UNIWERSYTET WARSZAWSKI

UNIWERSYTET WARSZAWSKI
W Y D Z I A Ł
B I O L O G I I
ZAKŁAD BIOLOGII MOLEKULARNEJ ROŚLIN
Paweł Karol Mazur
IDENTYFIKACJA, KLONOWANIE i CHARAKTERYSTYKA
GENU RETINOBLASTOMA
Z ARABIDOPSIS THALIANA
Praca licencjacka
wykonana pod kierunkiem
prof. dr hab. Andrzeja Jerzmanowskiego
Warszawa 2003
Składam serdeczne podziękowania mojemu opiekunowi
naukowemu dr Andrzejowi Wierzbickiemu za przekazaną
wiedzę i kształtowanie naukowego myślenia oraz mojemu
promotorowi prof. dr hab. Andrzejowi Jerzmanowskiemu
za życzliwość, pomoc w rozwijaniu możliwości i chęci
tworzenia szans.
2
SPIS TREŚCI
1.
Wstęp
4
2.
Anatomia szlaku kontroli cyklu komórkowego z udziałem białka retinoblastoma
6
2.1. Cykliny
2.2. Kinazy zależne od cyklin
2.3. Inhibitory kinaz zależnych od cyklin
2.4. Białko retinoblastoma
2.5. Białka E2F i DP
2.6. Białko retinoblastoma zmienia strukturę chromatyny
2.6.1.
Acetylacja
2.6.2.
Fosforylacja
2.6.3.
Metylacja
2.6.4.
Kompleksy remodelujące chromatynę
3.
6
8
9
10
13
17
17
17
18
18
Fizjologia szlaku kontroli cyklu komórkowego z udziałem białka retinoblastoma 20
3.1. Zwierzęta
3.1.1.
Rola Rb w regulacji cyklu komórkowego
3.1.2.
Rola Rb w onkogenezie
3.1.3.
Rola Rb w różnicowaniu komórek
3.1.4.
Rola Rb w apoptozie
3.1.5.
Rola Rb w kontrolowaniu długości telomerów
3.2. Chlamydomonas
3.3. Rośliny
3.3.1.
Rola Rb w cyklu komórkowym roślin
3.3.2.
Aberracje cyklu komórkowego roślin
3.3.3.
Rola Rb w fotomorfogenezie
20
20
21
22
22
23
24
25
25
26
26
4.
Cel pracy
27
5.
Materiały i metody
28
5.1. Hodowla bakterii
5.2. Materiał roślinny
5.3. Synteza cDNA
5.4. PCR
5.5. Rekombinacja DNA
5.6. Przygotowanie bakterii elektrokompetentnych i transformacja
5.7. Izolacja plazmidowego DNA bakterii
5.7.1.
Metodą lizy alkalicznej (miniprep)
5.7.2.
Zestaw do izolacji plazmidowego DNA
5.8. Sekwencjonowanie DNA
5.9. Techniki komputerowe
6.
Wyniki
6.1.
6.2.
6.3.
28
28
28
28
29
29
30
30
30
30
30
31
Identyfikacja wszystkich genów Rb w genomie Arabidopsis
Charakterystyka filogenetyczna Rb
Klonowanie Rb z Arabidopsis
31
31
32
7.
Dyskusja
34
8.
Literatura
37
3
1.
WSTĘP
Pół wieku temu w 1953 roku Howard i Pelc wprowadzili nomenklaturę
eukariotycznego cyklu komórkowego wyróżniającą fundamentalne fazy replikacji: DNA (S),
mitozy (M) i przerw pomiędzy nimi (G1 i G2) występujące w sekwencji G1-S-G2-M.
Termin cykl komórkowy sugeruje stałe powtarzanie się cyklicznie następujących
procesów, co jest prawdziwe jedynie w odniesieniu do ekspotencjalnego wzrostu organizmów
jednokomórkowych lub hodowli komórkowych. Nie ma jednak odniesienia do tego, co dzieje
się in vivo w złożonych organizmach wielokomórkowych. W nich bowiem komórka jest
częścią tkanek i organów o ściśle zdefiniowanych przestrzennych relacjach z sąsiednimi
komórkami. Niezbędny jest mechanizm wrażliwy na sygnały zewnętrzne, który w
odpowiednich
warunkach
decyduje
o
proliferacji.
Pozwala
to
na
tworzenie
wyspecjalizowanych struktur wyższego rzędu (tkanek, organów).
Komórka posiada system decydujący o kontynuowaniu lub zaprzestaniu podziałów
bądź apoptozie. Integruje on informacje o dostępności pokarmu, warunkach zewnętrznych,
kontekście położenia, stadium rozwoju oraz zdarzeniach wewnątrzkomórkowych takich jak
uszkodzenie DNA.
System kontroli cyklu komórkowego sprawowany jest przez kinazy białkowe zależne
do cyklin (Cdk), które są regulowane przez nagromadzanie i rozpad cyklin (Cyc). Istnieje
wiele cyklin i kinaz zależnych od nich, które tworzą kompleksy włączając różne etapy cyklu
komórkowego. Z biochemicznego punktu widzenia podstawową zasadą regulacji cyklu jest
uruchamianie kaskadowych reakcji fosforylacji i defosforylacji odpowiednich białek. Dzięki
systemowi kontroli, zdarzenia cyklu komórkowego następują w określonej kolejności.
Regulacja cyklu komórkowego odbywa się między innymi poprzez punkty kontrolne.
Dwa główne weryfikują przejście z faz G1 do S i G2 do M cyklu komórkowego. Punkt
kontrolny G1 często nazywany „start” jest kluczowym, ponieważ jego przejście determinuje
komórkę do ukończenia pełnego cyklu (Rys. 1).
Przejście fazy G1 w S znajduje się pod kontrolą silnie konserwowanego mechanizmu,
którego podstawowym elementem jest białko supresorowe retinoblastoma (Rb) [65]. Rolą
białka Rb jest transdukcja sygnału łączącego układ kontroli cyklu komórkowego z
transkrypcją. Białko Rb pośredniczy w kontroli ekspresji genów niezbędnych w fazie S.
Białko retinoblastoma stanowi główny punkt kontroli integrujący sygnały regulujące podziały
komórkowe [117].
4
Rys. 1. Model kontroli cyklu komórkowego u roślin [83]. Pod wpływem czynnika stymulującego proliferację
(mitogenu), produkowane są cykliny typu D wiążące się z kinazami zależnymi od cyklin typu A. Rezultatem
powstania kompleksu białkowego Cdk2a/CycD jest fosforylacja białka retinoblastoma, w wyniku której
uwalniany jest czynnik transkrypcyjny E2F (tworzący heterodimer z białkiem DP). E2F/DP indukuje ekspresje
genów niezbędnych w przejściu do fazy S. Po zainicjowaniu fazy S cyklu komórkowego cykliny D są szybko
degradowane dzięki obecności sekwencji PEST. Opisane przejście z fazy G1 do S może zostać zatrzymane przez
związanie Cdk2a z CKI. Podczas fazy S syntetyzowane są cykliny A, aktywujące Cdk-A. Po osiągnięciu przez
komórkę końca fazy S, aktywność Cdk2a jest hamowana przez kinazę tyrozynową. W fazie G2 produkowane są
cykliny B. Zarówno Cdk2a i Cdk-B wykazują aktywność w punkcie kontrolnym G2/M, jeśli zwiążą cyklinę B i
czynnik Cks1, a w Cdk2a usunięta zostanie grupa fosforanowa. Ponadto przejście G2/M jest uzależnione od
cytokinin (hormon). Motywy degradacyjne umożliwiają usunięcie cyklin A i B podczas fazy M [10,33].
5
2.
ANATOMIA SZLAKU KONTROLI CYKLU KOMÓRKOWEGO Z
UDZIAŁEM BIAŁKA RETINOBLASTOMA
Opisane zostaną składniki budujące system kontroli wzrostu, różnicowania i
proliferacji, sprawowany przez białko Rb. Uwzględniono przede wszystkim komponenty
szlaku roślinnego.
2.1. CYKLINY
Cykliny są głównymi regulatorami kinaz zależnych od cyklin, z którymi tworzą
kompleksy białkowe [90]. W regulacji szlaku Rb biorą udział cylkiny D [40] (u roślin CycD1,
CycD2 i CycD3 [102]). Stwierdza się niewielkie homologie (9%-14%) pomiędzy roślinnymi,
a zwierzęcymi cyklinami D, jednak posiadają one silnie konserwowany motyw LxCxE na Nkońcu [93]. Ta sama sekwencja występuje w onkoproteinach wirusowych (Tabela 1) i jest
motywem wiążącym białko retinoblastoma [35].
Pierwszym elementem kaskady cyklu komórkowego jest nasilenie ekspresji genów
cyklin D. Ze względu na pełnioną funkcje CycD jest protoonkogenem, ponieważ zwiększona
aktywność (amplifikacja genu, nadekspresja itp.) w komórkach zwierzęcych może prowadzić
do transformacji nowotworowej [20,22].
Nadekspresja CycD2 w tytoniu wywołuje intensywny ogólny wzrost rośliny,
zwiększenie liczby liści i przyśpieszony rozwój od nasienia do dojrzałości (Rys. 2). Nie
zmienia się fenotyp komórek, ani merysemów. Ulegają przyśpieszeniu podziały komórkowe
(skracanie fazy G1) oraz zwiększa się aktywność merystemów [19]. Nadekspresja CycD1 w
Arabidopsis powoduje znaczny rozrost korzenia i nieco mniejszy całej rośliny [32]. Wpływ
ograniczony do korzenia sugeruje tkankowo specyficzną aktywność CycD1.
Rys. 2. Fenotyp tytoniu nadprodukującego CycD2 [19]. Roślina dzika
(wt) i trzy linie roślin transgenicznych (hem-hemizygoty, homhomozygoty). 48 dzień hodowli (drążek – 1metr).
6
Cykliny D jak wszystkie cykliny są produkowane w określonym czasie i szybko
degradowane - posiadają sekwencje destrukcyjne PEST [90]. Na produkcję cyklin u roślin ma
wpływ dostępność cukrów oraz niektóre hormony.
Sacharoza i glukoza indukują syntezę mRNA cyklin CycD2 i CycD3. Stwierdzono, że
po dodaniu do pożywki sacharozy transkrypcja CycD2 wzrasta po 30 minutach, a CycD3 po 4
godzinach [58]. Sugeruje to możliwość istnienia różnych mechanizmów wrażliwości na
cukry. Transdukcja sygnału jest wrażliwa na inhibitory fosfataz białkowych oraz nie jest
wrażliwa na inhibitory kinaz. Nie wymaga też syntezy białka de novo [95].
Cytokininy - hormony roślinne, stymulują transkrypcję CycD3 [94]. Recepcja i
transdukcja sygnału cytokininy odbywa się poprzez tzw. system dwuskładnikowy (His-Asp)
[23]. Polega on na wielokrotnym sekwencyjnym transferze grup fosforanowych pomiędzy
histydyną a asparaginianem w różnych domenach białek i kolejnymi białkami (Rys. 3) [5].
Rys. 3. Model dwuskładnikowego systemu transdukcji
sygnału cytokininy. Opracowano na podstawie [23].
CKI1 jest transbłonowym receptorem o właściwościach
kinazy.
Związanie
cytokininy
przez
domenę
„wejściową” powoduje dimeryzację CKI1 i aktywację
przez
autofosforylację
histydyny
w
domenie
transmiterowej. Grupa fosforanowa z histydyny jest
następnie
przenoszona
na
asparaginian
domeny
„wyjściowej”, a stąd na histydynę białka AHP.
Ostatnim etapem jest przeniesienie fosforanu na
asparaginian białka ARR, którego C-koniec jest
aktywatorem transkrypcji [5,23].
Brasinosteroidy - hormony sterydowe
biorące udział we wzroście i rozwoju roślin. Stymulują ekspresje CycD3. Stwierdzono, że w
kulturach kallusowych i komórkowych Arabidopsis mogą zastępować cytokininy. Na
transdukcję sygnału hormonalnego nie wpływają inhibitory kinaz i fosfataz, hamują zaś
inhibitory syntezy białka ([62]. Jest to dowód, że brassinosteroidy działają innym szlakiem
niż cytokininy i cukry, indukując syntezę białek.
7
2.2. KINAZY ZALEŻNE OD CYKLIN
Białko retinoblastoma ulega fosforylacji przez cyklinozależne kinazy serynowotreoninowe typ A (Cdk-A, u roślin Cdk2a) [67,87]. Grupa Cdk-A wśród organizmów
eukarotycznych jest bardzo jednorodna z homologią sekwencji między 63% a 68%. Zawierają
one również charakterystyczny silnie konserwowany motyw PSTAIRE w domenie
przyłączającej cyklinę [90]. Kinazy zależne od cykli pełnią
funkcje katalityczne w kompleksie z odpowiednimi cyklinami
(podjednostki regulatorowe) [90]. Aby kompleks Cdk-A/CycD
był aktywny, Cdk-A musi zostać defosforylowane w pozycji
treonina 14 i tyrozyna 15 (fosforylacja uniemożliwia przyłączenie
ATP – kofaktora Cdk - Ramka 2) oraz fosforylowane w pozycji
treoniny
160
[74,102].
Jest
to
element
kontroli
cyklu
komórkowego (Rys. 4). Fosforylacji Tyr 160 dokonują kinazy
aktywujące kinazy zależne od cyklin (CAK). Fosforylacja Tyr 15
(białko
Wee1)
dezaktywuje
kompleks
Cdk2a/CycD.
Ramka
1:
Dysoxylum
binectariferum i Rb
Dysoxylum binectariferum
rośnie w Indiach. Z kory łodygi tej rośliny wyizolowano alkaloid flawopiridol,
który jest inhibitorem CdkA. Flawopiridol łączy się z
Cdk-A w miejscu wiązania
ATP, uniemożliwiając fosforylację Rb, a zatem wyjście z fazy G1 cyklu komórkowego. Flawopiridol
jest testowany jako lek
przeciwnowotworowy (w
fazie klinicznej) [43].
Ufosforylowanie Tyr 15 następuje w odpowiedzi na stres suszy u pszenicy [99], a wysoki
poziom ekspresji Wee1 w bielmie kukurydzy w czasie endoreplikacji sugeruje związek
fosforylacji Tyr 15 z endoreplikacją [106].
Konstytutywna ekspresja dominującego negatywnego allelu Cdk2a w tytoniu nie
zmieniła wielkości rośliny, odnotowano obecności mniejszej liczby większych komórek.
Podobnych obserwacji dokonano u Arabidopsis traktowanej roskowidyną (specyficzny
inhibitor
Cdk)
[104].
Rośliny
Arabidopsis
z
nadekspresją
Cdk2a
nie
mają
charakterystycznych fenotypów, niektóre tracą dominację wierzchołkową [29]. Stąd wniosek,
że Cdc2a niej jest limitującym czynnikiem cyklu komórkowego.
Rys. 4. Model regulacji Cdk2a.
Opracowany
na
podstawie
[74,83,102]. Na aktywność Cdk2a
wpływa fosforylacja i defosforylacja
określonych aminokwasów. Funkcje
katalityczne Cdk2a są blokowane
przez ICK i inhibitory chemiczne.
Ekspresja Cdk2a jest stymulowana
przez akusyny [83].
8
2.3. INHIBITORY KINAZ ZALEŻNYCH OD CYKLIN
W 1997 roku wyizolowano pierwszy roślinny (Arabidopsis) inhibitor kinazy zależnej
od cyklin – ICK1. ICK1 wykazuje podobieństwo do ssaczego inhibitora – p27Kip1 (silnie
konserwowana jest domena C-końcowa) [114]. ICK jest negatywnym regulatorem cyklu
komórkowego [101]. ICK1 oddziałuje bezpośrednio z CycD3 i Cdc2a C-końcową domeną
[115]. Związanie ICK1 z Cdk2a i CycD powoduje ich dezaktywację, co w rezultacie redukuje
liczbę podziałów komórkowych [101].
Nadekspresja ICK1 u Arabidopsis hamuje wzrost i wywołuje defekty rozwojowe
(Rys. 5) [116]. Na ekspresje ICK mają wpływ warunki zewnętrzne np. niska temperatura,
kwas abscysynowy [115, 107].
Rys. 5. Arabidopsis z nadekspresją inhibitora ICK1:
(a) 4 niezależne linie (prawa strona) i kontrolne
dzikie (wt), (b) w fazie kwitnienia [116]
9
2.4. BIAŁKO RETINOBLASTOMA
Gen retinoblastoma był pierwszym odkrytym genem supresora nowotworów.
Wyizolowany za pomocą klonowania pozycyjnego z nowotworu retinoblastoma [73]
(Rozdział 3.1.2). Produktem genu jest białko retinoblastoma (w Arabidopsis 112 kDa),
jądrowa fosfoproteina [80], hamująca transkrypcję genów niezbędnych do przejścia z fazy G1
do fazy S cyklu komórkowego. Regulacja proliferacji z udziałem Rb jest powszechna wśród
organizmów, homologii białka Rb występują u zwierząt i roślin, brak ich u grzybów [18]
(Rys. 6).
Główną funkcją Rb jest wiązanie czynników transkrypcyjnych (dla genów fazy S) z
rodziny E2F. Do złożenia fizjologicznego kompleksu Rb/E2F niezbędne i wystarczające są
dwie domeny A i B (pocket domain) oraz 20 aminokwasowy odcinek C-końcowy [15], są to
regiony silnie konserwowane w homologach Rb [72] (Rys. 6).
Rys. 6. Porównanie budowy homologów białka Rb z różnych organizmów. Na podstawie [18]. Najważniejszymi
i silnie konserwowanymi elementami strukturalnymi białka Rb są domeny A i B obecne u wszystkich znanych
homologów. Pozostałe sekwencje (np. łącznik) i ich długość cechują się znacznie większą zmiennością.
Podobieństwa sekwencji pomiędzy zwierzęcymi Rb sięgają 70% w rejonach domen A i B i ok. 30% łączniku
[18]. Natomiast podobieństwo zwierzęcych Rb z roślinnymi wynosi 20-35% w domenach [26].
10
W odcinku pomiędzy domenami A i B (tzw. łącznik - Rys. 10) znajduję się
kilkanaście miejsc fosforylacji (najważniejsze wydają się być Ser 576 i Ser 780-Rys. 10).
Fosforylacji dokonują kinazy zależne od cyklin. Ufosforylowane Rb nie oddziałuje z E2F.
Mechanizm utraty powinowactwa Rb do E2F wiąże się z interakcją domen A i B ze sobą. W
aktywnym białku Rb (nie fosforylowanym) domeny A i B oddziaływują ze sobą tworząc
odpowiednie warunki do wiązania E2F [120]. Fosforylacja likwiduje wzajemne
oddziaływania domen A i B, w czym istotną rolę pełni C-koniec Rb (zmiany konformacyjne
C-końca wywołują wewnątrz cząsteczkowe interakcje) [16] (Rys. 7).
Rys. 7. Schemat zmian w oddziaływaniu
domen A i B białka Rb pod wpływem
fosforylacji (P) [16].
Kryształ ludzkiego Rb przedstawia domenę A jako strukturę zbudowaną z dziewięciu
α-heliksów, z których dwa tworzą rdzeń a pozostałe otaczają go. Domena B zbudowana jest z
ośmiu α-heliksów, a jej najważniejszym elementem jest miejsce wiązania dla motywu LxCxE
(leucyna-x-cysteina-x-glutaminian, x – dowolny aminokwas) [72]. Miejsce wiązania motywu
LxCxE jest drugim po domenach A i B miejscem wiążącym białka. Motyw LxCxE jest silnie
konserwowany w białkach oddziałujących z Rb (Tabela 1).
Tabela 1. Porównanie sekwencji białek oddziałujących z Rb motywem LxCxE. Część górna przedstawia
sekwencje białek wirusowych, środkowa sekwencje białek komórkowych wiążących się z Rb, dolna - sekwencje
konsensusowe trzech grup cyklin D z Arabidopsis i wspólną sekwencje cyklin D ludzkich, mysich i szczurzych
(kropki oznaczają nie konserwowane aminokwasy).
Ad E1A
HPV 16 E7
SV40 T
BK T
Polyoma T
Yellow Dwarf RepA
Wheat Dwarf C1:C2
Rubella NSP90
BRG1
BRM
HDAC
CLF
SUV39H1
Cyc D1 At
Cyc D2 At
Cyc D3 At
Cyc D mam
P
P
A
K
K
F
F
A
A
A
D
F
S
.
S
.
E
E
N
W
W
T
P
A
E
E
S
P
P
.
M
.
.
V
T
E
D
D
E
T
L
V
V
D
S
T
.
A
.
.
11
I
T
E
E
E
S
E
L
E
E
K
Q
E
.
E
D
.
D
D
N
D
D
D
S
G
R
R
R
S
S
D
N
A
.
L
L
L
L
L
L
L
L
L
L
I
L
L
L
L
L
L
T
Y
F
F
F
R
I
P
T
T
A
L
I
.
A
.
L
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
S
C
C
C
C
C
H
Y
S
H
H
H
H
A
E
E
E
L
H
.
G
.
C
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
A
Q
E
D
D
D
T
D
E
E
E
Q
Q
D
T
E
.
G
L
M
M
M
L
I
Y
E
E
F
E
L
S
.
.
.
F
N
P
F
F
H
E
R
E
E
S
P
N
.
.
.
.
P
D
S
A
A
N
S
A
K
K
D
L
D
.
.
.
.
P
S
S
S
S
W
W
L
M
I
S
L
R
.
.
.
.
S
E
D
D
D
R
K
R
F
F
E
S
E
.
.
.
.
D
E
D
E
E
E
N
A
G
G
E
R
T
.
.
.
.
D
D
E
E
E
T
E
G
R
M
G
.
D
.
.
Pierwszym odkrytym białkiem interferującym z Rb za pośrednictwem LxCxE był
polipeptyd adenowirusa E1A [37]. Najważniejszym partnerem Rb posiadającym motyw
LxCxE są cykliny D [35,67]. Motyw LxCxE zawierają m.in. deacetylaza histonowa (HDAC)
[76], metylotransferaza histonowa [112], UBF - czynnik transkrypcyjny polimerazy I RNA,
enzymy remodelujące chromatynę BRG1 i BRM (składniki ludzkiego kompleksu SWI/SNF)
[123] oraz wirusowe białka onkogenne (Rozdział 3.1.2) i białka niektórych wirusów
roślinnych. Motyw ten jest obecny w sumie 19 w białkach komórkowych Arabidopsis [113].
Miejsce wiązania motywu LxCxE w Rb odkryto w badaniach kokrystalizacyjnych.
Stwierdzono specyficzne oddziaływanie zagłębienia w domenie B białka retinoblastoma z
motywem LxCxE. (Rys. 8). Aminokwasy wiążące motyw (Tyr 709, Lys 713, Tyr 756 i Asn
757) są silnie konserwowane w Rb (Rys. 9), a ich mutacja uniemożliwia oddziaływanie białek
z motywem LxCxE [24] (Tabela 1).
Rys. 8. Oddziaływanie LxCxE z Rb. Model oparty na badaniu
białka kokrystalizowanego z peptydem LxCxE [24].
Rys. 9. Stopień konserwacji miejsca wiązania motywu
LxCxE w domenie B białka Rb [41].
Uszkodzenia w miejscu wiążącym LxCxE nie wpływają na łączenie się E2F i Rb,
przeciwnie uniemożliwia uwolnienie E2F z kompleksu Rb/E2F (uszkodzenie miejsca
oddziałującego z Cdk). Cykl komórkowy u mutantów z uszkodzeniem wiązania LxCxE
zostaje zatrzymany w fazie G1 [31].
12
Rys. 10. Modele cząsteczki Rb i fragmentów
oddziałujących białek. Zaznaczono najważniejsze
miejsca fosforylacji przez Cdk Ser 567 i Ser 780.
A-[72], B.C-[PDB id: 1gux]
A
B
C
2.5. BIAŁKA E2F i DP
Funkcja Rb jest uwarunkowana współdziałaniem z heterodimerem E2F/DP [118]. E2F
jest czynnikiem transkrypcyjny łączącym się z DNA w miejscu konsensusowym
TTTCGCGC. Białko DP stabilizuje wiązanie E2F z DNA. Geny zawierające w promotorach
miejsca wiązania E2F/DP kodują białka niezbędne w fazie S cyklu komórkowego np. enzymy
syntetyzujące dNTP (reduktaza rybonukleotydowa [11], reduktaza dihydrofolianowa,
syntetaza tymidylanowa) [4], białka zaangażowane w replikację DNA (np. polimeraza α
[109]), białka tworzące kompleks prereplikacyjny (HsCdc6, MCM) [6]. E2F i DP
strukturalnie należą do białek z grupy winged helix, zawierających motyw wiązania do DNA
helisa-pętla-helisa.
Bezpośrednio
zaangażowaną
jest
sekwencja
RRxYN
(silnie
konserwowana) oddziałująca przez dużą bruzdę DNA (Rys. 11) z palindromową sekwencją
GCGCGC w miejscu konsesusowym dla E2F [42].
E2F/DP aktywuje transkrypcję poprzez bezpośrednią interakcje (C-koniec E2F tzw.
domena transaktywująca) z podstawowymi czynnikami transkrypcyjnymi TBP i TFIIH
tworząc kompleks preinicjacyjny i transkrypcyjny. Ponadto E2F pośredniczy składaniu
kompleksu TFIID/TFIIA. E2F ma również zdolność zginania DNA co pozytywnie wpływa na
rozpoznanie promotora i aktywację genu [6]. Rb wiążąc się do E2F maskuje domenę
13
transaktywującą znosząc pozytywną regulację transkrypcji [61]. Utworzenie kompleksu
Rb/E2F/DP uniemożliwia również zaginanie DNA, co także wpływa hamująco na inicjację
transkrypcji [6].
Rys. 11. Model oddziaływania heterodimeru E2F/DP z cząsteczką DNA (E2F – kolor fioletowy DP – czerwony)
[PDB id: 1cf7]
Niektóre homologi E2F powodują represję transkrypcji. Mechanizm nie jest dobrze
poznany. Prawdopodobnie E2F jest fosforylowany przez kompleks Cdk/Cyc [28].
E2F i DP tworzą rodzinę białek silnie konserwowanych ewolucyjnie. Homologii
białek E2F i DP występują u wszystkich organizmów, w których funkcjonuje szlak regulacji z
udziałem Rb (Rys. 12, Rys. 13).
W 1999 roku zidentyfikowano gen E2F w tytoniu [100] i wyizolowano białko E2F z
pszenicy [92]. Obecnie wiemy o sześciu białkach E2F u Arabidopsis [81]. W roku 2000
potwierdzono obecność białka DP (dwa homologi) i heterodimeru E2F-DP u pszenicy [91],
marchwi [3] i Arabidopsis.[79].
Białka należące do grupy E2F zawierają charakterystyczne regiony wiązania DNA, Rb
(z domeną transaktywującą) i DP, oraz sekwencje NLS. Unikalną cechą E2Fd, E2Fe i E2Ff z
Arabidopsis jest brak domeny dimeryzacyjnej i duplikacja domeny wiążącej DNA (Rys. 14),
co pozwala na łączenie się tych białek w formie monomerycznej z sekwencją konsensusową
DNA [70]. Nie wywołuje to jednak aktywacji transkrypcji [81]. Nie wiadomo, jaką funkcje
pełnią w komórkach Arabidopsis.
14
Rys.
12.
Drzewo
filogenetyczne
białek
E2F
(wykonanie Rozdział 5. Materiały i metody). Skala 0,1
reprezentuje 10% różnice w sekwencji aminokwasowej.
E2Ff, E2Fd, E2Fe z Arabidopsis i E2F innych roślin
oraz E2F1-3 człowieka mają podobną organizację
domen i wykazują duże podobieństwo sekwencji.
Pozostałe
E2F
Arabidopsis
są
unikalne
tworzą
oddzielną gałąź (Rys. 14).
Rys.
13.
Drzewo
filogenetyczne
białek
DP
(wykonanie Rozdział 5. Materiały i metody). Skala
0,1
reprezentuje
10%
różnice
w
sekwencji
aminokwasowej. Drzewo filogenetyczne wskazuje
istnienie
zwierzęcych
subrodzin
DP1
i
DP2.
Przyrównanie (nie zamieszczono) wskazuje bliższą
relację
DPa
(Arabidopsis)
z
DP2
niż
DP1
(zwierzęcych), a także bliskość homologów DPb
(Arabidopsis)
i
DP1
(zwierząt).
Drzewo
filogenetyczne nie grupuje jednak białek DP
Arabidopsis z subrodzinami zwierzęcych DP1 i DP2
formując oddzielną gałąź. Podobieństwo pomiędzy
białkami DP Arabidopsis (ok. 35%) jest dużo
mniejsze niż pomiędzy DP zwierząt (ok. 70%).
Nadekspresja E2Fa i DPa w Arabidopsis indukuje w dojrzałych (wyróżnicowanych)
komórkach liści wejście w fazę S [96]. Nadeksprymowany E2Fa w Arabidopsis podnosi
ekspresje genów fazy S i indukuje podziały komórkowe w koleoptylu i hipokotylu. Komórki
rośliny są mniejsze, częsta staje się endoreplikacja [27]. Natomiast E2Fc wywołuje odwrotny
efekt. Jest represorem transkrypcji i redukuje częstość podziałów, powoduje wzrost
objętościowy komórek [53].
15
Rys. 14. Schemat sekwencji i charakterystycznych regionów białek E2F i DP u Arabidopsis Opracowano na
podstawie [81].
U myszy również scharakteryzowano sześć homologów. Myszy z wyłączeniami
poszczególnych genów E2F wykazują różne defekty, co sugeruje odmienne role lub (i)
specyficzność tkankową homologów E2F [105] (Tabela 2).
Tabela 2. Charakterystyka białek E2F i DP myszy [6,105,122].
Domeny wiążące
E2F1
G1/S
+
+
+
+
Indukcja
genów
fazy S
+++
E2F2
G1/S
+
+
+
+
E2F3
G1/S
+
+
+
E2F4
konstyt.
+
-
E2F5
E2F6
DP1
DP2
konstyt.
konstyt.
konstyt.
konstyt.
+
+
+
+
-
Białko Ekspresja
+++
Supresja
nowotworów
+
+++
+
-
+
+++
+
-
-
-
+
+
-
E2F
E2F
+
+
+
+
+
+
-
?
DNA
Rb
DP
NLS
16
Indukcja
apoptozy
Myszy z wyłączeniem
ŻywoFenotyp
tność
+
Nowotwory
Defekty
+
immunologiczne
Red. ekspresji
+
genów fazy S
Defekty
rozwojowe
Wodogłowie
?
?
?
?
?
?
2.6.
BIAŁKO RETINOBLASTOMA ZMIENIA STRUKTURĘ CHROMATYNY
Chromatyna wywiera represyjny wpływ na proces transkrypcji. W ewolucji doszło do
wykształcenia wyspecjalizowanych białek i kompleksów białkowych, zdolnych do
przebudowy struktur chromatynowych. Stwierdzono, że niektóre mają zdolności do
oddziaływania z Rb.
2.6.1. Acetylacja
Acetylacja neutralizuje pozytywny ładunek nadawany histonom przez lizyny,
destabilizując
strukturę
nukleosomową
(zwiększając
dostępność
DNA
dla
białek
transkrypcyjnych). Deacetylacja działa przeciwnie (hamuje transkrypcję). Białko Rb tworzące
kompleks z heterodimerem E2F/DP wiąże deacetylazę histonową (HDAC) (Rys. 15), poprzez
motyw LxCxE (Tabela 1) [8]. Jest to mechanizm hamowania transkrypcji przez Rb
uzupełniający rolę E2F-DP (maskowanie promotora).

Rys. 15. W hamowaniu transkrypcji niezbędnych w fazie S genów przez Rb, bierze udział deacetylaza i
metylaza histonów.
Uniemożliwienie wiązania HDAC do Rb skutkuje dziewięciokrotnym wzrostem
transkrypcji w komórkach Jurkat (usunięcie Rb powoduje ponad 30-krotny wzrost
transkrypcji) [78]. Deacetylaza pozostaje w kontakcie fizycznym z Rb i dlatego deacetylacja
obejmuje tylko jeden nukleosom [85]. Nie we wszystkich promotorach genów regulowanych
przez kompleks Rb/E2F/DP obserwowana jest deacetylacja [76]. Stąd wniosek, że
mechanizmy represji są redundantne.
2.6.2. Fosforylacja
Struktura chromatyny jest zmieniona w komórkach mysich fibroblastów Rb i Rb-/-.
Chromatyna w komórkach Rb-/- jest bardziej narażona na trawienie nukleazą Micrococcus,
czyli ma luźniejszą strukturę. Koreluje to m.in. z wyższą fosforylacją histonów H1
17
stwierdzoną w fibroblastach Rb-/- [59]. Nie wiadomo jednak, jaką rolę w tym zjawisku
odgrywa białko Rb.
2.6.3. Metylacja
Kolejnym mechanizmem, indukowanej przez Rb inhibicji transkrypcji jest metylcja
histonu H3 przez metylazę Suv39H1. Metylaza łączy się z Rb za pomocą motywu LxCxE
(Tabela 1). Powstały kompleks Suv39H1/Rb/E2F/DP, w komórkach U20S i HEK-293,
metyluje lizynę 9 (K9) histonu H3 w nukleosomie wcześniej deacetylowanym (m.in. w K9)
(Rys. 15) [89,112].
2.6.4. Kompleksy remodelujące chromatynę
Niewiele wiadomo o współdziałaniu Rb z kompleksami remodelującymi chromatynę.
Obecna wiedza jest bardzo wycinkowa i niespójna.
Metylacja K9 histonu H3 indukuje przyłączenie białek heterochromatynowych z
rodziny HP1. Białko HP1 zawiera motyw LxCxE wiążący do Rb [119] i chromodomenę,
charakterystyczny motyw występujący w dużej rodzinie białek Polycomb związanych z
regulacją genów i organizacją chromatyny.
CLF jest roślinnym białkiem należącym do grupy Polycomb. Zawiera motyw LxCxE
(Tabela 2), a jego oddziaływanie z Rb wykazano w teście dwuhybrydowym [119]. CLF jest
niezbędne do regulacji genów homeotycznych zaangażowanych w proces kwitnienia [45].
Prawdopodobnie działanie roślinnych białek z grupy polycomb związane jest z wygaszaniem
ekspresji genów, przez tworzenie represywnych transkrypcyjnie struktur chromatynowych
[25] (Rys. 16).
Do Rb wiążą się białka BRG1 i Brm (przez motyw LxCxE -Tabela 2). Białka te należą
do głównych komponentów kompleksu remodelującego chromatynę SWI/SNF. Kompleks
Rb/E2F/DP/SWI/SNF hamuje transkrypcje uniemożliwiając przejście do fazy S [123].
Nadekspresja BRG1 i Brm objawia się powolnym wzrostem komórek podczas, gdy BRG1 i
Brm-/- są niezdolne do zatrzymania się w fazie G1 [55,57].
18
Rys. 16. Retinoblastoma jest pomostem do tworzenia heterochromatyny [119].
19
3.
FIZJOLOGIA SZLAKU KONTROLI CYKLU KOMÓRKOWEGO Z
UDZIAŁEM BIAŁKA RETINOBLASTOMA
Retinoblastoma stanowi rodzinę białek podobnych strukturalnie i funkcjonalnie.
Homologi białka Rb występują u zwierząt i roślin odkryto je także u jednokomórkowych
glonów Chlamydomonas. Nie odkryto komponentów szlaku Rb u grzybów w tym drożdży.
Najlepiej poznano rolę Rb u zwierząt.
3.1. ZWIERZĘTA
3.1.1. Rola Rb w regulacji cyklu komórkowego
Większość komórek dorosłego organizmu wielokomórkowego ulega regularnym
podziałom. Wielokrotnie powtarzające się cykle komórkowe są ściśle kontrolowane. Białko
retinoblastoma
kontroluje
cykl
komórkowy
w
najważniejszym etapie przejścia ze stanu G1 do fazy S. Rb za
pośrednictwem
E2F/DP
hamuje
transkrypcję
genów
związanych z przejściem do fazy S [61]. Uwolnienie E2F i
tym samym umożliwienie przejścia do fazy S, następuje po
fosforylacji Rb [44] przez kinazy zależne od cyklin (u
zwierząt Cdk4) będące w kompleksie z cyklinami D. [35].
(Rys. 17).
Ramka 2: Rb i Fe
Jon żelaza jest niezbędny do życia,
jego brak powoduje zatrzymanie
podziałów komórkowych i wzmożenie apoptozy. Stwierdzono, że Fe
powoduje hipofosforylację Rb
(prawdopodobnie przez obniżenie
ekspresji cyklin). Powstrzymanie
fosforylacji Rb powoduje zatrzymanie komórki w fazie G1. Istotne
dla onkologii wydaje się poznanie
chelatorów jonu żelaza [125].
Rys. 17. Schemat mechanizmu funkcjonowania szlaku kontroli przejścia faz G1 do S z udziałem białka Rb
20
Zapoczątkowanie proliferacji jest pod kontrolą szeregu czynników zewnątrz- (np.
czynniki wzrostu), jak i wewnątrzkomórkowych (np. specyficzne inhibitory).
3.1.2. Rola Rb w onkogenezie
Patologia cyklu komórkowego odgrywa główną rolę w inicjacji i progresji
nowotworu, a przez wielu autorów choroba nowotworowa jest uważana za chorobę
wynikającą z zaburzonego cyklu komórkowego. Proces onkogenezy najczęściej związany jest
z uszkodzeniem punktu restrykcyjnego G1/S cyklu komórkowego. Uszkodzenie białka Rb
całkowicie eliminuje ten ważny punkt kontrolny [77,97] i
jest bardzo częste w nowotworach człowieka.
Samo odkrycie białka Rb jest efektem badań nad
przyczynami
rzadkiego
nowotworu
oka
u
dzieci
nazwanego retinoblastoma (siatkówczak złośliwy). W
tym schorzeniu, dotykającym 1 na 20.000 dzieci,
obserwuje się utratę lub nieprawidłowe funkcjonowanie
białka Rb. Nowotwór rozwija się w macierzystych
komórkach nerwowych siatkówki [54,69]. Wiadomo, że
defekty w funkcjonowaniu białka Rb są przyczyną
również innych nowotworów człowieka (ponad 30-krotny
wzrost
u
heterozygot)
jak
kostniakomięsak,
drobnokomórkowy rak płuca, rakowiak [57,22].
Najczęściej spotykanymi zmianami dotyczącymi
Rb są mutacje inaktywujące [31] i zmiany metylacji
Ramka 3. Zielona herbata i Rb
Badania epidemiologiczne wskazują, że picie zielonej herbaty
obniża częstość pojawiania się
niektórych rodzajów nowotworów.
Efekt ochrony wywołują polifenole
głównie
epigalokatechino-3galusan (EGCG). Ciekawy wydaje
się efekt molekularny działania
EGCG. Badając nowotworowe
komórki A431 stwierdzono, że
EGCG obniża fosforylację seryny
780 w Rb (Rys. 10), co zwiększa
powinowactwo do E2F/DP i
hamuje przejście do fazy S cyklu
komórkowego.
Nie
znamy
mechanizmu działania EGCG, ale
zauważono wzrost aktywności
inhibitorów CKI (rozdział 2.4.3) i
obniżenie ekspresji E2F i DP
(onkogeny). Zaobserwowano także
wzrost
częstości
apoptozy
(prawdopodobnie pośredni efekt
utrzymywania komórki w fazie
G0/G1) [2].
promotora genu Rb oraz zahamowanie aktywności białka
Rb poprzez interakcję z onkoproteinami wirusowymi (białko E7 wirusa HPV [72], antygen T
wirusa SV40, onkoproteina E1B-55K adenowirusa)
Z punktu widzenia procesów nowotworowych istotny jest związek Rb z angiogenezą.
Prawidłowe unaczynnienie jest warunkiem sine qua non formowania się guza
nowotworowego i inwazyjności zmian nowotworowych (zdolności do tworzenia przerzutów).
Waskularyzację stymuluje śródbłonkowy czynnik wzrostu naczyń krwionośnych (VEGF).
Stwierdzono, że myszy z wyciszoną ekspresją Rb mają obniżoną ekspresję VEGF,
zahamowaną angiogenezę i onkogenezę [17].
21
3.1.3. Rola Rb w różnicowaniu komórek
Białko retinoblastoma u zwierząt pełni rolę w procesach różnicowania takich jak
myogeneza [49], adipogeneza [13], angiogeneza (rozdział 3.1.2) [17], hematopoeza i
neurogeneza [60,77]. Rb pełni rolę w różnicowaniu przez oddzaiływanie z tkankowo
specyficznym czynnikami transkrypcyjnymi (poza E2F, np. MyoD [49], NF-Il6 [14], C/EBP
[13]).
Różne
są
mechanizmy
działania
kompleksów
białka
Rb
z
czynnikami
transkrypcyjnymi. Na przykład podczas różnicowania się komórek mięśniowych Rb formuje
kompleks z miogennym czynnikiem transkrypcyjnymi MyoD aktywując geny mięśniowo
specyficzne (linie komórkowe Rb-/-, które nie są zdolne do wyróżnicowania w komórki
mięśniowe) [49].
Dowodem roli Rb w różnicowaniu jest efekt mutacji unieczynniającej Rb u myszy.
Objawia się on śmiercią mysich zarodków pomiędzy 14 a 15 dniem ciąży, której
bezpośrednią przyczyną jest obumieranie neuronów w centralnym układzie nerwowym i
defektywna erytropoeza [65].
3.1.4. Rola Rb w apoptozie
Białko retinoblastoma pełni rolę czynnika antyapoptotycznego. Potwierdzeniem tego
jest fakt cięcia Rb przez kaspazy podczas apoptozy. Udowodniono także odporność na
indukowaną apoptozę u myszy eksprymujących Rb
odporne na cięcie przez kaspazy [12].
Stwierdzono, że utrata funkcji Rb uruchamia
szlak apoptozy poprzez białko p53. Eliminuje to komórki
z
rozregulowanym
systemem
kontroli
proliferacji.
Istnienie tego zabezpieczenia potwierdza fakt częstej
inaktywacji p53 w komórkach nowotworowych z
uszkodzonym Rb [56].
Z przeprowadzonych badań na myszach z
wyłączonym genem Rb wynika, że nowotwór rozwijający
się w splocie naczyniówki oka tworzy się powoli, bo duża
część komórek obumiera. Natomiast u myszy z
wyłączonymi genami Rb i p53 obserwuje się gwałtowny
wzrost zmian nowotworowych i niski poziom apoptozy
[84]. Prawdopodobnie utrata Rb uwalnia E2F, który może
22
Ramka 4: Rb i promieniowanie γ
Promieniowanie γ indukuje w komórkach apoptozę. Odkryto, że linia komórkowa nowotworu prostaty DU-145, z uszkodzonym Rb,
jest odporna na apoptozę indukowaną promieniowaniem jonizujący. Co więcej przywrócenie prawidłowego Rb powoduje uwrażliwienie na promieniowanie γ. Natomiast funkcjonalne Rb chroni
przed apoptozą indukowaną promieniowaniem UV. Sugeruje to
możliwość istnienia różnych szlaków apoptozy związanych z Rb.
Pośrednictwo Rb w apoptozie
może wynikać ze specyficzności
uszkodzeń powodowanych przez
promieniowanie γ (podwójne pęknięcia DNA) i UV (dimeryzacja
tyminy u DNA) [124]. Rozwój
tych badań może mieć istotne znaczenie w poznaniu przyczyn odporności niektórych nowotworów
na radioterapię.
uruchomić szlak apoptozy aktywując ARFp19 i inne proapoptotyczne białka. Hipotezę taką
oparto m.in. na doświadczeniach: z wyłączeniem Rb u myszy (obumieranie embrionów) [65]
oraz wyłączeniem E2F (znaczące obniżenie poziomu apoptozy) [122] (Rys. 18)
Rys. 18. Funkcje Rb w komórce zwierzęcej (opracowano na podstawie [105,50,77]).
Znak
oznacza przejście do następnego etapu, znak
oznacza hamowanie procesu
3.1.5. Rola Rb w kontrolowaniu długości telomerów
Poznanie molekularnych mechanizmów śmiertelności komórek stało się bliższe wraz z
odkryciem roli telomerazy. W komórkach, w których brak telomerazy dochodzi do skracania
telomerów z każdą kolejną rundą replikacji. Doprowadza to do utraty ochrony jaką dają
chromosomom telomerowe odcinki DNA.
Stwierdzono, że brak Rb powoduje nieśmiertelność komórek [43]. Jednak barierą do
uzyskania nieśmiertelności jest rozwiązanie problemu telomerów. Niedawno odkryto związek
Rb z mechanizmem regulacji długości odcinków telomerowych DNA. W komórkach mysich
fibroblastów z wyłączonymi genami Rb zauważono znaczące wydłużenie telomerów nie
związane z podwyższeniem aktywności telomerazy. Nie znamy jednak molekularnej roli Rb
w nowo odkrytym mechanizmie kontroli długości telomerów. Wydaje się on kluczowy w
zjawiskach nieśmiertelności komórek nowotworowych. Tłumaczy również sens inaktywacji
Rb przez wirusowe białka onkogenne.
23
3.2. CHLAMYDOMONAS
Homolog białka retinoblastoma (Mat3) został odnaleziony w jednokomórkowych
fotosyntetuzujących Chlamydomonas reinhardtii [111]. Należą one do klasy zielenic
właściwych, rząd zawłotniowców, których cykl komórkowy odbywa się według mechanizmu
wielokrotnych podziałów [108]. Wegetatywna komórka Chlamydomonas (haploidalna)
wchodzi w przedłużoną fazę G1, w trakcie której wielokrotnie się powiększa. Następnie
szybko przechodzi kilka rund faz S i mitozy. W efekcie powstają komórki potomne o stałej
wielkości.
Mutacje w genie Mat3 powodują powstanie większej liczby mniejszych komórek
(Rys. 19). Mutacja w homologu Rb u Chlamydomonas wywołuje inne efekty niż u zwierząt nie skraca fazy G1, ani nie wprowadza komórki stale w fazę S. Utrata funkcjonalnego Mat3
upośledza zależną od wielkości komórki regulację liczby i czasu podziału (Tabela 3). Jest,
więc zależnym od wielkości represorem cyklu komórkowego, prawdopodobnie hamuje
przejście fazy G1 do S (czas rozpoczęcia podziału zależny do wielkości) i fazy S do mitozy
(liczba podziałów zależna od wielkości) [21,111].
(a)
(b)
Rys. 19. Komórki Chlamydomonas (a) typ dziki (wt) i (b) mutanty Mat3-/-
Tabela 3. Charakterystyka cyklu komórkowego i wielkości komórek Chlamydomonas typ dziki (wt) i mutanta w
genie.
Wt
Mat3-/-
Śr. wielkość komórki
potomnej µm3
113
23
Śr. liczba podziałów
komórki macierzystej
1,6
2,6
24
Min. wielkość dzielącej się Czas podwojenia
kom. macierzystej µm3
masy [h]
178
6,5
110
6,8
3.3. ROŚLINY
Pierwszą przesłanką wskazującą na istnienie u roślin szlaku związanego z Rb było
wyizolowanie trzech różnych cyklin typu D [102] wykazujących podobieństwo do
zwierzęcych cyklin D regulujących kinazy Cdk w szlaku Rb. Poparciem dla istnienia szlaku
było pokazanie oddziaływania łączenia się niektórych białek roślinnych wirusów z ludzkim
Rb [121].
Homolog ludzkiego białka retinoblastoma został w 1998 roku odkryty w kukurydzy
[48]. Obecność homologów Rb stwierdzono u: tytoniu [87], Arabidopsis [51], Chenopodium
rubrum [41] i grochu [103]. Rozpoczęto poszukiwania szlaku kontroli, z udziałem Rb,
podobnego do zwierzęcego.
W 1999 sklonowano E2F z pszenicy [92], który wykazywał duże podobieństwo do
ludzkiej rodziny czynników E2F. W 2000 roku odkryto dwa geny kodujące korepresor DPa i
DPb w Arabidopsis [79].
3.3.1. Rola Rb w cyklu komórkowym roślin
Ogólny mechanizm funkcjonowania szlaku kontroli cyklu komórkowego z udziałem
Rb u roślin jest podobny do zwierzęcego (Rys. 20).
Rys. 20. Schemat funkcjonowania szlaku kontroli przejścia faz G1 do S z udziałem Rb
25
3.3.2. Aberracje cyklu komórkowego roślin
U roślin nie ma naturalnie występujących mutacji Rb i nie ma związku Rb z
nowotworzeniem.
Geminiwirusy to roślinne wirusy DNA o małym genomie kodująym białka
uszkadzające szlak Rb [52]. Do tej grupy wirusów należą Mastrewirusy eksprymujące w
komórkach gospodarza białko RepA, które łączy się z Rb (za pośrednictwem motywu LxCxE
[121]). Obecność RepA stymuluje wzrost kallusa kukurydzy i podziały komórek BY-2 [46].
Podobnie funkcjonują Begomowirusy i Cutovirusy, przy czym w ich białkach nie ma motywu
LxCxE i wiążą się z Rb za pomocą innych regionów [52].
3.3.3. Rola Rb w fotomorfogenezie
W Arabidopsis występuje sześć homologów E2F (Rozdział 2.5). Rb działa na
heterodimer E2Fa/DP uniemożliwiając mu aktywację genów fazy S. Natomiast E2Fc/DP sam
i (lub) w kompleksie z Rb powoduje hamowanie podziałów, poprzez obniżenie wyrażania
niektórych niezbędnych genów. Stwierdzono jednak, że E2Fc jest usuwane przez kompleks
ubikwitynujący SCFSKP2, stymulowany z kolei przez światło. Wysunięto hipotezę o roli Rb i
E2Fc w przejściu od skotomorfogenezy do fotomorfogenezy [28] (Rys. 24).
Rys. 21. Hipoteza roli E2Fc/DP i E2Fa/DP w szlaku
kontroli cyklu komórkowego Rb.
26
4. CEL PRACY
Identyfikacja i klonowanie sekwencji kodującej genu Rb z Arabidopsis thaliana.
27
5.
MATERIAŁY I METODY
5.1. Hodowla bakterii
Używano szczepu Escherichia coli XL1 Blue (Stratagene) recA1 endA1 gyrA46 thi
hsdR17 supE44 relA1 lac F`[proAB lacIq ΔlacZ M15::Tn10 (Tetr)]. Bakterie hodowano przez
noc w temperaturze 37˚C na pożywce stałej lub płynnej. Hodowle płynne prowadzono z
intensywnym mieszaniem (150 obr./min).
Stosowano pożywkę LB (Luria Bertani: 1% bakto-trypton, 1% NaCl, 0,5% wyciąg
drożdżowy, pH 7,2). Pożywki stałe LB zestalono baktoagarem (1%). Antybiotyk selekcyjny:
ampicylina (Sigma) stosowano w stężeniu100 µg/ml. Do selekcji stosowano także IPTG
(100mM) i X-gal (20mg/ml) [98].
5.2. Materiał roślinny
Arabidopsis thaliana L. Heynh. Ekotyp Columbia (Lehle Seeds), hodowla w
koreczkach torfowych (Agrowit), w komorze fitotronowej w temperaturze 20-25˚C przy
fotoperiodzie 16/8 godzin dzień/noc.
5.3. Synteza cDNA
RNA izolowano z liści Arabidopsis zestawem RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)
zgodnie z zaleceniami producenta. Syntezę cDNA przeprowadzono zestawem Superscript
First Stand Synthesis System (Invitrogen) według instrukcji producenta.
5.4. PCR
W celu sklonowania fragmentu mRNA genu Rb (At3g12280), amplifikowano
wybrany fragment metodą łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR). Skonstruowano startery
oskrzydlające powielaną sekwencje (od 278bp do 1288bp mRNA EMBL: AF245395) i
posiadające miejsca rozpoznawane przez wybrane enzymy restrykcyjne. Produkty PCR
rozdzielano w żelu agarozowym.
F
KpnI
SpeI
AscI
PstI
Sekwencja komplementarna do cDNA
5`AT GGTACC ACTAGT GGCGCGCC CTGCAG GTTCCATAGATGCATGCTTGCTTGCTCA
R
BamH1
SwaI
PstI
Sekwencja komplementarna do cDNA
5`AT GGATCC ATTTAAAT CTGCAG GGTCGTTTCTTACAGGACCTAGCTCCA
28
Starter
R
F
Pozycja w mRNA Rb 278 1288
Temp. topnienia
68.8 68.0
Zawartość % GC
46
52
Etap
Czas Temperatura
Denaturacja wstępna
4m
94˚C
sek
Denaturacja
5
94˚C
Przyłączenie
30sek
65˚C
30x
m
sek
Synteza
1 20
72˚C
m
Synteza końcowa
4
72˚C
Zakończenie reakcji
4˚C
5.5. Rekombinacja DNA
Plazmid pBlueScript SK+ i produkt PCR trawiono enzymami restrykcyjnymi BamHI i
KpnI (Invitrogen) według zaleceń producenta. DNA rozdzielano w 1% żelu agarozowym z
dodatkiem bromku etydyny (0,5 µg/ml) Wielkość prążków oceniano względem markera
wielkości 1kb+ Ladder (Invitrogen). DNA izolowano z żelu przy pomocy zestawu QIAquick
(Qiagen) zgodnie z zaleceniami producenta. Ligację DNA prowadzono w obecności 0,5U
ligazy T4 (Invitrogen) przez 60 minut w 26˚C. Reakcje prowadzono w objętości 20 µl przy
proporcji stężeń molarnych wstawki do plazmidu 3:1. Otrzymaną mieszaniną ligacyjną
transformowano bakterie.
5.6. Przygotowanie bakterii elektrokompetentnych i transformacja
Bakterie E.coli XL-1 Blue zaszczepiono do 5 ml pożywki LB i hodowano przez noc
w 37˚C (hodowla wstępna). 0,5 ml nocnej hodowli przenoszono do 500 ml czystej pożywki
LB i hodowano w 23˚C aż do osiągnięcia przez bakterie gęstości optycznej OD600≈ 0,5.
Następnie hodowle schładzano w lodzie i wirowano (5000 obr./min) przez 5 min w temp.
4ºC. Po dokładnym odsączeniu bakterii od pożywki, dwukrotnie zawieszano je w 500 ml
sterylnej wody i wirowano jak wyżej. Otrzymane bakterie zawieszano w 10% glicerolu i
przechowywano w temp. –80ºC. Testowano wydajność transformacji (107/1µgDNA)
Bakterie transformowano przez elektroporację (Multiporator firmy Eppendorf).
Mieszaninę do elektroporacji, czyli preparat DNA, 40 µl bakterii i sterylną wodę do objętości
150 µl, umieszczono w schłodzonej kuwecie elektroporacyjnej (średnica szczeliny 1mm).
Przeprowadzono elektroporację przy napięciu 2,5 kV, przez kilka milisekund. Następnie do
mieszaniny dodano 700 µl pożywki LB i inkubowano w 37˚C przez 40 min w celu wyrażenia
genu oporności na antybiotyk, po czym odpłukiwano pożywkę, a bakterie wysiewano na
szalki z ampicyliną.
29
5.7. Izolacja plazmidowego DNA bakterii
5.7.1. Metodą lizy alkalicznej (miniprep)
Zwirowywano 3 ml nocnej hodowli bakterii. Osad zawieszano w 100 µl buforu I
(50mM glukoza, 10mM EDTA, 25 mM Tris-HCl, pH 8,0), dodawano 5 µl Rnazy (10 µg/ml) i
inkubowano przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodawano 200 µl świeżo
przygotowanego roztworu do lizy alkalicznej (0,2 M NaOH, 1% SDS), próbki mieszano
delikatnie i pozostawiano w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po tym czasie dodawano
150 µl zimnego roztworu neutralizującego (7,5 M octan amonu), silnie wstrząsano i
inkubowano w lodzie 10 minut. Następnie próbki wirowano przez 15 minut w mikrowirówce.
Zbierano supernatant i dodawano 900 µl zimnego 96% etanolu i inkubowano 20 minut w
-20˚C. Preparat wirowano przez 15 minut. Powstały osad przemywano 70% etanolem i
suszono przez 5 minut w wirówce próżniowej SpeedVac (Savant). Osad czyli plazmidowe
DNA zawieszano w TE (10mM Tris-HCl pH 8,0, 1mM EDTA) lub wodzie.
5.7.2. Zestaw do izolacji plazmidowego DNA
Preparat DNA plazmidowego przeznaczony do sekwencjonowania oczyszczano
zestawem do izolacji plazmidów Wizard Plus SV Minipreps (Promega)
5.8. Sekwencjonowanie DNA
Sekwencjonowanie DNA wykonane w Pracowni Sekwencjonowania i Syntezy
Oligonukleotydów IBB, PAN. Użyto standardowych starterów do sekwencjonowania T7,
M13.
5.9. Techniki komputerowe
•
Analizę
filogenetyczną
wykonano
programami
(http://evolution.genetics.washington.edu/philip).
Dystanse
z
pakietu
między
PHILIP
sekwencjami
obliczono algorytmem PAM matrix, drzewo obliczono algorytmem UPGMA.
•
Porównanie sekwencji wykonano programem ClustalX [].
•
Sekwencje przeszukiwano programem Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)
•
Startery zaprojektowano programen GeneFisher
•
Wyniki sekwencjonowania (chromatogram) odczytywano w programie Chromas
•
Modele cząsteczek wizualizowano w programie Swiss-pdbViewer
30
6.
WYNIKI
6.1. IDENTYFIKACJA WSZYSTKICH GENÓW Rb W GENOMIE ARABIDOPSIS
Bazę sekwencji genomowych przeszukiwano programem Blastp
względem
podobieństwa do sekwencji białka retinoblastoma. Spośród znalezionych sekwencji usunięto
powtarzające się i przeprowadzono analizę filogenetyczną. Porównanie sekwencji wykonano
programem ClustalX. Analizę filogenetyczną wykonano programami z pakietu PHYLIP. W
bazie danych sekwencji Arabidopsis znaleziono niewiele białek wykazujących, chociaż
częściowe podobieństwo do Rb. W analizie filogenetycznej sekwencja białka retinoblastoma
(gen: AT3G12280) nie wykazywała powiązania filogenetycznego pozostałymi. Oznacza to,
że w genomie Arabidopsis istnieje jeden gen kodujący Rb.
Rys. 22. Identyfikacja wszystkich wariantów genu Rb w
Arabidopsis.
6.2. CHARAKTERYSTYKA FILOGENETYCZNA Rb
Homologi
białka
retionblastoma
wykazują
podobieństwo
funkcjonalne
oraz
podobieństwo budowy domenowej. Z przeprowadzonej analizy filogenetycznej wynika, że
rodzina białek Rb jest mocno konserwowana ewolucyjnie. Mat3 homolog z Chlamydomonas
tworzy oddzielną gałąź ewolucji Rb. Szlak kontroli Mat3 funkcjonuje odmiennie od
pozostałych białek Rb (patrz 3.2.), co tłumaczy mniej konserwowaną sekwencje. Wszystkie
białka Rb mają jednak wspólną budowę domen A i B (Rys. 6) i silnie konserwowane regiony
wiążące oddziaływujące z nim białka.
31
Rys. 23. Drzewo filogenetyczne białek Rb (wykonanie Rozdział 5. Materiały i metody). Liczby wskazują
długości gałęzi, czyli różnice w sekwencji aminokwasowej, liczby w nawiasach przy rozgałęzieniach oznaczają
wartości boostrap.
6.3. KLONOWANIE Rb Z ARABIDOPSIS
Na matrycy cDNA uzyskanego z Arabidopsis thaliana zamplifikowano metodą PCR
fragment (1kb) sekwencji kodującej Rb.
Rys. 24. Obraz rozdziału elektroforetycznego produktów reakcji PCR z
matrycą cDNA (1) i kontrolnie bez matrycy (K). M – marker wielkości.
32
Zamplifikowany fragment cDNA wstawiono do plazmidu pBlueScript przy użyciu
enzymów restrykcyjnych KpnI i BamHI. Otrzymano klon fragmentu genu Rb (Rys. 25). W
celu potwierdzenia pochodzenia wstawki plazmid sekwencjonowano (Rys. 26).
Rys. 25. Obraz rozdziału elektroforetycznego: (1) plazmid z
klonem Rb trawiony KpnI i BamHI, (2) plazmid z klonem
Rb nie trawiony, (3) pusty plazmid, (M) marker wielkości
Rys. 26. Strona wynikowa programu BLAST, w którym sprawdzono wynik sekwencjonowania. Uzyskano
potwierdzenie sklonowania fragmentu cDNA Rb Arabidopsis.
Sekwencjonowanie wykazało, że osiągnięto zamierzony cel. Sklonowano fragment
cDNA genu Rb z Arabidopsis.
33
7.
DYSKUSJA
Jak dowiedziono rola szlaku kontroli cyklu komórkowego z udziałem białka
retinoblastoma jest istotna we wzroście i różnicowaniu komórek zwierzęcych i roślinnych.
Funkcjonowanie tego mechanizmu jest jednak dużo słabiej poznane u roślin.
Z
przeprowadzonej
analizy
filogenetycznej
wynika
bliskie
pokrewieństwo
podstawowych białek szlaku regulacji z udziałem Rb wśród organizmów je posiadających.
Zyskuje to potwierdzenie w danych eksperymentalnych dowodzących oddziaływania
homologów łączących się białek z różnych organizmów [92].
Identyfikacja jedynego genu Rb w Arabidopsis dokonana w tej pracy wydaje się być
prawidłowa. Niedawno ukazała się publikacja, w której dokonano identyfikacji wszystkich
genów kontrolujących cykl komórkowy u Arabidopsis, również Rb [113]. Rezultaty dowodzą
istnienia pojedynczego genu kodującego Rb, co potwierdza prawidłowość wyniku
uzyskanego, w niniejszej pracy.
Sklonowany fragmentu genu Rb z Arabidopsis posłuży w dalszych etapach
doświadczenia do wyciszenia ekspresji białka Rb metodą dsRNA. Wyłączenie Rb u zwierząt
powoduje zmiany nowotworowe. Warto w tym miejscu zadać pytanie, dlaczego rośliny nie
„chorują na raka” ? Nadmiarowe komórki są bardzo groźne dla zwierząt - mogą powodować
nowotwory. Jak dowiedziono, proces onkogenezy najczęściej związany jest z mutacją białek
regulujących fazę G1 cyklu komórkowego. Jednak u roślin typowo protoonkogenne mutacje
nie wywołują tak poważnych następstw. Na przykład, nadprodukcja CycD powodująca u
zwierząt nowotwory, u roślin wywołuje jedynie przyśpieszony wzrost (Rozdział 2.1).
Kontrola wzrostu i podziałów komórek powinna determinować ostateczną wielkość
rośliny, kształt liści, łodyg, korzeni. Jednak eksperymenty, w których stymulowano lub
hamowano podziały komórkowe sugerują, że nie jest to twierdzenie słuszne. Oczywiście
efekt obu manipulacji przynosił obniżenie albo podwyższenie ilości komórek, co jednak
powodowało niewielkie różnice w wyglądzie rośliny.
Rośliny mają zdolność do włączania pojawiających się dodatkowych komórek w
normalne tkanki. Wynika to prawdopodobnie ze strategii rozwoju. U roślin następuje
intensywne postembrionalne formowanie organów z nie wyróżnicowanych stref proliferacji,
czyli merystemów. Gdy komórka opuszcza strefę merystematyczną częstość podziałów
34
zmniejsza się, a los komórki jest determinowany bardziej przez otoczenie, niż pochodzenie.
Pozostaje to w kontraście do zwierząt, u których najczęściej tożsamość komórki jest
determinowana przez jej pochodzenie. Zwiększenie ilości komórek np. w korzeniu rośliny,
zwiększa tylko pulę komórek przeznaczoną do formowania korzenia. Nadnormatywne
komórki w strefach zróżnicowanych są zdeterminowane przez otoczenie i zostają wbudowane
w otaczającą tkankę. Przy zmniejszeniu ilości komórek występuje dodatkowy efekt w postaci
zwiększenia wymiarów komórek.
Rośliny wykazują wyjątkową oporność na transformacje neoplastyczne. Znany
przypadek tworzenia u roślin guzów lub narośli powodowany jest interakcją z patogenną
bakterią Agrobacterium. Trudno uznać to jednak za zmianę natury nowotworowej (jest to
raczej hormonalna indukcja proliferacji komórek). Rośliny są również oporne na kancerogeny
np. UV, promieniowanie jonizujące. Taka uderzająca różnica pomiędzy zwierzętami, a
roślinami wskazuje, że oporność na nowotwory jest elementem strategii rozwoju roślin.
Pomimo, że molekularne podstawy tych oczywistych różnic między roślinami a zwierzętami
są wieloczynnikowe, wiemy o nich coraz więcej [34]. Lepsze zrozumienie funkcjonowania
szlaku Rb, przybliża ich poznanie.
Tolerancja roślin na zwiększoną liczbę komórek mogłaby zostać wykorzystana do
zwiększenia biomasy (np. większe owoce). Pierwszym krokiem będzie lepsze zrozumienie
molekularnych zależności pomiędzy cyklem komórkowym, wzrostem i rozwojem.
Do wyjaśnienia pozostaje zganienie powiązania białka Rb z białkami remodelującymi
chromatynę. Planowany eksperyment, którego pierwszym etap przedstawiono w niniejszej
pracy, obejmuje również wyciszenie wraz z Rb trzech wariantów histonu H1. Celem jest
sprawdzenie czy białko Rb pozostaje w zależności funkcjonalnej z histonem H1. Podwójne
wyciszenie Rb i H1 może spowodować różne defekty (morfologiczne i biochemiczne). Brak
sumowania się defektów sugerowałby, że Rb współdziała z histonem, synergizm wyłączenia
pokazywałby niezależność funkcjonowania i wzajemne zastępowanie się funkcji H1 i Rb.
Od 1987 roku, kiedy to wyizolowano gen Rb, udało się stworzyć spójny model
regulacji fazy G1 cyklu komórkowego u zwierząt. Uszkodzenia dotyczące mechanizmów
kontroli fazy G1 prowadzą najczęściej do onkogenezy. Zrozumienie molekularnych
mechanizmów regulujących tę fazę ma istotne znaczenie w poznaniu etiologii chorób
nowotworowych oraz ich terapii. Dotyczy to szczególnie terapii genowej, w której przy
pomocy odpowiednich wektorów wprowadza się do komórki nowotworowej prawidłowe
35
geny (np. gen kodujący białko Rb). Oznaczanie stężeń białek regulujących fazę G1 ma
również inne implikacje kliniczne. Na podstawie tych danych można często wnioskować o
stopniu złośliwości nowotworu oraz o szansach przeżycia pacjenta. Oznaczanie poziomu
białek fazy G1 ma duże znaczenie w diagnostyce niektórych chorób nowotworowych. Co
więcej, w przypadku niektórych nowotworów można także prognozować skuteczność
ewentualnego leczenia. Dalsze badania nad regulatorami fazy G1 cyklu komórkowego
przyczynią się prawdopodobnie do poprawienia wyników terapii oraz wykrywania w
populacji osób szczególnie narażonych na choroby nowotworowe.
36
8.
LITERATURA
1.
Ach, R.A., Durfee, T., Miller, A.B., Taranto, P., Hanley-Bowdoni, L., Zambryski, P.C.,
and Gruissem, W.(1999). RRB1 and RRB2 encode maize retinoblastoma-related
proteins that interact with a plant D-type cyclin and geminivirus replication protein.
Mol Cell Biol 17, 5077-5086.
2.
Ahmad, N., Adhami, V.M., Gupta, S., Cheng, P., Mukhtar, H. (2002). Role of the
retinoblastoma pRb-E2F/DP pathway in cancer chemopreventive effects of green tea
polyphenol epigallocatechin-3-gallate. Arch Biophys Biochem 398, 125-131.
3.
Albani, D., Mariconti, L., Ricagno, S., Pitto, L., Moroni, C., Helin, K., and Cella,
R.(2000). DcE2F, a functional plant E2F-like transcriptional activator from Daucus
carota. J Biol Chem 275, 19258-19267.
4.
Angus, S.P., Wheeler, L.J., Ranmal, S.A., Zhang, X., Markey, M.P., Mathews, C.K.,
and Knudsen, E.S.(2002). The retinoblastoma tumor suppressor targets sNTP
metabolism to regulate DNA replication. JBC papers 6, 1-26.
5.
Appleby, J.L., Parkinson, J.S., Bourret, R.B. (1998). Signal transduction via the multistep posforelyay: not necessarily a road less traveled. Cell 86, 845-848.
6.
Black, A.R. and Azizkhan-Clifford, J.(1999). Regulation of E2F:a family of
transcriptional factors involved in proliferation control. Gene 237, 281-302.
7.
Brehm, A. and Kouzarides, T.(1999). Retinoblastoma protein meets chromatin. TIBS
24, 142-145.
8.
Brehm, A., Miska, E.A., McCance, D.J., Reid, J.L., Bannister, A.J., and Kouzarides,
T.(1998). Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription.
Nature 391, 597-601.
9.
Brown, V.D., Phillips, R.A., and Gallie, B.L.(1999). Cumulative effect of
phosphorylation of pRB on regulation of E2F activity. Mol Cell Biol 19, 3246-3256.
10.
Burssens, S., van Montagu, M., and Inze, D.(1998). The cell cycle in Arabidopsis.
Plant Physiol Biochem 36, 9-19.
11.
Chaboute, M.E., Clement, B., Sekine, M., Philipps, G., and Chaubet-Gigot, N.(2000).
Cell cycle regulation of the tobacco ribonucleotide reductase small subunit gene is
mediated by E2F-like elements . Plant Cell 12, 1987-1999.
12.
Chau, B.N., Borges, H.L., Chen, T.T., Massellin, A., Hunton, I.C., Wang, J.Y.J. (2002).
Signal-dependent protection from apoptosis in mice expressing caspase-resistant Rb.
Nature Cell Biol 4, 757-765.
13.
Chen, P.L., Riley, J.D., Chen, Y., and Lee, W.H. (1996). Retinoblastoma protein
positively regulates terminal adipocyte differentiation through direct interaction with
C/EBP. Genes Dev 10, 2794-2804.
37
14.
Chen, P.L., Riley, J.D., Chen-Kiang, Y., and Lee, (1996). Retinoblastoma protein
directly interacts with and activates the transcription foctor NF-IL6. Proc Nat Acad
Sci 93, 465-469.
15.
Chow, K.N.B. and Dean, D.C.(1996). Domains A and B in the Rb pocket interact to
form a transcriptional repressor motif. Mol Cell Biol 16, 4862-4868.
16.
Chow, K.N.B., Starostik, P., and Dean, D.C.(1996). The Rb family contains a
conserwed cyclin-dependent-kinase-regulated transcriptional repressor motif. Mol
Cell Biol 16, 7173-7181.
17.
Claudio, P.P., Stiegler, P., Howard, C.M., Bellan, C., Minimo, C., Tosi, G.M., Rak, J.,
Kovatich, A., de Fazio, P., Micheli, P., Caputi, M., Leoncini, L., Kerbel, R., Giordano,
G.G., Giordano, A. (2001). Rb2/p130 gene-enhanced expression down-regulates
vascular endothelian growth factor expression and inhibits angiogensis in vivo.
Cancer Res 61, 462-468.
18.
Claudio, P.P., Tonini, T., and Giordano, A.(2002). The retinoblastoma family: twins or
distant cousins? Genome Biol 3, 3012.1-3012.7
19.
Cockcroft, C.E.l., den Boer, B.G.W., Healy, J.M.S., and Murray, J.A.H.(2000). Cyclin
D control of growth rate in plants. Nature 405, 575-579.
20.
Coqueret, O.(2002). Linking cyclins to transcriptional control. Gene 299, 35-55.
21.
Cross, F.R. (2001). Retinoblastoma protein: combating algal bloom. Curr Biol 11, 824827.
22.
Czajkowski, R., Drewa, T., Olszewska, D., Woźniak, A. (2000). Zaburzenia kontroli
fazy G1 cyklu komórkowego podczas onkogenezy. Post Bioch 46, 309-317.
23.
D`Agostion, I.B.D. and Kieber, J.J.(1999). Molecular mechanisms of cytokinin action .
Curr Opin Plant Biol 2, 359-364.
24.
Dahiya, A., Gavin, M.R., Luo, R.X., and Dean, D.C.(2000). Role of the LXCXE
binding site in Rb function. Mol Cell Biol 20, 6799-6805.
25.
Dahiya, A., Wong, S., Gonzalo, S., Gavin, M., and Dean, D.C.(2001). Linking the Rb
and Polycomb pathways. Mol Cell 8, 557-568.
26.
de Jager, S.M. and Murray, J.A.H.(1999). Retinoblastoma proteins in plant. Plant Mol
Biol 41, 299
27.
De Veylder, L., Beeckman, T., Beemster, G.T., de Almeida-Engler, J., Ormenese, S.,
Maes, S., Naudts, M., Van der Schueren, E., Jacqmard, A., Engler, G., and Inze, D.,
(2002). Control of proliferation, endoreduplication and differentiation by the
Arabidopsis E2Fa-DPa transcription factor. EMBO J 21, 1360-1368.
28.
del Pozo, J.C., Boniotti, M.B., and Gutierrez, C.(2002). Arabidopsis E2Fc functions in
cell division and is degraded by the ubiquitin-SCFAtSKP2 pathway in response to light.
Plant Cell 14, 3057-3071.
38
29.
den Boer, B.G.W. and Murray, J.A.H.(2000). Control od plant growth and
developement through manipulation of cell-cycle genes. Curr Opin Biotech 11, 138145.
30.
den Boer, B.G.W. and Murray, J.A.H.(2000). Triggering the cell cycle in plants. Trends
Cell Biol 10, 245-250.
31.
Dick, F.A., Sailhamer, E., and Dyson, N.J.(2000). Mutagenesis of the pRB pocket
reveals that cell cycle arrest functions are separable from binding to viral
oncoproteins. Mol Cell Biol 20, 3715-3727.
32.
Doerner, P., Jorgensen, J-E., You, R., Steppuhn, J., Lamb, C. (1996). Control of root
growth and development by cyclin expression. Nature 380, 520-523.
33.
Doonan, J. and Fobert, P.(1997). Conserved and novel regulators of the plant cell cycle.
Curr Opin Cell Biol 9, 824-830.
34.
Doonan, J. and Hunt, T.(1996). Why don`t plants get cancer? Nature 380, 481-482.
35.
Dowdy, S.F., Hinds, P.W., Louie, K., Reed, S.I., Arnold, A., and Weinberg, R.A.(1993).
Physical interaction of the retinoblastoma protein with human D cyclins. Cell 73,
499-511.
36.
Durfee, T., Feiler, H.S., and Gruissem, W.(2000). Retinoblastoma-related proteins in
plants: homologus or orthologues of their metazoan counterparts? Plant Mol Biol 43,
635-642.
37.
Dynson, N., Guida, P., McCall, C., and Harlow, E.(1993). Adenovirus E1A makes two
distinct contacts with the retinoblastoma protein. J Virol 66, 4604-4611.
38.
Dyson, N.(1998). The regulation of E2F by pRB-family proteins. Genes Dev 12, 22452262.
39.
Ewen, M.E.(2000). Where the cell cycle and histones meet. Genes Dev 14, 2265-2270.
40.
Ewen, M.E., Sluss, H.K., Sherr, Ch.J., Matsushime, H., Kato, J., and Livingston,
D.M.(1993). Functional interactions of the retinoblastoma protein with mamalian Dtype cyclins. Cell 73, 487-497.
41.
Fountain, M.D., Murray, J.A.H., and Beck, E.(1999). Isolation and characterization of a
plant retinoblastoma-related gene from a photoautotrophic cell suspention culture of
Chenopodium rubum L. Plant Physiol 119, 363-370.
42.
Gajiwala, K.S. and Burley, S.K.(2000). Winged helix proteins. Curr Opin Struct Biol
10, 110-116.
43.
Garrett, M.D., Fattaey, A. (1999). CDK inhibition and cancer therapy. Curr Opin Genet
Dev 9, 104-111.
44.
Goodrich, D.W., Wang, N.P., Quian, Y., Lee, E.Y.H.P., and Lee, W.H.(1991). The
retinoblastoma gene product regulates progression through the G1 phase of the cell
cycle. Cell 67, 293-302.
39
45.
Goodrich, J., (1997) A polycomb-group gene regulates homeotic gene expression in
Arabidopsis. Nature 386, 44–51
46.
Gordon-Kamm, W., Dikes, B.P., Lowe, K., Hoerster, G., Sun, X., Ross, M., Church, L.,
Bunde, C., Farrell, J., Hill, P., Maddock, J., Sykes, L., Li, Z., Woo, Y., Bidney, D.,
and Larkins, B.A.l.(2002). Stimulation of the cell cycle and maize transformation by
disruption of the plant retinoblastoma pathway. PNAS 99, 11975-11980.
47.
Gould, A.,(1997). Functions of mammalian Polycomb group and trithorax group related
genes. Curr Opin Genet Dev 7, 488-494.
48.
Graf, G., Brunett, R.J., Helentjaris, T., Larkins, B.A., DeCaprio, J.A., Sellers, W.R., and
Kaelin, W.G.Jr.(1996). A maize cDNA encoding a member of the retinoblastoma
protein family: Involvement in endoreplication. Proc Natl Acad Sci USA 93, 89628967.
49.
Gu, W., Schneider, J.W., Condorelli, G., Kaushal, S., Mahdavi, V., and Nadal-Ginlard,
B.(1993). Interaction of myogenic factors and the retinoblastoma protein mediates
muscle cell commitment and differentiation. Cell 72, 309-324.
50.
Guo, M. and Hay, B.A.(1999). Cell proliferation and apoptosis. Curr Opin Cell Biol 11,
745-752.
51.
Gutierrez, C.(1998). The retinoblastoma pathway in plant cell cycle. Curr Opin Plant
Biol 1, 492-497.
52.
Gutierrez, C.(2000). Geminiviruses and the plant cell cycle. Plant Mol Biol 43, 763772.
53.
Gutierrez, C., Ramirez-Parra, E., Castellano, M.M., and del Pozo, J.C.(2002). G1 to S
transition: more than a cell cycle engine switch. Curr Opin Plant Biol 5, 480-486.
54.
Haber, D.A. and Housman, D.E.(1991). Rate-limiting steps: genetics of pediatric
cancers. Cell 64, 5-8.
55.
Harbour, J.W. and Dean, D.C.(2000). Chromatin remodeling and Rb activity. Curr
Opin Cell Biol 12, 685-689.
56.
Harbour, J.W. and Dean, D.C.(2000). Rb function in cell-cycle regulation and
apoptosis. Nature Cell Biol 2, 65-67.
57.
Harbour, J.W. and Dean, D.C.(2000). The Rb/E2F pathway: expanding roles and
emerging paradigms. Genes Dev 14, 2393-2409.
58.
Healy, J.M.S., Menges, M., Doonan, J., and Murray, J.A.H.(2001). The Arabidopsis Dtype cyclins CycD2 and CycD3 both interact in vivo with the PSTAIRE cyclindependent kinase Cdc2a but are differentially controlled. J Biol Chem 276, 70417047.
59.
Herrera, R.E., Chen, F., and Weinberg, R.A.(1996). Increased histone H1
phosphorylation and relaxed chromatin structure in Rb-deficient fibroblast. Proc Nat
Acad Sci USA 93, 11510-11515.
40
60.
Herwig, S. and Strauss, M.(1997). The retinoblastoma protein: a master regulatory of
cell cycle, differentiation and apoptosis. FEBS Lett 246, 581-601.
61.
Hiebertt, S.W., Chellappan, S.P., Horowitz, J.M., and Nevins, J.R.(1992). The
interaction of RB with E2F coincides with an inhibition of the transcriptional activity
of E2F. Genes Dev 6, 177-185.
62.
Hu, Y., Bao, F., and Li, J.(2000). Promotive effect of brassinosteroids on cell division
involves a distinct CycD3-induction pathway in Arabidopsis. Plant J 24, 693-701.
63.
Huntley, R., Healy, S., Freeman, D., Lavender, P., de Jager, S.M., Greenwood, J.,
Makker, J., Walker, E., Jackman, M., Xie, Q., Bannister, A.J., Kouzarides, T.,
Gutierrez, C., Doonan, J., and Murray, J.A.H.(1998). The maize retionblastoma
protein homologue ZnRb-1 regulated during leaf development and displays conserved
interactions with G1/S regulators and plant cyclin D (CycD) proteins. Plant Mol Biol
37, 157-169.
64.
Huntley, R.P. and Murray, J.A.H.(1999). The plant cell cycle . Curr Opin Plant Biol 2,
440-446.
65.
Jacks, T., Fazeli, A., Schmitt, E.M., Bronson, R.T., Goodell, M.A., and Weinberg,
R.A.(1992). Effects of an Rb mutation in the mouse . Nature 359, 295-300.
66.
Jacobs, T.(1997). Why do plant cells divide ? Plant Cell 9, 1021-1029.
67.
Kato, J., Matsushime, H., Hiebert, S.W., Ewen, M.E., and Sherr, Ch.J.(1993). Direct
binding of cyclin D to the retinoblastoma gene product (pRb) and pRb
phosphorylation by the cyclin D-dependent kinase CDK4. Genes Dev 7, 331-342.
68.
Knudsen, K.E., Booth, D., Naderi, S., Sever-chroneos, Z., Fribourg, A.F., Hunton, I.C.,
Feramisco, J.R., Wang, J.Y.J., and Knudsen, E.S.(2000). RB-dependent S-phase
response to DNA damage. Mol Cell Biol 20, 7751-7763.
69.
Knudson, A.G.(1985). Hereditary cancer, oncogenes, and antioncogenes. Cancer Res
45, 1437-1443.
70.
Kosugi, S. and Ohashi, Y.(2002). E2Ls, E2F-like represors of Arabidopsis that bind to
E2F sites in a monomeric form. J Biol Chem 277, 16553-16558.
71.
Lee, C., Chang, J.H., Lee, H.S., and Cho, Y.(2002). Structural basis for the recognition
of the E2F transactivation domain by the retinoblastoma tumor suppressor. Genes
Dev 16, 3199-3212.
72.
Lee, J., Russo, A.A., and Pavletich, N.P.(1998). Structure of the retinoblastoma tumoursuppressor pocket domain bound to a peptide from HPV E7. Nature 391, 859-865.
73.
Lee, W.H., Bookstein, R., Hong, F., Young, L.J., Shew, J.Y., Lee, E.Y. (1987). Human
retinoblastoma susceptibility gene: cloning, identification, and sequence. Science 235,
1394-1399.
74.
Lees, E.(1995). Cyclin dependent kinase regulation. Curr Opin Cell Biol 7, 773-780.
41
75.
Lundberg, A.S. and Weinberg, R.A.(1998). Functional inactivation of the
retinoblastoma protein requires sequential modification by at least two distinct cyclincdk complexes. Mol Cell Biol 18, 753-761.
76.
Luo, R.X., Postigo, A.A., and Dean, D.C.(1998). Rb interacts with histone deacetylase
to repress transcription. Cell 92, 463-473.
77.
Macleod, K.(1999). pRb and E2F-1 in mouse developement and tumorigenesis. Curr
Opin Genet Dev 9, 31-39.
78.
Magnaghi-Jaulin, L., Groisman, R., Naguibneva, I., Robin, P., Lorain, S., Le Villain,
J.P., Troalen, F., Trouche, D., and Harel-Bellan, A.(1998). Retinoblastoma protein
repress transcription by recruiting a histone deacetylase. Nature 391, 601-605.
79.
Magyar, A., Atanassova, A., Veylder, L., Rombauts, S., and Inze.D.(2000).
Characterization of two distinct DP-related genes from Arabidopsis thaliana. FEBS
Lett 486, 79-87.
80.
Mancini, M.A., Shan, B., Nickerson, J.A., Penman, S., and Lee, W.(1994). The
retinoblastoma gene product is a cell cycle-dependent, nuclear matrix-associated
protein. Proc Natl Acad Sci USA 91, 418-422.
81.
Mariconti, L., Pellegrini, B., Cantoni, R., Stevens, R., Bergounioux, C., Cella, R., and
Albani, D.(2002). The E2F family of transcription factors from Arabidopsis thaliana.
J Biol Chem 227, 9911-9919.
82.
Meijer, M. and Murray, J.A.H.(2000). The role and regulatiom of D-type cyclins in the
plant cell cycle. Plant Mol Biol 43, 621-633.
83.
Mironov, V., de Veylder, L., van Montagu, M., and Inze, D.(1999). Cyclin-dependent
kinases and cell division in plants - the nexus. Plant Cell 11, 509-521.
84.
Morgrnbesser, S.D., Williams, B.O., Jacks, T., and Depinho, R.A.(1994). p53 dependent apoptosis produced by Rb deficiency in the developing mouse lens. Nature
371, 72-74.
85.
Morrison, A.J., Sardet, C., and Herrera, R.E.(2002). Retinoblastoma protein
transcriptional repression through histone deacetylation of a single nucleosome. Mol
Cell Biol 22, 856-865.
86.
Mulligan, G. and Jacks, T.(1998). The retinoblastoma gene family: cousins with
overlapping interests. Trends Genet 14, 223-229.
87.
Nakagami, H., Sekine, M., Murakami, H., and Shinmyo, A.(1999). Tobacco
retinoblastoma-related protein phosphorylated by a distinct cyclin-dependent kinase
complex with Cdc2/cyclin D in vitro. Plant J 18, 243-252.
88.
Neufeld, T.P. and Edgar, B.A.(1998). Connections between growth and cell cycle. Cur
Opin Cell Biol 10, 784-790.
42
89.
Nielsen, S., Schneider, R., Bauer, U., Bannister, A.J., Morrison, A., O`Carroll, D.,
Firestein, R., Cleary, M., Jenuwein, T., Herrera, R.E., and Kouzarides, T.(2001). Rb
targets histone H3 methylation and HP1 to promoters . Nature 412, 561-565.
90.
Pines, J.(1995). Cyclins and cyclin-dependent kinases: a biochemical view. Biochem J
308, 697-711.
91.
Ramirez-Parra, E. and Gutierrez, C.(2000). Characterization of wheat DP, a
heterodimerization partner of the plant E2F transcription factor which stimulates E2FDNA binding. FEBS Lett 486, 73-78.
92.
Ramirez-Parra, E., Xie, Q., Boniotti, M.B., and Gutierrez, C.(1999). The cloning of
plant E2F, a retinoblastoma-binding protein, reveals unique and conserved features
with animal G1/S regulators. Nucleic Acid Res 27, 3527-3533.
93.
Renaudin, J.P., Doonan, J., Freeman, D., Hashimoto, J., Hirt, H., Inze, D., Jacobs, T.,
Kouchi, H., Rouze, P., Sauter, M., Savoure, A., Sorrell, D.A., Sundaresan, V., and
Murray, J.A.H.(1996). Plant cyclins: a unified nomenclature for plant A-, B- and Dtype cyclins based on sequence organization. Plant Mol Biol 32, 1003-1018.
94.
Riou-Khamlichi, C., Huntley, R., Jacqmard, A., and Murray, J.A.H.(1999). Cytokinin
activation of Arabidopsis cell division through a D-type cyclin. Science 283, 15411544.
95.
Riou-Khamlichi, C., Menges, M., Healy, J.M.S., and Murray, J.A.H.(2000). Sugar
contrrol of the plant cell cycle: differential regulation of Arabidopsis D-type cyclin
gene expression. Mol Cell Biol 20 , 4513-4521.
96.
Rossignnol, P., Stevens, R., Perennes, C., Jasinski, S., Cella, R., Tremousaygue, D.,
Bergounioux,C. (2002). AtE2Fa and AtDPa, members of the E2F family of
transcription factors induce Arabidopsisleaf cells to reenter S phase. Mol Genet
genomics 266, 995-1003.
97.
Sage, J., Mulligan, G.J., Attardi, L.D., Miller, A., Chen, S., Williams, B., Theodorou,
E., and Jacks, T.(2000). Targeted disruption of the three Rb-related genes leads to loss
of G1 control and immortalization. Genes Dev 14, 3037-3050.
98.
Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., Molecular cloning. A laboratory manual.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
99.
Schuppler, U., He, P.H., John, P.C.L., and Munns, R.(1998). Effect of water stress on
cell division and cell-division-cycle-2-like cell-cycle kinase activity in wheat leaves.
Plant Physiol 117, 667-678.
100. Sekine, M., Ito, M., Uemukai, K., Maeda, Y., Nakagami, H., and Shinmyo, A.(1999).
Izolation and characterization of the E2F-like gene in plants. FEBS Letters 460, 117122.
101. Sherr, Ch.J. and Roberts, J.M.(1999). CDK inhibitors: positive and negative regulators
of G1-phase progression. Genes Dev 13, 1501-1512.
43
102. Soni, R., Carmichael, J.P., Shah, Z.H., and Murray, J.A.H.(1995). A family of cyclin D
homologs from plants differentially controlled by growth regulators and containing
the conserved retinoblastoma protein interaction motif. Plant Cell 7, 85-103.
103. Stals, H. and Inze, D.(2001). Then plant cells decide to divide. Trends Plant Sci 6, 359364.
104. Stals, H., Casteels, P., van Montagu, M., and Inze, D.(2000). Regulation of cyclindependent kinases in Arabidospis thaliana. Plant Mol Biol 43, 583-593.
105. Stevens, C. and La Thangue, N.B.(2002). E2F and cell cycle control: a double-edged
sword. Arch Biochem Biophys 412, 157-169.
106. Sun, Y., Dilkes, B.P., Zhang, C., Dante, A.R., Carneiro, N.P., Lowe, K.S., Joung, R.,
Gordon-Kamm, W.J., Larkins, B.A. (1999). Characterization of maize Wee1 and its
activity in developing endosperm. Proc Natl Acad Sci USA 96, 4180-4185.
107. Swiatek, A., Lenjou, M., Van Bockstaele, D., Inze, D., and Van Onckelen, H.(2002).
Differential effect od jasmonic acid and abscisic acid on cell cycle progression in
tobacco BY-2 cells. Plant Physiol 128, 201-211.
108. Szweykowska, A., Szwejkowski, J. (1997) Botanika t.2 systematyka PWN, Warszaw,
137-140.
109. Takemura, M.(2002). Biochemical properties of the stimulatory activity of DNA
polymerase α by the hyper-phosphorylsted retinoblastoma protein. Biochem Biophys
Acta 1571, 151-156.
110. Tonini, T., Hillson, C., and Claudio, P.P.(2002). Interview with the retinoblastoma
family members: Do they help each other? J Cell Physiol 192, 138-150.
111. Umen, J.G. and Goodenough, U.W.(2001). Control of cell division by a retinoblastoma
protein homolog in Chlamydomonas. Genes Dev 15, 1652-1661.
112. Vandel, L., Nicolas, E., Vaute, O., Ferreira, R., Ait-Si-Ali, S., and Trouche, D.(2001).
Transcriptional represion by the retinoblastoma protein through the recruitment of a
histone methyltransferase. Mol Cell Biol 21, 6484-6494.
113. Vandepoele, K., Raes, J., de Veylder, L., Rouze, P., Rombauts, S., and Inze, D.(2003).
Genome -wide analysis of core cell cycle genes in Arabidopsis. Plant Cell 14, 903916.
114. Wang, H., Fowke, L.C., and Crosby, W.L.(1997). A plant cyclin-dependent kinase
inhibitor gene. Nature 386, 451-452.
115. Wang, H., Qi, Q., Schorr, P., Cutler, A.J., Crosby, W.L., and Fowke, L.C.(1998). ICK1,
a cyclin-dependent protein kinase inhibitor from Arabidopsis thaliana interacts with
both Cdc2a and CycD3 and its expression is induced by abscisic asid. Plant J 15,
501-510.
44
116. Wang, H., Zhou, Y., Gilmer, S., Whitwill, S., and Fowke, L.C.(2000). Expression of the
plant cyclin-dependent kinase inhibitor ICK1 affects cll division, plant growth and
morphology. Plant J 24, 613-623.
117. Weinberg, R.A.(1995). The retinoblastoma protein and cell cycyle control. Cell 81,
323-330.
118. Weintraub, S.J., Prater, C.A., and Dean, D.C.(1992). Retinoblastoma protein switches
the E2F site from positive to negative element . Nature 358, 259-261.
119. Williams, L. and Graf, G.(2000). The retinoblastoma protein-a bridge to
heterochromatin. Trends Plant Sci 5, 239-240.
120. Xiao, B., Spencer, J., Clements, A., Ali-Khan, N., Mittnacht, S., Broceno, C.,
Burghammer, M., Perrakis, A., Marmorstein, R., and Gamblin, S.(2003). Crystal
structure of the retinoblastoma tumor supressor protein bound to E2F and the
molecular basis of its regulation. PNAS 100, 2363-2368.
121. Xie, Q., Suarez-Lopez, P., and Gutierrez, C.(1995). Identyfication and analysis of a
retinoblastoma binding motif in the replication protein of a plant DNA virus:
requirement for efficient viral DNA replication. EMBO J 14, 4073-4082.
122. Yamasaki, L., Jacks, T., Bronson, R., Goillot, E., Harlow, E., and Dyson, N.(1996).
Tumor induction and tissue atrophy in mice lacking E2F-1. Cell 85, 537-548.
123. Zhang, H.S., Gavin, M., Dahiya, A., Postigo, A.A., Ma, D., Luo, R.X., Harbour, J.W.,
and Dean, D.C.(2000). Exit from G1 and S phase of the cell cycle is regulated by
repressor complexes containing HDAC-Rb-hSWI/SNF and Rb-hSWI/SNF. Cell 101,
79-89.
124. Bowen,. C., Birrer, M., Gelmann, E.P. (2000). Retinoblastoma protein-mediated
apoptosis after γ-iradiation.
125. Le, N.T.V., Richardson, D.R. (2002). The role of iron in cell cycle progression and the
proliferation of neoplastic cells. Bioch Biophys Acta 1603, 31-46.
126. Garcia-Cao, M. Gonzalo, S., Dean, D., Blasco, M.A. (2002). A role for the Rb family of
proteins in controlling telomer length. Nature Genet Publikacja w Internecie:
http://www.nature.com/naturegenetics doi:11.1038/ng1011.
45