Chromatografia cienkowarstwowa

Chromatografia cienkowarstwowa
Wstęp
Badanie szeregu złoŜonych mieszanin substancji nastręcza niejednokrotnie wielu trudności. Do
analizy skomplikowanych mieszanin wykorzystuje się między innymi procesy chromatograficzne
odznaczające się wysoką sprawnością stwarzające moŜ1iwości oznaczeń ilościowych. Rozdział
substancji w procesach chromatograficznych następuje wskutek róŜnic szybkości migracji
składników mieszanin w układach złoŜonych z 2 faz: fazy nieruchomej i ruchomej. Termin
„chromatografia” wprowadził rosyjski botanik Cwiet, twórca tej metody, który rozdzielał
mieszaniny barwników roślinnych w kolumnie wypełnionej sproszkowanym węglanem wapnia.
ChociaŜ w chwili obecnej stosuje się chromatografię nie tylko do analizy substancji barwnych
powyŜsza nazwa utrwaliła się. RozróŜniamy obecnie metody chromatografii gazowej (gdy fazą
ruchomą jest gaz) i cieczowej (faza ruchoma jest cieczą). Procesy chromatograficzne moŜna
prowadzić w kolumnie (chromatografia kolumnowa) albo na płaszczyźnie (chromatografia
planarna - bibułowa lub cienkowarstwowa). W zaleŜności od typu fazy nieruchomej rozróŜniamy
chromatografię adsorpcyjną, jonowymienną, podziałową, sitową i in. Cały wachlarz technik
chromatograficznych stworzył wielkie moŜliwości analizy skomplikowanych związków zarówno
organicznych jak i nieorganicznych. Godny podkreślenia jest znaczny udział tych technik
w rozwoju nauk chemicznych i biochemicznych naszego stulecia.
Podstawy teoretyczne chromatografii
a)
b)
c)
d)
zjawisko podziału
adsorpcja i desorpcja
wymiana jonowa
dyfuzja
Zjawisko podziału
Substancja, która znajdzie się w układzie 2 nie mieszających się ze sobą rozpuszczalników ulega
podziałowi między te rozpuszczalniki. Po osiągnięciu stanu równowagi stosunek stęŜeń
substancji w obu fazach ciekłych będzie stały w określonej temperaturze. Prawo podziału moŜna
zapisać w następującej postaci:
K = c1/c2
gdzie:
K - współczynnik podziału
c - stęŜenia substancji w rozpuszczalnikach 1 i 2
Adsorpcja i desorpcja
JeŜeli roztwór lub gaz zawierający pewną substancję graniczyć będzie z silnie rozwiniętą
powierzchnią ciała stałego, na granicy faz moŜna stwierdzić podwyŜszone stęŜenie tej substancji
w porównaniu z jej stęŜeniem w punktach oddalonych od granicy faz. Zjawisko tego typu nosi
nazwę adsorpcji. W zaleŜności od rodzaju sił powierzchniowych oddziałujących na substancję
rozróŜniamy adsorpcję fizyczną lub chemiczną (chemisorpcję). Adsorpcja fizyczna
spowodowana jest działaniem niewysyconych sił przyciągania międzycząsteczkowego,
1
występujących na granicy faz, tzw. sił Van der Waalsa. Jest to proces odwracalny,
i równowagowy. W przypadku zmiany warunków (temperatury, ciśnienia) albo zakłócenia
równowagi przez zmianę stęŜenia w pobliŜu granicy faz moŜe nastąpić zjawisko odwrotne do
adsorpcji - desorpcja. Proces chemisorpcji uzaleŜniony jest od sił natury chemicznej (wiązania
chemiczne pomiędzy substancją a powierzchnią ciała stałego). Chemisorpcja jest z reguły
procesem selektywnym i praktycznie nieodwracalnym. Adsorpcja zaleŜy od natury substancji
i fazy ruchomej (w przypadku fazy gazowej w niewielkim stopniu), od natury i struktury
powierzchni adsorbenta, od liczby miejsc aktywnych na tej powierzchni, od temperatury, pH
otoczenia wielkości cząsteczek substancji i in.
Wymiana jonowa
Wymiana jonowa następuje w wyniku zetknięcia się roztworu zawierającego jony zdolne do
wymiany z jonami związanymi z powierzchnią ciał stałych, tzw. jonitów. Wymiana jonów jest
zjawiskiem odwracalnym. Jonity po odpowiedniej obróbce mogą odzyskać pierwotną formę.
ZaleŜnie od rodzaju wymienianych jonów rozróŜniamy kationity i anionity. W chromatografii
cieczowej proces wymiany jonów wykorzystuje się w analizach substancji jonogennych np.
aminokwasów.
Dyfuzja
Dyfuzja polega na wzajemnym przenikaniu się substancji. Zjawisko to jest związane z ruchem
cząsteczek obojętnych elektrycznie lub zjonizowanych. Dwie substancje stykające się z sobą
a zawierające cząsteczki w róŜnych stęŜeniach będą ulegały dyfuzji w kierunku gradientów
stęŜeniowych. Zjawiska dyfuzji opisuje prawo Ficka, które mówi, Ŝe szybkość przechodzenia
substancji przez jednostkę powierzchni w jednostce czasu w określonym kierunku jest
proporcjonalna do gradientu stęŜeniowego w tym kierunku. Współczynnikiem proporcjonalności
w tej zaleŜności jest stała dyfuzji charakterystyczna dla danego układu.
Proces chromatograficzny
W kaŜdym procesie chromatograficznym rozdzielaną mieszaninę wprowadza się
w zasięg działania 2 faz: ruchomej (gaz lub ciecz) i nieruchomej (adsorbent, ciecz naniesiona na
stały nośnik, jonit itd.). Faza ruchoma stanowi siłę napędową procesu, natomiast faza nieruchoma
odgrywa rolę siły hamującej proces migracji składników w kierunku przepływu fazy ruchomej.
Rozdział substancji następuje w przypadku róŜnicy współczynników podziału składników
mieszaniny pomiędzy obie fazy. Szybkość migracji substancji jest tym większa, im mniejszy jest
współczynnik podziału. MoŜna załoŜyć, Ŝe w kaŜdym punkcie wzdłuŜ złoŜa fazy nieruchomej
następuje równowaga stęŜeniowa, a równowagę tę zakłóca przepływ fazy ruchomej. Proces
chromatograficzny jest więc procesem dynamicznym, w którym mają miejsce jednostkowe akty
absorpcji i desorpcji składników w fazie nieruchomej. W wyniku tego procesu twarzą się
charakterystyczne pasma poszczególnych substancji poruszające się z właściwą dla siebie
prędkością. Szerokość tych pasm zaleŜy od sposobu wprowadzenia analizowanej mieszaniny do
układu rozdzielczego oraz od szybkości i rodzaju dyfuzji, jaka zawsze towarzyszy procesom
chromatograficznym. O selektywności rozdziału chromatograficznego decyduje rodzaj
oddziaływań substancji z obydwoma fazami, a sprawność rozdziału limitują zjawiska dyfuzji.
W przypadku chromatografii adsorpcyjnej fazę stacjonarną stanowią róŜnego typu ciała stałe
o rozwiniętej powierzchni, zwane adsorbentami, takie jak węgiel aktywny, Ŝel krzemionkowy,
2
aktywny tlenek glinu itp. O ich działaniu decyduje przede wszystkim sposób aktywacji
powierzchni i obecność zanieczyszczeń trwale związanych z powierzchnią, które mogą blokować
centra aktywne adsorbenta. Z powodzeniem stosowana jest zarówno chromatografia adsorpcyjna
w układach gaz/ciało stałe, jak i ciecz/ciało stałe.
W chromatografii podziałowej (gaz/ciecz lub ciecz/ciecz) ciekłą fazę stacjonarną nanosi się
cienkim filmem na powierzchnię specjalnych nośników, którymi najczęściej są odpowiednio
oczyszczone ziemie okrzemkowe o niewielkiej powierzchni właściwej rzędu 1 m2/g.
W przypadku kolumn o małej średnicy (tzw. kolumn kapilarnych) ciekłą fazę stacjonarną
pokrywa się wewnętrzną ściankę kolumny. W podziałowej chromatografii gazowej jako fazy
stacjonarne stosuje się najczęściej oleje silikonowe, wysokocząsteczkowe węglowodory oraz
róŜnego typu niskolotne ciecze typu polieterów, poliestrów i in. W chromatografii ciecz/ciecz
fazami stacjonarnymi mogą być zarówno polarne ciecze, takie jak woda, niektóre nitryle, glikole
i in., jak i niepolarne, np. węglowodory alifatyczne. W tym drugim przypadku mówimy o tzw.
chromatografii z odwróconymi fazami. O wartości współczynników podziału w chromatografii
typu ciecz/ciecz decydują specyficzne lub niespecyficzne oddziaływania miedzy cząsteczkami
rozdzielanych substancji i cząsteczkami obu faz chromatograficznych. Są to zwykle
oddziaływania w sferze elektronowej (siły dyspersji, orientacji, tworzenie słabych kompleksów
donorowo – akceptorowych, wiązań wodorowych itd.).
W cieczowej chromatografii jonowymiennej proces chromatograficzny prowadzi się
w
kolumnach
wypełnionych
jonitem
(np.
sulfonowany
kopolimer
styrenu
z diwinylobenzenem) albo na płytkach pokrytych warstwą jonitu. Powinowactwo jonów do
jonitów danego typu zaleŜy od budowy jonu, (wielkość promienia jonowego, ładunek), jak i od
struktury i własności jonitu (rodzaj grupy funkcyjnej, struktura powierzchni, wielkość ziarna
itd.). Zwykle jony o wyŜszej wartościowości sorbują się lepiej od jonów o mniejszym ładunku.
Chromatografia bibułowa
Chromatografia bibułowa jest najprostszą ze stosowanych technik chromatograficznych. Oddaje
ona nieocenione usługi przy badaniu niewielkich próbek na przykład pochodzenia biologicznego.
Cały proces chromatograficzny przeprowadza się na pasku bibuły - czystej albo impregnowanej
odpowiednimi substancjami, np. Ŝywicami jonowymiennymi. W zaleŜności od rodzaju analizy
naleŜy dobrać odpowiedni gatunek bibuły oraz ewentualnie substancję impregnującą. Substancje
badane w roztworze lotnego rozpuszczalnika w ilości 1—50 µg nanosi się punktowo na bibułę za
pomocą kapilarki, mikropipetki lub mikrostrzykawki. Rozpuszczalnik powinien odparować przed
analizą. Dla celów preparatywnych niekiedy substancje nanosi się na bibułę w postaci wąskiego
pasma aby uzyskać większą wydajność rozdzielanych składników.
Rozpuszczalniki rozwijające (fazę ruchomą) dobiera się w zaleŜności od własności składników
analizowanej mieszaniny. Przepływ fazy ruchomej przez pasek bibuły osiąga się przez
zanurzenie krawędzi bibuły w rozpuszczalniku w taki sposób, Ŝeby naniesiona na bibułę próbka
znajdowała się tuŜ przed lustrem cieczy spełniającej rolę fazy ruchomej. Technicznie proces
rozwijania chromatogramu przeprowadza się w zamykanej szczelnie komorze szklanej, na dnie
której umieszcza się rozpuszczalnik. Po zanurzeniu krawędzi bibuły w rozpuszczalniku zaczyna
on płynąć z określoną prędkością ku górze dzięki działaniu sił kapilarnych Technika ta nosi
nazwę „wstępującej”. Bywa stosowana takŜe technika „zstępująca”, polegająca na tym, Ŝe
rozpuszczalnik umieszcza się w górnej części komory chromatograficznej w specjalnej rynience.
Po zanurzeniu krawędzi bibuły w zawartości rynienki następuje spływanie rozpuszczalnika
3
wzdłuŜ paska bibuły. W przypadku, kiedy bibuła nie jest impregnowana dodatkowymi
substancjami rolę fazy stacjonarnej w procesie chromatograficznym spełnia woda zawarta
w bibule i związana z nią częściowo chemicznie, a częściowo tylko siłami fizycznymi. Proces
rozdziału chromatograficznego zachodzi zgodnie z omówionym wcześniej mechanizmem
podziału substancji pomiędzy dwie fazy ciekłe. Szybkość migracji analizowanej substancji zaleŜy
od jej współczynnika podziału, a ten wynika ze zdolności rozpuszczania się tej substancji w fazie
nieruchomej (wodzie) i ruchomej (w rozpuszczalniku organicznym nie mieszającym się z wodą).
Po upływie określonego czasu lub teŜ po przebyciu określonej drogi przez rozpuszczalnik bibułę
wyciąga się z komory chromatograficznej, suszy się ją dokładnie i przystępuje się do tzw.
wywoływania chromatogramu. PołoŜenie plamek rozdzielonych substancji na chromatogramie
ustala się metodami fizycznymi (fluorescencja w świetle nadfioletowym, radioaktywność) albo
metodami chemicznymi polegającymi na spowodowaniu reakcji barwnej pomiędzy badaną
substancją a odpowiednio dobranym odczynnikiem wywołującym. Odczynnik ten wprowadza się
na bibułę w postaci aerozolu z małego rozpylacza.
Na podstawie połoŜenia plamek na chromatogramie określamy jakościowy skład badanej próbki.
Najłatwiej dokonuje się tego na podstawie porównania chromatogramu z rozwijanym równolegle
chrornatogramem mieszaniny wzorcowej złoŜonej ze składników, których oczekujemy
w analizowanej próbce. Inny sposób polega na korzystaniu z tzw. wielkości retencyjnych
charakteryzujących kaŜdą substancję.
Podstawową wielkością retencyjną w chromatografii planarnej jest współczynnik Rf:
Rf = ls/lr
gdzie:
ls - oznacza dystans (w cm) przebyty przez analizowaną substancję,
lr - odległość przebytą przez czoło rozpuszcza1nika.
Sposób wyznaczania wartości Rf z chromatogramu ilustruje rys.1
Rys.1 Wyznaczanie wartości Rf z chromatogramu
Istnieje zaleŜność pomiędzy wielkością plamki na chromatogramie i ilością wprowadzonej
substancji. Po wyznaczeniu krzywej wzorcowej w układzie: powierzchnia plamki - ilość
substancji, moŜna określić zawartość danego składnika w analizowanej mieszaninie. Inną metodą
ilościowej interpretacji chromatogramów jest pomiar intensywności zabarwienia plamek na całej
ich długości lub szerokości. Pomiaru intensywności dokonuje się za pomocą specjalnych
przyrządów zwanych fotodensytometrami. Dokładne wyniki ilościowe moŜna takŜe uzyskać
przez wycięcie fragmentu bibuły z p1amką i ekstrakcję substancji odpowiednim
4
rozpuszczalnikiem. Wyekstrahowaną substancję oznacza się ilościowo kolorymetrycznie lub
spektrofotometrycznie (na podstawie sporządzonej krzywej wzorcowej) albo innymi metodami
analizy chemicznej.
Chromatografia cienkowarstwowa
Chromatografia cienkowarstwowa (w skrócie z ang. TLC = Thin Layer Chromatography) ma
szereg cech wspólnych z bibułową - posiada wszystkie jej zalety, natomiast pozwala uniknąć
wielu jej wad. Fazę nieruchomą (adsorbent, ciecz na nośniku, jonit, porowaty polimer) nanosi się
cienką warstwą (ok.0,25 mm) na płytkę szklaną lub metalową w postaci drobnoziarnistego
proszku. Aby uzyskać powtarzalne wyniki analiz, zarówno grubość warstwy, jak
i równomierność jej rozłoŜenia na wszystkich uŜywanych płytkach musi być taka sama. Dlatego
stosuje się zwykle specjalne urządzenia do nanoszenia sorbenta na płytki. Po naniesieniu warstwy
sorbenta poddaje się ją suszeniu w temperaturze 100 - 1100C.
W odmianie adsorpcyjnej chromatografii cienkowarstwowej najczęściej stosuje się jako fazę
stacjonarną Ŝele krzemionkowe (ok. 80% zastosowań), niekiedy tlenek glinu, ziemię
okrzemkową i in. MoŜliwości doboru rozpuszczalnika w chromatografii cienkowarstwowej są
bardzo szerokie. Doboru rozpuszczalnika dokonuje się zwykle na podstawie tzw. szeregu
eluotropowego rozpuszczalników ułoŜonego w kolejności rosnącej polarności jego składników.
Analizowane mieszaniny wprowadza się na płytkę identycznie jak w przypadku chromatografii
bibułowej. Do rozwijania chromatogramów stosuje się najczęściej technikę wstępującą.
Wywoływanie chromatogramów przeprowadza się po wysuszeniu płytki. tj. po odparowaniu
zawartego w niej rozpuszczalnika rozwijającego podobnie jak w chromatografii bibułowej.
RównieŜ metody jakościowej i ilościowej interpretacji chromatogramów są takie same
(wizualizacja chromatogramów, porównywanie wartości Rf, pomiary ilościowe).
W tym miejscu jednak warto wymienić szereg ‘zalet chromatografii cienkowarstwowej
w porównaniu z bibułową. Obok wspomnianej juŜ wcześniej moŜliwości stosowania
róŜnorodnych faz stacjonarnych w TLC istnieje znacznie większy asortyment substancji
rozwijających i wywołujących, poniewaŜ w odróŜnieniu od bibuły, stosowane sorbenty
nieorganiczne są odporne na silnie agresywne związki, takie jak stęŜone kwasy, ługi, silne
utleniacze itp. Istotną zaletą TLC jest moŜliwość szybkiego rozwijania chromatogramów.
Przeciętny czas rozwijania chromatogramu wynosi ok. 1 godz. podczas gdy w chromatografii
bibułowej jest to proces często wielogodzinny. Ponadto na ogół sprawność rozdziału techniką
TLC jest wyŜsza niŜ w chromatografii bibułowej. Objawia się to w lepszym wykształceniu
plamek i mniejszych ich rozmiarach. Dzięki temu osiąga się z reguły lepsze wyniki interpretacji
jakościowej i ilościowej analiz.
Wykonanie ćwiczenia
Ćwiczenie polega na rozdziale i analizie trzech grup barwników w dwóch układach
rozwijających. W tym celu naleŜy sporządzić dwa układy rozwijające, odpowiedni zestaw
rozpuszczalników tak by sumaryczna ilość mieszaniny wynosiła 100 cm3. Układ rozwijający I
składa się z n-butanolu, kwasu octowego i wody zmieszanych z sobą w porcjach objętościowych
odpowiednio 5 : 1 : 2. Układ rozwijający II składa się z octanu etylu, metanolu i 5n wodorotlenku
amonu (5% NH3) zmieszanych w proporcji objętościowej 6 : 3 : 1. Tak przygotowanymi
układami napełnić odpowiednie komory rozwijające.
5
UWAGA:
Układów powyŜszych nie naleŜy sporządzać w przypadku gdy komory są juŜ
napełnione.
Posługując się szablonami nanieść na płytki chromatograficzne za pomocą kapilar kolejno:
1. barwniki A, B, C, D, E oraz mieszaninę M
2. barwniki a, b, c, d, e oraz mieszaninę m
3. barwniki 1, 2, 3, 4
Wszystkie trzy zestawy naleŜy nanosić na płytki w podwójnych egzemplarzach ze względu na
konieczność rozwijania ich w dwóch róŜnych układach. Linia startu barwników powinna
znajdować się w odległości nie mniejszej niŜ 1 cm od dolnej krawędzi płytki oraz powinna być
zaznaczona delikatnie ołówkiem, średnica naniesionych plamek winna wynosić 1 - 1,5 mm.
Nanoszenie barwników kapilarą dokonywać od razu na dwóch płytkach ze względu na
oszczędność kapilar kapilary zuŜyte wyrzucamy do kosza. Płytki z naniesionymi barwnikami
umieszczamy dolną krawędzią moŜliwie pionowo, w komorach rozwijających. Chromatogramy
rozwijać do momentu gdy front rozpuszczalnika osiągnie odległość 1- 0,5 cm od górnej
krawędzi,
zaznaczając
ołówkiem
linię
frontu
zaraz
po
wyjęciu
płytki
z komory. Zarysować delikatnie kontury plamek dla analizy A - M, a - m, 1 – 4, następnie
ponownie uczynić to w świetle ultrafioletowym lampy kwarcowej znajdującej się w wyposaŜeniu
ćwiczenia.
Wyznaczyć środki plamek i zmierzyć odległość od linii startu (x) oraz odległość czoła
rozpuszczalnika (y).
Obliczyć Rf, zapisać uwagi co do kształtu, koloru i sposobu uwizualnienia plamek.
W przypadku barwników 1 - 4 wyznaczyć ilość zanieczyszczeń dla kaŜdego z nich zaś dla
zestawów A - M i a - m podać rodzaje barwników znajdujących się
w mieszaninach. Zaznaczyć w sprawozdaniu przydatność układu do analizy.
Wzór sprawozdania
Temat: Chromatografia cienkowarstwowa
Po porównaniu plamek z układu I i II stwierdzono, Ŝe:
W mieszaninie M znajdowały się barwniki: ..............
W mieszaninie m znajdowały się barwniki: ..............
Barwnik 1 zawierał ............... zanieczyszczenia
Barwnik 2 zawierał ............... zanieczyszczenia
Barwnik 3 zawierał ............... zanieczyszczenia
Barwnik 4 zawierał ............... zanieczyszczenia
6
Układ I
Barwniki
Ilość
plamek
Kształt i kolor plamek
A
B
C
D
E
M
a
b
c
d
e
m
1
2
3
4
7
x
[mm]
y
[mm]
Rf
Układ II
Barwniki
Ilość
plamek
Kształt i kolor plamek
A
B
C
D
E
M
a
b
c
d
e
m
1
2
3
4
8
x
[mm]
y
[mm]
Rf