolizę dzięki denaturacji chemicznej [1]. Przykładami są białka fluorescencyjne emitujące światło w różnych zakresach spektralnych poprzez wprowadzenie przypadkowych mutacji w GFP np. BFP (blue fluorescent protein) w zakresie niebieskim, CFP (cyan fluorecent protein) w niebiesko-zielonym oraz YFP (yellow fluorescent protein) w żółtym. Natomiast EGFP (enhanced green fluorescent protein) uzyskano wymieniając dwa aminokwasy w obrębie chromoforu GFP. Białko to wykazuje znacznie wyższą (ponad 35 razy) intensywność fluorescencji w porównaniu do GFP oraz obniżoną tendencję do agregacji w 37°C [3]. Białka fluorescencyjne odkryto również w naturalnych źródłach, między innymi od koralowcach, ukwiałach, meduzach, skorupiakach, a nawet najprostszych strunowcach [2]. Aktualnie GFP oraz jego pochodne są wykorzystywane w wielu badaniach organizacji oraz funkcjonowania systemów życiowych. Interakcja między białkami w organizmie a białkami fluorescencji pozwala zaobserwować m. in. ich lokalizację, ruch, obroty a nawet ich „starzenie się”. Kwasy nukleinowe mogą być również znakowane poprzez RNA lub DNA. Białka fluorescencyjne ukierunkowane do organelli komórkowych poprzez białka sygnałowe umożliwiają wizualizację między innymi ich morfologii, syntezy i rozszczepienia oraz segregacji podczas podziału komórki. Są one również niezbędnymi narzędziami do znakowania pojedynczych komórek oraz tkanek, dzięki czemu można obserwować ich morfologię, położenie i ruch (np. podczas rozwoju embrionalnego lub tumorogenezy) oraz ich etapy mitotyczne. Znakowane mogą być również całe organizmy, w celu odróżnienia tych transgenicznych od naturalnie występujących, oraz dla celów całkiem nienaukowych np. akwarium z kolorowymi rybkami lub zwierzęta domowe w nietypowych kolorach [1]. Źródło: Wikimedia Commons, autor Nathan Shaner, licencja CC BY-SA 3.0 Ryc.2. Plaża w San Diego narysowana żywymi bakteriami z mutacjami odpowiadającymi ośmiu różnym kolorom białek fluorescencyjnych ( pochodzących z GFP i dsRed) Główną zaletą białek fluorescencyjnych jest możliwość prowadzenia obserwacji innych białek, kompleksów oraz określonych fragmentów chromosomów w żywej komórce w czasie rzeczywistym, oraz brak toksycznego wpływu na bakterie i organizmy eukariotyczne. Główną natomiast wadą GFP jest tendencja do tworzenia nierozpuszczalnych agregatów, zwłaszcza w wyższych temperaturach, a fuzja z GFP może zaburzać natywną strukturę analizowanego białka [3]. Opracowano wiele technik, które wykorzystują znaczniki fluorescencyjne: metody BiFC i FRET są wykorzystywane do obserwacji oddziaływań białkowych w komórce w czasie rzeczywistym, a FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) jest techniką pozwalającą na badanie dynamiki białek w komórkach. Metoda ta polega na wygaszeniu fluorescencji we fragmencie struktury subkomórkowej, która zawiera znakowane fluorescencyjnie białko [3]. W 2008 roku Osamu Shimomura, Martin Chalfie i Roger Tsien otrzymali nagrodę Nobla za odkrycie i rozwój białka zielonej fluorescencji. Ich dokonania umożliwiły udoskonalenie technik fluorescencyjnych, co wpłynęło na bardziej szczegółowe odkrycia w zakresie badania komórki. Poznano strukturę wewnętrzną komórki bakteryjnej, dzięki czemu obalono wcześniejszą teorię, iż nie posiada ona struktur subkomórkowych. Techniki te wykorzystywane są również w mikrobiologii oraz w medycynie. Agnieszka Staniczek Piśmiennictwo: 1. Chudakov DM. et al. Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging Living Cells and Tissues. Physiol Rev, 2010; 90: 1103-1163. 2. Wiedenmann J. et al. Fluorescent Proteins for Live Cell Imaging: Opportunities, Limitations, and Challenges. Life, 2009; 61, 11: 1029-1042. 3. Donczew M. i wsp. Odsłona tajemnic komórki bakteryjnej – zastosowanie nowych technik mikroskopii fluorescencyjnej. Postępy Hig Med Dosw, 2011; 65: 114-123. Gravity flow – krok naprzód w dziedzinie izolacji DNA Grawitację odczuwamy na co dzień. Jest ona zjawiskiem tak oczywistym i powszechnym, że nie zastanawiamy się nawet nad jej istnieniem. Naukowcy z firmy A&A Biotechnology postanowili skorzystać z siły grawitacji aby znacznie uprościć i przyspieszyć proces izolacji DNA. Jak to działa? Tradycyjne metody wykorzystujące różnego rodzaju złoża do izolacji kwasów nukleinowych wymagają specjalnych urządzeń takich jak: wirówki, pompy próżniowe lub generatory pola magnetycznego. Urządzenia te są niezbędne do wytworzenia sił napędzających kolejne etapy izolacji. Metoda przepływu grawitacyjnego (Gravity flow) opracowana przez A&A Biotechnology korzysta jedynie z naturalnej siły grawitacji i zjawisk kapilarnych. Dzięki specjalnie opracowanej membranie jonowymiennej i probówce odbierającej możliwy jest swobodny przepływ roztworów i elucja wyizolowanego DNA. Metoda Gravity flow. Specjalnie opracowana membrana i probówka lub płytka odbierająca pozwala na swobodny przepływ roztworów pod wpływem siły grawitacji. Tak zaprojektowany układ pozwala zredukować do minimum wszelkie czynności manualne oraz potrzebę stosowania dodatkowych urządzeń. Dzięki temu metoda jest wyjątkowo prosta, szybka i płynna. Dodawanie i przepływ kolejnych roztworów w metodzie Gravity flow przebiega płynnie, bez potrzeby wirowania i wymiany probówek odbierających. Porównanie izolacji DNA metodą wirówkową oraz Gravity flow Ilość czynności manualnych potrzebnych do przeprowadzenia izolacji metodą grawitacyjną w porównaniu do metody wirówkowej jest znacznie mniejsza. Gravity flow na żywo Manualna izolacja DNA metodą Gravity flow. Izolacja DNA metodą Gravity flow z wykorzystaniem Stacji Pipetującej epMotion®. Cztery powody, dla których warto izolować DNA metodą Gravity flow. 1. Wyjątkowa prostota, szybkość i płynność procedury Po przeprowadzeniu lizy do izolacji potrzebny jest jedynie statyw i pipeta. Aż do momentu elucji reszta czynności polega jedynie na dodawaniu kolejnych roztworów. Jest to najprostsze i bardzo wygodne dla każdego rozwiązanie, niezwykle pomocne do celów dydaktycznych oraz dla osób zabezpieczających próbki poza laboratorium np.próbki środowiskowe. Wszystkie kroki izolacji, aż do samej elucji odbywają się z wykorzystaniem jednej probówki odbierającej. To znacznie zmniejsza ilość czynności manualnych i tym samym okazji do popełnienia pomyłki lub kontaminacji próbek. Mniejsza ilość probówek to także mniejsza ilość plastikowych odpadów. 2. Elastyczność Metoda Gravity flow uniezależnia nas od planowania i oczekiwania na zajęte urządzenia laboratoryjne. Kolejne etapy izolacji nie wymagają nadzoru, a w razie potrzeby można robić pomiędzy nimi przerwy. 3. Większa wydajność W porównaniu do innych metod izolacji, metoda Gravity flow pozwala na uzyskanie do 50 % więcej czystego DNA z tej samej ilości materiału. 4. Łatwość automatyzacji Z uwagi na wyjątkowo nieskomplikowaną procedurę i małą ilość kroków, metoda Gravity flow jest idealna do zastosowania w wielu, nawet najprostszych modelach urządzeń typu liquid handler, na przykład w formacie płytek 96. Właściwy czas, żeby się przekonać Firma A&A Biotechnology do końca roku ustala 40 % rabat na wszystkie swoje zestawy do izolacji DNA metodą grawitacyjną. Ponadto oferujemy darmowe zestawy demonstracyjne oraz nagrody za wypróbowanie tej innowacyjnej metody i podzielenie się z nami swoją opinią. Więcej na www.aabiot.com/gravity Zapraszamy! Identyfikacja roślin i grzybów w medycynie sądowej Standardowe postępowanie podczas izolacji DNA z roślin Ekstrakcja DNA z tkanek roślinnych może się różnić w zależności od użytego materiału. Zasadniczo wszelkie mechaniczne środki niszczą ścianę komórkową i błony, umożliwiając tym samym dostęp do materiału jądrowego bez jego degradacji. Zazwyczaj w celu zniszczenia ściany komórkowej stosuje się rozcieranie tkanki roślinnej (ok. 200 mg) w moździerzu lub mielenie w homogenizatorze z wykorzystaniem ciekłego azotu, co pozwala na dostanie się do DNA, z jednoczesnym inaktywowaniem enzymów wewnątrzkomórkowych. W momencie, gdy tkanka zostanie dostatecznie zmielona, może zostać zawieszona w odpowiednim buforze. W celu oczyszczenia, cząstki stałe usuwane są przez wirowanie, a rozpuszczalne białka i inne cząsteczki są rozdzielane przez mieszanie z chloroforem i wirowanie. Następnie, DNA może być wytrącone z fazy wodnej i dokładnie przemyte, by usunąć zanieczyszczające próbkę sole. Oczyszczone DNA można przechowywać zawieszone w sterylnej wodzie lub buforze TE. Taki sposób postępowania, okazał się dawać nienaruszone genomowe DNA z tkanek roślinnych, przez co właśnie ta procedura jest dość znana i często wykorzystywana podczas izolacji DNA z materiału roślinnego. Modyfikacje standardowych metod izolacji W 1984 roku, Saghai-Maroof i wsp., opracowali szybką i stosunkowo niedrogą metodę izolacji DNA z materiału roślinnego, która stała się alternatywą do ówcześnie wykorzystywanej długiej, drogiej i mało wydajnej procedury izolacji z liści soi. W przedstawionej metodzie stosowano bromek heksadecylotriametyloamonu (CTAB) i liofilizowane tkanki. Procedura ta cieszyła się sporym powodzeniem, do czasu gdy J.A.Doyle i J.L. Doyle w 1987 roku wprowadzili do niej pewne modyfikacje. Wtedy to ich ulepszona metoda została uznana za skuteczną w izolacji kwasów nukleinowych ze świeżych liści, a także w odniesieniu do suszonej masy liściowej, dzięki czemu stała się powszechnie stosowaną metodą izolacji roślinnego DNA. W modyfikacji Doyle’a 1mg tkanki (liść)i miele się w moździerzu z gorącym buforem CTAB. W trakcie izolacji do próbki dodaje się jedną objętość alkoholu izoamylowego, a na koniec próbkę ekstrahuje się jedną porcja izopropanolu. Ta uproszczona metoda pozwoliła na zmniejszenie potencjalnego zanieczyszczenia krzyżowego DNA, ponieważ izolacja wymaga tylko jednego transferu DNA. Stewart C.N i wsp. (1993), zastosowali zmodyfikowana metodę Doyle’a , uzyskując w trakcie izolacji wydajność DNA j równą ok. 150 do 360 g/g tkanki roślinnej. Wiele powszechnie wykorzystywanych technik izolacji DNA w biologii molekularnej roślin, opiera się na użyciu do ekstrakcji buforu CTAB (bromek heksadecylotrimetyloamoniowy) w połączeniu z homogenizacją tkanki w moździerzu. Pomimo, iż procedury te są proste wymagają użycia bardzo dużych ilości buforu (ok. 10 ml), zaś stosowane homogenizatory są wielokrotnego użytku, przez co wzrasta ryzyko krzyżowych zanieczyszczeń izolowanej próbki. Sytuacja taka jest niedopuszczalna, ze względu na pojawienie się w następstwie produktów niespecyficznych w reakcji PCR. Ostatnio opracowane metody ekstrakcji DNA mają na celu uniknięcie potencjalnej kontaminacji podczas izolacji. ITStest kit Stosowany w naszym Laboratorium kit (ITStest kit) umożliwi identyfikację genetyczną każdego rodzaju roślin i grzybów, która jest coraz szerzej wykorzystywana w różnych gałęziach nauki: od medycyny po przemysł. Opracowana przez nas technologia identyfikacji jest szybka i tania, a co najważniejsze daje powtarzalne wyniki. Specjalnie zaprojektowana reakcja PCR jest bardzo wrażliwa, dzięki czemu możliwa jest identyfikacja gatunków na podstawie nawet mocno zdegradowanego materiału DNA. Specjalnie zaprojektowane i zoptymalizowane startery do technologii ITStest , umożliwiają szybką i czułą identyfikację Internal Transcribed Spacer 1 (ITS1) i ITS2, występujących w rybosomalnym DNA (rDNA),. Rejony te są wysoce konserwatywne wśród gatunków. Tak więc, możliwa jest identyfikacja wszelkich gatunków i podgatunków, takich jak: Cleome hassleriana- fenotypowo bardzo podobnej do Cannabis sativa (marihuana), Metasequoia glyptostroboides, Delonis regia, Euterpe oleracea , drzew owocowych, nasion oraz roślin wykorzystywanych w przemyśle. Ponadto, zestaw pozwala identyfikować grzyby, zarówno te wykorzystywane w przemyśle spożywczym, farmakologicznym, jak i grzyby chorobotwórcze. Jądrowy region DNA – ITS1 i ITS2 Geny rybosomalnego RNA (rRNA) należą do klasycznej rodziny genowej, której członkowie mają identyczną lub prawie identyczną sekwencję. W genomie roślin i grzybów występuje wiele powtórzeń jednostki zawierającej geny rybosomalnego RNA: 18S, 5,8S i 28S oraz wewnętrzne sekwencje transkrybowane tj.: ITS1 i ITS2 .Geny kodujące rybosomalne RNA występują w powtórzeniach tandemowych będących w tysiącach egzemplarzy. Na podstawie analizy regionów ITS1 oraz ITS2 (genetycznych markerów) możliwe jest rozróżnienie podobnych do siebie morfologicznie gatunków. Analiza sekwencyjna polimorficznych niekodujących regionów jądrowego DNA (ang. internal transcribed spacers – ITS1 i ITS2), jest z powodzeniem stosowana do badań taksonomicznych zwierząt, roślin i grzybów. Wykorzystanie genotypowania roślin w kryminalistyce Najnowsze osiągnięcia w dziedzinie badań DNA mają bezpośredni wpływ na wiele dyscyplin nauk przyrodniczych. Wśród wielu zastosowań genetyki molekularnej, wykorzystanie jej w toksykologii sądowej, do określania gatunków i geograficznego pochodzenia nielegalnych roślin, wydaje się być jednym z najbardziej obiecujących nurtów nauki opartej na identyfikacji roślin. Możliwości zastosowania technik biologii molekularnej w toksykologii zostały coraz szerzej zauważone, co w konsekwencji dało początek osobnej dyscyplinie naukowej znanej jako toksykologia molekularna lub toksygenetyka. Analiza polimorfizmu DNA jest obecnie bardzo powszechnie stosowana w celu identyfikacji zarówno zwierząt jak i roślin. Materiał roślinny zbierany przez policję dostarczany jest do laboratoriów toksykologicznych i kryminalistycznych, w celu określenia gatunków i ustalenia, czy zawiera on substancje odurzające. W większości przypadków materiał ten jest rozdrobniony i wysuszony, co sprawia, że w praktyce nie można ustalić gatunku roślin lub grzybów według klasycznego podejścia botanicznego na podstawie mikroskopowej oceny morfologicznej. Co więcej, analiza mikroskopowa przeprowadzona np. dla roślin konopi (opierająca się na obserwacji struktur charakterystycznych dla konopi takich jak: gruczoły włosków (włoski), czy obecność związków szczawianu wapnia) nie mogą być wystarczająco wiarygodne. Cechy te brane pod uwagę w trakcie mikroskopowej identyfikacji konopi, ujawniły obecność więcej niż 80 różnych gatunków tych roślin. W takim przypadku, kryminolodzy ratują się analizą chromatograficzna, umożliwiającą wykrycie substancji czynnej, typowej dla danej rośliny. Niestety, i ta metoda nie sprawdza się we wszystkich przypadkach, ponieważ posiadanie zbyt małej ilości dostarczonej próbki powoduje, że analiza chromatograficzna staje się bardzo trudna lub wręcz niemożliwa do wykonania. Trudności analityczne identyfikacji wynikają także z faktu, że wiele związków chemicznych, w tym obecne w konopiach THC (tetrahydrocannabinol), są wrażliwe na czynniki chemiczne i fizyczne, a tym samym łatwo ulegają degradacji. W związku z tym, najlepsza metoda identyfikacji opiera się na wykorzystaniu metod genetycznych, które dają jednoznaczne i pewne wyniki. Dodatkowo, izolacja DNA może być przeprowadzona z małej ilości pozostałego materiału roślinnego obecnego np. w kieszeniach handlarzy narkotyków, bądź znajdującego się na obiektach lub banknotach używanych przez osoby, które mają kontakt z lekami pochodzenia roślinnego. Konopie są roślinami charakteryzującymi się dużą zmiennością, dzięki czemu na podstawie tej zmienności możliwe jest określenie geograficznego pochodzenia okazów Cannabis zebranych przez policję. Jagadish i wsp. wykazali, że dzięki badaniom genetycznym możliwe jest nie tylko odróżnienie od siebie gatunków badanych roślin, ale także porównanie gatunków Cannabis sativa zbieranych z różnych plantacji (populacje) ujawniające różne sekwencje DNA. Gillan i wsp. przeprowadzili identyfikację Cannabis sativa za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) oraz metodami genetycznymi. W rezultacie, okazało się, że metody genetyczne dają bardziej wiarygodne wyniki i możliwość rozróżniania poszczególnych okazów, czego nie da się określić wykonując analizę HPLC. Genetyczna analiza DNA może być stosowana do identyfikacji praktycznie wszystkich organizmów. Lee i wsp. udowodnili, że ma ona bardzo skuteczne zastosowanie do identyfikacji nie tylko Cannabis sativa, ale i do identyfikacji halucynogennych grzybów z rodziny Panaeolus i Psilocybe. Identyfikacja grzybów Genom grzybow zawiera region kodujący podjednostki rybosomów, ktory nazywany jest rybosomalnym DNA (rDNA). W obrębie rDNA wyrożnia się region niekodujący tj. IGS (ang. intergenic spacer region). Region IGS zawiera fragmenty ETS1 i ETS2 (ang. external transcribed spacer), regiony kodujące elementy strukturalne rybosomu tj.: 18S, 5,8S, 28S oraz wewnętrzne regiony niekodujące określane mianem ITS1 i ITS2 (ang. internal transcribed spacer).W analizie grzybów największe znaczenie fragmenty ITS, które charakteryzują się dużą zmiennośćią międzygatunkową. Fragmenty te wykorzystywane są nie tylko w klasyfikacji taksonomicznej grzybów, ale mogą być też z powodzeniem wykorzystane jako markery molekularne w identyfikacji rodzajowej i gatunkowej. Standardową metodą identyfikacji gatunkowej grzybów jest analiza morfologiczna, na którą składa się obserwacje makro- i mikroskopowe. Przeprowadzana analiza makroskopowa polega na określeniu kilku parametrów tj.: koloru, rozmiaru i charakterystycznych struktur grzybów. Długotrwała i pracochłonna obserwacja mikroskopowa opiera się głównie na porównywaniu wyglądu zarodników, co nie zawsze daje zadowalające rezultaty. Szczególne trudności w analizie napotyka się w przypadkach, które bezpośrednio dotyczą zatruć grzybami, ponieważ zabezpieczone resztki pokarmu oraz popłuczyny z treści żołądka, to materiał często bardzo silnie zdegradowany, w związku z czym nawet doświadczony mikolog może napotkać problemy z analizą morfologiczną dostarczonych w takiej postaci próbek. Tak samo obserwacje mikroskopowe sproszkowanych elementów grzybów halucynogennych sprawiają wiele problemów. Co ciekawe, zdarza się, że cechy morfologiczne (szczególnie zarodniki) są podobne u grzybów należących do gatunków trujących, jak i do tych, które są nietoksyczne. W preparacie mikroskopowym, zarodniki dobrze znanegomuchomora sromotnikowego (Amanita phalloides) mogą zostać pomylone z kroplami tłuszczu, które licznie występują w treści pokarmowej. Trudności identyfikacyjnemogą sprawiać także zarodniki gatunków blisko spokrewnionych, m.in. muchomora sromotnikowego jadowitego czy wiosennego. Identyfikacja roślin i grzybów jest coraz szerzej stosowana. Wiąże się to zarówno z nielegalnym handlem i rozpowszechnianiem zakazanych gatunków roślin (w tym zawierających substancje narkotyczne), jak i z identyfikacją gatunkową roślin zabezpieczonych na miejscu przestępstwa. Aktualnie, pojawia się coraz więcej przypadków kiedy wymaga jest identyfikacja genetyczna roślin, a szczególnie, gdy dane rośliny zajmują charakterystyczne nisze ekologiczne. Rozważając wyżej opisane przykłady, mamy jednoznaczne potwierdzenie, że wykorzystywana w naszym Laboratorium metoda identyfikacji roślin i grzybów jest innowacyjna i niezwykle przydatna. Co więcej, pozwala wyeliminować przeszkody identyfikacji danego gatunku związane ze zbyt małą porcją próbki do analizy, ponieważ dzięki naszemu kitowi ITStest skutecznie wyeliminowaliśmy ten problem. Przeprowadzana przez nas analiza genetyczna umożliwia pozyskanie informacji niemożliwych do uzyskania za pomocą standardowych metod biochemicznych, bądź kiedy zawodzi nawet tak znana metoda jak HPLC. Przykłady wykorzystania analizy ITS1 i ITS2: – analiza sekwencji regionów ITS1 i ITS2 nrDNA (Nuclear ribosomal DNA) ma zastosowanie do identyfikacji gatunkowej grzybów trujących i halucynogennych dla celów sądowych- identyfikacja grzybów wykorzystywanych w przemyśle spożywczym i farmakologicznym- identyfikacja grzybów chorobotwórczych (wywołujących objawy patologiczne)- zastosowanie w medycynie i kryminalistyceidentyfikacja genetyczna gatunków wykorzystywana w botanice- identyfikacja ras geograficznych – systematyka molekularna na poziomie gatunku- bezpieczeństwo żywności pochodzącej z nowoczesnej biotechnologii- Wykrywanie patogenów grzybowych w żywności (np. w uprawie, koncentraty spożywcze), oraz patogenów roślin ( wykorzystanie w rolnictwie)- Kontrola jakości w przemyśle spożywczym Literatura: 1) Armbruster G.F.J., Korte A. 2006. Genomic nucleotide variation in the ITS1 rDNA spacer of landsnails. J. Molluscan Studies 72: 211–219. 2) Kallersjo M., Von Proschwitz T., Lundberg S., Eldenas P., Erseus C. 2005. Evaluation of ITS rDNA as a complement to mitochondrial gene sequences for phylogenetic studies in freshwater mussels: an example using Unionidae from north-western Europe. Zool. Scripta 34: 415–424 3) Kałuski T., Soroka M., Kozłowski J., 2011. ZMIENNOŚĆ TRZECH EUROPEJSKICH GATUNKÓW ŚLIMAKÓW Z RODZAJU ARION W ŚWIETLE BADAŃ MOLEKULARNYCH. Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 51 (3) 2011 4) Piotrowski P., Grzybowski T., Śliwka K.. THE POSSIBILITIES OF APPLYING MOLECULAR BIOLOGY TECHNIQUES TO FORENSIC TOXICOLOGY 5) Zuber A, Kowalczyk M, Sekuła A , Mleczko P, Kupiec T,2011. Methods used in species identification of hallucinogenic and other poisonous mushrooms in forensic investigations. Problems of Forensic Sciences 2011, vol. LXXXVI, 151–161 6) Doyle J.A., Doyle J.L., 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin (1987) Volume: 19, Issue: 1, Pages: 11-15Doyle, J.J., Dickson E.E., 1987. Preservation of plant samples for DNA restriction endonuclease analysis. Taxon 36: 715-722. 7) Doyle, J.J., Doyle J.L., 1990. A rapid total DNA preparation procedure for fresh plant tissue. Focus 12: 13-15. 8)Doyle, J.J.,1991. DNA protocol for plants. Pp. 283-293 in: Hewitt G, Johnson A.W.B., Young J.P.W., Molecular techniques in Taxonomy. NATO ASI Series H, Cell BiologyVol.57. 9) Stewart C.N.,Jr., Via L.E., 1993. A Rapid CTAB DNA Isolation Technique Useful for RAPD Fingerprinting and Other PCR Applications. BioTechniques 1993 article Vol. 14(5):748-749 10) http://www.cilr.uq.edu.au/UserImages/File/Plant%20Genomic%20DNA%20Extract ion%20by%20CTAB%20_2__Fiona.pdf 11) Schoch C.L., Seifert K.A., Huhndorf S., Robert V., Spouge J.L., Levesque C.A., Chen W., and Fungal Barcoding Consortium. Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America PNAS. Vol 109, no 16. Conrad L. Schoch, 6241–6246 12) Mecler I., Nawrot U., 2008. Metody molekularne stosowane w identyfikacji grzybów z rodzaju Candida. Mikologia Lekarska 2008, 15 (2): 99-103 Lidia Koperwas Krążące DNA nowotworowy jako marker Naukowcy z Uniwersytetu Stanford School of Medicine pracują nad nowatorską metodą wykrywania litych guzów nowotworowych przy pomocy badania krwi. Już wcześniej krążące DNA nowotworowe (ctDNA) pojawiło się jako obiecująca możliwość nieinwazyjnego wykrywania chorób nowotworowych. W artykule opublikowanym w Nature Medicine przeanalizowano zastosowanie pomiaru poziomu ctDNA u pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc (NSCLC). NSCLC obejmuje zdecydowaną większość nowotworów tego narządu, w tym gruczolakoraka, raka płaskonabłonkowego i raka wielkokomórkowego. Nowotworowe DNA różni się od normalnego obecnością mutacji w sekwencji nukleotydów. Mutacje te powstają przypadkowo podczas podziału komórkowego i odpowiedzialne są między innymi za niekontrolowany wzrost komórek nowotworowych. Mutacje wtórne mogą być przyczyną powstawania oporności na leczenie przeciwnowotworowe. Komórki nowotworowe, gdy umierają uwalniają DNA do krwioobiegu. Nawet u pacjentów z zaawansowaną chorobą nowotworową, zdecydowana większość krążącego we krwi DNA pochodzi z komórek nie zmienionych nowotworowo. W celu wykrywania bardzo małych ilości ctDNA konieczne było zwiększenie czułości metody stosowanej do jego oznaczania. Wobec tego naukowcy opracowali metodę Capp-Seq – ultraczułą metodę sekwencjonowania nowotworowego DNA, która wykrywa 1 cząsteczkę ctDNA na 10000 nie zmienionych nowotworowo cząsteczek DNA. Wyzwaniem dla nauki jest znalezienie takich sekwencji DNA, których występowanie jest najbardziej prawdopodobne dla danego nowotworu. Dlatego zespół naukowców przeanalizował dane uzyskane od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc pod kątem charakterystycznych dla tego nowotworu mutacji, zebranych w atlasie genomów (The Cancer Genome Atlas). W pracy zbadano genom 407 pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc. Zidentyfikowano 139 genów, które są zmutowane w badanym nowotworze i które stanowią jedynie 0,004% ludzkiego genomu. ctDNA wykryto u blisko 50% pacjentów z rakiem płuc w I stadium zaawansowania choroby i u 100% w II-IV stadium choroby. Co więcej naukowcy wykazali silną korelację między ilością krążącego DNA nowotworowego, a przybliżoną objętością guza widocznego w badaniu obrazowym. Zespół naukowców obecnie opracowuje badanie kliniczne, oceniające zastosowanie Capp-Seq oraz dąży do rozszerzenia techniki dla innych typów nowotworów. Fundacja Canon - stypendia w Japonii źródło - opracowanie własne Opracowanie testu, który miałby możliwość szybkiego i nieinwazyjnego wykrywania niewielkich stężeń DNA, pochodzących z komórek nowotworowych byłby szansą nie tylko na monitorowanie leczenia i wielkości guza, ale również mógłby mieć szansę stać się podstawą przesiewowego wykrywania nowotworów. Piśmiennictwo: 1. Newman M.A., Bratman V.S., Diehn M. et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nature Medicine, 2014 2. Conger K. Blood test could provide rapid, accurate method of detecting solid cancers, study finds. Stanford School of Medicine, 6 Apr 2014 Viscolase firmy A&A Biotechnology Firma A&A Biotechnology jest producentem blisko 200 produktów obejmujących zestawy do izolacji kwasów nukleinowych (DNA, RNA) z różnorodnych źródeł materiału biologicznego,odczynniki do reakcji PCR, Real-Time PCR, Hot-Start PCR, rekombinowane białka i enzymy lityczne. Nowością na rynku jest Viscolasa, która pozwala uniknąć problemu gęstych i lepkich preparatyk białkowych. Viscolasa jest rekombinowaną nukleazą o szerokim spektrum aktywności. Produkowana jest w unikalnym systemie drożdżowym. Enzym posiada aktywność endonuleazy degradującej wszystkie formy DNA i RNA do polinukleotydów o długości od 2 do 5 zasad i jest aktywny w szerokim zakresie buforowym. Do swojej aktywności wymaga jonów magnezu. Zastosowanie: 1. Zmniejszenie lepkości lizatów komórkowych (bakteryjnych, drożdżowych, ssaczych, itp.); 2. Przygotowanie próbek do rozdziału białek w elektroforezie 2D; 3. Usuwanie DNA i RNA z preparatów białek rekombinowanych. Viscolase jest dostępna w opakowaniach po 25 000 U, 100 000 U w stężeniu 250 U/μl. Definicja jednostki: 1 U Viscolase jest zdefiniowana jako ilość enzymu powodująca zmianę absorpcji roztworu DNA A260 o 1,0 jednostkę w czasie 30 min, co odpowiada całkowitemu strawieniu 37 μg DNA. Na stronach sklepu internetowego A&A Biotechnology dostępne są opakowania po 25 000 U i 100 000 U w stężeniu 250 U/μl. Nukleaza Viscolase o stężeniu 250 U/µl jest dostarczona w buforze zawierającym: 50% glicerol, 20 MM Tris-HCl ph 8.0, 20 mM NaCl oraz 2 mM MgCl. W preparacie nie stwierdzono aktywności proteolitycznej. Enzym może być stosowany w połączeniu z powszechnie używanymi lizozymami. Fundacja Canon - stypendia w Japonii źródło - opracowanie własne *** Więcej informacji o Viscolasie oraz innych produktach znaleźć można na stronie internetowej firmy A&A Biotechnology. Gorąca kartka na Walentynki dla naukowca Bardzo spodobała nam się ta znaleziona w sieci kartka walentynkowa dla naukowca. źródło: Medical Laboratory and Biomedical Science
