Rozdzielanie komórek metodą wirowania

Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej
Katedra Technologii Leków i Biochemii
Biologia komórki
Rozdzielanie komórek metodą wirowania
WSTĘP
Krew i jej rola w organizmie
Krew jest jedyną tkanką płynną organizmu, krąży w zamkniętym systemie
naczyń krwionośnych. Organizm człowieka zawiera 4.5 litra krwi (1/13 wagi ciała).
Z fizjologicznego punktu widzenia jest środowiskiem które łączy wszystkie
komórki i narządy w jedną funkcjonalną całość. Z histologicznego punktu widzenia
krew jest tkanką, której substancję międzykomórkową stanowi osocze, a komórkami
są krwinki czerwone (erytrocyty), krwinki białe (leukocyty) dzielące się na
granulocyty, limfocyty i monocyty oraz płytki krwi (trombocyty) (Rys.1.).
Krew spełnia w ustroju szereg różnorodnych funkcji. Najważniejsze z nich to:
1. Oddychanie: transport tlenu z płuc do tkanek i dwutlenku węgla z tkanek do
płuc;
2. Odżywianie: transport wchłoniętego i zmetabolizowanego pożywienia;
3. Wydalanie: transport odpadów metabolizmu do nerek, płuc, skóry i jelit w
celu ich wydalenia;
4. Utrzymanie w organizmie prawidłowej równowagi kwasowo-zasadowej;
5. Regulacja równowagi wodnej: krew ma wpływ na wymianę wody pomiędzy
płynem krążącym a płynem tkankowym;
6. Regulacja temperatury organizmu przez rozdział ciepła;
7. Obrona przed zakażeniem: krążące białe krwinki i przeciwciała;
8. Hormonalna regulacja metabolizmu i innych funkcji organizmu: transport
hormonów.
Podstawowe składniki krwi
Krew jest tkanką której 80 % stanowi woda, a pozostałe 20 % to składniki
organiczne i nieorganiczne.
Związki organiczne to białka (albuminy, globuliny, fibrynogen, enzymy),
hormony, glukoza i inne węglowodany, mocznik, kwas moczowy, aminokwasy,
produkty przemiany hemu oraz inne produkty organiczne przemian
wewnątrzkomórkowych. Występuje też dużo lipidów: cholesterol, fosfolipidy,
triacyloglicerole, witaminy rozpuszczalne w tłuszczach. Prawie wszystkie lipidy
występujące we krwi są związane z białkami osocza, tworząc lipoproteiny i w tej
postaci są transportowane.
1
Białka osocza dzielą się na trzy zasadnicze grupy:
- albuminy: zasadniczą ich funkcją jest wiązanie wody i małocząsteczkowych
związków organicznych (hormony) oraz ich transport;
- globuliny: w grupie tej występują mukoproteiny i glikoproteiny (połączenia
białek z węglowodanami), lipoproteiny (połączenia białek z lipidami),
globuliny wiążące jony metali (transferyna wiążąca Fe) oraz
immunoglobuliny;
- fibrynogen: ma duże znaczenie fizjologiczne, jego przemiana pod wpływem
trombiny w fibrynę stanowi istotę krzepnięcia krwi.
Osocze z którego usunięto elementy morfotyczne i fibrynogen przez
odwirowanie skrzepniętej krwi nazywane jest surowicą. W celu zapobieżenia
krzepnięcia krwi dodaje się do niej substancji (szczawiany, cytryniany, fluorki,
wersenian - EDTA) wiążących jony wapniowe, albo substancji hamujących
przekształcanie protrombiny w trombinę (heparyna). Po odwirowaniu komórek takiej
krwi otrzymuje się osocze (szczwianowe, cytrynianowe, wersenianowe, lub
heparynowe).
Związki nieorganiczne stanowią kationy sodu, wapnia, potasu, magnezu oraz
aniony chloru, węgla, fosforu. Wśród kationów najwięcej jest jonów sodowych,
potasowych i wapniowych, a wśród anionów jonów chlorkowych i węglanowych.
Elementy morfotyczne krwi
Komórki krwi (krwinki czerwone, krwinki białe i płytki krwi) tworzone są u ludzi
w szpiku kostnym czerwonym, występującym w nasadach kości długich, mostku,
miednicy, czaszce i kręgach. Całkowita ilość szpiku w organizmie jest w przybliżeniu
wagi wątroby. W pewnych warunkach rolę narządu krwiotwórczego oprócz szpiku
może pełnić wątroba i śledziona, a dla limfocytów także węzły chłonne i grasica.
Mechanizm powstawania krwinek nie jest jeszcze całkowicie poznany.
Prawdopodobnie wszystkie krwinki wywodzą się z jednego rodzaju komórek
macierzystych zwanych komórkami pnia.
Krwinki czerwone (erytrocyty)
Krwinki czerwone mają kształt dwuwklęsłego krążka o średnicy 7.5 µm i
grubości 1.8-2.4 µm. Kształt ten zwiększa ich powierzchnię o 1/3 w porównaniu z
taką samą objętością w kształcie kuli. Krążą we krwi obwodowej około 120 dni, a
czas ich połowicznego rozpadu (T1/2) wynosi 28 dni. Stare komórki usuwane są z
obiegu i rozkładane przez śledzionę. Przykładowo, u mężczyzn liczba krwinek
czerwonych wynosi około 5.4 · 1012 w litrze krwi.
Erytrocyty są strukturalnie i metabolicznie wyjątkowe wśród komórek
organizmu. Dojrzała krwinka czerwona nie ma jądra, ani cytoplazmatycznych struktur
subkomórkowych, gdyż traci ona organelle podczas dojrzewania w szpiku. W
związku z zanikiem jądra komórkowego traci zdolność do podziału, natomiast w
następstwie utraty mitochondriów zanika zdolność wytwarzania energii, a zanik
rybosomów uniemożliwia przeprowadzenie biosyntezy białek. Krwinka czerwona jest
więc wysoce wyspecjalizowaną komórką o bardzo ograniczonym zapotrzebowaniu
energetycznym, funkcjonującą prawie wyłącznie dzięki glikolizie. Energia zużywana
2
przez nią wykorzystywana jest głównie do utrzymania prawidłowego stanu błony
komórkowej i gradientu jonów.
Jednym z podstawowych zadań erytrocytów w organizmie jest
transportowanie tlenu z płuc do wszystkich tkanek organizmu oraz w pewnym stopniu
dwutlenku węgla z tkanek do płuc. Funkcja ta spełniana jest dzięki zawartej w nich
hemoglobinie, stanowiącej czerwony barwnik krwi. Warunkiem wiązania tlenu przez
hemoglobinę jest obecność niebiałkowej grupy hemowej składającej się z części
organicznej (porfiryna) i atomu żelaza. Hemoglobina jest głównym składnikiem
komórki i stanowi 75 % suchej masy krwinki czerwonej.
Krwinki białe (leukocyty)
Średnica krwinek białych wynosi 3-20 µm. Ilość ich we krwi obwodowej wynosi
około 7.5 · 109 w litrze krwi. Leukocyty dzielą się na granulocyty, limfocyty i
monocyty.
Granulocyty dzielą się na:
- obojętnochłonne (neutrofile): stanowią 65-75 % wszystkich krążących we
krwi krwinek białych;
- kwasochłonne (eozynofile): stanowią 2-5 % wszystkich leukocytów;
- zasadochłonne (bazofile): 0.5 %.
Czas krążenia granulocytów we krwi obwodowej wynosi od kilku do kilkunastu
godzin. Granulocyty obojętnochłonne i kwasochłonne mają zdolność do diapedezy,
czyli przenikania przez ściany naczyń włoskowatych do tkanek i nie powracają do
krwi krążącej. Całkowita pula granulocytów we krwi może się zwiększyć pod
wpływem toksyn bakteryjnych lub czynników uwalnianych przez same granulocyty.
Powoduje to przejście granulocytów ze szpiku do krążącej krwi, a w ciągu kilku
godzin ich liczba we krwi obwodowej może się zwiększyć kilkukrotnie Granulocyty
obojętnochłonne i kwasochłonne wykazują zdolność do kierowania się do ognisk
zapalnych organizmu, ognisk rozmnażania się bakterii, martwych tkanek i innych ciał
obcych na zasadzie chemotaksji. Pożerają, czyli fagocytują one, a następnie trawią w
lizosomach i unieczynniają wszelkie zbędne i niekorzystne dla organizmu czynniki.
Granulocyty zasadochłonne mają słabiej zaznaczone zdolności do diapedezy,
chemotaksji i fagocytozy, zasadniczą ich rolą jest wydzielanie heparyny.
Limfocyty wraz z narządami w których powstają (szpik kostny czerwony,
grasica, śledziona, węzły chłonne) i naczyniami chłonnymi stanowią tzw. układ
limfoidalny, w którym limfocyty krążą pomiędzy krwią i tkankami.
Część limfocytów wytwarzanych w szpiku kostnym, kolejno przechodzi do
grasicy i węzłów chłonnych, gdzie dzieli się, dojrzewa i zmienia się w grasicozależne
limfocyty T odpowiedzialne za reakcje immunologiczne typu komórkowego.
Pozostałe limfocyty powstające w szpiku kostnym zatrzymują się w grudkach
chłonnych przewodu pokarmowego, dzielą się, dojrzewają i przekształcają w
szpikozależne limfocyty B, które wytwarzają immunoglobuliny biorące zasadniczy
udział w reakcjach immunologicznych typu humoralnego.
Monocyty wykazują zdolność do diapedezy i fagocytozy. Po przejściu z krwi
krążącej do tkanek stają się makrofagami, które szybko poruszają się ruchem
amebowatym do miejsc uszkodzonych i wykazującymi zdolności żerne, pochłaniając
znaczne ilości bakterii i fragmenty martwych tkanek. Zawierają one liczne enzymy,
między innymi lipazę i dlatego mogą trawić bakterie mające otoczki lipidowe.
3
Płytki krwi (trombocyty)
Średnica ich wynosi 2-4 µm, krążą we krwi od 8 do 10 dni. Płytki krwi są
wytwarzane w szpiku kostnym w komórkach olbrzymich, zwanych megakariocytami i
stanowią fragmenty cytoplazmy tych komórek. Biorą udział w hemostazie, czyli
zamykaniu mechanicznych uszkodzeń naczyń krwionośnych.
bazofil
eozynofil
neutrofil
monocyt
erytrocyt
trombocyt
limfocyt
Rys.1. Elementy morfotyczne krwi
Za pomocą wirowania w roztworach Ficoll’u można rozdzielić składniki morfotyczne
krwi na frakcje wg schematu poniżej:
Wirowanie w nieciągłych gradientach Ficoll’u pozwala również na rozdział komórek
żywych od martwych. W tym celu na warstwę roztworu Ficoll o gęstości d=1.077 g/ml
nakłada się zawiesinę komórek w pożywce lub soli fizjologicznej i wiruje. Komórki
4
żywe gromadzą się na granicy roztworu Ficoll’u i pożywki a martwe komórki osiadają
na dnie naczynia.
Zwykle w praktyce laboratoryjnej używa się gotowych handlowych preparatów
Ficoll’u np. Ficoll MSL (Lymphocyte separation medium) firmy EuroBio lub
Lymphotest firmy Nyegaaro and Co A/S.
Inną metodą rozdziału komórek za pomocą wirowania jest wirowanie różnicowe
(elutriacja). System rozdziału komórek za pomocą wirowania różnicowego został
opracowany przez Lindahla pod koniec lat pięćdziesiątych zeszłego wieku. Metoda
wykorzystuje różnice pomiędzy komórkami co do ich kształtu, wielkości i tzw.
gęstości sedymentacyjnej. Zaletą tej metody jest stosunkowo mała inwazyjność w
procesy komórkowe w porównaniu np. ze stosowaniem inhibitorów procesów
metabolicznych jak inhibitory polimerazy DNA (afidikolina), inhibitorów szlaku
biosyntezy aminokwasów (mimozyna), inhibitorów funkcji wrzeciona mitotycznego
(nokodazol) itp. Pozwala ona także na otrzymywanie w stosunkowo szybki sposób
dużej ilości komórek (cząstek) rzędu 107-108 komórek o określonych parametrach.
Przykładowe zastosowanie elutriacji to otrzymywanie komórek znajdujących się w
określonych fazach cyklu komórkowego w celu synchronizacji komórek.
Homogenność frakcji komórek w poszczególnych fazach cyklu komórkowego jest
bardzo wysoka i wynosi zwykle dla komórek G1 ok. 90-95%, z fazy S 75-85% i fazy
G2/M 60-75%.
Typowy zestaw do wirowania różnicowego składa się z elementów przedstawionych
na rysunku 3 a procedura prowadzenia rozdziału na rysunku 4.
Pompa
manometr
Zbiornik
pozywki
Kolektor
frakcji
Nastrzykiwanie
próbki
Rotor
Rys 3. Schemat systemu do wirowania różnicowego
5
Zawór obejscia
Zawór obejscia w polozeniu 1
ciecz kierowana jest na uklad
z pominieciem zbiornika na próbke.
Zawór wpustowy próbki zamkniety
Z pompy
Zawór wpustowy
próbki
Strzykawka do nanoszenia
próbki podlaczona.
Zawór obejscia w polozeniu 1
Zawór wpustowy próbki zamkniety
Nanoszenie próbki.
Zawór obejscia w polozeniu 1
Zawór wpustowy próbki otwarty
.
Ladowanie próbki na uklad.
Zawór obejscia w polozeniu 2.
Zawór wpustowy próbki zamkniety.
Po zaladowaniu próbki
powrót do sytuacji z punktu (a)
Rys 4. System do wirowania różnicowego
6
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA
MATERIAŁY
1. Ludzkie komórki nowotworowe traktowane związkami przeciwnowotworowymi.
2. Ficoll 400: silnie rozgałęziony kopolimer cukru trzcinowego i epichlorohydryny o
masie cząsteczkowej 400 tys. g/mol, nie posiadający grup jonowych,
rozpuszczalny w wodzie w 50 % (w/v).
3. Roztwory:
A. izotoniczny roztwór soli (TBS), pH = 7.4:
NaCl (0.14 M)
glukoza (5.5 mM)
CaCl2 x2 H2O (5 ?M)
MgCl2 x6 H2O (0.1 mM)
KCl (0.54 mM)
Tris (15 mM)
woda destylowana
8.0 g
1.0 g
0.75 mg
20 mg
40 mg
1.7 g
do 1000 ml;
B. Ficoll 1077:
Ficoll 400
sól sodowa kwasu 3,5 bis(acetyloamino)2,4,6-trójjodobenzoesowego
woda destylowana
5.7 g
9g
do 100 ml;
C. Błękit trypanu/erytrozyny:
0.4 % roztwór barwnika w 0.9 % roztworze NaCl.
4. Szkło i aparatura:
A. Probówki wirówkowe o pojemności 15 ml;
B. Pipety;
C. Szkiełka mikroskopowe;
D. Wirówka;
E. Mikroskop.
WYKONANIE
1. Przygotować w probówce warstwę Ficollu i zawiesiny komórek: wlać 2 ml
Ficollu 1077 na dno probówki i nawarstwić ostrożnie 2 ml zawiesiny komórek,
tak aby uniknąć wymieszania warstw;
2. Wirować w temperaturze pokojowej 30 minut, z przyspieszeniem
odśrodkowym równym 400g.
3. Zebrać żywe komórki (warstwa komórek na granicy roztworów) do czystej
probówki, rozcieńczyć PBS;
4. Sprawdzić czy na dnie znajdują się martwe komórki. Zebrać komórki martwe
na dnie probówki, rozcieńczyć PBS.
7
5. Zawiesinę z każdej frakcji (żywe i martwe komórki) zmieszać 1:1 z roztworem
błękitu trypanu/erytrozyny;
6. Nanieść na szkiełko podstawowe kroplę wybarwionej zawiesiny i pod
mikroskopem policzyć w procentach ilość komórek martwych (zabarwione na
niebiesko lub różowo) przypadających na 100 komórek.
7. Określić ilość komórek w poszczególnych frakcjach i całkowitą ilość
analizowanych komórek (nakładanych na warstwę Ficoll-u).
Liczenie komórek w komorze hemocytometru
Przygotować hemocytometr do wprowadzenia próbki (według instrukcji
prowadzącego ćwiczenie);
Przygotowanie komórek to liczenia:
zawiesinę komórek przenieść do probówki Eppendorfa i zmieszać 1:1 z roztworem
barwnika (błękit trypanu lub erytrozyna); wymieszać;
zawiesinę wybarwionych komórek przenieść do hemocytometru zgodnie z
instrukcją prowadzącego ćwiczenie; policzyć; (uwaga: czas jaki upłynie od
momentu dodania barwnika nie może być zbyt długi ponieważ z czasem
wybarwiane są także żywe komórki);
Metodyka liczenia komórek w hemocytometrze:
- ustawić obiektyw x10 w mikroskopie;
- komorę ustawić tak, aby widoczne było największe pole ograniczone
liniami potrójnymi (pole o pow. 1mm2) jak na rysunku;
- liczyć komórki leżące wewnątrz kwadratu (o boku 1/20mm) a także na
górnych i lewych liniach ograniczających ( ); nie liczyć komórek
znajdujących się na dolnych i prawych liniach ograniczających ( );
pozwoli to uniknąć liczenia tych samych komórek po dwa razy;
Obliczenie gęstości komórek:
-
obliczyć średnią ze zliczeń (ilość policzonych pól zależy od rodzaju
siatki i celu dla jakiego oznaczenie jest wykonywane);
gęstość zawiesiny komórek [szt./ml] wyliczyć ze wzoru:
c = n / υ,
gdzie:
c – gęstość komórek
n – ilość zliczonych komórek
υ - objętość komory;
OPRACOWANIE SPRAWOZDANIA
W sprawozdaniu należy podać krótką część teoretyczną, sposób wykonania
ćwiczenia wraz ze schematem rozdziału komórek martwych od żywych. Przedstawić
8
w formie rysunku % ilość komórek martwych w poszczególnych próbkach. Opisać
krótko cechy morfologiczne martwych i żywych komórek zaobserwowane pod
mikroskopem.
LITERATURA UZUPEŁNIAJĄCA
[1] T. Pawlikowski, M. Karasek, M. Pawlikowski, Podręcznik histologii, Państwowy
Zakład Wydawnictw Lekarskich, Warszawa, 1981
[2] L. Stryer, Biochemia, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 1997
[3] J. Kawiak i wsp., Podstawy cytofizjologii, Wydawnictwo Naukowe PWN,
Warszawa, 1997
[4] M. Jakóbisiak, Immunologia, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 1996
[5] W. Bloom, D.W. Fawcett, Histologia, Państwowy Zakład Wydawnictw Lekarskich,
Warszawa, 1967
[6] M.L. Nucci, A. Abuchowski, W poszukiwaniu preparatów krwiozastępczych, Świat
Nauki, 4(80), kwiecień 1998, Pruszyński i S-ka, Warszawa, 1998
[7] Lindahl PE. On conter-streaming centrifugation in the separation of cells and cell
fragments. Biochem Biophys Acta 21: 411-415, 1956
[8] Marrancino RL and Keng PC. Centrifugal elutriation. W: Cell Cycle- Materials and
Methods. (M. Pagano, ed), Springer Verlag, Berlin-Heidelberg-New York, 1995,
pp.53-62
9